Predictores espaciales de la respuesta a la quimioinmunoterapia en el cáncer colorrectal metastásico con estabilidad microsatelital.

Si bien la inmunoterapia ha revolucionado el tratamiento del cáncer, muchos tumores sólidos siguen siendo resistentes a la inhibición de los puntos de control inmunitario debido a factores como la baja inmunogenicidad y los microambientes tumorales (MAT) supresores^[1]. Las nuevas estrategias de inmuno-oncología tienen como objetivo modular el MAT y mejorar la antigenicidad tumoral para superar esta resistencia, ampliando la eficacia de los inhibidores de los puntos de control inmunitario (ICI). El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres más comunes, con más de 2 millones de nuevos casos y casi 1 millón de muertes en todo el mundo en 2020^[2]. Casi todos los CCR con microsatélites estables (MSS) (95%) son refractarios a la inmunoterapia^[3]–^[5]. Los esfuerzos para superar esta resistencia y mejorar la respuesta inmune han tenido un éxito limitado.

La inactivación de la enzima de reparación del ADN O^[6]-metilguanina-ADN metiltransferasa (MGMT) a través de la metilación del promotor confiere una mayor sensibilidad a los agentes alquilantes, como el temozolomida (TMZ)^[6]. El CCR metastásico (mCCR) con MGMT silenciada presenta respuestas modestas al TMZ en monoterapia (tasa de respuesta objetiva (OR), ~10%, supervivencia libre de progresión (SLP) mediana de 1,8 meses)^[7], pero la capacidad del fármaco para inducir hipermutación en varios tipos de tumores sugiere un potencial para efectos sinérgicos con los ICI^[8]–^[11]. MAYA fue un ensayo de fase II, abierto, iniciado por el investigador y de prueba de concepto que utilizó TMZ en mCCR con pMMR/MSS y MGMT silenciada, refractario a la quimioterapia, como tratamiento de preparación para inducir un estado hipermutado y sensibilizar los tumores a la combinación de inmunoterapia anti-PD-1 y anti-CTLA-4. Los pacientes recibieron 2 ciclos de TMZ 150 mg/m² al día del día 1 al 5 durante 4 semanas; aquellos que no mostraron progresión de la enfermedad recibieron posteriormente tratamiento combinado con TMZ, nivolumab 480 mg cada 4 semanas y ipilimumab a baja dosis 1 mg/kg cada 8 semanas. Previamente, informamos sobre los resultados en los que se cumplió el punto final primario, con una tasa de SLP de 8 meses del 36 %^[12]. Se observaron respuestas clínicas duraderas con la combinación en mCCR que, de otro modo, sería refractario al tratamiento (OR: 45 %, SLP mediana de 7,1 meses, duración mediana de la respuesta (DLR) de 4,8 meses)^[12].

Los datos de secuenciación de nueva generación (NGS) del ensayo MAYA proporcionaron información valiosa sobre las alteraciones genómicas y los posibles mecanismos de respuesta/resistencia al TMZ y la inmunoterapia. El análisis de la carga mutacional tumoral (TMB) pre y postratamiento reveló un aumento de la TMB en varios pacientes con respuestas a largo plazo, pero esta asociación no fue consistente en todos los pacientes con SLP > 8 meses. Esto sugiere que los análisis de NGS fueron insuficientes para comprender completamente la compleja interacción entre las células tumorales y el sistema inmunitario dentro del MAT. El MAT desempeña un papel fundamental en la modulación de la progresión tumoral y la respuesta al tratamiento, y su organización espacial es crucial para dar forma a estas interacciones^[13]. Los estudios sobre los factores que afectan la eficacia de la inmunoterapia han demostrado una intrincada interacción entre las células tumorales, las células inmunitarias infiltrantes y las células del estroma, que también se ve muy influenciada por la ubicación y la densidad de las poblaciones celulares individuales^[14]. La información espacial, como las distancias entre células y la heterogeneidad, se ha correlacionado con los resultados clínicos para identificar biomarcadores de respuesta^[15]. Buscamos realizar un análisis espacial profundo del MAT a partir de muestras obtenidas del ensayo MAYA, utilizando varias plataformas novedosas para permitir la caracterización de nichos celulares distintos, identificar los principales actores celulares y dilucidar los cambios dinámicos que se producen dentro del MAT en respuesta a la terapia.

Se analizan muestras de tumor y sangre de pacientes que participaron previamente en el ensayo MAYA en tres puntos temporales predefinidos: línea de base, después del ciclo 2 de la terapia de combinación triple y en la progresión de la enfermedad con la terapia triple. Hipotetizamos que la evaluación sistemática de los efectos de la preparación con TMZ y la posterior terapia triple sobre la arquitectura del microambiente tumoral y el contexto inmunitario identificará nuevos biomarcadores, objetivos terapéuticos viables y mecanismos de resistencia. Una comprensión más profunda de la dinámica del MAT es esencial para fundamentar las estrategias de combinación racionales y avanzar en los enfoques de tratamiento personalizados en el cáncer colorrectal con microsatélites estables.

Resultados

Resultados clínicos favorables del ensayo MAYA de CCR con MSS y MGMT silenciado, refractario al tratamiento

Entre el 22 de marzo de 2019 y el 1 de noviembre de 2020, se preseleccionaron 716 pacientes con CCR con MSS refractario al tratamiento, 204 (28,5 %) eran molecularmente elegibles (MGMT silenciado) y un total de 135 pacientes se inscribieron y comenzaron el tratamiento con TMZ en monoterapia (Fig. 1a). De estos, 33 pacientes (24,4 %) lograron el control de la enfermedad y comenzaron la segunda parte del ensayo; estos pacientes recibieron tratamiento de combinación triple con ipilimumab, nivolumab más TMZ. El análisis primario se basó en una fecha de corte de datos del 17 de diciembre de 2021 y se ha publicado previamente^[12]. Aquí presentamos el análisis final del estudio en la fecha de corte de datos del 1 de mayo de 2023. Todos los puntos finales clínicos se informan en los pacientes que se inscribieron en la segunda parte del ensayo, definida según el protocolo. En el momento de este análisis, todos los pacientes habían interrumpido el tratamiento del estudio. El diagrama de consorte actualizado se muestra en el suplemento de datos y las razones de la interrupción del tratamiento fueron: progresión de la enfermedad en 23 pacientes, muerte en 3 pacientes, evento adverso en 1 paciente y solicitud del paciente/decisión médica en 6 pacientes (Fig. S1). La duración mediana del seguimiento para la supervivencia de los pacientes que recibieron la combinación triple fue de 35,8 meses (RIC 29,7–40,1). La combinación triple resultó en una SLP mediana de 7,1 meses (IC del 95 %: 5,6–8,4), supervivencia general (SG) mediana de 19,9 meses (IC del 95 %: 15,0–no alcanzado [NA]) (Fig. 1b, c) y DLR mediana de 8,1 meses (IC del 95 %: 5,8–NA) (Fig. 1d–f).

Análisis multiómicos de CCR con MSS y MGMT silenciado tratado con ICI

Para estudiar los determinantes moleculares y celulares de los pacientes que responden frente a los que no responden, realizamos análisis multiómicos en tejidos tumorales y muestras de sangre periférica. En total, se obtuvieron muestras traslacionales de 28 pacientes tratados con TMZ y terapia triple con ICI (28/33, 84,8 %). Los 28 pacientes tenían muestras tumorales de la línea de base, con un total de 39 muestras de tejido y 63 muestras de sangre periférica (Fig. 1a, 2a, b). Primero, examinamos la correlación entre los biomarcadores genómicos y la respuesta a la combinación triple (Fig. 2c) y no encontramos diferencias en los patrones de mutación (Fig. 2d, prueba exacta de Fisher, p > 0,05 para todas las comparaciones) y la carga mutacional tumoral (Fig. 2e, prueba t, p = 0,87) entre los pacientes que responden y los que no responden en la línea de base. Coherente con la evidencia preclínica^[9], los cambios en la TMB después del tratamiento con TMZ e ICI demostraron una correlación positiva con la SLP (r de Pearson = 0,863, p = 0,0598 [n = 5]). Si bien este hallazgo se basa en un tamaño de muestra limitado, apoya que los aumentos de la TMB posteriores al tratamiento están asociados con un control duradero de la enfermedad (Fig. 2f). Un estudio previo de Crisafulli et al. identificó una firma de mutación de agentes alquilantes distinta en tumores previamente tratados con TMZ, que se asoció con la estabilización de la enfermedad después del bloqueo de los puntos de control inmunitario^[8]. En nuestra cohorte, los pacientes con la firma a niveles clonales, que corresponden al subtipo B2 definido por Crisafulli et al., mostraron una tendencia no significativa hacia una SLP más prolongada en comparación con aquellos sin la firma (prueba de Wilcoxon, p = 0,12; Fig. S2a–d).

Caracterización espacial de las firmas transcriptómicas predictivas del beneficio de la inmunoterapia

Si bien la TMB es un biomarcador establecido para predecir la respuesta a los ICI, los estudios han demostrado que la TMB por sí sola es insuficiente para explicar completamente la variabilidad en los resultados clínicos^[16]. Para explorar determinantes adicionales de la respuesta, analizamos el panorama transcriptómico del microambiente tumoral utilizando la secuenciación de ARN masiva y aplicamos métodos de deconvolución de células inmunitarias establecidos para estimar las abundancias relativas de los subconjuntos de células inmunitarias en toda la cohorte. Este análisis no reveló diferencias obvias en las proporciones de las principales poblaciones inmunitarias, incluidas las células T CD8+, las células B o los macrófagos, entre los pacientes que responden y los que no responden en la línea de base, lo que sugiere que los niveles generales de infiltración inmune eran ampliamente comparables (Fig. S3). Dada las posibles limitaciones de los enfoques de perfilamiento masivo, que no capturan las relaciones espaciales, los estados funcionales o las interacciones celulares dentro del microambiente tumoral, aplicamos técnicas de perfilamiento espacial para evaluar si la distribución espacial de las células inmunitarias y no inmunitarias podría aportar información adicional sobre los mecanismos de respuesta y resistencia.

Realizamos un perfilamiento espacial digital (DSP; GeoMx, Nanostring Technologies) en muestras tumorales de la línea de base de 16 pacientes (8 respondedores, 8 no respondedores). Las láminas se tiñeron con PanCK (células epiteliales), CD45 (células inmunitarias) y SMA (estroma) para guiar la selección de las regiones de interés (ROI). Dentro de cada muestra tumoral, seleccionamos ROI en el núcleo del tumor, la interfaz del tumor y el tejido normal adyacente (Fig. 3a). Las ROI se segmentaron aún más en compartimentos tumorales y estromales (Fig. 3a), lo que resultó en un total de 390 áreas de iluminación (AOI) y, después del control de calidad, se utilizaron 328 AOI para los análisis posteriores (Métodos).

La agrupación no supervisada de las AOI reveló una clara distinción entre los compartimentos tumorales y estromales, independientemente del estado de respuesta o los efectos de lote (Fig. S4). Los compartimentos se caracterizaron por genes característicos, como EPCAM y KRT8 para el tumor y COL4A1 y COL4A2 para el estroma (Fig. S4b). Para evaluar las diferencias específicas del compartimento, comparamos las proporciones de células inmunitarias y el enriquecimiento de conjuntos de genes entre los compartimentos tumorales y estromales de los pacientes que responden y los que no responden. Tanto las AOI tumorales como las estromales de los pacientes que responden tenían mayores proporciones de células T CD8+ de memoria y células B de memoria (Fig. 3b), además del enriquecimiento de vías relacionadas con el reconocimiento inmunitario y la actividad de eliminación relacionada con la inmunidad (Fig. 3c), en comparación con las de los pacientes que no responden, lo que sugiere un reconocimiento tumoral eficaz en los pacientes que responden. Luego, realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) para evaluar las características generales de los compartimentos tumorales y estromales. En comparación con las AOI correspondientes de los pacientes que no responden, las AOI tumorales de los pacientes que responden se enriquecieron en conjuntos de genes relacionados con la proliferación celular (por ejemplo, 'objetivos de MYC v1/v2', 'husillo mitótico' y 'señalización de mTORC1'), mientras que las AOI estromales de los pacientes que responden mostraron un enriquecimiento en conjuntos de genes relacionados con la defensa inmune y la inflamación (por ejemplo, 'respuesta del interferón gamma', 'respuesta inflamatoria', 'apoptosis') (Fig. 3d). Por el contrario, las AOI tumorales de los pacientes que no responden se enriquecieron en conjuntos de genes relacionados con la transición epitelio-mesenquimal (TEM) (por ejemplo, 'transición epitelio-mesenquimal', 'señalización de TNFA', 'angiogénesis' y 'hipoxia'), con solo el conjunto de genes de 'señalización de Wnt/β-catenina' enriquecido en las AOI estromales de los pacientes que no responden (Fig. 3d). Estos hallazgos resaltan el papel de la activación y el compromiso inmunitarios dentro del microambiente tumoral como contribuyentes clave a la respuesta terapéutica, distinguiendo a los pacientes que responden de los que no responden por su respuesta inmune más robusta y eficaz.

La expresión diferencial de genes reveló hallazgos que sugieren procesos biológicos que podrían explicar el aumento de la inmunogenicidad inducida por el TMZ y la mejora de la respuesta a los inhibidores del punto de control inmunitario (ICIs) en los pacientes que respondieron (Fig. Sup. 5). En el compartimento tumoral, la sobreexpresión de genes como LCN2^[17] y PLA2G2A^[18] sugiere que los pacientes que respondieron podrían tener un microambiente tumoral preexistente inflamatorio o en estado de estrés, lo que podría hacer que estos tumores sean más susceptibles al estrés y la inmunogenicidad adicionales inducidos por el TMZ. Los tumores que presentan una mayor inflamación o activación inmune basal tienen más probabilidades de generar neoantígenos o exponer antígenos específicos del tumor tras el daño del ADN causado por el TMZ, lo que conduce a una mayor respuesta inmune cuando se administran los ICIs. En el compartimento estromal, la sobreexpresión de genes relacionados con la inmunidad, como CXCL9, CXCL8 y las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II, sugiere un estado inmune activado basal. CXCL9 y CXCL8 son quimiocinas esenciales para el reclutamiento de células inmunitarias efectoras, como las células T y los neutrófilos, y su mayor expresión puede indicar que los pacientes que respondieron ya tienen un microambiente favorable para la inmunidad^[19]. La presencia de HLA-DQA1 y HLA-DQB1, que están implicados en la presentación de antígenos, sugiere que los pacientes que respondieron pueden tener una mayor capacidad de vigilancia inmune basal, lo que podría conducir a una respuesta inmune más robusta a los neoantígenos inducidos por el TMZ y al tratamiento posterior con ICIs.

Estas características basales sugieren que los pacientes que respondieron tienen un microambiente tumoral más preparado para la interacción inmune, lo que podría explicar sus mejores resultados con la terapia combinada de TMZ e ICIs. La presencia inherente de vías inflamatorias, de reclutamiento inmunitario y de presentación de antígenos en los tumores de los pacientes que respondieron probablemente facilita una respuesta más fuerte a la inmunogenicidad inducida por el TMZ y a los efectos inmunoactivadores posteriores de los ICIs.

Diferentes paisajes inmunitarios entre los pacientes que respondieron y los que no respondieron en el estudio MAYA

Si bien la plataforma DSP ofrece análisis transcriptómicos espaciales dirigidos, su selección limitada de la región de interés (ROI) y la necesidad de la deconvolución celular restringen la caracterización integral del microambiente tumoral (TME), mientras que la tecnología de inmunofluorescencia secuencial (seqIF) hipercompleja de la plataforma Lunaphore COMET™ permite una evaluación más amplia y menos sesgada del paisaje del TME a nivel de célula única. Realizamos imágenes de inmunofluorescencia hipercompleja en muestras de tejido de 26 pacientes: 15 tratados con TMZ e ICIs (7 respondedores a la terapia triple, 8 no respondedores a la terapia triple) y 11 pacientes que progresaron después de 2 meses de tratamiento con TMZ y no recibieron ICIs (solo TMZ). Evaluamos la expresión de 20 proteínas relevantes para el TME, incluidas la citoqueratina, CD4, CD8, CD68, PD-L1, PD-1, granzima B y Ki67 a nivel de célula única (Tabla Sup. 1). Se determinaron los umbrales de positividad para cada marcador. Dentro de cada muestra, seleccionamos ROIs y los anotamos como: tumor, interfaz tumoral estromal (TSI) o estroma (Fig. Sup. 6a), lo que dio un total de 1891 ROIs (804 de solo TMZ, 567 de no respondedores a la terapia triple, 520 de respondedores a la terapia triple). El número medio de células únicas detectadas fue de 119.852 por muestra y de 1613 por ROI. Los tipos de células se asignaron en función de la expresión combinada de marcadores, utilizando marcadores definitorios de linaje, específicos de subtipo y de exclusión para delimitar los compartimentos inmunitario, estromal y tumoral (Tabla Sup. 1). Las células tumorales, definidas como células CK+/CD45-/CD68-/CD11c-, estaban presentes en proporciones cada vez mayores entre el estroma, la TSI y las regiones tumorales (Fig. Sup. 7a); el análisis de imágenes confirmó una mayor expresión de CK en las regiones tumorales (Fig. Sup. 6b).

Si bien la infiltración general de células T CD8+ fue baja tanto en los pacientes que respondieron como en los que no respondieron, lo que es consistente con el conocido fenotipo "frío" del cáncer colorrectal con microsatélites estables (MSS), observamos un enriquecimiento estadísticamente significativo de las células T CD8+ dentro de las regiones tumorales y estromales en los pacientes que respondieron en comparación con los que no respondieron (Fig. Sup. 7b). No se observaron diferencias en las poblaciones de otras células inmunitarias (incluidas las células T CD4, los macrófagos CD68+ y las células dendríticas CD11c+) dentro de las regiones entre los pacientes que respondieron y los que no respondieron (Fig. Sup. 7c, d). Comparamos las proporciones de los diferentes subtipos de células inmunitarias presentes dentro del núcleo tumoral, la TSI y el estroma (normalizado al recuento total de células por ROI), centrándonos en los estados celulares que coexpresan. Observamos proporciones más altas de células CD8+GzmB+ citotóxicas activadas y células CD8+Ki67+ proliferativas tanto en la TSI como en las regiones del núcleo tumoral en los pacientes que respondieron en comparación con los que no respondieron (Fig. 4a, b, Fig. Sup. 6c). Estos hallazgos, observados en muestras previas al tratamiento, son consistentes con estudios previos que demuestran que una mayor densidad de células T citotóxicas y de memoria infiltrantes en el tumor, particularmente en compartimentos espacialmente relevantes, se asocia con un mejor pronóstico en el cáncer colorrectal^[20],^[21].

Para proporcionar una evaluación más completa del TME, ampliamos nuestro análisis más allá de la abundancia de tipos de células específicas del compartimento mediante la incorporación de análisis espaciales de las relaciones celulares en los tres grupos (respondedores a la terapia triple, no respondedores a la terapia triple y solo TMZ) (Fig. 4c). Específicamente, analizamos la proximidad espacial de las células adyacentes dentro del compartimento tumoral en la línea de base, centrándonos en un radio de 20 μm desde las células tumorales dentro de los compartimentos tumorales de las muestras de la línea de base, para evaluar cómo interactúan los elementos inmunitarios y estromales^[22]. Coherente con el paisaje inmunitario escaso característico del cáncer colorrectal MSS, observamos pocas células inmunitarias adaptativas efectoras, incluidas las células T CD8 y las células B, en contraste con las células inmunosupresoras, como los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) y las células inmunitarias adaptativas de memoria, como las células T de memoria (Fig. 4d). Es interesante destacar que una mayor infiltración de CAF dentro de los compartimentos tumorales se asocia con una mala respuesta al TMZ solo y al tratamiento posterior con ICIs. Por el contrario, una mayor infiltración de células T de memoria dentro de las células tumorales se asoció con una buena respuesta a los ICIs.

También buscamos comprender cómo los tipos de células infiltrantes en el tumor influyeron en las células T CD8 efectoras dentro de los compartimentos tumorales. Evaluamos las distancias relativas de las células desde las células T CD8 y descubrimos que la proximidad relativa de las células T CD8 a los CAF en comparación con las células tumorales se asoció con una mala respuesta al TMZ solo, aunque no se alcanzó la significación estadística. De manera similar, la proximidad relativa de las células T CD8 a las células endoteliales se asoció con una peor respuesta (Fig. 4e, f).

El microambiente tumoral (TME) funciona como una entidad integrada, donde los distintos grupos de células inmunitarias interactúan para coordinar las respuestas antitumorales. Como tal, empleamos algoritmos de agrupación espacialmente resueltos descritos previamente por Schürch et al.^[20] para recuperar la información de vecindad celular (CN). Nuestros análisis demostraron CN que diferían en el repertorio y la diversidad de las células inmunitarias. Por ejemplo, se descubrió que el CN7 comprendía predominantemente células tumorales (98,6%) con baja diversidad de células inmunitarias (índice de Shannon = 0,097). En contraste, se descubrió que el CN2 y el CN9 tenían una alta diversidad de células inmunitarias (CN2, índice de Shannon = 1,715; CN9, índice de Shannon = 1,482) (Fig. 4g, h, Fig. Sup. 8).

Se descubrió que las proporciones comparativas específicas del compartimento de los CN se asociaban con los resultados de supervivencia y la respuesta. Por ejemplo, los pacientes con altas proporciones de células CN9 dentro de los compartimentos estromales se asociaron con resultados de supervivencia favorables. Por el contrario, los pacientes con altas proporciones de células CN2 (mezcla heterogénea de células tumorales, células endoteliales, neutrófilos, células T de memoria y CAF) dentro de la interfaz tumoral estromal (TSI) se asociaron con peores resultados de supervivencia (Fig. 4g, h). Los análisis exploratorios adicionales sugirieron que, a pesar de proporciones similares de células T, el CN9 se enriqueció con células T CD8+ y asociaciones de citocinas favorables, mientras que el CN2 se correlacionó con perfiles de citocinas pro-tumorales (Fig. Sup. 9a, b). El análisis de ligandos y receptores (LR) indicó además que el CN9 activó vías de apoyo inmunitario, mientras que el CN2 se caracterizó por una señalización de adhesión y exclusión (Fig. Sup. 9c). Es interesante destacar que el CN10, que se componía principalmente de CAF, no moduló la respuesta al tratamiento en la misma medida y magnitud que el CN2 (OS dentro de la TSI, HR = 2,28, p = 0,196; DFS dentro de la TSI, HR = 1,76, p = 0,337) (Fig. 4i, j). Coherente con esto, los análisis de LR centrados en CAF sugirieron que su impacto se vio influenciado por la naturaleza de su señalización con socios inmunitarios y tumorales, con señales de apoyo inmunitario (por ejemplo, complemento, ICAM) más evidentes en los respondedores (Fig. Sup. 10).

Cambios dinámicos en el microambiente tumoral durante la terapia triple

Si bien las biopsias durante el tratamiento después del TMZ, pero antes de los ICIs, habrían sido ideales para evaluar los cambios en el TME, obtener tales muestras de pacientes con cáncer avanzado y refractario resultó ser un desafío. Sin embargo, pudimos obtener muestras de biopsia durante el tratamiento con la terapia triple de tres pacientes, lo que podría ofrecer algunas ideas sobre estas dinámicas. Teniendo en cuenta la valiosa naturaleza de estas muestras, si bien Lunaphore ofreció una caracterización integral del TME a nivel de proteínas, su limitación a unos pocos marcadores de proteínas requirió un enfoque complementario. La plataforma 10X Visium sirvió para cerrar esta brecha al combinar los análisis de expresión de ARN dirigidos de GeoMx con las capacidades de perfilado del TME más amplias de Lunaphore, proporcionando una visión multifacética del microambiente tumoral. Realizamos una transcriptómica espacial de Visium en 11 muestras de tejido de 7 pacientes tratados con la combinación triple (3 no respondedores, 4 respondedores, con 3 muestras postratamiento emparejadas de 3 de los 4 respondedores). Cada sección de tejido se analizó a una resolución de más de 4500 puntos espaciales con código de barras, y cada punto capturó información transcriptómica de aproximadamente 1-10 células. Las regiones tumorales y estromales se identificaron utilizando un enfoque de aprendizaje automático supervisado guiado por un patólogo implementado en QuPath, lo que proporcionó una mayor precisión de segmentación en comparación con los enfoques de agrupación no supervisados, como BayesSpace. La validación del compartimento se respaldó con el enriquecimiento tumoral específico de transcritos epiteliales (por ejemplo, EPCAM) (Fig. 5a-c).

En la línea de base, el análisis de abundancia de células derivado de UCell mostró patrones de abundancia celular similares entre los respondedores y los no respondedores en los diferentes compartimentos. Se observó un mayor enriquecimiento de fibroblastos y células inmunitarias, como las células T CD8+, dentro del estroma en relación con las regiones tumorales en todas las muestras, lo que es consistente con un fenotipo inmunitario excluido característico del cáncer colorrectal MSS (Fig. 5d). Los análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes revelaron diferencias específicas del compartimento y de la respuesta. En los no respondedores, los compartimentos tumorales mostraron una sobreexpresión de las vías de TNFα-NF-κB y de respuesta inflamatoria. El estroma de estos pacientes también demostró firmas elevadas de EMT y remodelación metabólica, lo que es consistente con un microambiente inmunitario excluido (Fig. 5e). Estos hallazgos son consistentes con nuestros análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes anteriores que utilizan datos de DSP, que también identificaron EMT y la inflamación impulsada por TNFα en los no respondedores. En conjunto con los análisis de inmunohistoquímica multiplex anteriores que mostraron una menor infiltración inmunitaria en los tumores de los no respondedores, estos resultados sugieren que los programas transcripcionales inflamatorios observados en los no respondedores pueden reflejar la señalización intrínseca del tumor en lugar de una interacción efectiva de las células inmunitarias.

Para examinar los patrones espaciales de la señalización de las citocinas y la composición celular, calculamos perfiles de expresión suavizados mediante LOESS para las citocinas y las puntuaciones de células CD8⁺ T y fibroblastos derivadas de UCell a lo largo de un gradiente continuo tumor-estroma. Este gradiente se definió mediante la distancia euclidiana más corta desde cada punto al punto más cercano en el compartimento opuesto, utilizando un enfoque de vecino más cercano con distancias positivas asignadas a los puntos estromales y distancias negativas a los puntos tumorales. Los gradientes de citocinas se analizaron exclusivamente dentro del compartimento estromal, donde la heterogeneidad espacial es más pronunciada y la señalización de las citocinas es más probable que influya en el posicionamiento de las células inmunitarias. En la línea de base, los pacientes que respondieron al tratamiento mostraron un mayor enriquecimiento peritumoral de los transcritos CXCL12, CCL2 y CXCL9, lo que sugiere un entorno estromal más permisivo para el sistema inmunitario. En contraste, los pacientes que no respondieron al tratamiento mostraron niveles elevados de transcritos de TGFB1 de forma difusa, lo que es consistente con la exclusión inmunitaria. Después del tratamiento, los pacientes que respondieron al tratamiento demostraron un aumento de la expresión estromal de CCL2, CXCL9 y CXCL10, lo que posiblemente refleja una señalización quimiotáctica persistente, aunque la abundancia de células CD8⁺ T se mantuvo en gran medida sin cambios (Fig. 5g).

Las puntuaciones de abundancia de células CD8⁺ T, evaluadas a lo largo del gradiente tumor-estroma, fueron generalmente similares entre los pacientes que respondieron y los que no, con intervalos de confianza superpuestos y solo una ligera tendencia hacia un mayor enriquecimiento intratumoral y distal en el estroma en los pacientes que respondieron. En contraste, las puntuaciones de fibroblastos mostraron una divergencia espacial más pronunciada: los pacientes que no respondieron al tratamiento demostraron consistentemente una mayor abundancia de fibroblastos en todo el gradiente tumor-estroma en la línea de base. Las comparaciones pre y postratamiento se limitaron a los pacientes que respondieron, en quienes la terapia se asoció con una reducción de la densidad de fibroblastos intratumorales y un aumento de la abundancia de fibroblastos en el estroma, lo que sugiere una reorganización espacial. Estos hallazgos sugieren que la remodelación espacial de los fibroblastos, en lugar de la redistribución de las células CD8⁺ T, puede asociarse más prominentemente con la respuesta al tratamiento. Sin embargo, dado el carácter exploratorio de este análisis basado en gradientes, el tamaño limitado de la muestra y la ausencia de datos longitudinales en los pacientes que no respondieron, estos hallazgos deben interpretarse con cautela (Fig. 5h).

Para aproximar los cambios en los subconjuntos de células CD8⁺ T intratumorales en el conjunto de datos de Visium, evaluamos los correlatos transcripcionales de la disfunción de las células T utilizando la puntuación de disfunción derivada de TIDE^[23]. Este modelo incorpora múltiples marcadores de agotamiento canónicos (por ejemplo, PDCD1, TIGIT, CTLA4, LAG3, IFNG) y se ha validado como un indicador de la disfunción de las células CD8⁺ T en el microambiente tumoral. Aunque las puntuaciones fueron numéricamente más altas dentro de la región tumoral después del tratamiento en los pacientes que respondieron, la diferencia no fue estadísticamente significativa. Cabe destacar que solo se dispuso de muestras postratamiento para tres pacientes, todos ellos pacientes que respondieron, lo que limitó nuestra capacidad para comparar las diferencias entre los pacientes que respondieron y los que no (Fig. S11a).

En paralelo, examinamos los gradientes espaciales de la expresión de CD8A, PDCD1, TIGIT, CTLA4 y LAG3 a lo largo del eje tumor-estroma. Después del tratamiento, observamos un aumento difuso en la expresión de estos marcadores, particularmente dentro del compartimento estromal. Si bien estos transcritos a menudo se asocian con el agotamiento de las células T, también se inducen durante la activación de las células T, lo que se apoya aquí mediante el aumento concomitante de la expresión de GZMB y MKI67. En conjunto, estos patrones son consistentes con la reactivación inmunitaria y la remodelación post-ICI del compartimento de células CD8⁺ T. Dado el número limitado de muestras emparejadas, estos hallazgos son generadores de hipótesis y requieren una validación adicional en cohortes más grandes (Fig. S11b).

Resultados clínicos favorables del ensayo MAYA en cáncer colorrectal MSS refractario con silenciamiento de MGMT

Entre el 22 de marzo de 2019 y el 1 de noviembre de 2020, se preseleccionaron 716 pacientes con cáncer colorrectal MSS refractario al tratamiento, 204 (28,5%) eran molecularmente elegibles (silenciamiento de MGMT) y un total de 135 pacientes se incluyeron y comenzaron el tratamiento con TMZ en monoterapia (Fig. 1a). Entre estos, 33 pacientes (24,4%) lograron el control de la enfermedad y comenzaron la segunda parte del ensayo; estos pacientes recibieron tratamiento con la combinación triple de ipilimumab, nivolumab más TMZ. El análisis primario se basó en una fecha de corte de datos del 17 de diciembre de 2021 y se ha publicado previamente^[12]. Aquí presentamos el análisis final del estudio en la fecha de corte de datos del 1 de mayo de 2023. Todos los puntos finales clínicos se informan en los pacientes que se incluyeron en la segunda parte del ensayo, según lo definido en el protocolo. En el momento de este análisis, todos los pacientes habían interrumpido el tratamiento del estudio. El diagrama de flujo actualizado se muestra en el material suplementario y las razones de la interrupción del tratamiento fueron: progresión de la enfermedad en 23 pacientes, muerte en 3 pacientes, evento adverso en 1 paciente y solicitud del paciente/decisión médica en 6 pacientes (Fig. S1). La mediana de la duración del seguimiento para la supervivencia de los pacientes que recibieron la combinación triple fue de 35,8 meses (RIC 29,7-40,1). La combinación triple resultó en una mediana de SCP de 7,1 meses (IC del 95%: 5,6-8,4), mediana de supervivencia global (SG) de 19,9 meses (IC del 95%: 15,0-no alcanzado [NA]) (Fig. 1b, c) y mediana de duración de la respuesta (DOR) de 8,1 meses (IC del 95%: 5,8-NA) (Fig. 1d-f).

Análisis multiómicos del cáncer colorrectal MSS con silenciamiento de MGMT tratado con ICI

Para estudiar los determinantes moleculares y celulares de los pacientes que respondieron frente a los que no, realizamos análisis multiómicos en tejidos tumorales y muestras de sangre periférica. En total, se dispuso de muestras traslacionales de 28 pacientes tratados con la combinación triple de TMZ e ICI (28/33, 84,8%). Los 28 pacientes tenían muestras tumorales de la línea de base, con un total de 39 muestras de tejido y 63 muestras de sangre periférica (Fig. 1a, 2a, b). Primero, examinamos la correlación entre los biomarcadores genómicos y la respuesta a la combinación triple (Fig. 2c) y no encontramos diferencias en los patrones de mutación (Fig. 2d, prueba exacta de Fisher p > 0,05 para todas las comparaciones) y la carga mutacional tumoral (Fig. 2e, prueba t, p = 0,87) entre los pacientes que respondieron y los que no en la línea de base. Coherente con la evidencia preclínica^[9], los cambios en la carga mutacional tumoral (CMT) después del tratamiento con TMZ e ICI demostraron una correlación positiva con la supervivencia libre de progresión (SLP) (r de Pearson = 0,863, p = 0,0598 [n = 5]). Si bien este hallazgo se basa en un tamaño de muestra limitado, apoya que los aumentos en la CMT después del tratamiento se asocian con un control duradero de la enfermedad (Fig. 2f). Un estudio previo de Crisafulli et al. identificó una firma de mutación de agentes alquilantes distinta en tumores previamente tratados con TMZ, lo que se asoció con la estabilización de la enfermedad después del bloqueo del punto de control inmunitario^[8]. En nuestra cohorte, los pacientes con la firma a niveles clonales, correspondiente al subtipo B2 definido por Crisafulli et al., mostraron una tendencia no significativa hacia una mayor supervivencia libre de progresión en comparación con aquellos sin la firma (prueba de Wilcoxon, p = 0,12; Fig. S2a-d).

Caracterización espacial de las firmas transcripcionales predictivas del beneficio de la inmunoterapia

Si bien la CMT es un biomarcador establecido para predecir la respuesta a la ICI, los estudios han demostrado que la CMT por sí sola no es suficiente para explicar completamente la variabilidad en los resultados clínicos^[16]. Para explorar determinantes adicionales de la respuesta, analizamos el paisaje transcripcional del microambiente tumoral utilizando el secuenciamiento de ARN masivo y aplicamos métodos establecidos de deconvolución de células inmunitarias para estimar las abundancias relativas de los subconjuntos de células inmunitarias en toda la cohorte. Este análisis no reveló diferencias obvias en las proporciones de las principales poblaciones inmunitarias, incluidas las células CD8⁺ T, las células B o los macrófagos, entre los pacientes que respondieron y los que no en la línea de base, lo que sugiere que los niveles generales de infiltración inmunitaria eran ampliamente comparables (Fig. S3). Dadas las posibles limitaciones de los enfoques de perfilamiento masivo, que no capturan las relaciones espaciales, los estados funcionales o las interacciones celulares dentro del microambiente tumoral, aplicamos técnicas de perfilamiento espacial para evaluar si la distribución espacial de las células inmunitarias y no inmunitarias podría aportar información adicional sobre los mecanismos de respuesta y resistencia.

Realizamos un perfilamiento espacial digital (DSP; GeoMx, Nanostring Technologies) en muestras tumorales de la línea de base de 16 pacientes (8 respondedores, 8 no respondedores). Las láminas se tiñeron con PanCK (células epiteliales), CD45 (células inmunitarias) y SMA (estroma) para guiar la selección de regiones de interés (ROI). Dentro de cada muestra tumoral, seleccionamos ROI en el núcleo tumoral, la interfaz tumoral y el tejido normal adyacente (Fig. 3a). Las ROI se segmentaron aún más en compartimentos tumorales y estromales (Fig. 3a), lo que resultó en un total de 390 áreas de iluminación (AOI) y, después del control de calidad, se utilizaron 328 AOI para los análisis posteriores (Métodos).

El análisis de agrupamiento no supervisado de las áreas de interés (AOI) reveló una clara distinción entre los compartimentos tumoral y estromal, independientemente del estado de respuesta o de los efectos de lote (Fig. Supl. 4). Los compartimentos se caracterizaron por genes específicos, como EPCAM y KRT8 para el tumor, y COL4A1 y COL4A2 para el estroma (Fig. Supl. 4b). Para evaluar las diferencias específicas de cada compartimento, comparamos las proporciones de células inmunitarias y el enriquecimiento de conjuntos de genes entre los compartimentos tumoral y estromal de los pacientes que respondieron y los que no. Tanto las AOI tumorales como las estromales de los pacientes que respondieron mostraron mayores proporciones de células T CD8+ de memoria y células B de memoria (Fig. 3b), además del enriquecimiento de vías relacionadas con el reconocimiento inmunitario y la actividad de eliminación relacionada con el sistema inmunitario (Fig. 3c), en comparación con los pacientes que no respondieron, lo que sugiere un reconocimiento tumoral eficaz en los pacientes que respondieron. A continuación, realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) para evaluar las características generales de los compartimentos tumoral y estromal. En comparación con las AOI correspondientes de los pacientes que no respondieron, las AOI tumorales de los pacientes que respondieron se enriquecieron en conjuntos de genes relacionados con la proliferación celular (por ejemplo, ‘objetivos de MYC v1/v2’, ‘husillo mitótico’ y ‘señalización de mTORC1’), mientras que las AOI estromales de los pacientes que respondieron mostraron un enriquecimiento en conjuntos de genes relacionados con la defensa inmunitaria y la inflamación (por ejemplo, ‘respuesta a interferón gamma’, ‘respuesta inflamatoria’, ‘apoptosis’) (Fig. 3d). Por el contrario, las AOI tumorales de los pacientes que no respondieron se enriquecieron en conjuntos de genes relacionados con la transición epitelio-mesenquimal (EMT) (por ejemplo, ‘transición epitelio-mesenquimal’, ‘señalización de TNFA’, ‘angiogénesis’ y ‘hipoxia’), con solo el conjunto de genes de ‘señalización de Wnt/β-catenina’ enriquecido en las AOI estromales de los pacientes que no respondieron (Fig. 3d). Estos hallazgos resaltan el papel de la activación y el compromiso inmunitario dentro del microambiente tumoral como factores clave que contribuyen a la respuesta terapéutica, diferenciando a los pacientes que responden de los que no, por su respuesta inmunitaria más robusta y eficaz.

El análisis de la expresión génica diferencial arrojó resultados que sugieren procesos biológicos que podrían explicar potencialmente el aumento de la inmunogenicidad inducida por TMZ y la mejora de la respuesta a los inhibidores del punto de control inmunitario (ICIs) en los pacientes que respondieron (Fig. Supl. 5). En el compartimento tumoral, la regulación al alza de genes como LCN2^[17] y PLA2G2A^[18] sugiere que los pacientes que responden pueden tener un microambiente tumoral inflamatorio o estresado preexistente, lo que podría hacer que estos tumores sean más susceptibles al estrés y la inmunogenicidad adicionales inducidos por TMZ. Los tumores que exhiben una mayor inflamación o activación inmunitaria basal pueden ser más propensos a generar neoantígenos o exponer antígenos específicos del tumor tras el daño del ADN causado por TMZ, lo que conduce a un mayor reconocimiento inmunitario cuando se introducen los ICIs. En el compartimento estromal, la regulación al alza de genes relacionados con el sistema inmunitario, como CXCL9, CXCL8 y las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II, sugiere un estado inmunitario basal activado. CXCL9 y CXCL8 son quimiocinas esenciales para el reclutamiento de células inmunitarias efectoras, como las células T y los neutrófilos, y su mayor expresión puede indicar que los pacientes que responden ya tienen un microambiente inmunológicamente favorable^[19]. La presencia de HLA-DQA1 y HLA-DQB1, que están involucrados en la presentación de antígenos, sugiere que los pacientes que responden pueden tener capacidades de vigilancia inmunitaria más eficaces en la línea de base, lo que podría conducir a una respuesta inmunitaria más robusta a los neoantígenos inducidos por TMZ y al tratamiento posterior con ICIs.

Estas características basales sugieren que los pacientes que responden tienen un microambiente tumoral más preparado para el compromiso inmunitario, lo que podría explicar sus mejores resultados con la terapia combinada de TMZ e ICIs. La presencia inherente de vías inflamatorias, de reclutamiento inmunitario y de presentación de antígenos en los tumores de los pacientes que responden probablemente facilita una respuesta más fuerte a la inmunogenicidad inducida por TMZ y a los efectos inmunoactivadores posteriores de los ICIs.

Paisajes inmunitarios distintos entre los pacientes que responden y los que no en MAYA

Si bien la plataforma DSP ofrece análisis transcriptómicos espaciales dirigidos, su selección limitada de regiones de interés (ROI) y la necesidad de la deconvolución celular restringen la caracterización integral del microambiente tumoral (TME), mientras que la tecnología de inmunofluorescencia secuencial (seqIF) hipercompleja de la plataforma Lunaphore COMET™ permite una evaluación más amplia y menos sesgada del paisaje del TME a nivel de célula única. Realizamos imágenes de inmunofluorescencia hipercompleja en muestras de tejido de 26 pacientes: 15 tratados con TMZ e ICIs (7 pacientes que respondieron a la terapia triple, 8 pacientes que no respondieron a la terapia triple) y 11 pacientes que progresaron después de 2 meses de tratamiento con TMZ y no recibieron ICIs (TMZ solo). Evaluamos la expresión de 20 proteínas relevantes para el TME, incluidas la citoqueratina, CD4, CD8, CD68, PD-L1, PD-1, granzima B y Ki67 a nivel de célula única (Tabla Supl. 1). Se determinaron los umbrales de positividad para cada marcador. Dentro de cada muestra, seleccionamos las AOI y las anotamos como: tumor, interfaz tumor-estromal (TSI) o estroma (Fig. Supl. 6a), lo que dio un total de 1891 AOI (804 de TMZ solo, 567 de pacientes que no respondieron a la terapia triple, 520 de pacientes que respondieron a la terapia triple). El número medio de células únicas detectadas fue de 119.852 por muestra y 1613 por AOI. Los tipos de células se asignaron en función de la expresión combinatoria de marcadores, utilizando marcadores definitorios de linaje, específicos de subtipo y de exclusión para delimitar los compartimentos inmunitario, estromal y tumoral (Tabla Supl. 1). Las células tumorales, definidas como células CK+/CD45-/CD68-/CD11c-, estaban presentes en proporciones crecientes entre el estroma, la TSI y las regiones tumorales (Fig. Supl. 7a); el análisis de imágenes confirmó una mayor expresión de CK en las regiones tumorales (Fig. Supl. 6b).

Si bien la infiltración general de células T CD8+ fue baja tanto en los pacientes que respondieron como en los que no, lo que es consistente con el conocido fenotipo inmuno-frío del cáncer colorrectal con estabilidad de microsatélites (MSS), observamos un enriquecimiento estadísticamente significativo de las células T CD8+ dentro de las regiones tumorales y estromales en los pacientes que respondieron en comparación con los que no (Fig. Supl. 7b). No se observaron diferencias en las poblaciones de otras células inmunitarias (incluidas las células T CD4, los macrófagos CD68+ y las células dendríticas CD11c+) dentro de las regiones entre los pacientes que respondieron y los que no (Fig. Supl. 7c, d). Comparamos las proporciones de los diferentes subtipos de células inmunitarias presentes dentro del núcleo tumoral, la TSI y el estroma (normalizadas al recuento total de células por AOI), centrándonos en los estados celulares que coexpresan. Observamos mayores proporciones de células CD8+ GzmB+ citotóxicas activadas y células CD8+ Ki67+ proliferativas dentro de la TSI, así como en las regiones del núcleo tumoral, en los pacientes que respondieron en comparación con los que no (Fig. 4a, b, Fig. Supl. 6c). Estos hallazgos, observados en muestras previas al tratamiento, son consistentes con estudios previos que demuestran que una mayor densidad de células T citotóxicas y de memoria infiltrantes en el tumor, particularmente en compartimentos espacialmente relevantes, se asocia con un mejor pronóstico en el cáncer colorrectal^[20], ^[21].

Para proporcionar una evaluación más completa del TME, ampliamos nuestro análisis más allá de la abundancia de tipos de células específicas del compartimento, incorporando análisis espaciales de las relaciones celulares en los tres grupos (pacientes que respondieron a la terapia triple, pacientes que no respondieron a la terapia triple y pacientes que recibieron TMZ solo) (Fig. 4c). Específicamente, analizamos la proximidad espacial de las células adyacentes dentro del compartimento tumoral en la línea de base, centrándonos en un radio de 20 μm desde las células tumorales dentro de los compartimentos tumorales de las muestras de la línea de base, para evaluar cómo interactúan los elementos inmunitarios y estromales^[22]. Coherente con el paisaje inmunitario escaso característico del cáncer colorrectal MSS, observamos pocas células inmunitarias adaptativas efectoras, incluidas las células T CD8 y las células B, en contraste con las células inmunosupresoras, como los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) y las células inmunitarias adaptativas de memoria, como las células T de memoria (Fig. 4d). Es interesante destacar que una mayor infiltración de CAF dentro de los compartimentos tumorales se asocia con una mala respuesta a TMZ solo y, posteriormente, a los ICIs. Por el contrario, una mayor infiltración de células T de memoria dentro de las células tumorales se asoció con una buena respuesta a los ICIs.

También buscamos comprender cómo los tipos de células infiltrantes en el tumor influyeron en las células T CD8 efectoras dentro de los compartimentos tumorales. Evaluamos las distancias relativas de las células desde las células T CD8 y descubrimos que la proximidad relativa de las células T CD8 a los CAF en comparación con las células tumorales se asoció con una mala respuesta a TMZ solo, aunque no se alcanzó la significación estadística. De manera similar, la proximidad relativa de las células T CD8 a las células endoteliales se asoció con una peor respuesta (Fig. 4e, f).

El microambiente tumoral (TME) funciona como una entidad integrada, donde los distintos grupos de células inmunitarias interactúan para coordinar las respuestas antitumorales. Como tal, empleamos algoritmos de agrupamiento espacialmente resueltos descritos previamente por Schürch et al.^[20] para recuperar la información de vecindad celular (CN). Nuestros análisis demostraron que los CN diferían en el repertorio y la diversidad de las células inmunitarias. Por ejemplo, se descubrió que el CN7 comprendía predominantemente células tumorales (98,6%) con baja diversidad de células inmunitarias (índice de Shannon = 0,097). En contraste, se descubrió que el CN2 y el CN9 tenían una alta diversidad de células inmunitarias (CN2, índice de Shannon = 1,715; CN9, índice de Shannon = 1,482) (Fig. 4g, h, Fig. Supl. 8).

Se descubrió que las proporciones comparativas específicas del compartimento de los CN se asociaban con los resultados de supervivencia y la respuesta. Por ejemplo, los pacientes con altas proporciones de células CN9 dentro de los compartimentos estromales se asociaron con resultados de supervivencia favorables. Por el contrario, los pacientes con altas proporciones de células CN2 (mezcla heterogénea de células tumorales, células endoteliales, neutrófilos, células T de memoria y CAF) dentro de la interfaz tumor-estromal (TSI) se asociaron con peores resultados de supervivencia (Fig. 4g, h). Los análisis exploratorios adicionales sugirieron que, a pesar de las proporciones similares de células T, el CN9 se enriqueció con células T CD8+ y asociaciones de citoquinas favorables, mientras que el CN2 se correlacionó con perfiles de citoquinas pro-tumorales (Fig. Supl. 9a, b). El análisis de ligandos y receptores (LR) indicó además que el CN9 involucró vías de apoyo inmunitario, mientras que el CN2 se caracterizó por una señalización de adhesión y exclusión (Fig. Supl. 9c). Es interesante destacar que el CN10, que se compuso principalmente de CAF, no moduló la respuesta al tratamiento en la misma medida y magnitud que el CN2 (OS dentro de la TSI, HR = 2,28, p = 0,196; DFS dentro de la TSI, HR = 1,76, p = 0,337) (Fig. 4i, j). Coherente con esto, los análisis de LR centrados en CAF sugirieron que su impacto se vio influenciado por la naturaleza de su señalización con socios inmunitarios y tumorales, con señales de apoyo inmunitario (por ejemplo, complemento, ICAM) más evidentes en los pacientes que respondieron (Fig. Supl. 10).

Cambios dinámicos en el microambiente tumoral durante la terapia triple

Si bien las biopsias durante el tratamiento después de TMZ, pero antes de los ICIs, habrían sido ideales para evaluar los cambios en el TME, obtener tales muestras de pacientes con cáncer avanzado y refractario resultó difícil. Sin embargo, pudimos obtener muestras de biopsia durante el tratamiento con la terapia triple de tres pacientes, lo que podría ofrecer algunas ideas sobre estas dinámicas. Teniendo en cuenta la valiosa naturaleza de estas muestras, si bien Lunaphore ofreció una caracterización integral del TME a nivel de proteínas, su limitación a unos pocos marcadores de proteínas requirió un enfoque complementario. La plataforma 10X Visium sirvió para cerrar esta brecha al combinar los análisis de expresión de ARN dirigidos de GeoMx con las capacidades de perfilado del TME más amplias de Lunaphore, proporcionando una visión multifacética del microambiente tumoral. Realizamos una transcriptómica espacial de Visium en 11 muestras de tejido de 7 pacientes tratados con la combinación triple (3 pacientes que no respondieron, 4 pacientes que respondieron, con 3 muestras postratamiento emparejadas de 3 de los 4 pacientes que respondieron). Cada sección de tejido se analizó a una resolución de más de 4500 puntos espaciales con código de barras, y cada punto capturó información transcriptómica de aproximadamente 1-10 células. Los compartimentos tumoral y estromal se identificaron mediante un enfoque de aprendizaje automático supervisado guiado por un patólogo implementado en QuPath, lo que proporcionó una mayor precisión de segmentación en comparación con los enfoques de agrupamiento no supervisados, como BayesSpace. La validación del compartimento se respaldó con el enriquecimiento tumoral específico de los transcritos epiteliales (por ejemplo, EPCAM) (Fig. 5a-c).

En la línea de base, el análisis de la abundancia celular derivada de UCell mostró patrones de abundancia celular similares entre los pacientes que respondieron y los que no, en los diferentes compartimentos. Se observó un mayor enriquecimiento de fibroblastos y células inmunitarias, como las células T CD8⁺, dentro del estroma en relación con las regiones tumorales en todas las muestras, lo que es consistente con un fenotipo de exclusión inmune característico del cáncer colorrectal con microsatélites estables (Fig. 5d). Los análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes revelaron diferencias específicas de compartimento y de respuesta. En los pacientes que no respondieron, los compartimentos tumorales mostraron una mayor expresión de las vías de TNFα-NF-κB y de respuesta inflamatoria. El estroma de estos pacientes también demostró una mayor expresión de firmas de EMT y remodelación metabólica, lo que es consistente con un microambiente de exclusión inmune (Fig. 5e). Estos hallazgos son consistentes con nuestros análisis previos de enriquecimiento de conjuntos de genes utilizando datos de DSP, que también identificaron EMT e inflamación impulsada por TNFα en los pacientes que no respondieron. En conjunto con los análisis previos de inmunohistoquímica multiplex que mostraron una menor infiltración inmune en los tumores de los pacientes que no respondieron, estos resultados sugieren que los programas transcripcionales inflamatorios observados en los pacientes que no respondieron pueden reflejar una señalización intrínseca del tumor en lugar de una activación eficaz de las células inmunitarias.

Para examinar los patrones espaciales de la señalización de las citocinas y la composición celular, calculamos perfiles de expresión suavizados por LOESS para las citocinas y las puntuaciones de células T CD8⁺ y fibroblastos derivadas de UCell a lo largo de un gradiente continuo tumor-estroma. Este gradiente se definió mediante la distancia euclidiana más corta desde cada punto al punto más cercano en el compartimento opuesto, utilizando un enfoque de vecino más cercano con distancias positivas asignadas a los puntos del estroma y distancias negativas a los puntos tumorales. Los gradientes de citocinas se analizaron exclusivamente dentro del compartimento del estroma, donde la heterogeneidad espacial es más pronunciada y es más probable que la señalización de las citocinas influya en la posición de las células inmunitarias. En la línea de base, los pacientes que respondieron mostraron un mayor enriquecimiento peritumoral de los transcritos de CXCL12, CCL2 y CXCL9, lo que sugiere un microambiente del estroma más permisivo para la inmunidad. En contraste, los pacientes que no respondieron mostraron una mayor expresión difusa de los niveles de transcritos de TGFB1, lo que es consistente con la exclusión inmune. Después del tratamiento, los pacientes que respondieron demostraron una mayor expresión del estroma de CCL2, CXCL9 y CXCL10, lo que posiblemente refleja una señalización quimiotáctica persistente, aunque la abundancia de células T CD8⁺ se mantuvo en gran medida sin cambios (Fig. 5g).

Las puntuaciones de abundancia de células T CD8⁺, evaluadas a lo largo del gradiente tumor-estroma, fueron generalmente similares entre los pacientes que respondieron y los que no, con intervalos de confianza superpuestos y solo una ligera tendencia hacia un mayor enriquecimiento intratumoral y distal del estroma en los pacientes que respondieron. En contraste, las puntuaciones de fibroblastos mostraron una divergencia espacial más pronunciada: los pacientes que no respondieron demostraron consistentemente una mayor abundancia de fibroblastos a lo largo del gradiente tumor-estroma en la línea de base. Las comparaciones pre y postratamiento se limitaron a los pacientes que respondieron, en quienes la terapia se asoció con una menor densidad de fibroblastos intratumorales y una mayor abundancia de fibroblastos en el estroma, lo que sugiere una reorganización espacial. Estos hallazgos sugieren que la remodelación espacial de los fibroblastos, en lugar de la redistribución de las células T CD8⁺, puede asociarse más prominentemente con la respuesta al tratamiento. Sin embargo, dado el carácter exploratorio de este análisis basado en gradientes, el tamaño limitado de la muestra y la ausencia de datos longitudinales en los pacientes que no respondieron, estos hallazgos deben interpretarse con cautela (Fig. 5h).

Para aproximar los cambios en los subconjuntos de células T CD8⁺ intratumorales en el conjunto de datos de Visium, evaluamos los correlatos transcripcionales de la disfunción de las células T utilizando la puntuación de disfunción derivada de TIDE^[23]. Este modelo incorpora múltiples marcadores de agotamiento canónicos (por ejemplo, PDCD1, TIGIT, CTLA4, LAG3, IFNG) y se ha validado como un indicador de la disfunción de las células T CD8⁺ en el microambiente tumoral. Aunque las puntuaciones fueron numéricamente más altas dentro de la región tumoral después del tratamiento en los pacientes que respondieron, la diferencia no fue estadísticamente significativa. Cabe destacar que solo se dispuso de muestras postratamiento para tres pacientes, todos ellos pacientes que respondieron, lo que limitó nuestra capacidad para comparar las diferencias entre los pacientes que respondieron y los que no (Fig. S11a).

En paralelo, examinamos los gradientes espaciales de la expresión de CD8A, PDCD1, TIGIT, CTLA4 y LAG3 a lo largo del eje tumor-estroma. Después del tratamiento, observamos un aumento difuso en la expresión de estos marcadores, particularmente dentro del compartimento del estroma. Si bien estos transcritos a menudo se asocian con el agotamiento de las células T, también se inducen durante la activación de las células T, lo que se apoya aquí mediante el aumento concomitante de la expresión de GZMB y MKI67. En conjunto, estos patrones son consistentes con la reactivación inmune y la remodelación post-ICI del compartimento de las células T CD8⁺. Dado el número limitado de muestras emparejadas, estos hallazgos son generadores de hipótesis y requieren una mayor validación en cohortes más grandes (Fig. S11b).

El perfilado inmunitario de la sangre periférica revela cambios dinámicos en respuesta a la inmunoterapia basada en temozolomida

Para complementar los análisis basados en tejidos y evaluar las respuestas inmunitarias sistémicas, realizamos una citometría de flujo multidimensional longitudinal en las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) recolectadas en tres puntos temporales: línea de base (antes del inicio de TMZ), después de dos ciclos de TMZ (post-TMZ) y después de dos ciclos de terapia triple (post-triple) (Fig. 6a). Se evaluaron muestras de sangre periférica de 18 pacientes tratados con la combinación triple para el perfilado inmunitario. Para cada inmunofenotipo, se evaluaron las diferencias en el número de células, así como la relación de cambio en las células inmunitarias presentes entre los puntos temporales, entre los pacientes que respondieron y los que no. Los cambios en las poblaciones celulares se compararon en un análisis pre-post.

El perfilado inmunitario periférico reveló diferencias mínimas en los estados de las células inmunitarias entre los pacientes que respondieron y los que no en la mayoría de los puntos temporales. En particular, las células CD8⁺TIGIT⁺ se enriquecieron significativamente en los pacientes que no respondieron en el punto temporal post-triple, lo que sugiere una posible asociación con la resistencia terapéutica al régimen combinado (Fig. S12a-d). Para complementar las comparaciones transversales, los análisis basados en trayectorias que se centran en los cambios intra-paciente identificaron un aumento en las poblaciones de células T agotadas, particularmente las células CD8⁺TIGIT⁺ y las células CD4⁺PD-1⁺, después de la exposición a TMZ como un predictor de una respuesta deficiente (AUROC: 0,850 [IC del 95%: 0,605-1,000] y 0,800 [IC del 95%: 0,548-1,000] respectivamente) (Fig. 6b, c). Las comparaciones a nivel del paciente emparejado demostraron además que los fenotipos de agotamiento post-TMZ elevados se asociaron con una menor supervivencia libre de progresión y supervivencia general (Fig. 6d). Esto se alinea con las observaciones establecidas que vinculan el agotamiento de las células T con la disminución de la eficacia de los inhibidores del punto de control inmunitario^[24]. Si bien la composición inmune periférica post-TMZ es heterogénea, el perfilado longitudinal de los marcadores de agotamiento puede proporcionar indicadores tempranos de resistencia a la inmunoterapia posterior.

Discusión

El ensayo MAYA cumplió con su objetivo primario, demostrando que TMZ en combinación con ipilimumab y nivolumab a dosis bajas induce un beneficio clínico duradero con una mediana de SLP de 7,1 meses y una mediana de SG de 19,1 meses en pacientes con CRC con pMMR/MSS y MGMT silenciado. Los resultados se confirmaron en este análisis final con una mediana de seguimiento de 35,8 meses, donde se confirmó la durabilidad de las respuestas. Aunque estos resultados deben interpretarse con cautela, dado que provienen del subgrupo de pacientes que no progresaron después de 2 meses de TMZ y entraron en la parte 2 del protocolo del ensayo MAYA, los resultados de supervivencia son notablemente impresionantes y sostenidos en comparación con los pacientes con CRC con MGMT silenciado tratados con TMZ solo. La monoterapia con TMZ se ha asociado con una mediana de SLP y SG de 1,8 y 8,4 meses, respectivamente^[7], que son modestos en comparación con los resultados que se observan típicamente en estudios realizados en cáncer de CRC refractario al tratamiento^[25]-^[28]. Otros grupos también han intentado varias estrategias de combinación de IO en cáncer colorrectal con MSS con diversos grados de éxito^[29]-^[33]. En conjunto, la estrategia de combinación MAYA arrojó resultados positivos en cánceres que normalmente no responden a la inmunoterapia. Por lo tanto, varios grupos de investigación están planeando desarrollar aún más la estrategia MAYA y trasladarla a líneas de tratamiento más tempranas^[34].

Anteriormente, informamos un aumento en la carga mutacional tumoral (TMB) en las muestras de biopsia postratamiento de pacientes con SLP prolongada (>8 meses) después del régimen triple^[12]. Aquí, demostramos hallazgos consistentes que destacan que, si bien la TMB de la línea de base no influyó en la respuesta al tratamiento, los aumentos inducidos por el tratamiento en la TMB se correlacionan positivamente con la SLP. Estos hallazgos sugieren que los aumentos dinámicos en la TMB pueden servir como un posible biomarcador de respuesta a TMZ e ICI. Para lograr una utilidad clínica significativa, sin embargo, la TMB idealmente debe medirse después de la exposición a TMZ y antes de la inmunoterapia. Dada la preocupación práctica y de seguridad con las biopsias tumorales seriadas, un enfoque prometedor sería el monitoreo no invasivo de la TMB a través del ADN tumoral circulante (ctDNA), lo que podría permitir una evaluación en tiempo real de la hipermutación e informar la selección de tratamiento personalizado. Sin embargo, algunos estudios han sugerido que la TMB medida a partir del ctDNA (bTMB) puede no ser directamente concordante con la TMB basada en tejidos (tTMB); se observaron asociaciones discordantes entre bTMB y los resultados clínicos^[35], lo que posiblemente refleja la heterogeneidad tumoral en lugar de la carga mutacional pura^[36]. Por lo tanto, si bien el ctDNA ofrece una alternativa mínimamente invasiva para rastrear la hipermutación inducida por el tratamiento, la interpretación de bTMB debe considerar posibles factores de confusión por la carga tumoral, la subclonalidad y las limitaciones técnicas específicas del ensayo.

Para caracterizar aún más los mecanismos subyacentes a la respuesta y la resistencia terapéuticas, realizamos un perfilado transcripcional espacial y un perfilado inmunitario periférico integrales. El perfilado espacial utilizando la transcriptómica de DSP reveló que los pacientes que respondieron exhibieron un enriquecimiento inmunitario específico del compartimento, incluido un mayor porcentaje de células T CD8⁺ de memoria y células B, y una mayor expresión de genes efectores inmunitarios tanto en los compartimentos tumoral como del estroma. Los pacientes que respondieron también demostraron una mayor expresión basal de genes inflamatorios y de presentación de antígenos (por ejemplo, CXCL9, HLA-DQA1) y una menor expresión de firmas de EMT y TNFα-NF-κB, lo que apoya la hipótesis de que un microambiente inmunitario preexistente permisivo sustenta el beneficio terapéutico.

En paralelo, el análisis de inmunohistoquímica multiplex y la proximidad celular reveló que los pacientes que respondieron albergaron células T CD8⁺GzmB⁺ y CD8⁺Ki67⁺ localizadas espacialmente en la interfaz tumor-estroma, así como en las regiones del núcleo tumoral. Esto es consistente con los datos de varios estudios que demuestran el impacto pronóstico de la distribución espacial de las células T CD8⁺ en múltiples cánceres, incluido el cáncer colorrectal^[37]-^[41]. En particular, la estrecha proximidad de las células T CD8⁺ a los elementos del estroma, como las células endoteliales y los CAF, se asoció con una mala respuesta al tratamiento. La influencia inmunosupresora de los CAF, sin embargo, parecía ser dependiente del contexto. Los vecindarios enriquecidos con CAF solos no impactaron significativamente en la supervivencia, mientras que los análisis de ligandos y receptores centrados en CAF sugirieron que interacciones de señalización específicas con las células tumorales e inmunitarias se correlacionaron con la respuesta al tratamiento. En consonancia con los datos de numerosos estudios^[42]-^[44], estas observaciones implican que la exclusión inmune impulsada por CAF y las células endoteliales puede ser un contribuyente potencial a la resistencia y subraya el papel de la arquitectura del estroma en la configuración de los resultados del tratamiento.

Una limitación de nuestro estudio es la falta de muestras de biopsia seriadas, específicamente en los momentos posteriores al tratamiento con TMZ y previos a la inmunoterapia, lo que habría proporcionado una mayor claridad sobre las contribuciones relativas de cada componente del tratamiento a la modificación del contexto inmunitario. Además, pocos pacientes contaron con un número suficiente de muestras de biopsia obtenidas durante el tratamiento para realizar análisis correlativos. Solo se dispuso de muestras pareadas, obtenidas antes y después del tratamiento, en 3 pacientes, todos ellos respondedores. No obstante, el análisis espacial de estas muestras pareadas mediante Visium demostró un enriquecimiento constante de las puntuaciones de las células inmunitarias dentro de los compartimentos estromales en todos los subconjuntos inmunitarios, acompañado de un aumento de fibroblastos, macrófagos y células endoteliales, así como de una mayor actividad inmunitaria en el análisis GSEA. Se observó una expresión estromal persistente de citocinas quimiotácticas (CCL2, CXCL9, CXCL10) y una reorganización espacial de los fibroblastos, caracterizada por una reducción de la densidad de fibroblastos intratumorales y un aumento de la densidad de fibroblastos estromales, en los pacientes respondedores, lo que sugiere que la remodelación de los fibroblastos puede estar más estrechamente asociada con el beneficio terapéutico que la redistribución de las células T CD8⁺. Aunque se observaron aumentos en los marcadores de disfunción y activación de las células T CD8⁺ (por ejemplo, PDCD1, TIGIT, GZMB, MKI67) después del tratamiento, estos análisis se limitaron a un pequeño número de muestras pareadas de pacientes respondedores; por lo tanto, los resultados son exploratorios y requieren validación en cohortes más amplias con muestras obtenidas longitudinalmente. Otra limitación es que los ensayos de transcriptómica espacial (GeoMx y Visium) se realizaron en un número limitado de muestras y no se superpusieron completamente en los mismos pacientes, lo que refleja las limitaciones prácticas de la disponibilidad de tejido en los ensayos clínicos. No obstante, se aplicó de forma más amplia el perfilado espacial proteómico de alta dimensión (Lunaphore COMET™ seqIF), y la integración de plataformas complementarias de transcriptómica y proteómica espacial proporcionó información complementaria, con tendencias consistentes en los diferentes ensayos, lo que aumenta la confianza en la solidez de nuestros resultados.

Para complementar los hallazgos espaciales y evaluar la dinámica inmunitaria sistémica, realizamos un perfilado inmunitario periférico longitudinal en una cohorte más amplia. Este análisis identificó un enriquecimiento de las células T CD8⁺ agotadas TIGIT⁺ en los pacientes no respondedores después de la exposición a TMZ. Los aumentos tempranos en los marcadores de agotamiento, como TIGIT y PD-1, predijeron la resistencia a la inmunoterapia posterior. Se están planificando ensayos en todo el mundo para evaluar la adición de la co-inhibición de PD-1 y TIGIT a la terapia de primera línea estándar en el CRC metastásico, lo que destaca el creciente interés en esta estrategia terapéutica.

En conjunto, estos resultados del perfilado de la transcriptómica espacial y el perfilamiento inmunitario periférico proporcionan información complementaria sobre los mecanismos subyacentes a la respuesta y la resistencia terapéuticas. La activación inmunitaria basal y la reducción de los programas mesenquimales dentro del microambiente tumoral (TME) se correlacionan con el beneficio posterior, mientras que la aparición temprana de estados de agotamiento de las células T en la sangre periférica después del tratamiento con TMZ puede predecir la resistencia a la inhibición posterior de los puntos de control inmunitarios. Aunque se basa en un número limitado de muestras, esta cohorte única de un ensayo clínico permitió un análisis multi-ómico integrado que proporciona información mecanicista y genera hipótesis para su validación en estudios prospectivos más amplios. Nuestras observaciones enfatizan el valor de los enfoques multi-ómicos integrados para dilucidar la compleja interacción entre las características intrínsecas del tumor, la dinámica local del TME y las adaptaciones inmunitarias sistémicas durante la terapia.

Si bien el ensayo MAYA demostró resultados prometedores en una población de pacientes con un desafío clínico, nuestros análisis espaciales multi-ómicos destacan la complejidad del microambiente inmunitario tumoral y su papel en la determinación de la respuesta a la inmunoterapia basada en TMZ. Los estudios futuros deben centrarse en dilucidar los mecanismos que subyacen a la exclusión de las células T en los pacientes no respondedores. Es crucial realizar una mayor investigación sobre la dinámica temporal de la infiltración inmunitaria y la expresión de biomarcadores, especialmente después del tratamiento con TMZ y antes de la inmunoterapia, para comprender cómo este régimen prepara el tumor para la inmunoterapia. Además, los ensayos que incorporen otros inhibidores de puntos de control novedosos, como los agentes anti-TIGIT, pueden ofrecer una estrategia para prevenir o retrasar la resistencia a la inmunoterapia combinada. Finalmente, la exploración del potencial de las nuevas terapias combinadas que se dirijan directamente al TME supresor junto con TMZ e ICIs podría mejorar aún más la eficacia del tratamiento en el cáncer colorrectal MSS. En general, creemos que el éxito futuro de las estrategias de inmunoterapia requerirá una cuidadosa selección de pacientes basada en las características del TME y que los nuevos ensayos de perfilamiento espacial se integren de forma prospectiva en los ensayos clínicos para guiar el desarrollo inteligente de fármacos y evitar nuevos fracasos al investigar combinaciones prometedoras en pacientes no seleccionados.

Métodos

Cohorte de pacientes y muestras

El estudio MAYA fue un estudio de fase II, de un solo brazo, no aleatorizado y no cegado, que evaluó el uso de temozolomida, nivolumab más ipilimumab en pacientes con cáncer colorrectal metastásico refractario, con estabilidad de microsatélites y silenciamiento de MGMT (NCT03832621). Los pacientes fueron incluidos en la parte 1 del estudio, donde recibieron 2 ciclos de temozolomida. De estos, los pacientes que demostraron respuesta o enfermedad estable al tratamiento con temozolomida en monoterapia pasaron a la parte 2 para recibir tratamiento con nivolumab + ipilimumab + temozolomida (Fig. 2a). Los detalles de los criterios de elegibilidad de los pacientes y los procedimientos del estudio se han publicado previamente ^[12]. El tamaño de la muestra se calculó en base al punto final primario de la tasa de respuesta al PFS a los 8 meses. Según nuestros resultados previamente publicados [7, 45], el PFS de los pacientes con CRC metastásico con silenciamiento de MGMT y beneficio clínico del tratamiento con temozolomida en monoterapia es casi siempre 70% y detección de ≥20.000 genes únicos por muestra. La calidad y consistencia de las muestras se evaluaron además mediante el análisis de la correlación intermuestral y la visualización de los patrones de agrupamiento mediante análisis de componentes principales (PCA) y diagramas de escalamiento multidimensional (MDS). Las muestras identificadas como valores atípicos o que no cumplían los umbrales de calidad se excluyeron de los análisis posteriores.

Para estimar la abundancia relativa de los tipos de células inmunitarias y estromales, los datos de expresión génica se normalizaron a TPM y se analizaron utilizando el paquete R xCell (v1.1.0) con parámetros predeterminados para generar puntuaciones de enriquecimiento. Para la subtipificación molecular, los recuentos derivados de RSEM se introdujeron en el paquete R CMSCaller (v2.0.1), y las muestras se clasificaron en subtipos moleculares de consenso (CMS) utilizando la configuración recomendada, lo que permitió la estratificación basada en perfiles transcriptómicos establecidos del cáncer colorrectal.

La actividad de las citocinas se infirió a partir de los datos de RNA-seq a granel utilizando el marco CytoSig^[46], que estima los niveles de señalización de las citocinas basándose en la expresión de los genes diana transcripcionales. Las puntuaciones z de las citocinas inferidas se correlacionaron con las proporciones de CN estratificadas por región de interés (tumor, estroma e interfaz tumor-estromal) para evaluar la actividad inmunitaria dentro de estos microambientes.

Transcriptómica espacial - GeoMx

Los bloques de FFPE se cortaron en secciones de 5 µm de espesor y se colocaron en portaobjetos BOND Plus (Leica Biosystems, Wetzlar, Alemania). Se realizó una tinción con hematoxilina y eosina (H&E) en una sección de cada bloque, donde un patólogo delimitó regiones de interés (ROI) específicas, incluido el tumor, el estroma y el epitelio normal. La sección adyacente se procesó utilizando el protocolo Digital Spatial Profiling (DSP) GeoMx (NanoString, Seattle, WA, EE. UU.). En resumen, las secciones de FFPE se colocaron en una placa calefactora a 60 °C durante 30 minutos y se desparafinaron secuencialmente en xileno tres veces, dos veces en etanol al 100%, una vez en etanol al 95% y una vez en PBS, con una incubación de 5 minutos cada una. Se realizó la recuperación del antígeno a 99 °C en un baño de vapor durante 15 minutos, seguida de la incubación con Proteinasa K (1 μg/ml, Ambion) a 37 °C durante 15 minutos. Las muestras se lavaron y se fijaron en NBF al 10% (ThermoFisher, Richard Allan Scientific 5700) durante 5 minutos. Se realizó la hibridación in situ con las sondas humanas WTA del kit de ensayo GeoMx en una cámara de hibridación a 37 °C, durante la noche, según el protocolo del fabricante. Las muestras se inmunotintaron con una combinación de marcadores de morfología que incluyen CD45 AF532 (2B11 + PD7/26, Novus, a 10,2 μg/ml), PanCK AF594 (AE-1/AE-3, Novus a 3,25 μg/ml), αSMA AF647 (1A4/asm-1, Novus a 8 μg/ml) y se contratiñeron con Syto 13 (50 μM) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se analizaron en el Digital Spatial Profiler con un tiempo de exposición de 300 mseg para todos los marcadores de morfología y 150 mseg para la tinción nuclear.

La selección de las ROI se realizó en tres ubicaciones: núcleo tumoral, interfaz tumoral y tejido normal adyacente, y se guió mediante la inmunotincón con cuatro marcadores: ADN, CD45, Pan-citoqueratina (PanCK) y actina de músculo liso (SMA). Se seleccionaron un total de 390 ROI de 16 muestras, que consistieron en 8 respondedores y 8 no respondedores. Estas ROI se segmentaron aún más en regiones tumorales y estromales, según la tinción de PanCK y SMA, lo que resultó en 390 áreas de iluminación (AOI) que se secuenciaron individualmente. Las bibliotecas para el secuenciamiento se construyeron utilizando los reactivos SeqCode (NanoString, Seattle, WA, EE. UU.) y se secuenciaron en la plataforma Illumina.

Todos los análisis se realizaron en R (versión 4.3.2) con los recuentos brutos exportados desde DSP Control Center (Nanostring, Seattle, WA, EE. UU.). Se realizó un control de calidad de los segmentos para retener solo aquellos que cumplían los siguientes criterios: ≥1000 lecturas brutas, ≥80% de las lecturas recortadas, ≥80% de las lecturas unidas, ≥80% de las lecturas alineadas, ≥50% de saturación de secuenciación y ≥30 núcleos detectados (Sup. Fig. 13a-d). Los segmentos se filtraron aún más para retener aquellos que tenían una relación entre el tamaño de la biblioteca y el recuento de núcleos inferior a 9000 (Sup. Fig. 13e). Las ROI realizadas en el tejido normal adyacente también se eliminaron debido a que solo estaban disponibles para cinco pacientes. Tras el control de calidad, quedaron 328 de las 390 AOI. Los recuentos de las AOI retenidas se normalizaron al cuartil 75 (es decir, normalización Q3), que se utilizaron para PCA (función prcomp del paquete R stats [versión 4.3.2]) y deconvolución espacial con la matriz de referencia safeTME (paquete SpatialDecon [versión 1.12.3])^[47]. Las comparaciones de la proporción de tipos de células se realizaron con la función propeller.ttest del paquete R speckle (versión 1.2.0) y los resultados con un valor p ajustado inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. El análisis de expresión génica diferencial se realizó sobre los recuentos brutos con el paquete R DESeq2 (versión 1.42.0). Los valores de log2(cambio de pliegue) se corrigieron para el ruido asociado con los genes con recuentos bajos utilizando el estimador apeglm^[48] dentro de la función lfcShrink de DESeq2. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes se realizó con el paquete R fgsea (versión 1.28.0) y los términos GO:BP (Gene Ontology: Biological Processes) del paquete R msigdbr (versión 7.5.1) en los genes clasificados por los valores de log2(cambio de pliegue) reducidos de DESeq2. Las vías relacionadas con el sistema inmunitario se identificaron por sus ID GO:BP "es_a" que contienen los términos de búsqueda "inmune|leucocito|linfocito" o cuando las vías contienen nombres de células inmunitarias.

Proteómica espacial - COMET

Según el protocolo de Lunaphore Technologies^[49], las secciones de FFPE de 4 µm de espesor se sometieron primero a la recuperación del antígeno mediada por calor. A continuación, se realizó un protocolo de inmunofluorescencia secuencial en las secciones de tejido (área de 9 mm × 9 mm) utilizando la plataforma COMET (Lunaphore Technologies SA, Suiza) para la detección de 40 anticuerpos primarios (Sup. Tabla 2), y posteriormente se realizó la adquisición de imágenes. La imagen final de 40 plexes apilada de cada muestra de paciente se obtiene, junto con la contratinción nuclear DAPI.

Seleccionamos 70 o más campos de visión (cada uno con 2048 × 2048 píxeles) de la imagen de tejido multiplexada de cada caso como regiones de interés (ROI) utilizando el software QuPath (v0.5.0)^[50]. Las ROI se eligieron para que fueran representativas de la histología general del tejido y con artefactos o pliegues de tejido mínimos o nulos, según los marcadores DAPI, CK y CD45. Las ROI se anotaron además como regiones "tumorales", "interfaz tumor-estromal" o "estromales" en función de estos tres marcadores. La segmentación celular y las mediciones de características se realizaron utilizando un software automatizado de análisis de imágenes de tejidos (cellXpress v2.4.0; https://cellXpress.org; Bioinformatics Institute, Singapur). La intensidad media de los respectivos marcadores en las regiones citoplasmáticas se cuantificó, excepto para los marcadores Ki67 y FOXP3, donde se cuantificaron las regiones nucleares, y para los marcadores CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD20 y CD45RA, donde se utilizaron las regiones externas al núcleo para determinar la positividad de las células.

La clasificación celular y la determinación de umbrales se realizaron utilizando una plataforma de análisis basada en la web patentada (ImmunoThreshold™; ImmunoQs Pte. Ltd., Singapur). El software era preexistente y no se desarrolló específicamente para este estudio. Para cada marcador, el sistema empleó el modelado de mezclas gaussianas (GMM) (mixtools v2.0.0)^[52] para determinar un umbral de decisión que pueda separar entre las células con ("positivas") o sin ("negativas") tinción del marcador. Solo para la determinación del umbral, el sistema eliminó las células con los niveles de intensidad media del marcador más bajos del 1.er percentil, transformó los valores de intensidad media en log2 y ejecutó el algoritmo GMM hasta 20.000 iteraciones o la convergencia. Todos los umbrales se verificaron manualmente en función de los fenotipos, las apariencias y la coexpresión esperadas de otros marcadores relacionados en las células positivas. Si se encontró que un umbral era inexacto, el umbral se ajustaría manualmente en función de los criterios mencionados anteriormente. Para garantizar la coherencia, todas las ROI de los mismos portaobjetos utilizaron los mismos valores de umbral. Las etiquetas de todas las células individuales positivas y negativas se exportaron como archivos .csv.

Los datos de células únicas exportados se procesaron aún más en R (versión 4.3.2) utilizando paquetes públicos establecidos: la manipulación y el resumen de datos se realizaron utilizando el marco tidyverse (versión 2.0.0), mientras que las operaciones del sistema de archivos y la gestión de archivos relativos al proyecto se gestionaron utilizando los paquetes fs (versión 1.6.6) y here (versión 1.0.2), respectivamente. Se implementaron operaciones estadísticas básicas utilizando rstatix (versión 0.7.3). Las células con un área celular (número de píxeles) inferior o superior al percentil 0,1 y al percentil 99,9 de todas las células se eliminaron porque eran artefactos o células mal segmentadas. Posteriormente, cada tipo de célula se identificó en función de un solo marcador o una combinación de marcadores. Las definiciones de los marcadores de IHC por tipo de célula se proporcionan en la Sup. Tabla 1. El número total de células para cada tipo de célula se determinó para cada ROI, y el número medio final de células para cada caso se derivó como la mediana del número total de células en todas las ROI del caso. Los mismos procedimientos se repitieron para los tres tipos de ROI: tumor, interfaz tumor-estromal y estroma.

La proximidad de las células adyacentes se evaluó utilizando un enfoque descrito previamente por Jia et al. tomando el número medio de células dentro de un radio de 20 μm de una célula predefinida^[22].

Los vecindarios celulares se recuperaron mediante un algoritmo descrito previamente por Schürch et al.^[20]. En resumen, utilizamos un tamaño de ventana de 10 células (1 célula central y 9 vecinos más cercanos, determinados por la distancia euclidiana) para evaluar la actividad funcional local. El radio de la ventana, que se estimó para cubrir dos distancias celulares en cada dirección según la inspección visual, se aplicó para agrupar las ventanas por su composición microambiental en 6 tipos de células. Esto generó un vector que representa la frecuencia de cada tipo de célula dentro del vecindario. El agrupamiento se realizó utilizando MiniBatchKMeans con k = 10 (configuración predeterminada) en Python, y cada célula se asignó al mismo vecindario celular (CN) que su ventana central, lo que captura la influencia de los tipos de células vecinas sobre la función de la célula central. La diversidad de las células inmunitarias se cuantificó utilizando el índice de Shannon^[53].

Transcriptómica espacial - Visium

La expresión génica espacial de Visium (10x Genomics, Pleasanton, CA, EE. UU.) se basa en el uso de portaobjetos Visium, cada uno de los cuales tiene cuatro áreas de captura que contienen aproximadamente 5000 puntos con código de barras. Cada área de captura contiene millones de oligonucleótidos, y cada oligonucleótido consta de una secuencia de poli(dT) de 30 nucleótidos para la captura de moléculas de ARNm poliadeniladas, un identificador molecular único (UMI) de 12 nucleótidos, un código de barras espacial de 16 nucleótidos (un conjunto único de códigos de barras espaciales se comparte entre todos los oligonucleótidos dentro de cada punto de expresión génica individual, abreviado como punto Visium) y una secuencia parcial de TruSeq Read 1 para la preparación y el secuenciamiento de la biblioteca.

Según el protocolo Visium de 10x Genomics, las secciones de tejido de FFPE (10 μm de espesor) se colocaron en las áreas de captura (cada una de 6,5 mm × 6,5 mm) del portaobjetos, se fijaron, se tiñeron con H&E y se obtuvieron imágenes utilizando Zeiss AxioScan 7 y el software Zeiss Zen (versión 3.7; Carl Zeiss Microscopy, Jena, Alemania). Las secciones de tejido se permeabilizaron y las moléculas de ARNm se capturaron mediante la secuencia de poli(dT) en la superficie del portaobjetos, dejando moléculas de ADN complementario (ADNc) complementarias al código de barras espacial adheridas covalentemente al portaobjetos. Las moléculas con código de barras espacial se liberaron del portaobjetos, se amplificaron por PCR y se secuenciaron a la profundidad recomendada de 50.000 lecturas brutas por punto de captura cubierto por el tejido.

Utilizando tejidos teñidos con H&E del estudio Visium, capturados con un aumento de 20×, un patólogo (JY) e histólogo (YZX) capacitados desarrollaron un clasificador de aprendizaje automático supervisado con el software QuPath (versión 0.3.2). El clasificador se entrenó específicamente para distinguir entre tejidos tumorales y estromales, excluyendo áreas con tejido dañado y altas concentraciones de colágeno o músculo. Posteriormente, este clasificador se aplicó a todas las muestras de tejido para generar anotaciones de categorías de tejido, que se exportaron como máscaras binarias.

Los análisis se realizaron utilizando R (versión 4.3.2). La alineación fiduciaria y de tejido (para localizar los códigos de barras espaciales en el tejido) se realizó manualmente en las imágenes de H&E utilizando el Loupe Browser (10x Genomics), seguido de la alineación de lecturas o UMIs al genoma de referencia humano GRCh38 utilizando Space Ranger (10x Genomics). Utilizando el paquete Seurat R versión 4.4.0^[54], excluimos las células de baja calidad o las gotitas vacías eliminando los puntos de Visium que contenían menos de 20 genes únicos. Utilizando la función sctransform en Seurat, se generaron datos normalizados basados en los 3000 genes más variables.

Para asignar categorías de tejido a los puntos de Visium, empleamos varios parámetros esenciales: los valores del factor de escala del archivo de salida de Space Ranger (scalefactorsjson.json), las coordenadas de los puntos de tejido (tissuepositions_list.csv) y el factor de reducción de escala necesario para ajustar las imágenes de H&E de 20× a 2× de aumento. Aprovechando estos parámetros, desarrollamos un script de Python personalizado que mapeó con precisión cada punto de Visium a su categoría correspondiente dentro de las máscaras binarias.

Para la inferencia del tipo celular, aplicamos el método UCell (versión 2.2.0) para puntuar las firmas génicas específicas del tipo celular en los datos de transcriptómica espacial de Visium normalizados logarítmicamente^[55]. Los conjuntos de genes se derivaron del marco MCP-counter para capturar una variedad de poblaciones de células inmunitarias y estromales, incluidas las células endoteliales y los fibroblastos^[56]. UCell calcula puntuaciones de enriquecimiento basadas en rangos para cada punto, lo que permite una estimación sólida de la abundancia del tipo celular en las regiones espaciales.

El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) se realizó utilizando la función GSEA() del paquete R clusterProfiler versión 4.6.2, basada en conjuntos de genes Hallmark seleccionados de la base de datos de firmas moleculares (MSigDB) a través del paquete R msigdbr versión 7.5.1. La significación estadística se evaluó a un nivel α bilateral de 0,05.

Para aproximar los gradientes de expresión espacial a través de la interfaz tumor-estroma, calculamos la distancia euclidiana más corta desde cada punto de Visium al punto más cercano en el compartimento opuesto (tumor o estroma) utilizando un algoritmo de vecino más cercano implementado a través del paquete R FNN (versión 1.1.4.1). Las distancias se asignaron un signo para preservar la direccionalidad: a los puntos estromales se les asignaron valores positivos en relación con el punto tumoral más cercano, mientras que a los puntos tumorales se les asignaron valores negativos en relación con el punto estromal más cercano. Esto produjo un eje espacial continuo que abarcaba los dos compartimentos. Las tendencias de expresión génica a lo largo de este eje se modelaron utilizando el suavizado de diagrama de dispersión estimado localmente (LOESS) para capturar la variación espacial no lineal. Los promedios condicionales suavizados se visualizaron utilizando la función geom_smooth() en el paquete R ggplot2 (versión 3.5.2).

Para evaluar la disfunción inmunitaria en el microambiente tumoral, aplicamos el algoritmo Tumor Immune Dysfunction and Exclusion (TIDE)^[23] a los datos de transcriptómica de Visium agregados a nivel de muestra y compartimento de tejido (tumor frente a estroma). Los valores de expresión normalizados logarítmicamente se promediaron en todos los puntos dentro de cada compartimento por muestra para generar perfiles pseudovoluminosos. TIDE se ejecutó en cada perfil pseudovoluminoso utilizando la configuración predeterminada y el tipo de cáncer especificado como "Otro". Los análisis se centraron en la puntuación de disfunción de las células T, dado su relevancia en los tumores inmunológicamente "fríos". Las comparaciones se realizaron utilizando pruebas de rango de Wilcoxon.

Las interacciones ligando-receptor se infirieron a partir de los datos de transcriptómica espacial de Visium utilizando el paquete R CellChat (versión 1.6.1) con la base de datos CellChatDB humana. Las interacciones extraídas se analizaron tanto a nivel del par ligando-receptor individual como después de agruparlas en puntuaciones de actividad a nivel de vía, lo que permitió comparaciones entre los grupos de respuesta clínica y las correlaciones con las proporciones de CN en los compartimentos.

Citometría de flujo periférica

Se obtuvieron muestras de sangre periférica de los pacientes en 3 puntos temporales del estudio para su análisis: (I) Línea de base: antes del temozolomida, (II) Post-TMZ: después de 2 ciclos de temozolomida, (III) Post-Triplete: después de 2 ciclos de temozolomida y 2 ciclos adicionales de temozolomida más nivolumab e ipilimumab (Fig. 6a).

Las células se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37 °C y se lavaron con RPMI + 10% FBS (Gibco). Se realizó un recuento celular y las células se lavaron con tampón de tinción (PBS + 5% FBS + 2 mM EDTA). Se agregaron anticuerpos contra TIGIT, TIM3, PD-L1 y PD1 a las células y se tiñeron durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, se agregaron los anticuerpos restantes de los marcadores de superficie a la suspensión celular y se incubaron durante 20 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con tampón de tinción y luego se fijaron y permeabilizaron con el kit de tinción de Foxp3/factor de transcripción (eBioscience) según las instrucciones del fabricante. Luego, se agregaron anticuerpos contra los marcadores intracelulares a las células y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente (Tabla Suplementaria 3). Después de lavar los anticuerpos no unidos, las muestras se analizaron en un BD FACSymphony (BD Biosciences). Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (Flowjo LLC).

La puerta de tiempo se estableció en función de la región de MFI de PE estable en función del tiempo para eliminar las señales aberrantes causadas por cualquier inestabilidad del flujo. La puerta FSC frente a SSC se estableció en el tamaño y la granularidad esperados de las células, según experimentos anteriores que utilizaron células fijadas y permeabilizadas con un kit de tinción comercial de Foxp3 para eliminar los desechos del análisis. Luego, se realizó la segmentación de un solo punto a través de FSC-H frente a FSC-A y la exclusión de la viabilidad de células vivas/muertas para eliminar aún más las señales fluorescentes aberrantes. La mayoría de las puertas de población positiva y negativa se definieron en gráficos de pseudocolores segmentando en el área de menor densidad o dividiendo en el espacio en blanco entre las distintas poblaciones positiva y negativa. Estas puertas también se establecieron de manera que fueran generalmente aplicables a múltiples muestras de la cohorte para reducir la variabilidad de la segmentación entre las muestras, al tiempo que se tiene en cuenta la variabilidad biológica humana esperada de la densidad del antígeno. Para las poblaciones con resolución indistinta, la positividad del antígeno se definió en función de los controles internos de otros subconjuntos de células que no expresan el marcador, o en función de la muestra con la población negativa más baja distinta y se aplicó a todas las muestras como un medio de estandarización. Las estadísticas detalladas de la citometría de flujo, incluida la abundancia de subconjuntos de células inmunitarias en cada punto temporal, se proporcionan en los datos suplementarios (Fig. Suplementaria 14).

Se realizaron comparaciones entre los respondedores y los no respondedores utilizando la prueba de Wilcoxon. Estas comparaciones se representaron gráficamente utilizando gráficos de enjambre con barras de error. Los análisis estadísticos se realizaron en R (versión 4.3.2), con un valor de p < 0,05 que se consideró indicativo de significación.

Los cambios posteriores al tratamiento en los subconjuntos de células inmunitarias se cuantificaron como proporciones en relación con la línea de base y se evaluó su valor predictivo utilizando el análisis del área bajo la curva de características operativas del receptor (AUROC). La dinámica longitudinal de las proporciones de células inmunitarias se visualizó utilizando diagramas de caja en los puntos temporales del tratamiento, y la significación estadística se evaluó utilizando pruebas t de dos colas. Se realizaron análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para evaluar las asociaciones entre la dinámica de las células inmunitarias y los resultados clínicos, con valores de p derivados de la prueba de rango logarítmico.

Resumen de la presentación de informes

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen de presentación de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Cohorte de pacientes y muestras

El estudio MAYA fue un estudio de fase II, de un solo brazo, no aleatorizado y no cegado de temozolomida, nivolumab más ipilimumab en cáncer colorrectal metastásico refractario con microsatélites estables y MGMT silenciado (NCT03832621). Los pacientes se incluyeron en la Parte 1 del estudio, donde recibieron 2 ciclos de temozolomida. De estos, los pacientes que demostraron respuesta o enfermedad estable al temozolomida en monoterapia pasaron a la Parte 2 para recibir tratamiento con nivolumab + ipilimumab + temozolomida (Fig. 2a). Los detalles de los criterios de elegibilidad de los pacientes y los procedimientos del estudio se han publicado previamente^[12]. El tamaño de la muestra se calculó en base al punto final primario de la tasa de PFS a los 8 meses. Según nuestros resultados previamente publicados^[7],^[45], la PFS de los pacientes con cáncer colorrectal metastásico MGMT silenciado y beneficio clínico del temozolomida en monoterapia es casi siempre 70% y detección de ≥ 20.000 genes únicos por muestra. La calidad y la consistencia de la muestra se evaluaron aún más mediante la evaluación de la correlación entre muestras y la visualización de los patrones de agrupamiento mediante análisis de componentes principales (PCA) y diagramas de escalamiento multidimensional (MDS). Las muestras identificadas como valores atípicos o que no cumplían con los umbrales de calidad se excluyeron de los análisis posteriores.

Para estimar la abundancia relativa de los tipos de células inmunitarias y estromales, los datos de expresión génica se normalizaron a TPM y se analizaron utilizando el paquete R xCell (v1.1.0) con los parámetros predeterminados para generar puntuaciones de enriquecimiento. Para la subtipificación molecular, los recuentos derivados de RSEM se introdujeron en el paquete R CMSCaller (v2.0.1) y las muestras se clasificaron en subtipos moleculares de consenso (CMS) utilizando la configuración recomendada, lo que permite la estratificación basada en perfiles transcripómicos establecidos del cáncer colorrectal.

La actividad de las citocinas se infirió a partir de los datos de ARN-seq masivo utilizando el marco CytoSig^[46], que estima los niveles de señalización de las citocinas en función de la expresión de los genes diana transcripcionales. Las puntuaciones z de las citocinas inferidas se correlacionaron con las proporciones de CN estratificadas por región de interés (tumor, estroma e interfaz tumor-estromal) para evaluar la actividad inmunitaria dentro de estos microambientes.

Transcriptómica espacial - GeoMx

Los bloques de FFPE se cortaron en secciones de 5 µm de grosor y se colocaron en portaobjetos BOND Plus (Leica Biosystems, Wetzlar, Alemania). Se realizó una tinción con hematoxilina y eosina (H&E) en un portaobjetos de cada bloque, donde un patólogo delimitó regiones de interés (ROI) específicas, incluido el tumor, el estroma y el epitelio normal. El portaobjetos adyacente se procesó utilizando el protocolo Digital Spatial Profiling (DSP) GeoMx (NanoString, Seattle, WA, EE. UU.). En resumen, las láminas de FFPE se colocaron en una placa calefactora a 60 °C durante 30 minutos y se desparafinaron secuencialmente en xileno tres veces, dos veces en etanol al 100%, una vez en etanol al 95% y una vez en PBS, todas las incubaciones durante 5 minutos cada una. Se realizó la recuperación del antígeno a 99 °C en un vaporizador durante 15 minutos, seguida de la incubación con Proteinasa K (1 μg/ml, Ambion) a 37 °C durante 15 minutos. Las muestras se lavaron y se fijaron en 10% NBF (ThermoFisher, Richard Allan Scientific 5700) durante 5 minutos. La hibridación in situ con las sondas humanas WTA del kit de ensayo GeoMx se realizó en una cámara de hibridación a 37 °C, durante la noche, según el protocolo del fabricante. Las muestras se inmunotintieron con un cóctel de marcadores de morfología que incluyen CD45 AF532 (2B11 + PD7/26, Novus, a 10,2 μg/ml), PanCK AF594 (AE-1/AE-3, Novus a 3,25 μg/ml), αSMA AF647 (1A4/asm-1, Novus a 8 μg/ml) y se contratiñeron con Syto 13 (50 μM) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las láminas se perfilaron en el Digital Spatial Profiler con un tiempo de exposición de 300 ms para todos los marcadores de morfología y 150 ms para la tinción nuclear.

La selección de ROI se realizó en tres ubicaciones, el núcleo del tumor, la interfaz del tumor y el tejido normal adyacente, y se guió mediante la inmunotinción con cuatro marcadores: ADN, CD45, citoqueratina pancelular (PanCK) y actina de músculo liso (SMA). Se seleccionaron un total de 390 ROI de 16 muestras que consistieron en 8 respondedores y 8 no respondedores. Estos ROI se segmentaron aún más en regiones de tumor y estroma, según la tinción de PanCK y SMA, lo que resultó en 390 áreas de iluminación (AOI) que se secuenciaron individualmente. Las bibliotecas para la secuenciación se construyeron utilizando los reactivos SeqCode (NanoString, Seattle, WA, EE. UU.) y se secuenciaron en la plataforma Illumina.

Todos los análisis se realizaron en R (versión 4.3.2) con los recuentos en bruto exportados desde DSP Control Center (Nanostring, Seattle, WA, EE. UU.). Se realizó un control de calidad de los segmentos para retener solo aquellos que cumplían con los siguientes criterios: ≥ 1000 lecturas en bruto, ≥ 80% de las lecturas recortadas, ≥ 80% de las lecturas unidas, ≥ 80% de las lecturas alineadas, ≥ 50% de saturación de la secuenciación y ≥ 30 núcleos detectados (Sup. Fig. 13a-d). Los segmentos se filtraron aún más para retener aquellos que tenían una relación entre el tamaño de la biblioteca y el recuento de núcleos inferior a 9000 (Sup. Fig. 13e). Los ROI realizados en el tejido normal adyacente también se eliminaron debido a que solo estaban disponibles para cinco pacientes. Después del control de calidad, quedaron 328 de 390 AOI. Los recuentos de los AOI retenidos se normalizaron al cuantil 75 (es decir, normalización Q3), que se utilizaron para PCA (función prcomp del paquete R stats [versión 4.3.2]) y la deconvolución espacial con la matriz de referencia safeTME (paquete SpatialDecon [versión 1.12.3])^[47]. Las comparaciones de proporciones de tipos de células se realizaron con la función propeller.ttest del paquete R speckle (versión 1.2.0) y los resultados con un valor p ajustado inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. El análisis de expresión génica diferencial se realizó sobre los recuentos en bruto con el paquete R DESeq2 (versión 1.42.0). Los valores de log2(cambio de pliegue) se corrigieron para el ruido asociado con los genes con recuentos bajos utilizando el estimador apeglm dentro de la función lfcShrink de DESeq2. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes se realizó con el paquete R fgsea (versión 1.28.0) y los términos GO:BP (Gene Ontology: Biological Processes) del paquete R msigdbr (versión 7.5.1) en los genes clasificados por los valores de log2(cambio de pliegue) reducidos de DESeq2. Las vías relacionadas con el sistema inmunitario se identificaron por sus ID GO:BP "esa" que contienen los términos de búsqueda "inmune|leucocito|linfocito" o cuando las vías contienen nombres de células inmunitarias.

Transcriptómica espacial - GeoMx

Los bloques de FFPE se cortaron en secciones de 5 µm de grosor y se colocaron en portaobjetos BOND Plus (Leica Biosystems, Wetzlar, Alemania). Se realizó una tinción con hematoxilina y eosina (H&E) en un portaobjetos de cada bloque, donde un patólogo delimitó regiones de interés (ROI) específicas, incluido el tumor, el estroma y el epitelio normal. El portaobjetos adyacente se procesó utilizando el protocolo Digital Spatial Profiling (DSP) GeoMx (NanoString, Seattle, WA, EE. UU.). En resumen, las láminas de FFPE se colocaron en una placa calefactora a 60 °C durante 30 minutos y se desparafinaron secuencialmente en xileno tres veces, dos veces en etanol al 100%, una vez en etanol al 95% y una vez en PBS, todas las incubaciones durante 5 minutos cada una. Se realizó la recuperación del antígeno a 99 °C en un vaporizador durante 15 minutos, seguida de la incubación con Proteinasa K (1 μg/ml, Ambion) a 37 °C durante 15 minutos. Las muestras se lavaron y se fijaron en 10% NBF (ThermoFisher, Richard Allan Scientific 5700) durante 5 minutos. La hibridación in situ con las sondas humanas WTA del kit de ensayo GeoMx se realizó en una cámara de hibridación a 37 °C, durante la noche, según el protocolo del fabricante. Las muestras se inmunotintieron con un cóctel de marcadores de morfología que incluyen CD45 AF532 (2B11 + PD7/26, Novus, a 10,2 μg/ml), PanCK AF594 (AE-1/AE-3, Novus a 3,25 μg/ml), αSMA AF647 (1A4/asm-1, Novus a 8 μg/ml) y se contratiñeron con Syto 13 (50 μM) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las láminas se perfilaron en el Digital Spatial Profiler con un tiempo de exposición de 300 ms para todos los marcadores de morfología y 150 ms para la tinción nuclear.

La selección de ROI se realizó en tres ubicaciones, el núcleo del tumor, la interfaz del tumor y el tejido normal adyacente, y se guió mediante la inmunotinción con cuatro marcadores: ADN, CD45, citoqueratina pancelular (PanCK) y actina de músculo liso (SMA). Se seleccionaron un total de 390 ROI de 16 muestras que consistieron en 8 respondedores y 8 no respondedores. Estos ROI se segmentaron aún más en regiones de tumor y estroma, según la tinción de PanCK y SMA, lo que resultó en 390 áreas de iluminación (AOI) que se secuenciaron individualmente. Las bibliotecas para la secuenciación se construyeron utilizando los reactivos SeqCode (NanoString, Seattle, WA, EE. UU.) y se secuenciaron en la plataforma Illumina.

Todos los análisis se realizaron en R (versión 4.3.2) con los recuentos brutos exportados desde DSP Control Center (Nanostring, Seattle, WA, EE. UU.). Se realizó un control de calidad de los segmentos para retener solo aquellos que cumplieran los siguientes criterios: ≥1000 lecturas brutas, ≥80% de las lecturas recortadas, ≥80% de las lecturas unidas, ≥80% de las lecturas alineadas, ≥50% de saturación de la secuenciación y ≥30 núcleos detectados (Sup. Fig. 13a–d). Los segmentos se filtraron aún más para retener aquellos que tuvieran una relación entre el tamaño de la biblioteca y el recuento de núcleos inferior a 9000 (Sup. Fig. 13e). Las regiones de interés (ROI) realizadas en el tejido normal adyacente también se eliminaron debido a que solo estaban disponibles para cinco pacientes. Tras el control de calidad, quedaron 328 de 390 AOI. Los recuentos de las AOI retenidas se normalizaron al cuartil 75 (es decir, normalización Q3), que se utilizaron para el análisis de componentes principales (PCA) (función prcomp del paquete R stats [versión 4.3.2]) y la deconvolución espacial con la matriz de referencia safeTME (paquete SpatialDecon [versión 1.12.3])^[47]. Las comparaciones de la proporción de tipos celulares se realizaron con la función propeller.ttest del paquete R speckle (versión 1.2.0) y los resultados con un valor p ajustado inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. El análisis de expresión génica diferencial se realizó sobre los recuentos brutos con el paquete R DESeq2 (versión 1.42.0). Los valores de log2(cambio de expresión) se corrigieron para el ruido asociado con los genes con recuentos bajos utilizando el estimador apeglm^[48] dentro de la función lfcShrink de DESeq2. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes se realizó con el paquete R fgsea (versión 1.28.0) y los términos GO:BP (Ontología Genética: Procesos Biológicos) del paquete R msigdbr (versión 7.5.1) en los genes clasificados por los valores de log2(cambio de expresión) reducidos de DESeq2. Las vías relacionadas con el sistema inmunitario se identificaron por sus ID GO:BP "is_a" que contienen los términos de búsqueda "immune|leukocyte|lymphocyte" o cuando las vías contienen nombres de células inmunitarias.

Proteómica espacial – COMET

Según el protocolo de Lunaphore Technologies^[49], las secciones de FFPE de 4 µm de grosor se sometieron primero a una recuperación de antígenos mediada por calor. A continuación, se realizó un protocolo de inmunofluorescencia secuencial en las secciones de tejido (área de 9 mm × 9 mm) utilizando la plataforma COMET (Lunaphore Technologies SA, Suiza) para la detección de 40 anticuerpos primarios (Sup. Tabla 2), y posteriormente se realizó la adquisición de imágenes. La imagen final apilada de 40 canales de cada muestra de paciente se obtiene, junto con la tinción nuclear DAPI.

Seleccionamos 70 o más campos de visión (cada uno con 2048 × 2048 píxeles) de la imagen de tejido multiplex de cada caso como regiones de interés (ROI) utilizando el software QuPath (v0.5.0)^[50]. Las ROI se eligieron para que fueran representativas de la histología general del tejido y con artefactos o pliegues de tejido mínimos o nulos, según los marcadores DAPI, CK y CD45. Las ROI se anotaron aún más como regiones "tumorales", "interfase tumor-estroma" o "estroma" según estos tres marcadores. La segmentación celular y las mediciones de características se realizaron utilizando un software automatizado de análisis de imágenes de tejido (cellXpress v2.4.0; https://cellXpress.org; Instituto de Bioinformática, Singapur)^[51]. Se cuantificó la intensidad media de los respectivos marcadores en las regiones citoplasmáticas, excepto para los marcadores Ki67 y FOXP3, donde se cuantificaron las regiones nucleares, y para los marcadores CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD20 y CD45RA, donde se utilizaron las regiones externas al núcleo para determinar la positividad de las células.

La clasificación celular y la definición de umbrales se realizaron utilizando una plataforma de análisis basada en la web patentada (ImmunoThreshold™; ImmunoQs Pte. Ltd., Singapur). El software ya existía y no se desarrolló específicamente para este estudio. Para cada marcador, el sistema empleó un modelado de mezcla gaussiana (GMM) (mixtools v2.0.0)^[52] para determinar un umbral de decisión que pueda separar entre las células con ("positivas") o sin ("negativas") tinción del marcador. Solo para la determinación del umbral, el sistema eliminó las células con los niveles de intensidad media del marcador más bajos del percentil 1, transformó los valores de intensidad media en log2 y ejecutó el algoritmo GMM hasta 20 000 iteraciones o hasta la convergencia. Todos los umbrales se verificaron manualmente en función de los fenotipos, las apariencias y la coexpresión esperadas de otros marcadores relacionados en las células positivas. Si se encontró que un umbral era inexacto, el umbral se ajustaría manualmente en función de los criterios mencionados anteriormente. Para garantizar la coherencia, todas las ROI de los mismos portaobjetos utilizaron los mismos valores de umbral. Las etiquetas de todas las células individuales positivas y negativas se exportaron como archivos .csv.

Los datos de una sola célula exportados se procesaron aún más en R (versión 4.3.2) utilizando paquetes públicos disponibles y establecidos: la manipulación y el resumen de datos se realizaron utilizando el marco tidyverse (versión 2.0.0), mientras que las operaciones del sistema de archivos y la gestión de archivos relativos al proyecto se gestionaron utilizando los paquetes fs (versión 1.6.6) y here (versión 1.0.2), respectivamente. Se implementaron operaciones estadísticas básicas utilizando rstatix (versión 0.7.3). Se eliminaron las células con un área celular (número de píxeles) inferior o superior al percentil 0,1 y 99,9 de todas las células, ya que se trataba de artefactos o células segmentadas incorrectamente. Posteriormente, se identificó cada tipo de célula en función de un solo marcador o una combinación de marcadores. Las definiciones de los marcadores de IHC por tipo de célula se proporcionan en la Sup. Tabla 1. Se determinó el número total de células para cada tipo de célula para cada ROI, y el número medio final de células para cada caso se derivó como la mediana del número total de células en todas las ROI del caso. Los mismos procedimientos se repitieron para los tres tipos de ROI: tumor, interfase tumor-estroma y estroma.

La proximidad de las células adyacentes se evaluó utilizando un enfoque descrito previamente por Jia et al. mediante el cálculo del número medio de células dentro de un radio de 20 µm de una célula predefinida^[22].

Los vecindarios celulares se obtuvieron mediante un algoritmo descrito previamente por Schürch et al.^[20]. Brevemente, utilizamos un tamaño de ventana de 10 células (1 célula central y 9 vecinos más cercanos, determinados por la distancia euclidiana) para evaluar la actividad funcional local. El radio de la ventana, que se estimó para cubrir dos distancias celulares en cada dirección según la inspección visual, se aplicó para agrupar las ventanas por su composición microambiental en 6 tipos de células. Esto generó un vector que representa la frecuencia de cada tipo de célula dentro del vecindario. El agrupamiento se realizó utilizando MiniBatchKMeans con k = 10 (configuración predeterminada) en Python, y cada célula se asignó al mismo vecindario celular (CN) que su ventana central, capturando la influencia de los tipos de células vecinas sobre la función de la célula central. La diversidad de las células inmunitarias se cuantificó utilizando el índice de Shannon^[53].

Transcriptómica espacial – Visium

Visium Spatial Gene Expression (10x Genomics, Pleasanton, CA, EE. UU.) se basa en el uso de portaobjetos Visium, cada uno de los cuales tiene cuatro áreas de captura que contienen aproximadamente 5000 puntos con código de barras. Cada área de captura contiene millones de oligonucleótidos, y cada oligonucleótido consta de una secuencia de poli(dT) de 30 nucleótidos para la captura de moléculas de ARNm poliadeniladas, un identificador molecular único (UMI) de 12 nucleótidos, un código de barras espacial de 16 nucleótidos (un conjunto único de códigos de barras espaciales se comparte entre todos los oligonucleótidos dentro de cada punto de expresión génica individual, abreviado como punto Visium) y una secuencia parcial de TruSeq Read 1 para la preparación de la biblioteca y la secuenciación.

Según el protocolo Visium de 10x Genomics, las secciones de tejido fijadas con formalina y embebidas en parafina (FFPE) (10 µm de grosor) se colocaron en las áreas de captura (cada una de 6,5 mm × 6,5 mm) del portaobjetos, se fijaron, se tiñeron con H&E y se obtuvieron imágenes utilizando Zeiss AxioScan 7 y el software Zeiss Zen (versión 3.7; Carl Zeiss Microscopy, Jena, Alemania). Las secciones de tejido se permeabilizaron y las moléculas de ARNm se capturaron mediante la secuencia de poli(dT) en la superficie del portaobjetos, dejando moléculas de ADN complementario (ADNc) complementarias al código de barras espacial y al UMI unidas covalentemente al portaobjetos. Las moléculas con código de barras espacial se liberaron del portaobjetos, se amplificaron por PCR y se secuenciaron a la profundidad recomendada de 50 000 lecturas brutas por punto de captura cubierto por el tejido.

Utilizando los tejidos teñidos con H&E de Visium como referencia, capturados con un aumento de 20×, un patólogo (JY) y un histólogo (YZX) capacitados desarrollaron un clasificador de aprendizaje automático supervisado con el software QuPath (versión 0.3.2). El clasificador se entrenó específicamente para distinguir entre los tejidos tumoral y del estroma, excluyendo las áreas con tejido dañado y altas concentraciones de colágeno o músculo. Este clasificador se aplicó a todas las muestras de tejido para generar anotaciones de categorías de tejido, que se exportaron como máscaras binarias.

Los análisis se realizaron utilizando R (versión 4.3.2). La alineación fiduciaria y de tejidos (para localizar los códigos de barras espaciales en el tejido) se realizó manualmente en las imágenes de H&E utilizando el Loupe Browser (10x Genomics), seguida de la alineación de lecturas o UMI al genoma de referencia humano GRCh38 utilizando Space Ranger (10x Genomics). Utilizando el paquete R Seurat versión 4.4.0^[54], excluimos las células o gotas de baja calidad eliminando los puntos Visium que contenían menos de 20 genes únicos. Utilizando la función sctransform en Seurat, se generaron datos normalizados basados en los 3000 genes más variables.

Para asignar categorías de tejido a los puntos Visium, empleamos varios parámetros esenciales: los valores del factor de escala del archivo de salida de Space Ranger (scalefactorsjson.json), las coordenadas de los puntos de tejido (tissuepositions_list.csv) y el factor de reducción necesario para ajustar las imágenes de H&E de 20x a 2x de aumento. Aprovechando estos parámetros, desarrollamos un script de Python personalizado que asignó con precisión cada punto Visium a su categoría correspondiente dentro de las máscaras binarias.

Para la inferencia de tipos celulares, aplicamos el método UCell (versión 2.2.0) para puntuar las firmas génicas específicas de los tipos celulares en los datos de transcriptómica espacial Visium normalizados en logaritmo^[55]. Los conjuntos de genes se derivaron del marco MCP-counter para capturar una variedad de poblaciones de células inmunitarias y del estroma, incluidas las células endoteliales y los fibroblastos^[56]. UCell calcula puntuaciones de enriquecimiento basadas en rangos de muestra única por punto, lo que permite una estimación sólida de la abundancia de tipos celulares en las regiones espaciales.

El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) se realizó utilizando la función GSEA() del paquete R clusterProfiler versión 4.6.2, basada en los conjuntos de genes Hallmark seleccionados de la base de datos de firmas moleculares (MSigDB) a través del paquete R msigdbr versión 7.5.1. La significación estadística se evaluó a un nivel alfa bilateral de 0,05.

Para aproximar los gradientes de expresión espacial en la interfase tumor-estroma, calculamos la distancia euclidiana más corta desde cada punto Visium al punto más cercano en el compartimento opuesto (tumor o estroma) utilizando un algoritmo de vecino más cercano implementado a través del paquete R FNN (versión 1.1.4.1). Las distancias se firmaron para preservar la direccionalidad: a los puntos del estroma se les asignaron valores positivos en relación con el punto tumoral más cercano, mientras que a los puntos tumorales se les asignaron valores negativos en relación con el punto del estroma más cercano. Esto produjo un eje espacial continuo que abarcaba los dos compartimentos. Las tendencias de expresión génica a lo largo de este eje se modelaron utilizando el suavizado de dispersión estimado localmente (LOESS) para capturar la variación espacial no lineal. Los medios condicionales suavizados se visualizaron utilizando la función geom_smooth() en el paquete R ggplot2 (versión 3.5.2).

Para evaluar la disfunción inmunitaria en el microambiente tumoral, aplicamos el algoritmo Tumor Immune Dysfunction and Exclusion (TIDE)^[23] a los datos de transcriptómica Visium agregados a nivel de muestra y compartimento de tejido (tumor frente a estroma). Los valores de expresión normalizados en logaritmo se promediaron en todos los puntos dentro de cada compartimento por muestra para generar perfiles pseudovoluminosos. TIDE se ejecutó en cada perfil pseudovoluminoso utilizando la configuración predeterminada y el tipo de cáncer especificado como "Otro". Los análisis se centraron en la puntuación de disfunción de las células T, dado su relevancia en los tumores "fríos" inmunológicamente. Las comparaciones se realizaron utilizando pruebas de rango de Wilcoxon.

Las interacciones ligando-receptor se infirieron a partir de los datos de transcriptómica espacial de Visium utilizando el paquete R CellChat (versión 1.6.1) con la base de datos CellChatDB humana. Las interacciones extraídas se analizaron tanto a nivel de pares de ligandos y receptores individuales como después de agruparlas en puntuaciones de actividad a nivel de vía, lo que permitió realizar comparaciones entre los grupos de respuesta clínica y establecer correlaciones con las proporciones de CN en los diferentes compartimentos.

Citometría de flujo periférica

Se obtuvieron muestras de sangre periférica de los pacientes en 3 momentos del estudio para su análisis: (I) Línea de base: antes del temozolomida, (II) Post-TMZ: después de 2 ciclos de temozolomida, (III) Post-Triplet: después de 2 ciclos de temozolomida y 2 ciclos adicionales de temozolomida más nivolumab e ipilimumab (Fig. 6a).

Las células se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37 °C y se lavaron con RPMI + 10 % de FBS (Gibco). Se realizó un recuento celular y las células se lavaron con tampón de tinción (PBS + 5 % de FBS + 2 mM de EDTA). Se añadieron anticuerpos contra TIGIT, TIM3, PD-L1 y PD1 a las células y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron los anticuerpos restantes contra marcadores de superficie a la suspensión celular y se incubaron durante 20 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con tampón de tinción y, posteriormente, se fijaron y permeabilizaron con el kit de tinción de Foxp3/factores de transcripción (eBioscience) según las instrucciones del fabricante. A continuación, se añadieron anticuerpos contra marcadores intracelulares a las células y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente (Tabla Supl. 3). Después de lavar los anticuerpos no unidos, se analizaron las muestras en un BD FACSymphony (BD Biosciences). Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (Flowjo LLC).

Se estableció la puerta de tiempo basándose en la región de MFI de PE estable en función del tiempo para eliminar las señales aberrantes causadas por cualquier inestabilidad del flujo. La puerta FSC frente a SSC se estableció en el tamaño y la granularidad esperados de las células, según experimentos anteriores en los que se utilizaron células fijadas y permeabilizadas con un kit comercial de tinción de Foxp3 para eliminar los residuos del análisis. A continuación, se realizó la segmentación de singulete mediante FSC-H frente a FSC-A y la exclusión de la viabilidad de células vivas/muertas para eliminar aún más las señales fluorescentes aberrantes. La mayoría de las puertas de población positiva y negativa se definieron en gráficos de pseudocolor segmentando el área de menor densidad o dividiéndola en el espacio en blanco entre las distintas poblaciones positiva y negativa. Estas puertas también se establecieron de manera que fueran generalmente aplicables a múltiples muestras de la cohorte con el fin de reducir la variabilidad de la segmentación entre las muestras, al tiempo que se tiene en cuenta la variabilidad biológica humana esperada de la densidad del antígeno. Para las poblaciones con una resolución poco clara, la positividad del antígeno se definió en función de los controles internos de otros subconjuntos de células que no expresan el marcador, o en función de la muestra con la población negativa más baja y se aplicó a todas las muestras como medio de estandarización. Se proporcionan estadísticas detalladas de la citometría de flujo, incluidas las abundancias de los subconjuntos de células inmunitarias en cada momento, en los Datos Suplementarios (Fig. Supl. 14).

Se realizaron comparaciones entre los respondedores y los no respondedores utilizando la prueba de Wilcoxon. Estas comparaciones se representaron gráficamente mediante gráficos de dispersión con barras de error. Los análisis estadísticos se realizaron en R (versión 4.3.2), y se consideró que un valor de p < 0,05 indicaba significación.

Los cambios postratamiento en los subconjuntos de células inmunitarias se cuantificaron como proporciones en relación con la línea de base y se evaluó su valor predictivo utilizando el análisis del área bajo la curva ROC (AUROC). La dinámica longitudinal de las proporciones de células inmunitarias se visualizó mediante gráficos de caja en los diferentes momentos del tratamiento, y la significación estadística se evaluó utilizando pruebas t de dos colas. Se realizaron análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para evaluar las asociaciones entre la dinámica de las células inmunitarias y los resultados clínicos, y los valores de P se obtuvieron de la prueba de log-rank.

Resumen de la presentación de resultados

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen de la presentación de resultados de Nature Portfolio vinculado a este artículo.