Comparación de las mutaciones/vías que presentan un enriquecimiento diferencial entre el estadio II y el estadio IV del cáncer colorrectal con dMMR/MSI-H.

El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los tipos de cáncer más comunes y de más rápido crecimiento en todo el mundo. Según las estimaciones de GLOBOCAN 2020, a nivel mundial hubo 1,15 millones de nuevos casos de cáncer de colon y 0,7 millones de nuevos casos de cáncer de recto en 2020. A medida que avanza la investigación, se espera que estas cifras aumenten a 1,92 millones, 1,16 millones y 78.000, respectivamente, para 2040.^[1],^[2] Se reconoce ampliamente que el CCR es una enfermedad heterogénea con diversos mecanismos moleculares subyacentes. La complejidad patológica del CCR se debe principalmente a su inestabilidad genómica, lo que conduce a una mayor acumulación de mutaciones en oncogenes y genes supresores de tumores. La inestabilidad genómica incluye la inestabilidad cromosómica y la inestabilidad de microsatélites (MSI).^[3],^[4] La MSI alta (MSI-H) se asoció estrechamente con la deficiencia en la reparación de errores de emparejamiento (dMMR) en el CCR y se encontró en el 15%-20% de los CCR en estadio II y III. Los pacientes con CCR dMMR/MSI-H tendieron a tener un mejor pronóstico que aquellos con tumores con microsatélites estables y reparación de errores de emparejamiento eficiente (pMMR)^[5]; sin embargo, los pacientes con CCR dMMR/MSI-H que sufrieron recurrencia o metástasis podrían tener un mal pronóstico debido a su insensibilidad a la quimioterapia.^[6] El estadio de la enfermedad también desempeñó un papel importante en la determinación del pronóstico de los pacientes con CCR dMMR/MSI-H.^[7]

Dada la heterogeneidad del CCR dMMR/MSI-H y las diferentes respuestas a los tratamientos en los distintos estadios, la identificación de alteraciones genéticas y vías específicas del estadio es crucial para desarrollar terapias dirigidas y mejorar los resultados de los pacientes. Este estudio tiene como objetivo llenar este vacío comparando los perfiles de mutación y los mecanismos moleculares entre el estadio II y el estadio IV del CCR dMMR/MSI-H, con el potencial de informar la toma de decisiones clínicas y las estrategias terapéuticas.

Materiales y métodos

Participantes del estudio

Cuarenta y siete pacientes con CCR que fueron tratados en el Hospital General del Ejército Popular de Liberación de China (Beijing, China) desde enero de 2016 hasta diciembre de 2019 fueron incluidos en este estudio. Los criterios de inclusión fueron (1) pacientes con CCR primario confirmado por patología; (2) se realizó secuenciación de alto rendimiento dentro de los tres meses posteriores a la obtención de las muestras de tejido tumoral; (3) pacientes que fueron clasificados como dMMR/MSI-H por los resultados de la secuenciación; y (4) pacientes que consintieron en participar en este estudio. Las muestras de tejido tumoral se obtuvieron mediante aspiración con aguja fina (AAF) de los sitios del tumor primario bajo guía ecográfica o tomográfica. Los 47 pacientes tenían muestras de tejido tumoral fijadas en formalina y embebidas en parafina (FFPE) y muestras de glóbulos blancos (GB) emparejadas disponibles para el análisis de secuenciación. Todas las muestras de tejido tumoral se obtuvieron de los sitios del tumor primario. Se requirió el consentimiento informado por escrito de cada paciente antes de que analizáramos sus muestras de ADN con fines de investigación. Los datos demográficos y las características clínicas de los pacientes se obtuvieron de los registros médicos electrónicos y las entrevistas telefónicas. Este estudio fue aprobado por los Comités de Ética Institucional del Hospital General del Ejército Popular de Liberación de China (ubicación: Beijing; número de aprobación: S2017-009-01; y fecha de aprobación: 2017-2-23).

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki (1975, según se revisó en 2024) y las directrices de Buenas Prácticas Clínicas. El protocolo y sus modificaciones fueron aprobados por la junta de revisión institucional. Todos los pacientes proporcionaron el consentimiento informado por escrito.

Flujo de trabajo para la exclusión del síndrome de Lynch

Todos los pacientes con tumores dMMR/MSI-H se sometieron a inmunohistoquímica (IHQ) para las proteínas de reparación de errores de emparejamiento (MMR) (MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2). Los casos con pérdida de MLH1/PMS2 se analizaron posteriormente para la metilación del promotor de MLH1 y la mutación BRAF V600E. Los pacientes con metilación confirmada del promotor de MLH1 o mutación BRAF V600E se consideraron CCR esporádicos y se incluyeron en el estudio.

Los pacientes con pérdida de MSH2/MSH6 o pérdida aislada de PMS2 o MSH6, así como aquellos con sospecha de síndrome de Lynch según la IHQ o la historia familiar, se sometieron a pruebas de la línea germinal para detectar variantes patógenas en MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 y EPCAM. Los individuos con mutaciones confirmadas en la línea germinal asociadas con el síndrome de Lynch fueron excluidos del estudio.

Secuenciación de alto rendimiento y análisis de datos

Según las instrucciones del fabricante, las muestras se cargaron en la plataforma de secuenciación de alto rendimiento Illumina HiSeq 4000 (Illumina, Inc., San Diego, CA, EE. UU., https://www.illumina.com). El panel de secuenciación cubrió 416 genes relacionados con el cáncer (Nanjing Geneseeq Technology, Inc., Nanjing, China), abarcando 1,46 megabases (Mb) del genoma humano. Los ADN formaron cúmulos de ADN en la celda de flujo en el kit de ensayo. La secuenciación de alto rendimiento se llevó a cabo en la plataforma de secuenciación a través de ciclos de síntesis de una sola base e interrupción, detección de fluorescencia y reanudación de la síntesis. Los resultados de la secuenciación de alto rendimiento se alinearon con los datos del genoma chino hg19 y se completó el mapeo de genes. Los resultados del mapeo analizaron simultáneamente mutaciones puntuales, mutaciones de inserción/deleción, variaciones del número de copias y anomalías estructurales de los cromosomas. La base de datos del Proyecto de los 1000 Genomas y la base de datos de polimorfismos de un solo nucleótido (dbSNP) se utilizaron para la alineación con el fin de analizar las mutaciones específicas del tumor y las mutaciones de la línea germinal. Agrupamos las variantes con una frecuencia poblacional de 1, lo que indica que estaban asociados con un mayor riesgo (Figura 7). Específicamente, hubo 10 genes estadísticamente significativos, que fueron AIP (HR = 1,50, IC del 95%: 1,01-2,23, p = 0,04), CDKN2A (HR = 1,19, IC del 95%: 1,04-1,35, p = 0,01), CUX1 (HR = 1,43, IC del 95%: 1,00-2,06, p = 0,04), FLT1 (HR = 1,29, IC del 95%: 1,01-1,63, p = 0,03), FLT4 (HR = 1,25, IC del 95%: 1,01-1,53, p = 0,04), GSTM1 (HR = 1,09, IC del 95%: 1,01-1,19, p = 0,03), MEF2B (HR = 1,42, IC del 95%: 1,12-1,81, p = 2,8 × 10-3), NOTCH3 (HR = 1,23, IC del 95%: 1,01-1,51, p = 0,04), SRY (HR = 1,68, IC del 95%: 1,13-2,50, p = 0,04) y XPA (HR = 1,59, IC del 95%: 1,05-2,41, p = 0,03). De estos 10 genes destacados, nueve se encuentran en los genes mutados comunes a los pacientes en estadio II y IV, y uno proviene de un gen mutado único de los pacientes en estadio IV (Figura 5). Además, utilizamos los datos de supervivencia y los perfiles de expresión de todos los pacientes con CRC en la base de datos TCGA para trazar la curva de Kaplan-Meier de estos 10 genes (Figura 8).

En el estadio IV, la vía del carcinoma de células basales (ES = 0,6408 y NP = 0,0253) y la vía de señalización de Notch (ES = 0,6663 y NP = 0,0227) continuaron mostrando un enriquecimiento significativo, lo cual es consistente con los hallazgos del estadio II y apoya aún más el papel continuo de esta vía en la progresión tumoral. Además, la vía de reparación del desajuste de bases (ES = 0,6832 y NP = 0,0273) mostró una significancia notable, lo que respaldó la estrecha asociación entre la reparación del desajuste de bases y el desarrollo tumoral. Otras vías directamente asociadas con los tumores, como el metabolismo del lactato (ES = 0,6343 y NP = 0,0722), también mostraron un enriquecimiento significativo, lo que podría estar relacionado con la reprogramación metabólica de las células tumorales (Figura 4). Estos hallazgos destacan que los patrones de enriquecimiento de vías específicas pueden estar estrechamente relacionados con la biología y el estadio de progresión del tumor en diferentes etapas del desarrollo tumoral.

Análisis de enriquecimiento de vías para mutaciones específicas del estadio

De los 378 genes mutados, 279 estaban presentes en los tumores dMMR/MSI-H de CRC de los estadios II y IV. Un total de 63 y 36 genes mutados fueron específicos de los tumores de los estadios II y IV, respectivamente (Tabla 4 y Figura 5). Por lo tanto, analizamos las vías de señalización diferencialmente enriquecidas utilizando las mutaciones específicas de los estadios II o IV. Como se muestra en la Figura 6, generalmente hubo más vías de señalización enriquecidas en los pacientes del estadio IV que en los del estadio II. En particular, las vías relacionadas con el metabolismo mostraron las mayores diferencias entre los pacientes de los estadios II y IV en términos de la mayor proporción de genes y las diferencias en el valor p. Además, las mutaciones específicas del estadio IV se enriquecieron en gran medida en múltiples vías, incluidas las vías de señalización de HIF-1, insulina, Rap1, JAK-STAT y VEGF, mientras que las mutaciones específicas del estadio II estuvieron implicadas principalmente en las vías de señalización de GnRH y anemia de Fanconi (Figura 6).

Genes relacionados con el pronóstico y su importancia pronóstica para el CRC

Utilizamos los datos de supervivencia de los pacientes de los estadios II y IV en la base de datos TCGA para identificar los genes asociados con el pronóstico entre todos los genes mutados. En este análisis, evaluamos la relación entre los genes asociados con la razón de riesgo (HR) y encontramos que todos los genes con significancia estadística tenían HR > 1, lo que indica que estaban asociados con un mayor riesgo (Figura 7). Específicamente, hubo 10 genes con significancia estadística, que fueron AIP (HR = 1,50, IC del 95%: 1,01–2,23, p = 0,04), CDKN2A (HR = 1,19, IC del 95%: 1,04–1,35, p = 0,01), CUX1 (HR = 1,43, IC del 95%: 1,00–2,06, p = 0,04), FLT1 (HR = 1,29, IC del 95%: 1,01–1,63, p = 0,03), FLT4 (HR = 1,25, IC del 95%: 1,01–1,53, p = 0,04), GSTM1 (HR = 1,09, IC del 95%: 1,01–1,19, p = 0,03), MEF2B (HR = 1,42, IC del 95%: 1,12–1,81, p = 2,8 × 10^-3), NOTCH3 (HR = 1,23, IC del 95%: 1,01–1,51, p = 0,04), SRY (HR = 1,68, IC del 95%: 1,13–2,50, p = 0,04) y XPA (HR = 1,59, IC del 95%: 1,05–2,41, p = 0,03). De estos 10 genes destacados, nueve se encuentran en los genes mutados comunes a los pacientes de los estadios II y IV, y uno proviene de un gen mutado único de los pacientes del estadio IV (Figura 5). Además, utilizamos los datos de supervivencia y los perfiles de expresión de todos los pacientes con CRC en la base de datos TCGA para trazar la curva de Kaplan-Meier de estos 10 genes (Figura 8).

Discusión

En este estudio, comparamos las diferencias en el espectro de mutaciones genéticas entre los estadios II y IV de CRC dMMR/MSI-H. Hasta donde sabemos, nuestro estudio fue el primero en examinar los perfiles mutacionales diferenciales basados en el estadio de la enfermedad y los mecanismos moleculares en pacientes chinos con CRC dMMR/MSI-H, y nuestros hallazgos ayudaron a comprender mejor la base genética de la progresión de la enfermedad en CRC dMMR/MSI-H.

Nuestro estudio revela perfiles mutacionales y mecanismos moleculares distintos entre los estadios II y IV de CRC dMMR/MSI-H, lo que tiene implicaciones clínicas significativas. El enriquecimiento diferencial de las mutaciones en genes como TSC2, FGFR1 y SMAD3 en los pacientes del estadio IV sugiere que la focalización de estas vías podría ser beneficiosa en las etapas avanzadas. Además, la identificación de genes pronósticos como AIP, CDKN2A y CUX1 proporciona posibles biomarcadores para la estratificación del riesgo y la planificación del tratamiento. Estos hallazgos subrayan la importancia de los enfoques de tratamiento personalizados basados en el estadio de la enfermedad y el perfil genético.

Aunque 31 pacientes informaron antecedentes familiares de CRC, el cribado integral mediante inmunohistoquímica, la metilación del promotor de MLH1 y las pruebas de BRAF V600E, así como el análisis de la línea germinal, confirmaron que ninguno cumplía los criterios genéticos para el síndrome de Lynch. En el análisis del panorama de mutaciones, empleamos la secuenciación de alto rendimiento y descubrimos que la frecuencia de mutación de SMARCA4, EPHA3, MTHFR, RAD50 y PDGFRB fue significativamente mayor en los pacientes del estadio II que en los del estadio IV. Por otro lado, la frecuencia de mutación de TSC2, FGFR1, PTPN13, SMAD3 y STK11 en los pacientes del estadio IV fue significativamente mayor que en los del estadio II. Se sabe que SMARCA4, PDGFRB y EPHA3 son proteínas efectoras aguas arriba de múltiples vías de señalización,^[12][]–^[14], mientras que RAD5 y MTHFR están implicados en la reparación del ADN y la metilación.^[15],^[16]. Entre las mutaciones en puntos críticos en los pacientes del estadio IV, TSC2, SMAD3, FGFR1 y PTPN13 fueron proteínas efectoras de las principales vías de señalización, como las vías de señalización PI3K-AKT y del factor de crecimiento transformante beta (TGF-β),^[17][][]–^[20], y las mutaciones en estos genes tendieron a causar una división, proliferación y migración celular desreguladas, lo que condujo a un crecimiento tumoral incontrolado.^[21][][]–^[24]. Además, el análisis GSEA reveló un enriquecimiento significativo de las vías asociadas con la tumorigénesis, lo que proporciona información valiosa sobre los fundamentos moleculares de la progresión del CRC. En el estadio II, observamos un enriquecimiento notable en la vía de señalización de Notch y la vía del carcinoma de células basales. Se sabe que la vía de señalización de Notch, conocida por su doble papel como oncogén o supresor tumoral, está implicada en el desarrollo y la progresión de varios cánceres, incluidos los cánceres hematológicos y los tumores sólidos. Su desregulación es crucial en el proceso oncogénico, y nuestros hallazgos subrayan su relevancia en el CRC en etapa temprana. La vía del carcinoma de células basales, que también mostró un enriquecimiento significativo, sugiere un posible papel en las etapas tempranas de la tumorigénesis, lo que justifica una mayor investigación. En el estadio IV, el enriquecimiento continuo y significativo tanto de las vías del carcinoma de células basales como de la señalización de Notch se alinea con nuestros hallazgos del estadio II, lo que refuerza su importancia a lo largo de la progresión del CRC. La aparición de la vía de reparación del desajuste de bases como significativamente enriquecida en el estadio IV es consistente con la relación establecida entre la reparación del desajuste de bases y la tumorigénesis. Además, el enriquecimiento de la vía del metabolismo del lactato sugiere la reprogramación metabólica de las células tumorales, que es una característica reconocida del cáncer. Estos hallazgos sugieren que los patrones de enriquecimiento de vías específicas están intrínsecamente relacionados con las características biológicas y las etapas de progresión del CRC, lo que destaca la naturaleza dinámica de la enfermedad.

Descubrimos varias diferencias potenciales en los mecanismos moleculares entre los estadios II y IV de CRC dMMR/MSI-H. Las mutaciones específicas del estadio IV se enriquecieron principalmente en las vías relacionadas con el crecimiento tumoral, la proliferación y la transformación maligna, como las vías de señalización de RAP1, JAK-STAT y VEGF.^[25][]–^[27]. RAP1, que contiene los isoformas RAP1A y RAP1B, es un miembro de la familia de pequeñas proteínas G RAS,^[28], y la deleción de RAP1 podría interrumpir la adhesión célula-célula y promover la invasividad de las células cancerosas.^[29],^[30]. Otros estudios informaron que la sobreexpresión de RAP1B activó la vía de señalización PI3K/AKT/mTOR en el cáncer gástrico y fue un factor pronóstico desfavorable.^[31],^[32]. Además, la vía de señalización JAK-STAT se asoció con las respuestas inmunitarias, la inflamación y la proliferación celular,^[33],^[34], y la activación aberrante de STAT3 en el cáncer de colon se asoció con un mal pronóstico.^[35]. Morikawa et al.^[36] analizaron la activación de STAT3 en 725 pacientes con cáncer de colon y encontraron que los niveles de fosforilación de tirosina de STAT3 estaban significativamente elevados en los tejidos cancerosos en etapa tardía y en las metástasis de los ganglios linfáticos. La activación de STAT3 en las células tumorales también puede dar como resultado la metilación aberrante del promotor o la inactivación de la proteína tirosina fosfatasa, lo que conduce a una disminución de la expresión de las proteínas supresoras de la señalización de citocinas (SOCS) y a una activación persistente de STAT3.^[37]. La vía de señalización de VEGF se asoció con la angiogénesis, y su interrupción desempeñó un papel irremplazable en la tumorigénesis y la metástasis.^[27]. En la actualidad, los fármacos antiangiogénicos se han convertido en tratamientos prometedores para el CRC. En general, el CRC dMMR/MSI-H de los estadios II y IV exhibió espectros de mutación y mecanismos moleculares significativamente diferentes, lo que puede explicar al menos parcialmente la gran diferencia en los resultados del tratamiento entre los dos grupos de pacientes.

En los tejidos tumorales dMMR/MSI-H, la reparación aberrante del ADN conduce a la acumulación de mutaciones génicas, lo que a su vez provoca un gran número de neoantígenos. El estado inmunitario de los pacientes en etapa temprana suele estar a un nivel normal sin supresión de la actividad de los linfocitos. En contraste, los pacientes en etapa tardía tendieron a tener una expresión aberrante de PD-L1 y evasión inmune,^[38],^[39], lo que resultó en una capacidad disminuida para reconocer y eliminar los tumores. Nuestro estudio mostró que las vías PI3K-AKT y RAS-MAPK fueron las vías de señalización más pronunciadas que se mutaron en los pacientes del estadio IV, y estudios anteriores han demostrado que las mutaciones en estas vías pueden suprimir el sistema inmunitario.^[40][][][][]–^[45]. Además, encontramos que IL7R se mutó exclusivamente en los tumores del estadio IV. IL-7R media varias vías de señalización que son vitales para el desarrollo y la homeostasis de las células T normales.^[28],^[46]. Por lo tanto, las mutaciones de IL7R podrían afectar potencialmente la inmunidad durante la progresión de la enfermedad y podrían desempeñar un papel en la determinación de la sensibilidad a los tratamientos con PD-1.

Nuestro análisis de la base de datos TCGA identificó diez genes con HR estadísticamente significativas > 1, lo que indica su asociación con un mayor riesgo de mal pronóstico. Estos genes incluyen AIP, CDKN2A, CUX1, FLT1, FLT4, GSTM1, MEF2B, NOTCH3, SRY y XPA. El hecho de que nueve de estos genes se encuentren en los genes mutados comunes a los pacientes de los estadios II y IV, y uno sea único del estadio IV, sugiere un panorama genético compartido que contribuye a la progresión del CRC, con mutaciones adicionales específicas de las etapas avanzadas. Las curvas de Kaplan-Meier para estos genes, construidas utilizando los datos de supervivencia y expresión de todos los pacientes con CRC en la base de datos TCGA, dilucidan aún más su importancia pronóstica.

La identificación de estos genes ofrece una base para comprender los determinantes genéticos del pronóstico del CRC y puede informar el desarrollo de terapias dirigidas. La superposición entre los estadios sugiere que, si bien ciertas alteraciones genéticas son comunes en todo el espectro de la enfermedad, otras son específicas de las etapas avanzadas, lo que podría influir en la respuesta al tratamiento y la supervivencia. Los detalles del tratamiento de todos los pacientes con datos disponibles se resumen en la Tabla Suplementaria 1.

Nuestro estudio presenta varias limitaciones. En primer lugar, el análisis se limitó a las etapas II y IV del CCRC, lo que restringió nuestra comprensión de la progresión de la enfermedad en todas las etapas. Los estudios futuros deberían considerar la inclusión de más etapas para dilucidar completamente los cambios moleculares en el CCRC. En segundo lugar, el tamaño limitado de la muestra afectó la profundidad de nuestro análisis estadístico; los estudios posteriores deberían ampliar el tamaño de la muestra y considerar la validación de los resultados utilizando datos de bases de datos públicas. Además, los datos de la carga mutacional tumoral (TMB) no estaban disponibles para todos los pacientes debido al período de seguimiento relativamente corto en el momento del análisis. Aunque hemos proporcionado valores de TMB para un subconjunto de pacientes en el Material Suplementario (Tabla Suplementaria 2), el conjunto de datos incompleto puede limitar la evaluación exhaustiva de la TMB como biomarcador en esta cohorte. Aunque resumimos los regímenes de tratamiento recibidos por los pacientes en los grupos de etapa II y etapa IV, el tiempo de seguimiento relativamente corto y los datos de supervivencia incompletos impiden actualmente un análisis sólido de la asociación entre terapias específicas y los resultados clínicos. Los valores de TMB estaban disponibles para 12 pacientes y se proporcionan en la Tabla Suplementaria 2; lamentablemente, los datos de TMB para los casos restantes no pudieron obtenerse debido al período de seguimiento corto en el momento del análisis (Tabla Suplementaria 1). A medida que continúe el seguimiento y los datos maduren, planeamos realizar análisis pronósticos más detallados en estudios futuros para dilucidar mejor el impacto del tratamiento en la supervivencia en pacientes con CCRC dMMR/MSI-H.

Conclusión

Este estudio revela perfiles de mutación y mecanismos moleculares distintos entre la etapa II y la etapa IV del CCRC dMMR/MSI-H en pacientes chinos. La etapa IV presenta un enriquecimiento de mutaciones (por ejemplo, TSC2, FGFR1 y SMAD3) y vías (por ejemplo, RAP1, JAK-STAT y VEGF) que impulsan la proliferación, la evasión inmune y la metástasis, mientras que la etapa II muestra patrones diferentes. Se identificaron genes pronósticos (por ejemplo, AIP, CDKN2A y CUX1) y alteraciones de las vías (por ejemplo, Notch, carcinoma de células basales, reparación de errores de emparejamiento y metabolismo del lactato). Estas diferencias genéticas y moleculares específicas de la etapa arrojan luz sobre la comprensión de la trayectoria molecular durante la progresión de la enfermedad y facilitan la elección de regímenes de tratamiento apropiados en el CCRC dMMR/MSI-H.