Dinámica espaciotemporal de la abundancia de Mcl-1 y su influencia en la susceptibilidad a la apoptosis

La apoptosis es una forma altamente regulada de muerte celular programada, que es necesaria durante el desarrollo, para la eliminación de células dañadas o infectadas y para mantener la homeostasis tisular ([Nagata & Tanaka, 2017]). En consecuencia, la apoptosis desregulada puede contribuir a trastornos degenerativos y enfermedades proliferativas, como el cáncer ([Hanahan, 2022]; [Vitale et al., 2023]). Muchos factores estresantes y tipos de daño celular pueden iniciar la señalización de la apoptosis a través de las vías de apoptosis extrínseca o intrínseca, ambas convergiendo en las mitocondrias, donde suficientes señales apoptóticas conducen a la permeabilización de la membrana externa mitocondrial (MOMP). La MOMP representa un punto de control central que desencadena la fase de ejecución de la apoptosis y está tanto orquestada como estrictamente regulada a través de las interacciones de los miembros de la familia de proteínas Bcl-2 ([Czabotar & Garcia-Saez, 2023]; [Singh et al., 2019]). Los miembros proapoptóticos Bax y Bak pueden oligomerizarse para formar poros en la membrana mitocondrial externa, mientras que los inhibidores antiapoptóticos como Bcl-2, Bcl-xL y Mcl-1 inhiben a Bax y Bak. Los miembros del grupo de proteínas BH3 solo proapoptóticas antagonizan las proteínas de la familia Bcl-2 antiapoptóticas o, además, activan directamente a Bax y Bak ([Czabotar & Garcia-Saez, 2023]; [Singh et al., 2019]). La expresión elevada de los miembros de la familia Bcl-2 antiapoptóticos promueve, en consecuencia, la resistencia a la apoptosis al neutralizar las proteínas BH3 solo y mantener a Bax y Bak bajo control, y la sobreexpresión o la amplificación génica de Bcl-2, Bcl-xL y Mcl-1 se encuentra con frecuencia en varios cánceres ([Beroukhim et al., 2010]; [Tsujimoto et al., 1984]). A pesar de sus funciones protectoras superpuestas, estas proteínas difieren notablemente en su regulación y estabilidad. Bcl-2 y Bcl-xL son relativamente estables y proporcionan una protección sostenida contra la apoptosis ([Goodall et al., 2016]). En contraste, Mcl-1 se degrada mucho más rápidamente (vida media = 20-40 min, ([Nijhawan et al., 2003]; [Schwickart et al., 2010])), lo que permite que sus niveles de proteína se ajusten rápidamente mediante cambios en la transcripción, la traducción y la degradación proteasómica ([Senichkin et al., 2020]). Mcl-1 se localiza predominantemente en la MOM, pero también se ha informado que Mcl-1 se encuentra en el citoplasma, en el retículo endoplásmico y en el núcleo ([Fu et al., 2022]; [Kale et al., 2018]; [Nakajima et al., 2014]). En la MOM, Mcl-1 ejerce su función antiapoptótica canónica al secuestrar los formadores de poros proapoptóticos, pero también parece apoyar la bioenergética mitocondrial y la aptitud metabólica celular ([Brinkmann et al., 2025]; [Wright et al., 2024]). En contraste con Bcl-2 y Bcl-xL, la expresión de Mcl-1 también está regulada por la progresión del ciclo celular ([Harley et al., 2010]; [Pollak et al., 2021]), y los niveles elevados de Mcl-1 confieren una resistencia transitoria, trans-mitótica a la apoptosis extrínseca ([Pollak et al., 2021]).

Aquí, combinamos imágenes cuantitativas de alta resolución a nivel de célula única y subcelular junto con el modelado matemático para dilucidar cómo la dinámica de expresión y la distribución subcelular de Mcl-1 definen los umbrales de apoptosis mitocondrial. Además, mostramos cómo las diferencias entre células en la susceptibilidad a la apoptosis surgen de las heterogeneidades intercelulares naturales en la expresión y distribución de Mcl-1, y demostramos que ambos factores contribuyen de forma independiente a la resistencia a la apoptosis.

Resultados

Mcl-1 se acumula a medida que avanza el ciclo celular y se redistribuye a las mitocondrias.

Análisis bioquímicos previos en poblaciones celulares y análisis microscópicos de células únicas mostraron que los niveles de Mcl-1 están regulados a lo largo del ciclo celular ([Harley et al., 2010]; [Pollak et al., 2021]). Además, la imagen de proyección de intensidad máxima indicó que Mcl-1 podría redistribuirse hacia las mitocondrias durante la progresión del ciclo celular, aunque estas mediciones carecían de una resolución espacial auténtica ([Pollak et al., 2021]). Aquí, por lo tanto, nos propusimos determinar cuantitativamente los cambios relativos genuinos en los niveles y la localización de Mcl-1 a nivel de resolución de célula única dentro y entre los principales compartimentos celulares, incluido el núcleo, el citosol y las mitocondrias. Las células NCI-H460 que expresan geminin-GFP como indicador del ciclo celular se etiquetaron con MitoTracker rojo y DAPI como marcadores de segmentación para mitocondrias y núcleos, respectivamente, y se tiñeron para Mcl-1 (Figura 1A). La segmentación de una sola capa nos permitió separar las regiones nuclear, citosólica y mitocondrial (Figura 1B, consulte también la sección de métodos). Las concentraciones de Mcl-1 fueron más altas en las regiones mitocondriales, lo que corresponde a los resultados de Bcl-xL, un miembro relacionado de la familia Bcl-2 (Figura 1C). La presencia de grupos de Mcl-1 no mitocondriales también se confirmó por sus señales que superaban sustancialmente las obtenidas mediante el uso de solo tinción con anticuerpo secundario, así como por la fraccionamiento bioquímico (Figura S1A-C). Separar y comparar células de las primeras y últimas etapas del ciclo celular en función de la ausencia o la presencia de señales de reportero de geminin muy altas (Figura S1D) mostró que las concentraciones de Mcl-1 en todos los compartimentos aumentaron desde las primeras etapas del ciclo celular (G1) hasta las últimas etapas del ciclo celular (S/G2 tardío), con los mayores aumentos de concentración observados en las mitocondrias (Figura 1D, E). En contraste, las concentraciones subcelulares de Bcl-xL no aumentaron en ninguno de los compartimentos (Figura 1F). Para comparar las distribuciones de proteínas subcelulares de Mcl-1, calculamos las relaciones entre las intensidades medias del citoplasma y las mitocondrias para cada célula individual. Si bien las relaciones para Bcl-xL permanecieron constantes, Mcl-1 se redistribuyó de manera muy prominente hacia las mitocondrias (Figura 1G). Si bien el tamaño de las áreas nuclear, citosólica y mitocondrial aumentó a lo largo del ciclo celular (Figura S1E), las concentraciones y distribuciones de Mcl-1 no se correlacionaron y, por lo tanto, no pudieron explicarse por estos cambios (Figura S1F-H). En conjunto, estos análisis demuestran que las concentraciones celulares de Mcl-1 aumentan con la progresión del ciclo celular y que, además, Mcl-1 se acumula de forma desproporcionada en las mitocondrias (Figura 1H).

La redistribución de Mcl-1 ocurre de forma concomitante, pero independiente, de la acumulación de Mcl-1.

Para estudiar si los aumentos de Mcl-1 a lo largo del ciclo celular y su redistribución hacia las mitocondrias están acoplados temporal y mecánicamente, aplicamos un análisis combinatorio de tinción celular y pseudotiempo. Para inferir la dinámica de los cambios en la expresión y la redistribución de Mcl-1, combinamos las señales de geminin-GFP y las intensidades de DAPI, esta última que indica el contenido de ADN. Como datos instantáneos, ambos proporcionan información sobre la posición del ciclo celular de las células individuales desde la fase S hasta la G2 y hacia la entrada en la mitosis. Estas posiciones se vincularon luego a los datos de tinción celular de Mcl-1. La agrupación y la normalización de experimentos independientes (Figura 2A) nos proporcionaron información de un total de 4500 células individuales. Los niveles de Mcl-1 y la redistribución de Mcl-1 a las mitocondrias aumentaron de forma concomitante a lo largo de las dimensiones de geminin-GFP y DAPI (Figura 2B, C). Debido a la corta duración de la mitosis, las células en fase M estaban cuantitativamente subrepresentadas en este análisis. Por lo tanto, recopilamos por separado datos de imagen que incluían células en fase M y células hermanas G1 recién divididas (Figura 2D). Las células en fase M expresaban Mcl-1 a concentraciones significativamente más altas que en las fases S/G2 (Figura 2E). Las células justo antes o durante la división inicialmente conservaron la alta concentración de Mcl-1 observada en la fase M (Figura 2E). Las células también mantuvieron la acumulación de Mcl-1 en las mitocondrias durante la mitosis y en las células hermanas recién divididas (Figura 2F). Esto sugiere que las células hijas inicialmente heredan tanto el aumento de la expresión como la acumulación mitocondrial de Mcl-1 de las células madre, antes de que los niveles y las distribuciones de Mcl-1 vuelvan a los valores que se encuentran en las células G1 típicas. Por lo tanto, la expresión y la redistribución de Mcl-1 también están reguladas de forma concurrente durante y a través de la mitosis.

A continuación, evaluamos si la acumulación y la redistribución dependían entre sí. Las células NCI-H460 con la depleción inducible de Mcl-1 (Figura 2G) no acumularon cantidades notables de Mcl-1 desde la fase G1 hasta la fase S/G2 (Figura 2H). Sin embargo, las pequeñas cantidades de Mcl-1 restantes aún se redistribuyeron hacia las mitocondrias (Figura 2I). Este hallazgo excluye que la alta acumulación de Mcl-1 en las últimas fases del ciclo celular sea suficiente para impulsar su acumulación desproporcionada en las mitocondrias.

En conjunto, por lo tanto, concluimos que tanto los niveles de expresión de Mcl-1 como su distribución subcelular están regulados en paralelo con la progresión del ciclo celular, pero independientemente entre sí.

Mcl-1 se intercambia rápidamente entre las mitocondrias y el citoplasma.

La detección de los niveles de Mcl-1 en las mitocondrias, pero también en el citoplasma y el núcleo, y la evidencia de su redistribución espacio-temporal plantean la pregunta de cuán móvil es Mcl-1 entre estos compartimentos.

Para estudiar la cinética de intercambio entre las mitocondrias y el citoplasma, etiquetamos fluorescentemente Mcl-1 endógeno con mScarlet en el extremo N-terminal mediante el sistema CRISPR-Cas9 en las células NCI-H460 (H460-S-Mcl-1). Las células H460-S-Mcl-1 expresaron mScarlet-Mcl-1 con el peso molecular esperado (Figura 3A, B). El secuenciamiento y la amplificación por PCR confirmaron además la inserción correcta del ADN de mScarlet en el locus de Mcl-1 (Figura S2A), y la fluorescencia de mScarlet-Mcl-1 disminuyó cuando se dirigió a la expresión de Mcl-1 mediante siRNA (Figura S2B). Además, la expresión de mScarlet-Mcl-1 aumentó y mScarlet-Mcl-1 se redistribuyó hacia las mitocondrias a medida que avanzaba el ciclo celular (Figura 3C, D, Figura S2C). mScarlet-Mcl-1 mantuvo su función antiapoptótica, como lo demuestran los perfiles de tiempo de muerte comparables entre las células NCI-H460 WT y H460-S-Mcl-1 tras el tratamiento con Fc-scTRAIL y mediante la eliminación de la resistencia transmitótica previamente descrita al tratamiento con TRAIL ([Pollak et al., 2021]) mediante la inhibición farmacológica de mScarlet-Mcl-1 (Figura S2D, E). En conjunto, estos hallazgos demuestran que la proteína de fusión mScarlet-Mcl1 refleja con precisión el comportamiento y la potencia antiapoptótica de la proteína no etiquetada intrínseca.

A continuación, medimos la cinética de intercambio de mScarlet-Mcl-1 (unión y liberación mitocondrial) mediante la pérdida de fluorescencia por fotoblanqueo (FLIP) en células individuales (Figura 3E). Las células vecinas sirvieron como células de control para corregir las señales de fotoblanqueo en las regiones adyacentes mediante la dispersión de la luz (Figura S2F-H). Los datos de medición de FLIP corregidos (Figura S2I) nos permitieron trazar la disminución de la fluorescencia en el citoplasma y las mitocondrias. Las intensidades de mScarlet-Mcl-1 citosólicas disminuyeron rápidamente, como se esperaba de la difusión libre entre las áreas de fotoblanqueo y medición (Figura 3F). Sorprendentemente, la intensidad de mScarlet-Mcl-1 mitocondrial también disminuyó rápidamente, lo que sugiere una movilidad relativamente alta también para el grupo de Mcl-1 asociado con las mitocondrias (Figura 3F). Para cuantificar la cinética de intercambio, definimos un modelo matemático basado en ecuaciones diferenciales ordinarias para describir los resultados de FLIP mediante estimaciones de los parámetros cinéticos subyacentes (Figura 3G). Como se esperaba, la tasa de fotoblanqueo se identificó de forma única a partir de los datos experimentales, ya que era independiente de los otros parámetros (Figura S2J). En contraste, las tasas de intercambio y dependieron linealmente entre sí (Figura 3H), de modo que cualquier combinación de y a lo largo del óptimo lineal satisfizo los datos experimentales (Figura 3I). Para simplificar, establecimos en cero para determinar el mínimo como un número explícito para el modelo. En general, estos resultados demuestran que Mcl-1 se intercambia entre los grupos citosólicos y mitocondriales, y que estos intercambios se producen a velocidades más rápidas que las de la producción o degradación de proteínas (Figura 3K).

Para determinar si este intercambio abarca toda la reserva de Mcl-1, examinamos la retención de Mcl-1 en las mitocondrias después de una permeabilización selectiva de la membrana plasmática con digitonina ([Niklas et al., 2011]). Después de la permeabilización, grandes cantidades de Mcl-1 se difundieron fuera de la célula, pero en menor medida de lo que se esperaría de una proteína citosólica completamente soluble (comparar con GAPDH) (Figura S3A). En comparación con Mcl-1, las señales de TOM20 se retuvieron mucho mejor, como se esperaba de una proteína integrada en la membrana (Figura S3A). Tiempos de incubación más prolongados con digitonina aumentaron solo marginalmente la pérdida de Mcl-1, lo que demuestra que la reserva restante de Mcl-1 se mantiene estable dentro de las células (Figura S3B). La observación de la pérdida de Mcl-1 marcada con Scarlet tras la adición de digitonina en tiempo real proporcionó resultados similares. Una cantidad sustancial de Mcl-1 se perdió inmediatamente tras la permeabilización basada en digitonina, y el análisis de proporciones mostró que el Mcl-1 restante estaba predominantemente asociado con las mitocondrias (Figura S3C, D). Estos datos sugieren que una fracción de Mcl-1 se elimina rápidamente de la célula después de la permeabilización, y que una reserva de Mcl-1 asociada o integrada en la membrana se mantiene estable incluso después de una incubación más prolongada con digitonina. Al purificar las mitocondrias para los experimentos de extracción con carbonato, no se encontró Mcl-1 en los sobrenadantes de las mitocondrias aisladas, lo que confirma aún más que cualquier Mcl-1 restante está establemente asociado o integrado en la membrana mitocondrial externa (Figura S3E, F). La extracción con carbonato a un pH elevado transfirió más fácilmente las subreservas de Mcl-1 al sobrenadante que la TOM20 integrada en la membrana, y cantidades sustanciales de Mcl-1 permanecieron fuertemente asociadas a la fracción mitocondrial (Figura S3F).

En conjunto, estos resultados demuestran que Mcl-1 existe en dos reservas, una de las cuales puede intercambiarse rápidamente entre las mitocondrias (o las regiones asociadas a las mitocondrias) y el citosol, mientras que la otra está fuertemente asociada a la membrana o integrada en las mitocondrias.### Las estimaciones cuantitativas de los umbrales alterados de MOMP indican que la máxima resistencia requiere tanto la redistribución como la acumulación de Mcl-1.

Dado que la acumulación y la redistribución de Mcl-1 se producen en paralelo durante la progresión del ciclo celular, utilizamos un modelado matemático determinista para cuantificar su contribución relativa a la alteración de la susceptibilidad a MOMP a lo largo del ciclo celular. Desarrollamos un primer modelo para describir la regulación espacio-temporal de Mcl-1 (Figura 4A), y luego lo acoplamos con un componente de modelo separado que permitió cuantificar los umbrales de MOMP. La progresión a través del ciclo celular se integró infiriendo la duración de las fases individuales, la proporción de células en las respectivas fases y la duración total del ciclo celular en las células H460 (Figura S4A). Además, se tuvieron en cuenta los cambios en el volumen celular con la progresión en el ciclo celular (Figura S4B). El modelo resultante se pudo utilizar para simular la acumulación dependiente del ciclo celular de Mcl-1 y su redistribución subcelular (Figura 4B, C). Para verificar cuantitativamente la precisión del modelo, simulamos una población de 2000 células no sincronizadas (Figura S4C), de la cual se pudieron comparar directamente las instantáneas de la población con los experimentos. Los resultados de la simulación para la redistribución y la acumulación de Mcl-1 dependientes del ciclo celular se correspondieron excelentemente con los datos experimentales (Figura 4D, E). Luego, utilizamos el modelo para separar matemáticamente la acumulación de Mcl-1 y su redistribución a las mitocondrias, que de otro modo serían biológicamente concomitantes, de modo que sus respectivas contribuciones a los umbrales de MOMP pudieran estimarse de forma independiente. En contraste con el modelo completo que reflejaba tanto la redistribución como la acumulación de Mcl-1, como se observó experimentalmente (Figura 4F), la variante del modelo "Solo redistribución" mantuvo constantes las cantidades de Mcl-1 para aislar el efecto único de la redistribución de Mcl-1 (Figura 4G). Por el contrario, la variante del modelo "Solo acumulación" mantuvo constante la afinidad de Mcl-1 hacia las mitocondrias, separando así la acumulación de Mcl-1 a lo largo del ciclo celular de los efectos derivados de la alteración de la redistribución subcelular (Figura 4H). Las concentraciones de Mcl-1 mitocondrial fueron muy similares entre todas las variantes durante G1, pero difirieron sustancialmente hacia el final del ciclo celular (Figura 4I). Tanto la redistribución como la acumulación de Mcl-1 contribuyeron significativamente a elevar las concentraciones de Mcl-1 mitocondrial, y ambos actuaron juntos para lograr las concentraciones máximas de Mcl-1 mitocondrial en la fase M (Figura 4J). Las concentraciones de Mcl-1 mitocondrial de las variantes del modelo sirvieron como entrada para un modelo matemático simplificado y validado experimentalmente capaz de estimar la susceptibilidad a MOMP ([Hantusch et al., 2018]). En este modelo, t-Bid sirvió como una señal de entrada proapoptótica representativa y ajustable, mientras que la susceptibilidad a MOMP se evaluó mediante la cantidad de Bax y Bak en los poros (interactoma visualizado en la Figura S4D-G). En comparación con solo la redistribución o la acumulación de Mcl-1, se requirió una cantidad sustancialmente mayor de t-Bid para la oligomerización de Bax y Bak cuando se tuvo en cuenta tanto la acumulación como la redistribución de Mcl-1 (Figura 4K). Definiendo un umbral del 10% de Bax y Bak en los poros como un mínimo para una MOMP eficiente, ambos procesos elevaron conjuntamente la resistencia a MOMP aproximadamente de 2 a 3 veces desde G1 hasta la fase M (Figura 4K, L).

En conjunto, estos resultados de simulación sugieren que tanto la acumulación como la redistribución contribuyen sustancialmente a la resistencia a la apoptosis y que ambos procesos son necesarios para lograr la máxima resistencia a MOMP al final del ciclo celular.### La localización subcelular y los niveles de expresión de Mcl-1 contribuyen de forma independiente a la regulación de la susceptibilidad a la apoptosis.

A continuación, nos propusimos estudiar si la redistribución y la acumulación de Mcl-1 contribuyen realmente de forma independiente a la mayor resistencia a la apoptosis en los experimentos. Primero, medimos la heterogeneidad de los niveles de expresión y la distribución subcelular de Mcl-1 en las células H460-S-Mcl-1. Para hacer que estas células dependieran del Mcl-1 endógeno para la supervivencia, inhibimos tanto Bcl-2 como Bcl-xL (10 µM ABT-199, 10 µM WEHI-539) y luego analizamos la relación entre la abundancia y la localización de Mcl-1 en células individuales, y la cinética de la muerte celular tras la inhibición de Mcl-1 (1 µM S63845) (Figura 5A).

Para capturar suficientemente la heterogeneidad de la población, primero medimos la expresión y la distribución de Mcl-1 en un total de 420 células y luego aplicamos nuestro modelo matemático para estimar las resistencias a MOMP de estas células (Figura 5B). Como se esperaba de los contribuyentes independientes a la resistencia a la muerte celular, los umbrales de MOMP aumentaron con la expresión de Mcl-1 y también con su redistribución hacia las mitocondrias (Figura 5B). Las sensibilidades a la apoptosis medidas experimentalmente (tiempo hasta la muerte (TTD) después de la inhibición de Mcl-1) se correspondieron muy bien con esta predicción (Figura 5C), y tanto la expresión de Mcl-1 como la acumulación mitocondrial se correlacionaron con los tiempos de supervivencia (Figura S5A, B). Para un análisis más exhaustivo y cuantitativo de los efectos de la expresión y la distribución de Mcl-1 en los tiempos de supervivencia, comparamos las células con una expresión similar de Mcl-1 pero diferentes distribuciones, o viceversa (Figura 5D, E). Si bien las células con una alta relación Mcl-1cito/mito y una baja expresión de Mcl-1 murieron más rápido, ya sea una redistribución hacia las mitocondrias o un aumento de la expresión general de Mcl-1 fueron suficientes para extender significativamente los tiempos de supervivencia (Figura 5F). Las células con una alta expresión de Mcl-1 y una alta acumulación en las mitocondrias sobrevivieron más tiempo (Figura 5F, Figura S5C). Examinamos además si otros factores, como el tamaño de la célula o la posición de la célula, influyeron adicionalmente en los tiempos de supervivencia medidos. Sin embargo, estos parámetros mostraron solo un poder explicativo mínimo, en comparación con la distribución de Mcl-1 y la expresión general de Mcl-1 (Figura S5D).

Para cuantificar las contribuciones relativas de la distribución y la expresión de Mcl-1 en los tiempos de supervivencia, realizamos regresiones lineales univariadas y bivariadas (Figura 5G). Encontramos que el modelo bivariado fue significativamente mejor para predecir las duraciones de supervivencia (TTD) que los modelos univariados individuales (Figura 5H), lo que confirma que ambos parámetros contribuyen significativamente a la sensibilidad a la apoptosis. Es importante destacar que los valores absolutos de los coeficientes de regresión para las cantidades generales de Mcl-1 y sus proporciones de distribución se encontraban dentro de un rango similar, lo que demuestra a partir de los datos experimentales que ambos parámetros contribuyen igualmente a la resistencia a la apoptosis (Figura 5I).

En conjunto, estos hallazgos experimentales demuestran que la relación de distribución de Mcl-1 y los niveles totales de expresión de Mcl-1 actúan de forma independiente entre sí y contribuyen a la resistencia a la apoptosis en un grado comparable.### La heterogeneidad del tumor del paciente en las distribuciones de Mcl-1 contribuye a una alta variabilidad intercelular en la resistencia a MOMP esperada.

Nuestros resultados muestran que las células cancerosas proliferantes atraviesan fases de diferente resistencia a la apoptosis, impulsadas por cambios tanto en la abundancia como en la localización subcelular de Mcl-1. Esta regulación dinámica crea una heterogeneidad intercelular sustancial en la susceptibilidad a MOMP. A continuación, preguntamos si también se podía observar una heterogeneidad similar en los tejidos tumorales humanos.

Para abordar esto, evaluamos muestras de tejido de cáncer colorrectal en estadio III que no habían recibido tratamiento y que se habían analizado previamente mediante imágenes de inmunofluorescencia multiplex de proteínas de señalización de la apoptosis ([Lindner et al., 2022]). En resumen, las muestras teñidas de cuatro pacientes se sometieron a segmentación celular para lograr una resolución a nivel de célula individual, seguida de la asignación del tipo de célula en compartimentos estromales, inmunitarios y tumorales. En el presente estudio, ampliamos este análisis para incluir la segmentación subcelular en regiones citoplasmáticas y mitocondriales, la evaluación cuantitativa de la expresión y la distribución de Mcl-1, y el cálculo basado en modelos de la resistencia a MOMP para células individuales (Figura 6A). Las células individuales se segmentaron en función del ADN nuclear y la tinción de la quinasa S6 del citoplasma. Las mitocondrias se segmentaron utilizando una combinación de señales de Bak y Smac (Figura 6B). Las células tumorales se identificaron utilizando los marcadores epiteliales AE1 y PCK26 (Figura 6C, Figura S6A). Como se esperaba, los compartimentos mitocondriales exhibieron cantidades elevadas de Mcl-1 en comparación con las regiones nuclear y citoplasmática (Figura S6B). Además, las proporciones de distribución de Mcl-1 en las células tumorales coincidieron estrechamente con las observadas en las células cancerosas humanas (Figura S6C). Tanto los niveles generales de expresión de Mcl-1 como su distribución subcelular mostraron una heterogeneidad pronunciada en todas las cuatro muestras de pacientes (Figura 6D), comparable a la heterogeneidad observada en nuestros experimentos con líneas celulares.

A continuación, investigamos en qué medida la heterogeneidad en la distribución de Mcl-1 afecta a la resistencia predicha a la MOMP en las células tumorales. Primero, estimamos la resistencia a la MOMP basándonos únicamente en la abundancia total de Mcl-1, de forma análoga a la estratificación patológica clásica en muestras de expresión baja, media y alta, pero a nivel de célula individual (Figura 6E). Al simular la sensibilidad a la apoptosis de estas células, el aumento de la abundancia de Mcl-1 se correlacionó, como se esperaba, con un aumento de la resistencia a la MOMP (Figura 6F). Es importante destacar que la incorporación de la distribución subcelular medida de Mcl-1 en el modelo aumentó notablemente la heterogeneidad en la resistencia a la MOMP predicha dentro de cada grupo de expresión (Figura 6G). En consecuencia, las poblaciones celulares que parecían estar bien separadas basándose únicamente en la abundancia de Mcl-1 ahora se superponen sustancialmente en su resistencia a la MOMP predicha (Figura 6H, I; Figura S6D). Al extender este análisis más allá de los grupos de expresión discretos (baja, media y alta) a todas las células analizadas, se obtuvo un patrón muy similar al observado en las líneas celulares: tanto la abundancia de Mcl-1 como su distribución entre los compartimentos subcelulares contribuyen a determinar el umbral general de la MOMP (Figura 6J, Figura S6E). En otras palabras, se espera que las células con niveles totales similares de Mcl-1 difieran notablemente en su sensibilidad a la apoptosis debido a las diferencias en la distribución subcelular de Mcl-1.

En conjunto, estos hallazgos demuestran que tanto los niveles de expresión de Mcl-1 como su localización intracelular influyen en la sensibilidad a la apoptosis predicha de las células tumorales individuales, y tanto la cantidad como la distribución contribuyen de forma independiente a una alta heterogeneidad en la resistencia a la apoptosis esperada dentro del tejido tumoral humano.

Mcl-1 se acumula durante la progresión del ciclo celular y se redistribuye hacia las mitocondrias.

Análisis bioquímicos previos en poblaciones celulares y análisis microscópicos de células individuales mostraron que los niveles de Mcl-1 están regulados a lo largo del ciclo celular ([Harley et al., 2010]; [Pollak et al., 2021]). Además, la proyección de intensidad máxima en imágenes indicó que Mcl-1 podría redistribuirse hacia las mitocondrias durante la progresión del ciclo celular, aunque estas mediciones carecían de una resolución espacial auténtica ([Pollak et al., 2021]). Por lo tanto, aquí nos propusimos determinar cuantitativamente los cambios relativos genuinos en la cantidad y la localización de Mcl-1 a nivel de célula individual dentro y entre los principales compartimentos celulares, incluido el núcleo, el citosol y las mitocondrias. Las células NCI-H460 que expresan geminin-GFP como indicador del ciclo celular se etiquetaron con MitoTracker rojo y DAPI como marcadores de segmentación para las mitocondrias y los núcleos, respectivamente, y se tiñeron para Mcl-1 (Figura 1A). La segmentación de una sola capa nos permitió separar las regiones nuclear, citosólica y mitocondrial (Figura 1B, véase también la sección de métodos). Las concentraciones de Mcl-1 fueron más altas en las regiones mitocondriales, lo que coincide con los resultados de Bcl-xL, un miembro relacionado de la familia Bcl-2 (Figura 1C). La presencia de grupos no mitocondriales de Mcl-1 también se confirmó por sus señales que superaban sustancialmente las obtenidas mediante el uso únicamente de anticuerpo secundario, así como por la fraccionamiento bioquímico (Figura S1A–C). La separación y comparación de células de las primeras y últimas etapas del ciclo celular, basándose en la ausencia o la presencia de señales muy altas del reportero de geminin (Figura S1D), mostraron que las concentraciones de Mcl-1 en todos los compartimentos aumentaron desde las primeras etapas del ciclo celular (G1) hasta las últimas etapas (final de S/G2), con los mayores aumentos de concentración observados en las mitocondrias (Figura 1D, E). En contraste, las concentraciones subcelulares de Bcl-xL no aumentaron en ninguno de los compartimentos (Figura 1F). Para comparar las distribuciones subcelulares de proteínas de Mcl-1, calculamos las relaciones entre las intensidades medias del citoplasma y las mitocondrias para cada célula individual. Si bien las relaciones de Bcl-xL se mantuvieron constantes, Mcl-1 se redistribuyó de manera muy prominente hacia las mitocondrias (Figura 1G). Si bien el tamaño de las áreas nuclear, citosólica y mitocondrial aumentó a lo largo del ciclo celular (Figura S1E), las concentraciones y distribuciones de Mcl-1 no se correlacionaron y, por lo tanto, no pudieron explicarse por estos cambios (Figura S1F–H). En conjunto, estos análisis demuestran que las concentraciones celulares de Mcl-1 aumentan con la progresión del ciclo celular y que, además, Mcl-1 se acumula de forma desproporcionada en las mitocondrias (Figura 1H).

La redistribución de Mcl-1 ocurre de forma concomitante, pero independiente, a la acumulación de Mcl-1.

Para estudiar si los aumentos de Mcl-1 a lo largo del ciclo celular y su redistribución hacia las mitocondrias están acoplados temporal y mecánicamente, aplicamos un análisis combinatorio de tinción celular y pseudotiempo. Para inferir la dinámica de los cambios en la expresión y la redistribución de Mcl-1, combinamos las señales de geminin-GFP y las intensidades de DAPI, esta última indicando el contenido de ADN. Como datos instantáneos, ambos proporcionan información sobre la posición del ciclo celular de las células individuales desde la fase S hasta la G2 y hacia la entrada en la mitosis. Estas posiciones se vincularon luego a los datos de tinción celular de Mcl-1. La agrupación y normalización de experimentos independientes (Figura 2A) nos proporcionó información de un total de 4500 células individuales. Las cantidades de Mcl-1 y la redistribución de Mcl-1 a las mitocondrias aumentaron de forma concomitante a lo largo de las dimensiones de geminin-GFP y DAPI (Figura 2B, C). Debido a la corta duración de la mitosis, las células en fase M estaban cuantitativamente subrepresentadas en este análisis. Por lo tanto, recopilamos por separado datos de imagen que incluían células en fase M y células hermanas G1 recién divididas (Figura 2D). Las células en fase M expresaban Mcl-1 a concentraciones significativamente más altas que en las fases S/G2 (Figura 2E). Las células justo antes o durante la división inicialmente conservaron la alta concentración de Mcl-1 observada en la fase M (Figura 2E). Las células también mantuvieron la acumulación de Mcl-1 en las mitocondrias durante la mitosis y en las células hermanas recién divididas (Figura 2F). Esto sugiere que las células hijas inicialmente heredan tanto el aumento de la expresión como la acumulación mitocondrial de Mcl-1 de las células madre, antes de que las cantidades y distribuciones de Mcl-1 vuelvan a los valores que se encuentran en las células G1 típicas. Por lo tanto, la expresión y la redistribución de Mcl-1 también están reguladas de forma concurrente durante y a través de la mitosis.

A continuación, evaluamos si la acumulación y la redistribución dependían entre sí. Las células NCI-H460 con la depleción inducible de Mcl-1 (Figura 2G) no acumularon cantidades notables de Mcl-1 desde la fase G1 hasta la fase S/G2 (Figura 2H). Sin embargo, las pequeñas cantidades de Mcl-1 restantes aún se redistribuyeron hacia las mitocondrias (Figura 2I). Este hallazgo excluye que el alto aumento de Mcl-1 en las últimas fases del ciclo celular sea suficiente por sí solo para impulsar su acumulación desproporcionada en las mitocondrias.

En conjunto, por lo tanto, concluimos que tanto los niveles de expresión de Mcl-1 como su distribución subcelular están regulados en paralelo con la progresión del ciclo celular, pero de forma independiente entre sí.

Mcl-1 se intercambia rápidamente entre las mitocondrias y el citoplasma.

La detección de las cantidades de Mcl-1 en las mitocondrias, pero también en el citoplasma y el núcleo, y la evidencia de su redistribución espacio-temporal, plantean la pregunta de cuán móvil es Mcl-1 entre estos compartimentos.

Para estudiar la cinética de intercambio entre las mitocondrias y el citoplasma, etiquetamos fluorescentemente Mcl-1 endógeno con mScarlet en el extremo N-terminal mediante el sistema CRISPR-Cas9 en las células NCI-H460 (H460-S-Mcl-1). Las células H460-S-Mcl-1 expresaron mScarlet-Mcl-1 con el peso molecular esperado (Figura 3A, B). El secuenciamiento y la amplificación por PCR confirmaron además la inserción correcta del ADN de mScarlet en el locus de Mcl-1 (Figura S2A), y la fluorescencia de mScarlet-Mcl-1 disminuyó cuando se dirigió a la expresión de Mcl-1 mediante siRNA (Figura S2B). Además, la expresión de mScarlet-Mcl-1 aumentó y mScarlet-Mcl-1 se redistribuyó hacia las mitocondrias a lo largo de la progresión del ciclo celular (Figura 3C, D, Figura S2C). mScarlet-Mcl-1 mantuvo su función antiapoptótica, como lo demuestran los perfiles de tiempo de muerte comparables entre las células NCI-H460 WT y H460-S-Mcl-1 tras el tratamiento con Fc-scTRAIL, y al eliminar la resistencia transmitótica previamente descrita al tratamiento con TRAIL (Pollak et al., 2021) mediante la inhibición farmacológica de mScarlet-Mcl-1 (Figura S2D, E). En conjunto, estos hallazgos demuestran que la proteína de fusión mScarlet-Mcl1 refleja con precisión el comportamiento y la potencia antiapoptótica de la proteína no etiquetada intrínseca.

A continuación, medimos la cinética de intercambio de mScarlet-Mcl-1 (unión y liberación mitocondrial) mediante la pérdida de fluorescencia por fotoblanqueo (FLIP) en células individuales (Figura 3E). Las células vecinas sirvieron como células de control para corregir las señales de fotoblanqueo en las regiones adyacentes mediante la dispersión de la luz (Figura S2F–H). Los datos de medición de FLIP corregidos (Figura S2I) nos permitieron trazar la disminución de la fluorescencia en el citoplasma y las mitocondrias. Las intensidades de mScarlet-Mcl-1 citosólicas disminuyeron rápidamente, como se esperaba de la difusión libre entre las áreas de fotoblanqueo y medición (Figura 3F). Sorprendentemente, la intensidad de mScarlet-Mcl-1 mitocondrial también disminuyó rápidamente, lo que sugiere una movilidad relativamente alta también para el grupo de Mcl-1 asociado con las mitocondrias (Figura 3F). Para cuantificar la cinética de intercambio, definimos un modelo matemático basado en ecuaciones diferenciales ordinarias para describir los resultados de FLIP mediante estimaciones de los parámetros cinéticos subyacentes (Figura 3G). Como se esperaba, la tasa de fotoblanqueo se identificó de forma única a partir de los datos experimentales, ya que era independiente de los otros parámetros (Figura S2J). En contraste, las tasas de intercambio y dependieron linealmente entre sí (Figura 3H), de modo que cualquier combinación de y a lo largo del óptimo lineal satisfizo los datos experimentales (Figura 3I). Para simplificar, establecimos en cero para determinar el mínimo como un número explícito para el modelo. Es importante destacar que la inhibición de la traducción o degradación de proteínas mediante cicloheximida o bortezomib no afectó el rango de valores mínimos determinados a partir de células individuales en estos experimentos (Figura 3J). En general, estos resultados demuestran que Mcl-1 se intercambia entre los grupos citosólicos y mitocondriales, y que estos intercambios se producen a velocidades más rápidas que las de la producción o degradación de proteínas (Figura 3K).

Para determinar si este intercambio abarca todo el grupo de Mcl-1, examinamos la retención de Mcl-1 mitocondrial después de la permeabilización selectiva de la membrana plasmática con digitonina ([Niklas et al., 2011]). Después de la permeabilización, grandes cantidades de Mcl-1 se difundieron fuera de la célula, pero menos de lo que se esperaría de una proteína citosólica completamente soluble (comparar con GAPDH) (Figura S3A). En comparación con Mcl-1, las señales de TOM20 se conservaron mucho mejor, como se esperaba de una proteína integrada en la membrana (Figura S3A). Los tiempos de incubación más largos con digitonina solo aumentaron marginalmente la pérdida de Mcl-1, lo que demuestra que el grupo restante de Mcl-1 se retiene de forma estable dentro de las células (Figura S3B). La observación de la pérdida de Mcl-1 etiquetado con Scarlet tras la adición de digitonina en tiempo real proporcionó resultados similares. Un grupo sustancial de Mcl-1 se perdió inmediatamente tras la permeabilización basada en digitonina, y el análisis de la relación mostró que el Mcl-1 restante estaba predominantemente asociado con las mitocondrias (Figura S3C, D). Estos datos sugieren que una fracción de Mcl-1 se elimina rápidamente de la célula después de la permeabilización y que un grupo de Mcl-1 asociado a la membrana o integrado permanece retenido de forma estable incluso después de una incubación más larga con digitonina. Al purificar las mitocondrias para los experimentos de extracción de carbonato, no se encontró Mcl-1 en los sobrenadantes de las mitocondrias aisladas, lo que confirma aún más que cualquier Mcl-1 restante está asociado de forma estable o integrado en la membrana mitocondrial externa (Figura S3E, F). La extracción de carbonato a un pH elevado transfirió más fácilmente los subgrupos de Mcl-1 al sobrenadante que la proteína integrada en la membrana TOM20, y cantidades sustanciales de Mcl-1 permanecieron estrechamente asociadas con la fracción mitocondrial (Figura S3F).

En conjunto, estos resultados demuestran que Mcl-1 existe en dos compartimentos, uno de los cuales puede intercambiarse rápidamente entre las mitocondrias (o regiones asociadas a las mitocondrias) y el citosol, mientras que el otro está estrechamente asociado a la membrana o integrado en las mitocondrias.

Las estimaciones cuantitativas de los umbrales alterados de MOMP indican que la máxima resistencia requiere tanto la redistribución como la acumulación de Mcl-1.

Dado que la acumulación y la redistribución de Mcl-1 se producen en paralelo durante la progresión del ciclo celular, utilizamos un modelado matemático determinista para cuantificar su contribución relativa a la alteración de la susceptibilidad a MOMP a lo largo del ciclo celular. Desarrollamos un primer modelo para describir la regulación espacio-temporal de Mcl-1 (Figura 4A), y luego lo combinamos con un componente de modelo separado que permitió cuantificar los umbrales de MOMP. La progresión a través del ciclo celular se integró infiriendo la duración de las fases individuales, la proporción de células en las respectivas fases y la duración total del ciclo celular en las células H460 (Figura S4A). Además, se tuvieron en cuenta los cambios en el volumen celular durante la progresión en el ciclo celular (Figura S4B). El modelo resultante se pudo utilizar para simular la acumulación dependiente del ciclo celular de Mcl-1 y su redistribución subcelular (Figura 4B, C). Para verificar cuantitativamente la precisión del modelo, simulamos una población de 2000 células no sincronizadas (Figura S4C), a partir de la cual se pudieron comparar directamente las instantáneas de la población con los experimentos. Los resultados de la simulación para la redistribución y la acumulación de Mcl-1 dependientes del ciclo celular se correspondieron excelentemente con los datos experimentales (Figura 4D, E). Luego, utilizamos el modelo para separar matemáticamente la acumulación de Mcl-1 y su redistribución a las mitocondrias, que de otro modo serían biológicamente concomitantes, de modo que sus respectivas contribuciones a los umbrales de MOMP pudieran estimarse de forma independiente. En contraste con el modelo completo que reflejaba tanto la redistribución como la acumulación de Mcl-1, tal como se observó experimentalmente (Figura 4F), la variante del modelo "Solo redistribución" mantuvo constantes las cantidades de Mcl-1 para aislar el efecto único de la redistribución de Mcl-1 (Figura 4G). Por el contrario, la variante del modelo "Solo acumulación" mantuvo constante la afinidad de Mcl-1 hacia las mitocondrias, separando así la acumulación de Mcl-1 a lo largo del ciclo celular de los efectos derivados de la alteración de la redistribución subcelular (Figura 4H). Las concentraciones de Mcl-1 mitocondrial fueron muy similares entre todas las variantes durante la fase G1, pero difirieron sustancialmente hacia el final del ciclo celular (Figura 4I). Tanto la redistribución como la acumulación de Mcl-1 contribuyeron significativamente a elevar las concentraciones de Mcl-1 mitocondrial, y ambos actuaron conjuntamente para lograr las concentraciones máximas de Mcl-1 mitocondrial en la fase M (Figura 4J). Las concentraciones de Mcl-1 mitocondrial de las variantes del modelo sirvieron como entrada para un modelo matemático simplificado y validado experimentalmente, capaz de estimar la susceptibilidad a MOMP ([Hantusch et al., 2018]). En este modelo, t-Bid sirvió como una señal de entrada proapoptótica representativa y ajustable, mientras que la susceptibilidad a MOMP se evaluó mediante la cantidad de Bax y Bak en los poros (interactoma visualizado en la Figura S4D-G). En comparación con solo la redistribución o la acumulación de Mcl-1, se requirió una cantidad sustancialmente mayor de t-Bid para la oligomerización de Bax y Bak cuando se tuvo en cuenta tanto la acumulación como la redistribución de Mcl-1 (Figura 4K). Definiendo un umbral del 10% de Bax y Bak en los poros como un mínimo para una MOMP eficiente, ambos procesos elevaron conjuntamente la resistencia a MOMP en aproximadamente 2-3 veces desde la fase G1 hasta la fase M (Figura 4K, L).

En conjunto, estos resultados de simulación sugieren que tanto la acumulación como la redistribución contribuyen sustancialmente a la resistencia a la apoptosis y que ambos procesos son necesarios para lograr la máxima resistencia a MOMP al final del ciclo celular.

La localización subcelular y los niveles de expresión de Mcl-1 contribuyen de forma independiente a la regulación de la susceptibilidad a la apoptosis.

A continuación, nos propusimos estudiar si la redistribución de Mcl-1 y la acumulación de Mcl-1 contribuyen realmente de forma independiente a una mayor resistencia a la apoptosis en los experimentos. Primero, medimos la heterogeneidad de los niveles de expresión de Mcl-1 y las distribuciones subcelulares en las células H460-S-Mcl-1. Para hacer que estas células dependieran del Mcl-1 endógeno para la supervivencia, inhibimos tanto Bcl-2 como Bcl-xL (10 µM ABT-199, 10 µM WEHI-539) y luego analizamos la relación entre la abundancia y la localización de Mcl-1 en células individuales, y la cinética de la muerte celular tras la inhibición de Mcl-1 (1 µM S63845) (Figura 5A).

Para capturar suficientemente la heterogeneidad de la población, primero medimos la expresión y la distribución de Mcl-1 en un total de 420 células y luego aplicamos nuestro modelo matemático para estimar las resistencias a MOMP de estas células (Figura 5B). Como cabría esperar de los contribuyentes independientes a la resistencia a la muerte celular, los umbrales de MOMP aumentaron con la expresión de Mcl-1 y también con su redistribución hacia las mitocondrias (Figura 5B). Las sensibilidades a la apoptosis medidas experimentalmente (tiempo hasta la muerte (TTD) tras la inhibición de Mcl-1) se correspondieron muy bien con esta predicción (Figura 5C), y tanto la expresión de Mcl-1 como la acumulación mitocondrial se correlacionaron con los tiempos de supervivencia (Figura S5A, B). Para un análisis más exhaustivo y cuantitativo de los efectos de la expresión y la distribución de Mcl-1 en los tiempos de supervivencia, comparamos las células con una expresión similar de Mcl-1 pero con diferentes distribuciones, o viceversa (Figura 5D, E). Si bien las células con una alta relación Mcl-1cito/mito y una baja expresión de Mcl-1 murieron más rápidamente, ya sea una redistribución hacia las mitocondrias o un aumento de la expresión general de Mcl-1 fueron suficientes para extender significativamente los tiempos de supervivencia (Figura 5F). Las células con una alta expresión de Mcl-1 y una alta acumulación en las mitocondrias sobrevivieron más tiempo (Figura 5F, Figura S5C). Examinamos además si otros factores, como el tamaño de la célula o la posición de la célula, influyeron adicionalmente en los tiempos de supervivencia medidos. Sin embargo, estos parámetros mostraron solo un poder explicativo mínimo, en comparación con la distribución de Mcl-1 y la expresión general de Mcl-1 (Figura S5D).

Para cuantificar las contribuciones relativas de la distribución y la expresión de Mcl-1 en los tiempos de supervivencia, realizamos regresiones lineales univariadas y bivariadas (Figura 5G). Descubrimos que el modelo bivariado fue significativamente mejor para predecir las duraciones de supervivencia (TTD) que los modelos univariados individuales (Figura 5H), lo que confirma que ambos parámetros contribuyen significativamente a la sensibilidad a la apoptosis. Es importante destacar que los valores absolutos de los coeficientes de regresión para las cantidades generales de Mcl-1 y sus proporciones de distribución se encontraban dentro de un rango similar, lo que demuestra a partir de los datos experimentales que ambos parámetros contribuyen igualmente a la resistencia a la apoptosis (Figura 5I).

En conjunto, estos hallazgos experimentales demuestran que la relación de distribución de Mcl-1 y los niveles totales de expresión de Mcl-1 actúan de forma independiente entre sí y contribuyen a la resistencia a la apoptosis en un grado comparable.

La heterogeneidad del tumor del paciente en las distribuciones de Mcl-1 contribuye a una alta variabilidad de célula a célula en la resistencia esperada a MOMP.

Nuestros resultados muestran que las células cancerosas proliferantes atraviesan fases de diferente resistencia a la apoptosis, impulsadas por cambios tanto en la abundancia como en la localización subcelular de Mcl-1. Esta regulación dinámica crea una heterogeneidad celular sustancial en la susceptibilidad a MOMP. A continuación, preguntamos si también se podía observar una heterogeneidad similar en los tejidos tumorales humanos.

Para abordar esto, evaluamos muestras de tejido de cáncer colorrectal en estadio III no tratadas previamente, que se habían analizado previamente mediante imágenes de inmunofluorescencia multiplex de proteínas de señalización de la apoptosis ([Lindner et al., 2022]). En resumen, las muestras teñidas de cuatro pacientes se sometieron a segmentación celular para lograr una resolución a nivel de célula individual, seguida de la asignación del tipo de célula en compartimentos estromales, inmunitarios y tumorales. En el presente estudio, ampliamos este análisis para incluir la segmentación subcelular en regiones citoplasmáticas y mitocondriales, la evaluación cuantitativa de la expresión y la distribución de Mcl-1, y el cálculo basado en el modelo de la resistencia a MOMP para células individuales (Figura 6A). Las células individuales se segmentaron en función del ADN nuclear y la tinción de la quinasa S6 del citoplasma. Las mitocondrias se segmentaron utilizando una combinación de señales de Bak y Smac (Figura 6B). Las células tumorales se identificaron utilizando los marcadores epiteliales AE1 y PCK26 (Figura 6C, Figura S6A). Como se esperaba, los compartimentos mitocondriales exhibieron cantidades elevadas de Mcl-1 en comparación con las regiones nuclear y citoplasmática (Figura S6B). Además, las proporciones de distribución de Mcl-1 en las células tumorales coincidieron estrechamente con las observadas en las células cancerosas humanas (Figura S6C). Tanto los niveles totales de expresión de Mcl-1 como su distribución subcelular mostraron una heterogeneidad pronunciada en todas las cuatro muestras de pacientes (Figura 6D), comparable a la heterogeneidad observada en nuestros experimentos con líneas celulares.

A continuación, investigamos la medida en que la heterogeneidad en la distribución de Mcl-1 afecta la resistencia a MOMP predicha en las células tumorales. Primero, estimamos la resistencia a MOMP basándonos únicamente en la abundancia total de Mcl-1, de forma análoga a la estratificación patológica clásica en muestras de baja, media y alta expresión, pero a resolución de célula individual (Figura 6E). Al simular la sensibilidad a la apoptosis de estas células, un aumento de la abundancia de Mcl-1 se correlacionó, como se esperaba, con un aumento de la resistencia a MOMP (Figura 6F). Es importante destacar que la incorporación de la distribución subcelular medida de Mcl-1 en el modelo aumentó notablemente la heterogeneidad en la resistencia a MOMP predicha dentro de cada grupo de expresión (Figura 6G). En consecuencia, las poblaciones celulares que parecían estar bien separadas basándose únicamente en la abundancia de Mcl-1 ahora se superponen sustancialmente en su resistencia a MOMP predicha (Figura 6H, I; Figura S6D). Ampliar este análisis más allá de los grupos de expresión discretos de baja, media y alta a todas las células analizadas produjo un patrón muy similar al observado en las líneas celulares: tanto la abundancia de Mcl-1 como su distribución entre los compartimentos subcelulares contribuyen a determinar el umbral general de MOMP (Figura 6J, Figura S6E). En otras palabras, se espera que las células con niveles totales similares de Mcl-1 difieran notablemente en su sensibilidad a la apoptosis debido a las diferencias en la distribución subcelular de Mcl-1.

En conjunto, estos hallazgos demuestran que tanto los niveles de expresión de Mcl-1 como la localización intracelular influyen en la sensibilidad a la apoptosis predicha de las células tumorales individuales, y que tanto la cantidad como la distribución contribuyen de forma independiente a una alta heterogeneidad en la resistencia a la apoptosis esperada dentro del tejido tumoral humano.

Discusión

En este estudio, demostramos que la expresión de Mcl-1 y su redistribución entre el citoplasma y las mitocondrias están coordinadas con la progresión del ciclo celular. Ambos procesos funcionan como reóstatos paralelos, independientes e igualmente potentes que aumentan la resistencia a la apoptosis a medida que las células avanzan en el ciclo celular.

Si bien se ha informado previamente sobre la regulación dependiente del ciclo celular de la abundancia de Mcl-1 a nivel poblacional y en células individuales ([Harley et al., 2010]; [Pollak et al., 2021]), aquí, por primera vez, identificamos la redistribución de Mcl-1 como un proceso independiente y definimos cuantitativamente su impacto en la resistencia a la apoptosis. Nuestros resultados indican que Mcl-1 existe tanto en fracciones solubles como en fracciones asociadas a las mitocondrias, siendo estas últimas fracciones que incluyen moléculas estrechamente unidas o integradas en la membrana. La existencia de diferentes fracciones de Mcl-1 está respaldada por informes que identifican fracciones de Mcl-1 en el núcleo y el citosol ([Fu et al., 2022]; [Kale et al., 2018]; [Nakajima et al., 2014]) y por la evidencia de fracciones de Mcl-1 que participan en diferentes interacciones en y dentro de las mitocondrias. Por ejemplo, se informó que las fracciones de Mcl-1 se localizan en la matriz mitocondrial, donde afectan la respiración y la fusión mitocondrial ([Perciavalle et al., 2012]). Mcl-1 también puede asociarse con ACSL1 en la membrana mitocondrial externa para regular la oxidación de ácidos grasos de cadena larga ([Wright et al., 2024]) y, obviamente, Mcl-1 puede interactuar con otros miembros de la familia Bcl-2 en la membrana mitocondrial externa ([Kale et al., 2018]). Dado el rápido intercambio de la fracción móvil de Mcl-1 entre las mitocondrias y el citosol que se identificó aquí, es tentador especular que una fracción sustancial de Mcl-1 está asociada a la membrana en lugar de integrada, lo que permitiría un intercambio rápido. Se ha informado previamente sobre el transporte dinámico de otros miembros de la familia Bcl-2, sobre todo durante la retrotranslocación dependiente de Bcl-xL de Bax y Bak desde las mitocondrias hacia el citosol ([Edlich et al., 2011]; [Todt et al., 2015]). Sin embargo, la regulación dependiente del ciclo celular de la localización de Mcl-1 parece ser distinta, ya que no observamos una regulación comparable para Bcl-xL. Además, la cinética de intercambio de Mcl-1 es notablemente rápida, superando tanto las tasas informadas de retrotranslocación mediada por Bcl-xL como la renovación de la proteína Mcl-1 ([Edlich et al., 2011]; [Nijhawan et al., 2003]; [Slomp et al., 2021]; [Todt et al., 2015]).

La acumulación de Mcl-1 en las mitocondrias desde la fase S y alcanzando su punto máximo en la fase M depende tanto del aumento de la abundancia de Mcl-1 como de su redistribución neta hacia las mitocondrias. Las células también aumentan de volumen y contenido mitocondrial a medida que avanzan en el ciclo celular ([Posakony et al., 1977]), lo que podría contribuir a niveles locales más altos de Mcl-1. Tanto en nuestras simulaciones como en nuestras mediciones, corregimos estos factores, pero aún así observamos una acumulación neta de Mcl-1 en las mitocondrias. Esto indica que la redistribución debe estar impulsada por otros procesos que promuevan la translocación a las mitocondrias, reduzcan la retrotranslocación o ambas.

Mostramos que las células hijas inicialmente heredan las cantidades máximas de Mcl-1 alcanzadas en sus células madre durante la fase M, antes de que estas cantidades de Mcl-1 se restablezcan a los niveles más bajos típicos de las células en fase G1. Esto puede parecer contradictorio con estudios previos que informan que la degradación de Mcl-1 comienza durante la fase M ([Allan et al., 2018]; [Clarke et al., 2018]; [Haschka et al., 2015]; [Wertz et al., 2011]). Sin embargo, estos estudios se centraron principalmente en escenarios de detención mitótica prolongada y utilizaron poblaciones celulares sincronizadas químicamente. Se puede concebir que, bajo una detención prolongada, se activan mecanismos de degradación que están ausentes o se activan más tarde, durante o después de una mitosis no perturbada. Además, la sincronización química de las células puede influir sustancialmente en los procesos asociados al ciclo celular y a la proliferación ([Cooper, 2003]; [Ligasová & Koberna, 2021]; [Min et al., 2020]), lo que podría interferir con la dinámica estudiada aquí. Aún así, no podemos descartar formalmente la posibilidad de que la degradación mejorada de Mcl-1 se inicie al menos en la fase M, sin afectar notablemente las cantidades de proteína. Dado que la citocinesis reduce significativamente el volumen de las células hijas en comparación con la célula madre, las concentraciones de Mcl-1 podrían mantenerse inicialmente a pesar de la degradación en curso. Es importante destacar que la distribución de Mcl-1 también se hereda en las células hijas, por lo que se espera que las células recién divididas exhiban inicialmente una alta resistencia a la apoptosis. De hecho, nuestro trabajo anterior sobre los destinos de las células transmitóticas durante la apoptosis extrínseca mostró que las células hijas que heredan altos niveles de Mcl-1 y caspasa-8 activa de las células madre necesitan al menos de 30 a 60 minutos para recuperar la competencia de MOMP ([Pollak et al., 2021]).

Si bien tanto las cantidades de Mcl-1 como su localización están reguladas a lo largo del ciclo celular, observamos una heterogeneidad celular sustancial en ambos parámetros, incluso entre las células de la misma etapa del ciclo celular. Dado que pudimos demostrar que la localización es tan importante para la toma de decisiones sobre el destino celular como las cantidades totales de Mcl-1, esto representa una capa independiente y igualmente significativa que contribuye a la variabilidad intercelular en la sensibilidad a la apoptosis. Aunque la heterogeneidad no genética en la susceptibilidad a la muerte celular se revela naturalmente en los estudios de células individuales ([Rehm et al., 2002]; [Spencer et al., 2009]), ahora se reconoce cada vez más como un contribuyente crítico que puede permitir que algunas células eviten la muerte y potencialmente provoquen la recurrencia del cáncer y la progresión de la enfermedad ([Ichim et al., 2015]; [Russo et al., 2024]). Nuestros análisis de muestras de tumores de pacientes confirman que la heterogeneidad en la expresión y la distribución subcelular de Mcl-1 también se produce entre las células de tumores individuales. Además, nuestras estimaciones de los umbrales de apoptosis indican que ambos parámetros influyen fuertemente en la resistencia esperada a la muerte celular, incluso difuminando las distinciones entre las poblaciones celulares que estarían claramente separadas basándose únicamente en la expresión de Mcl-1.

En nuestro estudio, nos centramos en identificar la dinámica de la regulación espacio-temporal de Mcl-1 y su relevancia para las consecuencias funcionales que afectan a los destinos celulares. Nuestra evidencia de que la regulación espacial de Mcl-1 afecta significativamente las decisiones celulares sobre la vida y la muerte, y que experimentalmente se ha demostrado que es tan importante como la acumulación total de Mcl-1, proporciona una justificación para futuros estudios destinados a desentrañar los mecanismos complejos y multifactoriales que probablemente controlan la localización subcelular de Mcl-1. Estos mecanismos podrían estar relacionados con el propio Mcl-1, sus proteínas interaccionantes o características de las mitocondrias que cambian a lo largo del ciclo celular y que afectan específicamente a Mcl-1 en lugar de a Bcl-xL. Dado que existen fracciones de Mcl-1 con distintas movilidades, comprender estos procesos subyacentes también podría permitir el desarrollo de estrategias farmacológicas que afecten selectivamente a la localización subcelular de fracciones específicas de Mcl-1. Esto podría contribuir a nuevas vías terapéuticas mediante las cuales se podrían evitar las toxicidades sistémicas que se producen tras la inhibición global de Mcl-1 ([Bolomsky et al., 2020]; [Kelly & Strasser, 2020]).

Materiales y métodos

Reactivos y anticuerpos

Los anticuerpos primarios fueron los siguientes: ratón anti- -Tubulina (DM1A, Cell Signaling #3873, 1:1000 western blotting (WB)), conejo anti-Calnexina (Cell Signaling #2433, 1:1000 WB), conejo anti-Cox IV (3E11, Cell Signaling #4850, 1:1000 WB), ratón anti-GAPDH (D4C6R, Cell Signaling #97166, 1:1000 WB), ratón anti-Laminina A/C (Cell Signaling #4777, 1:1000 WB), conejo anti-Mcl-1 (D2W9E, Cell Signaling #94296, 1:1000 WB, 1:800 IF, 1:50 citometría de flujo (FC)), ratón anti-RFP (ChromoTek 6g6, 1:1000 WB), conejo anti-Fosfo-Histona H3 (D2C2, Cell Signaling #3377 y #8552, 1:50 FC), conejo anti-Tom20 (Cell Signaling #42406, 1:1000 WB).

Los anticuerpos secundarios fueron los siguientes: cabra anti-IgG de conejo – Alexa Fluor 647 (Life Technologies Corporation), cabra anti-IgG de conejo – Alexa Fluor 488 (Life Technologies Corporation), cabra anti-IgG – Peroxidasa (Dianova GmbH), cabra anti-IgG de ratón – Peroxidasa (Dianova GmbH), cabra anti-IgG de conejo - IRDye®680RD (LI-COR GmbH), cabra anti-IgG de ratón - IRDye®800CW (LI-COR GmbH).

Fc-scTRAIL se produjo como se describió previamente ([Hutt et al., 2017]). El DMSO se compró a Carl Roth, ABT-199 a Active Biochem, S63845 y WEHI-539 a APExBIO y bortezomib a UBPBio. MioTracker™ Red CMXRos, MitoTracker™ Green FM y DAPI se obtuvieron de Invitrogen, y cicloheximida se compró a Sigma. La puromicina se obtuvo de AppliChem GmbH.

Plásmidos y transfecciones

El plásmido EZ-Tet-pLKO-Blast (Addgene #85973) se utilizó para expresar siRNA contra Mcl-1 (CCAGTATACTTCTTAGAAAGT), clonado como una secuencia de horquilla para la estabilización (CTAGC-CCAGTATACTTCTTAGAAAGT-TACTAGT-ACTTTCTAAGAAGTATACTGG-TTTTT-G). Este plásmido se transdujo por lentivirus en células NCI-H460.

Los plásmidos pSpCas9(BB)-2A-Puro human MCL-1 y pUC Scarlet-MCL-1 se recibieron de Stephen Tait ([Cao et al., 2022]) y se utilizaron para etiquetar endógenamente Mcl-1 con mScarlet en células NCI-H460. El Silencer®Select siRNA dirigido a Mcl-1 (ambion #s8583; CCAGUAUACUUCUUAGAAATT) se transfectó utilizando Lipofectamine®RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) según el protocolo del fabricante.

Etiquetado endógeno de Mcl-1 con mScarlet

Las células NCI-H460 se sembraron en un plato de Petri de 10 cm y se transfectaron a una confluencia de aproximadamente el 30%. El ADN del plásmido pSP-Cas9 y pUC-mScarlet (amablemente proporcionado por Stephen Tait, publicado en ([Cao et al., 2022]), se preparó con el kit de transfección Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher) según el protocolo del fabricante y se añadió a las células. 24 horas después de la transfección, el medio se cambió a un medio que contenía 0,5 µg/ml de puromicina para la selección de células positivas a la transfección. Las células se clasificaron en el FACS por su fluorescencia mScarlet y se expandieron como clones de células individuales. La intensidad de mScarlet de los clones expandidos se midió mediante citometría de flujo con excitación a 561 nm y un filtro de emisión de 586/15 nm. El tamaño molecular del constructo mScarlet-Mcl-1 se evaluó mediante inmunoblot para Mcl-1 y mScarlet. La distribución subcelular de mScarlet-Mcl-1 se validó utilizando la imagen de células vivas en el microscopio LSM 980. Para validar la inserción de mScarlet, el ADN genómico se amplificó utilizando el kit de extracción rápida de ADN (Biozym, #QE0905T) según el protocolo del fabricante. La inserción de mScarlet se amplificó mediante PCR y los productos de PCR se secuenciaron con éxito y se confirmó una inserción correcta. Los siguientes cebadores se utilizaron para amplificar el locus de Mcl-1: Mcl-1-UTR-for: CACTTCCGCTTCCTTCCAGT; Mcl-1-Ex1-rev2: CCGCGTTTCTTTTGAGGCCA. La PCR se realizó utilizando el kit PCR-NEB Q5. Las muestras de PCR se cargaron en un gel de agarosa al 1% y el ADN se tiñó con EtBr en el gel. Las bandas respectivas se cortaron del gel y se secuenciaron.

Cultivo celular

Las células se cultivaron con medio RPMI 1640, suplementado con 10% (v/v) de FBS en matraces de cultivo celular (37 °C, 5% de CO2). Las células se sembraron y se pasaron con una proporción de pasaje entre 1:3 y 1:10.

Imagen de inmunofluorescencia y análisis de imágenes

Para analizar las concentraciones de proteínas subcelulares, las células cultivadas en portaobjetos fueron incubadas con MitoTracker Red CMXRos (100 nM) durante 90 minutos antes de la fijación con 4% de PFA, la permeabilización con 0,3% de Triton-X-100 y la inmunotinción. Los núcleos se tiñeron utilizando DAPI. Las imágenes se adquirieron en un microscopio de disco giratorio Zeiss Axio Observer SD equipado con un objetivo de aceite Plan-Apochromat 40×/1.4 NA y una cámara CCD Axiocam 503 Mono. La geminina se excitó con un láser de diodo de 488 nm utilizando un filtro de emisión de 525/50 nm, el tinte Alexa Fluor 647 se excitó con un láser de diodo de 638 nm utilizando el filtro de emisión de 690/50 nm y el DAPI se excitó con un láser de diodo de 405 nm utilizando el filtro de emisión de 450/50 nm. El MitoTracker Red se excitó con un láser de diodo de 561 nm utilizando un filtro de emisión de 575/50 nm. Todas las imágenes se tomaron como pilas Z con una distancia de 0,5 μm entre cada capa Z. Para la cuantificación, se analizó una sola capa Z cerca de la superficie del portaobjetos utilizando CellProfiler 4.2.7 ([Stirling et al., 2021]). En el análisis de CellProfiler, los núcleos se reconocieron mediante la tinción con DAPI y los respectivos cuerpos celulares se expandieron alrededor de cada núcleo basándose en la tinción de Mcl-1. Basándose en la señal de MitoTracker, se definió el área mitocondrial para cada célula individualmente. El citoplasma representa el inverso de las mitocondrias, y el núcleo se definió como un objeto separado. Para cuantificar la expresión de proteínas subcelulares, se midieron las respectivas intensidades de tinción de inmunofluorescencia. La distinción entre las etapas temprana y tardía del ciclo celular se estableció de forma estricta en el percentil 0,15 y 0,85 de las intensidades medias de geminina dentro del núcleo; las células que se encontraban entre estos valores no se consideraron para el análisis específico del ciclo celular. Para el análisis específico de las células M y las células hermanas recién divididas, el ADN y la morfología celular se evaluaron y clasificaron manualmente.

Imagen de lapso de tiempo y análisis de imágenes

Para el análisis de la resistencia a la apoptosis transmitótica, las células se sembraron en placas de vidrio de fondo plano de 35 mm (CellView Cell Culture Dish, Greiner Bio One) en RPMI 1640 sin rojo fenol que contuviera 10% de FBS. Las imágenes se adquirieron a 37 °C y 5% de CO2 en un microscopio Zeiss Cell Observer equipado con una cámara CCD Axiocam MRm y un objetivo Plan-Apochromat 20×/0.8. Se añadió un medio que contenía Fc-scTRAIL solo o en combinación con S6385 y las células se observaron durante 24 horas en intervalos de 15 minutos. Se midió el tiempo hasta la muerte (tmuerte) después del tratamiento para las células individuales. Por lo tanto, la población de células analizadas se subdividió en células que sufrieron mitosis (f0+f1) o no (f0).

Para el análisis de la expresión y distribución de Mcl-1, las células que contenían mScarlet-Mcl-1 endógena se sembraron en placas de vidrio de fondo plano de 35 mm (CellView Cell Culture Dish, Greiner Bio One) en RPMI 1640 sin rojo fenol que contenía 10% de FBS. Antes de la imagen, las células se incubaron con RPMI 1640 sin rojo fenol que contenía 10% de FBS y 100 nM de MitoTracker Green y 1 μg/ml de Hoechst 33342 durante 30 minutos a 37 °C y 5% de CO2. Las imágenes se adquirieron a 37 °C y 5% de CO2 en un microscopio confocal de escaneo láser (LSM 980 Airyscan 2) equipado con un objetivo Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27. mScarlet-Mcl-1 se excitó con un láser de 561 nm utilizando un filtro de emisión de 573–627 nm, MitoTracker Green se excitó con un láser de 488 nm utilizando un filtro de emisión de 490–512 nm. Si se añadió al experimento, Hoechst se excitó con un láser de 405 nm utilizando un filtro de emisión de 380–548 nm. La segmentación celular se realizó como se describió para las imágenes de inmunofluorescencia, utilizando la tinción de Hoechst para los núcleos, la señal de mScarlet-Mcl-1 para el cuerpo celular y MitoTracker Green para las mitocondrias. Para los experimentos de pérdida de fluorescencia por fotoblanqueo (FLIP), las regiones de medición y las células de control se recortaron y analizaron manualmente mediante CellProfiler, como se describe anteriormente.

Citometría de flujo

Las células se recogieron y centrifugaron a 300 g y 4 °C durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y el precipitado se resuspendió en 100 μl de 4% de PFA en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación con PFA, las células se centrifugaron de nuevo en las mismas condiciones que antes y se resuspendieron en 100 μl de solución de permeabilización 2 (BD Biosciences, Alemania) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de otro paso de centrifugación, las células se resuspendieron en 100 μl de medio durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente, para bloquear los sitios de unión inespecíficos. Después de la centrifugación, los antígenos diana deseados se marcaron mediante la incubación con el anticuerpo primario respectivo en el medio durante 90 minutos a temperatura ambiente, incluido un anticuerpo de control isotípico. Después de otro paso de centrifugación, las células se lavaron dos veces en PBS durante 5 minutos cada vez, incluida la centrifugación entre lavados. Para detectar los anticuerpos primarios unidos, las células se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia. La incubación con el anticuerpo secundario se realizó en medio RPMI 1640 durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después de un paso de centrifugación final, las células se resuspendieron en PBS suplementado con 0,02% (p/v) de azida sódica y se transfirieron a una placa de 96 pocillos para la citometría de flujo (MACSQuant VYB, Miltenyi Biotec, Alemania).

Western blot

Las células se lisaron en tampón de solubilización [50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v/v) de TritonX-100 más inhibidores de proteasas Complete (Roche) y 1 mM de DTT], se incubaron en hielo durante 20 minutos y se centrifugaron a 21.000 g y 4 °C. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante el ensayo de Bradford (Roti®-Quant). A continuación, las muestras se incubaron en tampón de Laemmli durante 10 minutos a 98 °C. Las proteínas se separaron utilizando geles prefabricados Bolt™ de 4 a 12% de Bis-Tris (Thermo Fisher) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando el iBlot2® (Thermo Fisher). Los sitios de unión inespecíficos de la membrana se bloquearon mediante la incubación con reactivo de bloqueo occidental (Roche) 1:10 en TBS-T durante al menos 60 minutos a temperatura ambiente. La incubación con anticuerpos primarios en PBS suplementado con 0,02% (p/v) de azida sódica se realizó a 4 °C durante la noche. Después de otro paso de centrifugación, la membrana se incubó tres veces con TBS-T, y luego se incubó con un anticuerpo secundario conjugado con HRP durante 45 minutos a temperatura ambiente en TBS-T y 0,5X de reactivo de bloqueo. Después de tres pasos de lavado más con TBS-T, la membrana se incubó con sustrato immobilon forte (fabricante) durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, seguido de la medición en un imagenador Amersham™ 600 (GE Healthcare, EE. UU.). Alternativamente, se utilizó un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y se obtuvo la imagen en un imagenador Li-Cor 9120 Odyssey® (LI-COR Biosciences GmbH, Alemania).

Fraccionamiento subcelular

Las células NCI-H460 se recogieron y homogeneizaron en tampón de homogeneización frío [225 mM de manitol, 75 mM de sacarosa, 0,1 mM de EGTA/EDTA, 30 mM de Tris-HCl pH 7,4] suplementado con inhibidores de proteasas cOmplete. Todos los pasos de centrifugación posteriores se realizaron a 4 °C. Para aislar la fracción nuclear, la suspensión de homogeneizado se centrifugó a 600 g durante 5 minutos. El precipitado resultante, que contenía núcleos y restos celulares, se resuspendió en tampón de homogeneización con 100 μg/ml de digitonina para una purificación adicional y se centrifugó de nuevo a 600 g durante 5 minutos. El precipitado se resuspendió entonces en PBS, se lavó y se centrifugó una vez más a 600 g durante 5 minutos para obtener el precipitado nuclear final. Los núcleos purificados se almacenaron a -20 °C para análisis posteriores. El sobrenadante del primer paso de centrifugación se centrifugó de nuevo a 600 g durante 5 minutos para eliminar los núcleos residuales. El sobrenadante resultante se centrifugó entonces a 7.000 g durante 15 minutos para obtener la fracción mitocondrial. El precipitado mitocondrial se resuspendió en 2 ml de PBS frío, se centrifugó de nuevo a 7.000 g y posteriormente a 10.000 g durante 10 minutos. El precipitado mitocondrial final se almacenó a -20 °C para su posterior análisis. El sobrenadante del paso de centrifugación a 7.000 g se centrifugó posteriormente a 20.000 g durante 30 minutos. El sobrenadante restante se centrifugó entonces a 100.000 g durante 1 hora. El precipitado resultante contenía el retículo endoplásmico (RE), mientras que el sobrenadante representaba la fracción citosólica. La fracción citosólica se precipitó además añadiendo ácido tricloroacético (TCA) hasta una concentración final del 15%, seguido de la incubación en hielo durante 30 minutos. Después de la centrifugación a 18.000 g durante 10 minutos, el precipitado resultante se lavó añadiendo suavemente etanol al 100%. Este paso se repitió una vez. Las proteínas de la fracción citosólica se disolvieron en tampón de Laemmli, se calentaron a 95 °C durante 10 minutos y se analizaron mediante Western blot. Para todas las demás fracciones, primero se determinaron las concentraciones de proteína utilizando el ensayo de Bradford antes de su posterior procesamiento.

Extracción con carbonato de sodio

Las células se recogieron, se centrifugaron a 400 g durante 5 minutos y el precipitado se resuspendió en 5 ml de tampón de homogeneización que contenía inhibidores de proteasas cOmplete y se mantuvo en hielo durante 2 minutos. Las células se homogeneizaron mecánicamente con un pistilo de vidrio moviéndolo suavemente de arriba a abajo. Se confirmó la homogeneización bajo un microscopio. Para eliminar las células intactas, la suspensión se centrifugó a 3.200 g y 4 °C durante 5 minutos. El sobrenadante se recogió y se repitió el paso de centrifugación hasta que no se observó ningún sedimento. El sobrenadante se dividió en cuatro alícuotas y se centrifugó a 18.000 g y 4 °C durante 10 minutos. El precipitado resultante se resuspendió en 1 ml de tampón de homogeneización y se centrifugó de nuevo a 18.000 g y 4 °C durante 10 minutos. Los precipitados que contenían la fracción mitocondrial cruda se resuspendieron en 100 mM de Na2CO3 con valores de pH de 10, 11,25 y 12,5, o en PBS como control sin tratamiento, y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Las muestras se centrifugaron a 100.000 g y 4 °C durante 60 minutos. La fracción insoluble del precipitado se disolvió en tampón de Laemmli y se calentó a 98 °C durante 10 minutos. La fracción soluble del sobrenadante se precipitó añadiendo TCA. Las muestras finales se analizaron mediante inmunoblotting.

Análisis y cuantificación de la cinética de transporte de Mcl-1 mediante FLIP

En cada célula, se definió un área de fotoblanqueo en un borde de la célula y un área de medición en el borde opuesto de la misma célula. Después de dos minutos de equilibrio, la mScarlet-Mcl-1 se fotoblanqueó dentro del área de fotoblanqueo utilizando el 100% de la potencia del láser de 561 nm cada 10 segundos. Al mismo tiempo, se midió la disminución de la intensidad de mScarlet en el área de medición cada 10 segundos. El área de medición se segmentó en compartimentos mitocondriales y citosólicos basándose en la tinción de MitoTracker Green. Para corregir el fotoblanqueo no deseado debido a la dispersión de la luz, se midió una célula de control junto a la célula FLIP de la misma manera. Se ajustó una función de decaimiento exponencial de una fase a las intensidades de decaimiento de mScarlet-Mcl-1 de la célula de control para cuantificar el fotoblanqueo inespecífico fuera del área de fotoblanqueo. Por lo tanto, los datos brutos se corrigieron dividiéndolos por y escalándolos a , lo que condujo al decaimiento corregido del control. De la misma manera, los datos de la célula FLIP se corrigieron utilizando la función correctiva de la célula de control en los datos FLIP. Para obtener los parámetros cinéticos de Mcl-1 ( o ), se definió un modelo ODE simplificado que describiera el experimento FLIP. El modelo consistió en un compartimento citosólico y un compartimento mitocondrial, y un compartimento externo teórico. Mcl-1 puede estar localizado en las mitocondrias o en el citoplasma, o existir en el compartimento externo como "Mcl-1 fotoblanqueada". En el modelo, el fotoblanqueo se simuló mediante el agotamiento de Mcl-1 citosólica en el compartimento externo. Se supuso que Mcl-1 se unía a las mitocondrias y se liberaba de nuevo al citoplasma basándose en la cinética de acción de masas. Este modelo se escribió matemáticamente como un sistema de tres ODEs acopladas:

Ecuación (I) – ODE de Mcl-1 citosólica en el modelo FLIP:

Ecuación (II) – ODE de Mcl-1 mitocondrial en el modelo FLIP:

Ecuación (III) – ODE de Mcl-1 fotoblanqueada en el modelo FLIP:

Utilizando la biblioteca SymPy en Python, este sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias (EDO) se resolvió analíticamente para optimizar de manera eficiente los parámetros cinéticos del sistema con los datos experimentales. Por lo tanto, las condiciones iniciales y se tomaron de los datos experimentales y se estableció en cero. Para cada paso de optimización, el sistema de EDO se evaluó cada 10 segundos durante 10 minutos, de manera similar al experimento. Luego, se ajustó una función de decaimiento exponencial a estas curvas de decaimiento modeladas de y y se comparó con las curvas de decaimiento medidas en los respectivos compartimentos. La pérdida se definió como la diferencia absoluta en los coeficientes de decaimiento entre el modelo de EDO y los datos experimentales. Utilizando el algoritmo de optimización DIviding RECTangles (DIRECT) de la biblioteca SciPy, se examinó iterativamente un espacio de parámetros predefinido de los parámetros cinéticos para encontrar un óptimo de parámetros global que se ajustara a los datos experimentales.

Permeabilización de la membrana plasmática utilizando digitonina

Las células se tiñeron con MitoTracker durante 90 minutos. Antes de la fijación, las células se trataron con 100 μg/ml de digitonina en PBS durante 1 minuto a temperatura ambiente y se lavaron inmediatamente después con PBS. Después de la permeabilización, las células se mantuvieron en PBS durante diferentes puntos de tiempo antes de la fijación y la tinción de inmunofluorescencia.

Modelo in silico del ciclo celular de la expresión y distribución de Mcl-1

El modelo de EDO consistió en un compartimento mitocondrial y citoplasmático volumétrico, que contiene Mcl-1 mitocondrial o citoplasmático, respectivamente. Por lo tanto, se implementó dentro de la biblioteca de Python Tellurium en Antimony ([Choi et al., 2018]; [Smith et al., 2009]).

Se asumió que Mcl-1 se desplazaba entre los compartimentos citoplasmático y mitocondrial, obedeciendo la relación de distribución definida experimentalmente y las velocidades de desplazamiento definidas por las mediciones de FLIP:

Ecuación (IV): EDO de Mcl-1 citoplasmático en el modelo del ciclo celular:

Ecuación (V): EDO de Mcl-1 mitocondrial en el modelo del ciclo celular:

Para incluir el ciclo celular, las longitudes de las fases del ciclo celular (G1, S/G2 combinadas y M) se determinaron utilizando citometría de flujo y los respectivos marcadores de fase del ciclo celular. Al dividir la longitud total del ciclo celular de 18 horas por los porcentajes respectivos de células en cada fase, se estimó la duración de cada fase. Utilizando las tasas de crecimiento de la literatura ([Cadart et al., 2022]), el volumen de los compartimentos se definió dinámicamente para duplicarse exponencialmente durante el tiempo de un ciclo celular y se restableció a los valores iniciales tras la división. Dado que y se definieron como concentraciones, el crecimiento del volumen también influyó en estos valores en el sistema de EDO:

Ecuación (VI): Cambio dinámico en el volumen mitocondrial:

Ecuación (VII): Cambio dinámico en el volumen citoplasmático:

El recambio de Mcl-1 se implementó en el modelo mediante una producción continua de Mcl-1 citoplasmático que aumenta exponencialmente con el crecimiento celular, ya que se encontró que las concentraciones de ARNm de Mcl-1 permanecían constantes durante la progresión del ciclo celular ([Pollak et al., 2021]). La degradación de Mcl-1 se definió en base a la ley de acción de masas, con la tasa de degradación calculada a partir de una vida media de Mcl-1 de 30 minutos ([Nijhawan et al., 2003]; [Slomp et al., 2021]).

Ecuación (VIII): Adición de recambio a la Ecuación (IV):

Para tener en cuenta la acumulación dependiente del ciclo celular de Mcl-1, la tasa de degradación se disminuyó exponencialmente con la progresión del ciclo celular, y la tasa se ajustó empíricamente a los datos experimentales:

Ecuación (IX): Disminución dinámica en la tasa de degradación:

Para tener en cuenta el cambio dependiente del ciclo celular en las distribuciones de Mcl-1, la relación entre y se ajustó con el tiempo. Dado que y son directamente dependientes entre sí a través de la relación entre Mcl-1 citoplasmático y mitocondrial, se puede describir como . En el modelo, el valor de la relación se cambió dinámicamente para que coincida con las observaciones experimentales en las etapas temprana y tardía del ciclo celular.

El modelo general se resolvió utilizando la biblioteca roadrunner en Python ([Somogyi et al., 2015]). Esto permitió simular cualquier célula individual o conjuntos de células durante cualquier número de ciclos celulares en función de los siguientes parámetros iniciales: nivel de expresión de Mcl-1, distribución de Mcl-1, tamaño celular, etapa del ciclo celular.

Para las simulaciones de perturbación predictiva, la acumulación o redistribución de Mcl-1 se desactivaron de forma independiente. La acumulación de Mcl-1 se desactivó manteniendo la tasa de degradación constante durante todo el ciclo celular, lo que deja el recambio de Mcl-1 en un equilibrio constante y una concentración constante. La redistribución de Mcl-1 se desactivó manteniendo el valor de la relación constante durante todo el ciclo celular.

Experimentos y análisis del tiempo hasta la muerte

Las células H460-S-Mcl1 se sembraron y se tiñeron con 100 nM de MitoTracker Green y se visualizaron como se mencionó anteriormente. Se definieron e imágenes múltiples campos de visión con al menos 10 células cada uno para capturar la expresión y distribución de Mcl-1. Después de la imagen inicial, las células se trataron en la plataforma con una combinación mimética de BH3 de 10 μM de ABT-199, 10 μM de WEHI-539 y 1 μM de S63845 en medio. Después del tratamiento, las células se visualizaron continuamente cada 5 minutos para determinar el tiempo hasta que cada célula muriera morfológicamente (formación de protuberancias en la membrana). Los parámetros de célula única, como las intensidades de mScarlet-Mcl-1, el tamaño de los compartimentos o las posiciones de las células, se analizaron a partir de la imagen inicial. Para cada célula, la expresión de Mcl-1 y la distribución de Mcl-1 se utilizaron como entrada para el modelo de susceptibilidad a la apoptosis mencionado anteriormente para simular un umbral de t-Bid individual. Además, se analizaron las correlaciones de la expresión y distribución de Mcl-1 utilizando el coeficiente de correlación de Pearson. Para determinar el 10% extremo por esquina, se calcularon las distancias de cada célula a cada esquina y el 10% de las células que estaban más cerca de cada esquina se asignaron a ese grupo respectivo. Las regresiones univariadas y bivariadas y los valores de R2 y los coeficientes de regresión resultantes se analizaron en Python utilizando la biblioteca Scikit-learn. El análisis del factor de inflación de la varianza se realizó utilizando la biblioteca Statsmodels en Python.

Muestras de tejido de cáncer colorrectal y imagen multiplexada

Se obtuvieron secciones de tejido tumoral primario fijadas en formalina e incluidas en parafina de cuatro pacientes con cáncer colorrectal en estadio III, no tratados con quimioterapia y resecados, de la Queen’s University Belfast (Reino Unido). Se ensamblaron tres muestras del núcleo de cada tumor en matrices de tejido (TMA). Se realizó una tinción iterativa de inmunofluorescencia multiplexada de las TMA como se describió previamente ([Lindner et al., 2022]) utilizando la tecnología Cell DIVE™ (Leica Microsystems; anteriormente GE Healthcare). Esto implica una tinción e imagen iterativas de la misma sección de tejido con múltiples anticuerpos y se logra mediante una oxidación suave del tinte entre rondas sucesivas de tinción e imagen. En total, hubo 13 rondas de tinción utilizando anticuerpos de segmentación celular, identidad celular y señalización de apoptosis como se describe en ([Lindner et al., 2022]), y DAPI se visualizó en cada ronda. El Leica Bond (Leica Biosystems) se utilizó para la tinción con anticuerpos. Los anticuerpos adquiridos comercialmente se sometieron a un proceso de múltiples pasos de validación y conjugación de tinte como se describió previamente ([Lindner et al., 2022]). Los tiempos de exposición se establecieron en valores fijos para todas las imágenes de un marcador determinado.

Segmentación y análisis de células individuales en muestras de tumor

Se obtuvieron imágenes sin procesar de tejidos tumorales teñidos como se describió ([Lindner et al., 2022]). En el presente estudio, los núcleos y las áreas citoplasmáticas circundantes de las células individuales de cada TMA se segmentaron utilizando la biblioteca Cellpose en Python. Esta biblioteca contiene modelos preentrenados que reconocen los núcleos y toda la célula. Se utilizó el modelo preentrenado cyto2 junto con la tinción de DAPI para los núcleos y la tinción de quinasa S6 para el citoplasma. Las máscaras segmentadas se importaron a CellProfiler, donde se utilizó una imagen combinada de la tinción de Bak y Smac para segmentar las mitocondrias dentro de la máscara citoplasmática. Por lo tanto, la señal de Bak reescalada se ponderó 2/3 y la señal de Smac reescalada se ponderó 1/3 de la imagen resultante. Las estructuras mitocondriales se segmentaron utilizando un umbral adaptativo, de modo que las estructuras pequeñas se excluyeran por tamaño para minimizar el enmascaramiento mitocondrial falso positivo.

La clasificación de las células en células tumorales, inmunitarias o del estroma se realizó utilizando las distribuciones de intensidad de CD3 (marcador inmunitario) y AE1/PCK26 (marcadores tumorales). Las células negativas para todos los marcadores se asignaron como estroma. Todo el análisis de las cantidades y distribuciones de Mcl-1 se realizó en las células tumorales.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando PRISM 10 (GraphPad Software) y las siguientes bibliotecas en Python: Statsmodels, Scikit-learn, SciPy, NumPy. Se utilizó una prueba t no pareada con la corrección de Welch en las Figuras 1D, F, G; S1E; 3D; S2D, E. Se utilizó ANOVA de una vía con comparaciones múltiples de Dunnett en las Figuras 2E, F; S3B, 4 J, L; 5F; S6B, C. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney en las Figuras 2H, I. Se realizó una regresión lineal y se compararon los modelos anidados utilizando ANOVA y la prueba F en las Figuras 5H, I.

Visualizaciones

Los esquemas en las figuras 3K y S2A se crearon con BioRender.com

Reactivos y anticuerpos

Los anticuerpos primarios fueron los siguientes: ratón anti- -tubulina (DM1A, Cell Signaling #3873, 1:1000 Western blotting (WB)), conejo anti-Calnexina (Cell Signaling #2433, 1:1000 WB), conejo anti-Cox IV (3E11, Cell Signaling #4850, 1:1000 WB), ratón anti-GAPDH (D4C6R, Cell Signaling #97166, 1:1000 WB), ratón anti-Laminina A/C (Cell Signaling #4777, 1:1000 WB), conejo anti-Mcl-1 (D2W9E, Cell Signaling #94296, 1:1000 WB, 1:800 IF, 1:50 citometría de flujo (FC)), ratón anti-RFP (ChromoTek 6g6, 1:1000 WB), conejo anti-Histona H3 fosforilada (D2C2, Cell Signaling #3377 y #8552, 1:50 FC), conejo anti-Tom20 (Cell Signaling #42406, 1:1000 WB).

Los anticuerpos secundarios fueron los siguientes: IgG anti-conejo de cabra – Alexa Fluor 647 (Life Technologies Corporation), IgG anti-conejo de cabra – Alexa Fluor 488 (Life Technologies Corporation), IgG anti-conejo de cabra – Peroxidasa (Dianova GmbH), IgG anti-ratón de cabra – Peroxidasa (Dianova GmbH), IgG anti-conejo de cabra - IRDye®680RD (LI-COR GmbH), IgG anti-ratón de cabra - IRDye®800CW (LI-COR GmbH).

Fc-scTRAIL se produjo como se describió previamente ([Hutt et al., 2017]). DMSO se compró a Carl Roth, ABT-199 a Active Biochem, S63845 y WEHI-539 a APExBIO y bortezomib a UBPBio. MioTracker™ Red CMXRos, MitoTracker™ Green FM y DAPI se obtuvieron de Invitrogen, cicloheximida se compró a Sigma. Puromicina se obtuvo de AppliChem GmbH.

Plásmidos y transfecciones

Se utilizó el plásmido EZ-Tet-pLKO-Blast (Addgene #85973) para expresar siRNA contra Mcl-1 (CCAGTATACTTCTTAGAAAGT), clonado como una secuencia de horquilla para la estabilización (CTAGC-CCAGTATACTTCTTAGAAAGT-TACTAGT-ACTTTCTAAGAAGTATACTGG-TTTTT-G). Este plásmido se transdujo lentiviralmente en células NCI-H460.

Los plásmidos pSpCas9(BB)-2A-Puro humano MCL-1 y pUC Scarlet-MCL-1 se recibieron de Stephen Tait ([Cao et al., 2022]) y se utilizaron para etiquetar endógenamente Mcl-1 con mScarlet en células NCI-H460. El siRNA Silencer®Select dirigido a Mcl-1 (ambion #s8583; CCAGUAUACUUCUUAGAAATT) se transfectó utilizando Lipofectamine®RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) según el protocolo del fabricante.

Etiquetado de Mcl-1 endógeno con mScarlet

Las células NCI-H460 se sembraron en una placa de Petri de 10 cm y se transfectaron a una confluencia de aproximadamente el 30 %. El ADN plasmídico pSP-Cas9 y pUC-mScarlet (recibido amablemente de Stephen Tait, publicado en [Cao et al., 2022]) se preparó con el kit de transfección Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher) según el protocolo del fabricante y se añadió a las células. 24 horas después de la transfección, el medio se cambió por un medio que contenía 0,5 µg/ml de puromicina para la selección de células con transfección positiva. Las células se clasificaron en el citómetro de flujo (FACS) según su fluorescencia mScarlet y se expandieron como clones celulares individuales. La intensidad de mScarlet de los clones expandidos se midió mediante citometría de flujo con excitación a 561 nm y un filtro de emisión de 586/15 nm. El tamaño molecular del constructo mScarlet-Mcl-1 se evaluó mediante inmunoblot para Mcl-1 y mScarlet. La distribución subcelular de mScarlet-Mcl-1 se validó utilizando la microscopía de células vivas en el microscopio LSM 980. Para validar la inserción de mScarlet, el ADN genómico se amplificó utilizando el kit de extracción rápida de ADN (Biozym, #QE0905T) según el protocolo del fabricante. La inserción de mScarlet se amplificó mediante PCR y los productos de PCR se secuenciaron con éxito, confirmando una inserción correcta. Se utilizaron los siguientes cebadores para amplificar el locus de Mcl-1: Mcl-1-UTR-for: CACTTCCGCTTCCTTCCAGT; Mcl-1-Ex1-rev2: CCGCGTTTCTTTTGAGGCCA. La PCR se realizó utilizando el kit PCR-NEB Q5. Las muestras de PCR se cargaron en un gel de agarosa al 1 % y el ADN se tiñó con EtBr en el gel. Las bandas respectivas se cortaron del gel y se secuenciaron.

Cultivo celular

Las células se cultivaron con medio RPMI 1640, suplementado con 10 % (v/v) de FBS en matraces de cultivo celular (37 °C, 5 % de CO2). Las células se sembraron y se pasaron con una proporción de pasaje entre 1:3 y 1:10.

Imagen de inmunofluorescencia y análisis de imágenes

Para analizar las concentraciones de proteínas subcelulares, las células cultivadas en portaobjetos se incubaron con MitoTracker Red CMXRos (100 nM) durante 90 minutos antes de la fijación con 4 % de PFA, la permeabilización con 0,3 % de Triton-X-100 y la inmunotinción. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Las imágenes se adquirieron en un microscopio de disco giratorio Zeiss Axio Observer SD equipado con un objetivo PlanApochromat 40×/1.4 NA y una cámara CCD Axiocam 503 Mono. La geminina se excitó con un láser de diodo de 488 nm utilizando un filtro de emisión de 525/50 nm, el tinte Alexa Fluor 647 se excitó con un láser de diodo de 638 nm utilizando el filtro de emisión de 690/50 nm y el DAPI se excitó con un láser de diodo de 405 nm utilizando el filtro de emisión de 450/50 nm. El MitoTracker Red se excitó con un láser de diodo de 561 nm utilizando un filtro de emisión de 575/50 nm. Todas las imágenes se tomaron como pilas Z con una distancia de 0,5 µm entre cada capa Z. Para la cuantificación, se analizó una sola capa Z cerca de la superficie del portaobjetos utilizando CellProfiler 4.2.7 ([Stirling et al., 2021]). En el análisis de CellProfiler, los núcleos se reconocieron mediante la tinción con DAPI y los respectivos cuerpos celulares se expandieron alrededor de cada núcleo basándose en la tinción de Mcl-1. Basándose en la señal de MitoTracker, el área mitocondrial se definió para cada célula individualmente. El citoplasma representa el inverso de las mitocondrias, y el núcleo se definió como un objeto separado. Para cuantificar la expresión de proteínas subcelulares, se midieron las intensidades de tinción de IF respectivas. La distinción entre las etapas temprana y tardía del ciclo celular se estableció de forma estricta en el percentil 0,15 y 0,85 de las intensidades medias de geminina dentro del núcleo; las células que se encontraban entre estos valores no se consideraron para el análisis específico del ciclo celular. Para el análisis específico de las células M y las células hermanas recién divididas, el ADN y la morfología celular se evaluaron y clasificaron manualmente.

Imagen de lapso de tiempo y análisis de imágenes

Para el análisis de la resistencia a la apoptosis transmitótica, las células se sembraron en placas de vidrio de fondo plano de 35 mm (CellView Cell Culture Dish, Greiner Bio One) en medio RPMI 1640 sin fenol rojo que contuviera 10 % de FBS. Las imágenes se adquirieron a 37 °C y 5 % de CO2 en un microscopio Zeiss Cell Observer equipado con una cámara CCD Axiocam MRm y un objetivo Plan-Apochromat 20×/0,8. Se añadió un medio que contenía Fc-scTRAIL solo o en combinación con S6385 y las células se visualizaron durante 24 horas en intervalos de 15 minutos. El tiempo hasta la muerte (tdeath) después del tratamiento se midió para las células individuales. Por lo tanto, la población de células analizadas se subdividió en células que sufrieron mitosis (f0+f1) o no (f0).

Para el análisis de la expresión y distribución de Mcl-1, las células que contenían mScarlet-Mcl-1 endógena se sembraron en placas de vidrio de fondo plano de 35 mm (CellView Cell Culture Dish, Greiner Bio One) en medio RPMI 1640 sin fenol rojo que contenía 10 % de FBS. Antes de la imagen, las células se incubaron con medio RPMI 1640 sin fenol rojo que contenía 10 % de FBS y 100 nM de MitoTracker Green y 1 µg/ml de Hoechst 33342 durante 30 minutos a 37 °C y 5 % de CO2. Las imágenes se adquirieron a 37 °C y 5 % de CO2 en un microscopio confocal de escaneo láser (LSM 980 Airyscan 2) equipado con un objetivo Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27. mScarlet-Mcl-1 se excitó con un láser de 561 nm utilizando un filtro de emisión de 573–627 nm, MitoTracker Green se excitó con un láser de 488 nm utilizando un filtro de emisión de 490–512 nm. Si se añadió al experimento, Hoechst se excitó con un láser de 405 nm utilizando un filtro de emisión de 380–548 nm. La segmentación de células se realizó como se describió para las imágenes de inmunofluorescencia, utilizando la tinción de Hoechst para los núcleos, la señal de mScarlet-Mcl-1 para el cuerpo celular y MitoTracker Green para las mitocondrias. Para los experimentos de pérdida de fluorescencia por fotoblanqueo (FLIP), las regiones de medición y las células de control se recortaron manualmente y se analizaron mediante CellProfiler como se describe anteriormente.

Citometría de flujo

Las células se recogieron y se centrifugaron a 300 g y 4 °C durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y el precipitado se resuspendió en 100 µl de 4 % de PFA en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación con PFA, las células se centrifugaron nuevamente en las mismas condiciones que antes y se resuspendieron en 100 µl de solución de permeabilización 2 (BD Biosciences, Alemania) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de otro paso de centrifugación, las células se resuspendieron en 100 µl de medio durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente, para bloquear los sitios de unión inespecíficos. Después de la centrifugación, los antígenos diana deseados se marcaron mediante la incubación con el anticuerpo primario respectivo en el medio durante 90 minutos a temperatura ambiente, incluido un anticuerpo de control isotípico. Después de otro paso de centrifugación, las células se lavaron dos veces en PBS durante 5 minutos cada una, incluida la centrifugación entre ellas. Para detectar los anticuerpos primarios unidos, las células se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia. La incubación con el anticuerpo secundario se realizó en medio RPMI 1640 durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después de un paso de centrifugación final, las células se resuspendieron en PBS suplementado con 0,02 % (p/v) de azida de sodio y se transfirieron a una placa de 96 pocillos para la citometría de flujo (MACSQuant VYB, Miltenyi Biotec, Alemania).

Western blotting

Las células se lisaron en tampón de solubilización [50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % (v/v) de TritonX-100 más inhibidores de proteasas Complete (Roche) y 1 mM de DTT], se incubaron en hielo durante 20 minutos y se centrifugaron a 21.000 g y 4 °C. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante el ensayo de Bradford (Roti®-Quant). Posteriormente, las muestras se incubaron en tampón de Laemmli durante 10 minutos a 98 °C. Las proteínas se separaron utilizando geles prefabricados Bolt™ de 4 a 12 % Bis-Tris (Thermo Fisher) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando el iBlot2® (Thermo Fisher). Los sitios de unión inespecíficos en la membrana se bloquearon mediante la incubación con reactivo de bloqueo occidental (Roche) 1:10 en TBS-T durante al menos 60 minutos a temperatura ambiente. La incubación con anticuerpos primarios en PBS suplementado con 0,02 % (p/v) de azida de sodio se realizó a 4 °C durante la noche. Después de tres pasos de lavado con TBS-T, la membrana se incubó con un anticuerpo secundario conjugado con HRP durante 45 minutos a temperatura ambiente en TBS-T y 0,5X de reactivo de bloqueo. Después de tres pasos de lavado más con TBS-T, la membrana se incubó con sustrato immobilon forte (fabricante) durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, seguido de la medición en un imager Amersham™ 600 (GE Healthcare, EE. UU.). Alternativamente, se utilizó un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y se visualizó en un imager Li-Cor 9120 Odyssey® (LI-COR Biosciences GmbH, Alemania).

Fraccionamiento subcelular

Las células NCI-H460 se recogieron y se homogeneizaron en tampón de homogeneización frío [225 mM de manitol, 75 mM de sacarosa, 0,1 mM de EGTA/EDTA, 30 mM de Tris-HCl pH 7,4] suplementado con inhibidores de proteasas cOmplete. Todos los pasos de centrifugación posteriores se realizaron a 4 °C. Para aislar la fracción nuclear, la suspensión de homogeneizado se centrifugó a 600 g durante 5 minutos. El precipitado resultante, que contiene núcleos y restos celulares, se resuspendió en tampón de homogeneización con 100 µg/ml de digitonina para una purificación adicional y se centrifugó nuevamente a 600 g durante 5 minutos. El precipitado se resuspendió luego en PBS, se lavó y se centrifugó una vez más a 600 g durante 5 minutos para obtener el precipitado nuclear final. Los núcleos purificados se almacenaron a -20 °C para análisis posteriores. El sobrenadante del primer paso de centrifugación se centrifugó nuevamente a 600 g durante 5 minutos para eliminar los núcleos residuales. El sobrenadante resultante se centrifugó luego a 7.000 g durante 15 minutos para obtener la fracción mitocondrial. El precipitado mitocondrial se resuspendió en 2 ml de PBS frío, se centrifugó nuevamente a 7.000 g y luego a 10.000 g durante 10 minutos. El precipitado mitocondrial final se almacenó a -20 °C para un análisis posterior. El sobrenadante del paso de centrifugación a 7.000 g se centrifugó posteriormente a 20.000 g durante 30 minutos. El sobrenadante restante se centrifugó luego a 100.000 g durante 1 hora. El precipitado resultante contenía el retículo endoplásmico (RE), mientras que el sobrenadante representaba la fracción citosólica. La fracción citosólica se precipitó adicionalmente agregando ácido tricloroacético (TCA) a una concentración final del 15 %, seguida de la incubación en hielo durante 30 minutos. Después de la centrifugación a 18.000 g durante 10 minutos, el precipitado resultante se lavó agregando suavemente etanol al 100 %. Este paso se repitió una vez. Las proteínas de la fracción citosólica se disolvieron en tampón de Laemmli, se calentaron a 95 °C durante 10 minutos y se analizaron mediante Western Blot. Para todas las demás fracciones, primero se determinaron las concentraciones de proteína utilizando el ensayo de Bradford antes del procesamiento adicional.

Extracción de carbonato de sodio

Las células se recogieron, se centrifugaron a 400 g durante 5 minutos y el precipitado se resuspendió en 5 ml de tampón de homogeneización que contenía inhibidores de proteasas cOmplete y se mantuvo en hielo durante 2 minutos. Las células se homogeneizaron mecánicamente con un pistilo de vidrio moviéndolo suavemente hacia arriba y hacia abajo. Se confirmó la homogeneización exitosa bajo un microscopio. Para eliminar las células intactas, la suspensión se centrifugó a 3.200 g y 4 °C durante 5 minutos. El sobrenadante se recogió y se repitió el paso de centrifugación hasta que no se observó ningún sedimento. El sobrenadante se dividió en cuatro alícuotas y se centrifugó a 18.000 g y 4 °C durante 10 minutos. El precipitado resultante se resuspendió en 1 ml de tampón de homogeneización y se centrifugó nuevamente a 18.000 g y 4 °C durante 10 minutos. Los precipitados que contenían la fracción mitocondrial cruda se resuspendieron en 100 mM de Na2CO3 con valores de pH de 10, 11,25 y 12,5, o en PBS como control sin tratamiento, y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Las muestras se centrifugaron a 100.000 g y 4 °C durante 60 minutos. La fracción insoluble en el precipitado se disolvió en tampón de Laemmli y se calentó a 98 °C durante 10 minutos. La fracción soluble en el sobrenadante se precipitó agregando TCA. Las muestras finales se analizaron mediante inmunoblotting.

Análisis y cuantificación de la cinética de transporte de Mcl-1 mediante FLIP

En cada célula, se definió un área de aclaramiento en un borde de la célula y un área de medición en el borde opuesto de la misma célula. Después de dos minutos de equilibrio, mScarlet-Mcl-1 se aclaró dentro del área de aclaramiento utilizando el 100% de la potencia del láser de 561 nm cada 10 segundos. Simultáneamente, se midió la disminución de la intensidad de mScarlet en el área de medición cada 10 segundos. El área de medición se segmentó en compartimentos mitocondriales y citoplasmáticos basándose en la tinción con MitoTracker verde. Para corregir el aclaramiento no deseado debido a la dispersión de la luz, se midió una célula de control adyacente a la célula FLIP de la misma manera. Se ajustó una función de decaimiento exponencial de una fase a las intensidades de decaimiento de mScarlet-Mcl-1 de la célula de control, para cuantificar el aclaramiento inespecífico fuera del área de aclaramiento. Por lo tanto, los datos brutos se corrigieron dividiéndolos por y escalándolos a , lo que condujo al decaimiento corregido de control . De manera similar, los datos de la célula FLIP se corrigieron utilizando la función correctiva de la célula de control sobre los datos de la célula FLIP. Para obtener los parámetros cinéticos de Mcl-1 ( o ), se definió un modelo ODE simplificado que describió el experimento FLIP. El modelo consistió en un compartimento citoplasmático y un compartimento mitocondrial, y un compartimento externo teórico. Mcl-1 puede estar localizado en las mitocondrias o en el citoplasma, o existir en el compartimento externo como "Mcl-1 aclarado". En el modelo, el aclaramiento se simuló mediante la depleción de Mcl-1 citoplasmático en el compartimento externo. Se asumió que Mcl-1 se unía a las mitocondrias y se liberaba de nuevo al citoplasma basándose en la cinética de acción de masas. Este modelo se escribió matemáticamente como un sistema de tres ODEs acopladas:

Ecuación (I) – ODE de Mcl-1 citoplasmático en el modelo FLIP:

Ecuación (II) – ODE de Mcl-1 mitocondrial en el modelo FLIP:

Ecuación (III) – ODE de Mcl-1 aclarado en el modelo FLIP:

Utilizando la biblioteca SymPy en python, este sistema de ODE se resolvió analíticamente para optimizar de manera eficiente los parámetros cinéticos del sistema con los datos experimentales. Por lo tanto, las condiciones iniciales y se tomaron de los datos experimentales y se fijó en cero. Para cada paso de optimización, el sistema de ODE se evaluó cada 10 segundos durante 10 minutos, de forma similar al experimento. A continuación, se ajustó una función de decaimiento exponencial a través de estas curvas de decaimiento modeladas de y y se comparó con las curvas de decaimiento medidas en los respectivos compartimentos. La pérdida se definió como la diferencia absoluta en los coeficientes de decaimiento entre el modelo ODE y los datos experimentales. Utilizando el algoritmo de optimización DIviding RECTangles (DIRECT) de la biblioteca SciPy, se examinó iterativamente un espacio de parámetros predefinido de los parámetros cinéticos para encontrar un óptimo de parámetros global que se ajustara a los datos experimentales.

Permeabilización de la membrana plasmática utilizando digitonina

Las células se tiñeron con MitoTracker durante 90 minutos. Antes de la fijación, las células se trataron con 100 µg/ml de digitonina en PBS durante 1 minuto a temperatura ambiente y se lavaron inmediatamente después con PBS. Después de la permeabilización, las células se mantuvieron en PBS durante diferentes puntos temporales antes de la fijación y la tinción de inmunofluorescencia.

Modelo in silico del ciclo celular de la expresión y distribución de Mcl-1

El modelo ODE consistió en un compartimento mitocondrial y citoplasmático volumétrico, que contienen Mcl-1 mitocondrial o citoplasmático, respectivamente. Por lo tanto, se implementó dentro de la biblioteca de python Tellurium en Antimony ([Choi et al., 2018]; [Smith et al., 2009]).

Se asumió que Mcl-1 se desplazaba entre los compartimentos citoplasmático y mitocondrial, obedeciendo la relación de distribución definida experimentalmente y las velocidades de desplazamiento definidas por las mediciones FLIP:

Ecuación (IV) – ODE de Mcl-1 citoplasmático en el modelo del ciclo celular:

Ecuación (V) – ODE de Mcl-1 mitocondrial en el modelo del ciclo celular:

Para incluir el ciclo celular, las longitudes de las fases del ciclo celular (G1, S/G2 combinadas y M) se determinaron utilizando citometría de flujo y los respectivos marcadores de fase del ciclo celular. Al dividir la longitud total del ciclo celular de 18 horas por los porcentajes respectivos de células en cada fase, se estimó la duración de cada fase. Utilizando las tasas de crecimiento de la literatura ([Cadart et al., 2022]), el volumen de los compartimentos se definió dinámicamente para duplicarse exponencialmente durante el tiempo de un ciclo celular y se restableció a los valores iniciales tras la división. Dado que y se definieron como concentraciones, el crecimiento del volumen también influyó en estos valores en el sistema ODE:

Ecuación (VI) – Cambio dinámico en el volumen mitocondrial:

Ecuación (VII) – Cambio dinámico en el volumen citoplasmático:

El recambio de Mcl-1 se implementó en el modelo mediante una producción continua de Mcl-1 citoplasmático que aumenta exponencialmente con el crecimiento celular, ya que se encontró que las concentraciones de ARNm de Mcl-1 permanecían constantes durante la progresión del ciclo celular ([Pollak et al., 2021]). La degradación de Mcl-1 se definió basándose en la ley de acción de masas, con la tasa de degradación calculada a partir de una vida media de Mcl-1 de 30 minutos ([Nijhawan et al., 2003]; [Slomp et al., 2021]).

Ecuación (VIII) – Adición de recambio a la Ecuación (IV):

Para tener en cuenta la acumulación dependiente del ciclo celular de Mcl-1, la tasa de degradación se disminuyó exponencialmente con la progresión del ciclo celular, con la tasa ajustada empíricamente a los datos experimentales:

Ecuación (IX) – Disminución dinámica en la tasa de degradación:

Para tener en cuenta el cambio dependiente del ciclo celular en las distribuciones de Mcl-1, la relación entre y se ajustó con el tiempo. Dado que y son directamente dependientes entre sí a través de la relación entre Mcl-1 citoplasmático y mitocondrial, se puede describir como . En el modelo, el valor de la relación se cambió dinámicamente para que coincida con las observaciones experimentales en las etapas temprana y tardía del ciclo celular.

El modelo general se resolvió utilizando la biblioteca roadrunner en python ([Somogyi et al., 2015]). Esto permitió simular cualquier célula individual o conjuntos de células durante cualquier número de ciclos celulares basándose en los siguientes parámetros iniciales: nivel de expresión de Mcl-1, distribución de Mcl-1, tamaño celular, etapa del ciclo celular.

Para las simulaciones de perturbación predictivas, la acumulación o redistribución de Mcl-1 se desactivaron de forma independiente. La acumulación de Mcl-1 se desactivó manteniendo la tasa de degradación constante durante todo el ciclo celular, lo que deja el recambio de Mcl-1 en un equilibrio constante y una concentración constante. La redistribución de Mcl-1 se desactivó manteniendo el valor de la relación constante durante todo el ciclo celular.

Experimentos de tiempo hasta la muerte y análisis

Las células H460-S-Mcl1 se sembraron y se tiñeron con 100 nM de MitoTracker Green y se visualizaron como se mencionó anteriormente. Se definieron e imágenes múltiples campos de visión con al menos 10 células cada uno para capturar la expresión y distribución de Mcl-1. Después de la imagen inicial, las células se trataron en la plataforma con una combinación mimética de BH3 de 10 µM de ABT-199, 10 µM de WEHI-539 y 1 µM de S63845 en medio. Tras el tratamiento, las células se visualizaron continuamente cada 5 minutos para determinar el tiempo hasta que cada célula muriera morfológicamente (abultamiento de la membrana). Los parámetros de célula única, como las intensidades de mScarlet-Mcl-1, los tamaños de los compartimentos o las posiciones de las células, se analizaron a partir de la imagen inicial. Para cada célula, la expresión de Mcl-1 y la distribución de Mcl-1 se utilizaron como entrada para el modelo de susceptibilidad a la apoptosis mencionado anteriormente para simular un umbral de t-Bid individual. Además, se analizaron las correlaciones de la expresión y la distribución de Mcl-1 utilizando el coeficiente de correlación de Pearson. Para determinar el 10% extremo por esquina, se calcularon las distancias de cada célula a cada esquina y el 10% de las células que estaban más cerca de cada esquina se asignaron a ese grupo respectivo. Las regresiones univariadas y bivariadas y los valores R2 y los coeficientes de regresión resultantes se analizaron en python utilizando la biblioteca Scikit-learn. El análisis del factor de inflación de la varianza se realizó utilizando la biblioteca Statsmodels en python.

Muestras de tejido de cáncer colorrectal y imagen multiplexada

Se obtuvieron secciones de tejido tumoral primario fijadas en formalina e incluidas en parafina de cuatro pacientes con cáncer colorrectal en estadio III, no tratados con quimioterapia y resecados, recogidas del Queen’s University Belfast (Reino Unido). Se ensamblaron tres muestras del núcleo de cada tumor en matrices de tejido (TMAs). Se realizó una tinción iterativa de inmunofluorescencia multiplexada de las TMAs como se describió anteriormente ([Lindner et al., 2022]) utilizando la tecnología Cell DIVE™ (Leica Microsystems; anteriormente GE Healthcare). Esto implica una tinción e imagen iterativas de la misma sección de tejido con múltiples anticuerpos y se logra mediante una oxidación suave del tinte entre rondas sucesivas de tinción e imagen. En total, hubo 13 rondas de tinción utilizando anticuerpos de segmentación celular, identidad celular y señalización de apoptosis como se describe en ([Lindner et al., 2022]), y DAPI se visualizó en cada ronda. El Leica Bond (Leica Biosystems) se utilizó para la tinción con anticuerpos. Los anticuerpos adquiridos comercialmente se sometieron a un proceso de múltiples pasos de validación y conjugación de tinte como se describió anteriormente ([Lindner et al., 2022]). Los tiempos de exposición se fijaron en valores fijos para todas las imágenes de un marcador dado.

Segmentación y análisis de células individuales en muestras de tumor

Se obtuvieron imágenes en bruto de tejidos tumorales teñidos como se describió ([Lindner et al., 2022]). En el presente estudio, los núcleos y las áreas citoplasmáticas circundantes de las células individuales de cada TMA se segmentaron utilizando la biblioteca Cellpose en python. Esta biblioteca contiene modelos preentrenados que reconocen los núcleos y toda la célula. Se utilizó el modelo preentrenado cyto2 junto con la tinción de DAPI para los núcleos y la tinción de quinasa S6 para el citoplasma. Las máscaras segmentadas se importaron a CellProfiler, donde se utilizó una imagen combinada de la tinción de Bak y Smac para segmentar las mitocondrias dentro de la máscara citoplasmática. Por lo tanto, la señal de Bak reescalada se ponderó 2/3 y la señal de Smac reescalada se ponderó 1/3 de la imagen resultante. Las estructuras mitocondriales se segmentaron utilizando un umbral adaptativo, de modo que las estructuras pequeñas se excluyeran por tamaño para minimizar el enmascaramiento mitocondrial falso positivo.

La clasificación de las células en células tumorales, inmunitarias o estromales se realizó utilizando las distribuciones de intensidad de CD3 (marcador inmunitario) y AE1/PCK26 (marcadores tumorales). Las células negativas para todos los marcadores se asignaron como estroma. Todo el análisis de las cantidades y distribuciones de Mcl-1 se realizó en las células tumorales.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando PRISM 10 (GraphPad Software) y las siguientes bibliotecas en python: Statsmodels, Scikit-learn, SciPy, NumPy. Se utilizó una prueba t no pareada con la corrección de Welch en las Figuras 1D, F, G; S1E; 3D; S2D, E. Se utilizó ANOVA de una vía con comparaciones múltiples de Dunnett en las Figuras 2E, F; S3B, 4 J, L; 5F; S6B, C. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney en las Figuras 2H, I. Se realizó una regresión lineal y se compararon los modelos anidados utilizando ANOVA y la prueba F en las Figuras 5H, I.

Visualizaciones

Los esquemas de las figuras 3K y S2A se crearon con BioRender.com