La O-GlcNAcilación, una única adición de N-acetilglucosamina (GlcNAc) en residuos serina/treonina de proteínas nucleocitoplasmáticas, se encuentra frecuentemente sobreexpresada en diversos cánceres e implicada en varios aspectos del progreso tumoral. Creciente evidencia reporta que el tratamiento con drogas quimioterapéuticas puede activar la O-GlcNAcilación de proteínas.
Sin embargo, su papel preciso en la modulación de las respuestas a la quimioterapia, particularmente en cáncer colorrectal (CRC), permanece mal definido. Aquí investigamos los efectos biológicos del oxaliplatino (OXA), un medicamento quimioterapéutico de primera línea para pacientes con CRC metastásico, y la reducción de O-GlcNAcilación proteica en células SW620 de CRC metastásico. El tratamiento solo con OXA redujo la viabilidad celular así como la proliferación, e incrementó los niveles de O-GlcNAcilación proteica y GFPT1, la enzima limitante del camino biosintético hexosámico que es un sensor nutricional de la metabolización de glucosa. La inhibición de la O-GlcNAcilación proteica mediante el abatimiento genético de transferasa O-GlcNAc (OGT) o inhibición química (OSMI-1) mejoró significativamente la sensibilidad de SW620 a OXA.
Esto se evidenció por una disminución en la viabilidad celular y proliferación, un incremento en apoptosis celular y arresto del ciclo celular. El análisis proteómico basado en espectrometría de masas e informático reveló que la combinación de abatimiento genético de OGT y tratamiento con OXA majoritariamente redujo varios ribosomas proteicos.
Además, el tratamiento con OXA y el abatimiento de OGT alteraron las proteínas involucradas en vías críticas incluyendo complejo de sintesis de ADN, proceso glicolítico, regulación negativa de la expresión génica, proceso del ciclo celular y regulación negativa de fosforilación de proteína. Específicamente, OGT redujo varios ribosomas proteicos, y el abatimiento de OGT influyó en las proteínas a través de las vías identificadas. En conjunto, estos hallazgos demuestran que la reducción de OGT y O-GlcNAcilación proteica puede mejorar la sensibilidad de células CRC a OXA, y las vías alteradas pueden ofrecer nuevas perspectivas en potenciales mecanismos para superar la quimoresistencia del CRC.
El cáncer colorrectal (CCR) es un cáncer común que afecta principalmente a las personas mayores, y la mayoría de los casos se producen en personas mayores de 50 años [[1]]. Según el informe de 2024 sobre las estadísticas globales de cáncer, el CCR ocupa el tercer lugar en cuanto a incidencia, después del cáncer de pulmón y el cáncer de mama femenino, y también es la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer, después del cáncer de pulmón [[2]]. El desarrollo del CCR tarda más de una década y está impulsado por la acumulación de numerosas mutaciones en las células de los tejidos intestinales, lo que provoca una expansión celular incontrolada y una transformación en un tumor maligno. Una vez que se forman las células cancerosas en el sitio primario, tienen la capacidad de invadir las células vecinas y metastatizar a sitios distantes (secundarios), como el hígado y el cerebro [[3]].
La reprogramación metabólica se ha estudiado ampliamente en el contexto de la oncogénesis y es una de las características más importantes de las células cancerosas [[4]]. Los cambios en el metabolismo de la glucosa en el cáncer afectan a varias vías metabólicas, incluida la vía de la biosíntesis de hexosamina (HBP) [[5]]. El producto final de la HBP es la N-acetilglucosamina (GlcNAc), que es un sustrato tanto para la glicosilación clásica como para la O-GlcNAcilación de las proteínas. A diferencia de la N-GlcNAcilación de la asparagina, que es una unión N-enlazada clásica de dolichol-GlcNAc2Man9Glc3 a la asparagina mediante la oligosacariltransferasa (OST) que se produce en el retículo endoplásmico, la O-GlcNAcilación implica la unión de una sola molécula de GlcNAc a los residuos de serina y treonina de las proteínas citoplasmáticas y nucleares [[6]]. Esta modificación está regulada dinámicamente por dos enzimas clave: la O-GlcNAc transferasa (OGT) y la O-GlcNAcase (OGA), que son responsables de añadir y eliminar donantes de azúcar, respectivamente, y pueden interactuar con la fosforilación [[7]]. Anteriormente, nuestro grupo y otros investigadores informaron que los niveles de OGT y la O-GlcNAcilación de las proteínas estaban aumentados en los tejidos de CCR en comparación con los tejidos normales [[8],[9]]. Además, nuestro grupo también demostró que el nivel de O-GlcNAcilación de las proteínas en el clon metastásico de CCR (SW620) era mayor que el del clon primario isogénico de CCR (SW480) [[10]]. También demostramos que la inhibición de la OGT inhibía la formación de colonias de estas líneas celulares de CCR, especialmente en el clon metastásico. Estos datos sugieren que la O-GlcNAcilación de las proteínas y la OGT pueden desempeñar un papel importante en la progresión del cáncer, especialmente en el CCR metastásico.
La quimioterapia sigue siendo un tratamiento estándar para las etapas metastásicas y avanzadas del cáncer. Varias líneas de evidencia demuestran que el estrés celular inducido por la quimioterapia aumenta la O-GlcNAcilación global de las proteínas, y se cree que este aumento activa las vías de señalización que promueven la supervivencia y la protección de las células [[11]–[13]]. El cisplatino aumenta la O-GlcNAcilación de las proteínas en las células de cáncer de pulmón no microcítico [[11]]. La doxorrubicina aumentó el nivel de O-GlcNAcilación y la supresión de esta modificación redujo la resistencia de las células de cáncer de mama a la quimioterapia [[12]]. En el cáncer de colon, la inhibición de la O-GlcNAcilación de las proteínas cambia la respuesta celular de la senescencia protectora a la apoptosis terapéutica [[14]]. En conjunto, estos hallazgos destacan el papel fundamental de la O-GlcNAcilación de las proteínas en la regulación de la quimiorresistencia del cáncer.
El oxaliplatino (OXA) es un fármaco de quimioterapia comúnmente utilizado y aprobado para el tratamiento del CCR avanzado [[15]]. Se cree que su citotoxicidad inhibe la síntesis de ADN mediante la formación de aductos de platino-ADN, lo que induce el estrés celular y provoca la muerte celular. En este estudio, dado que el tratamiento con OXA se dirige al cáncer metastásico, y nuestro informe anterior indica que la O-GlcNAcilación está aumentada en el CCR metastásico, SW620, decidimos utilizar esta línea celular para investigar si la reducción del nivel de O-GlcNAcilación de las proteínas mediante OSMI-1, un inhibidor de la OGT, o la inhibición de la OGT afectó a las respuestas celulares en combinación con el tratamiento con OXA. Además, se investigaron los efectos biológicos de la inhibición de la OGT con oxaliplatino. Por último, se aplicó la proteómica basada en la espectrometría de masas y el análisis bioinformático para identificar las posibles vías de señalización tras los tratamientos con OXA y la reducción de la OGT.
2. Materiales y métodos
2.1. Cultivos celulares
Las líneas celulares de CCR, incluidas SW480 y SW620, se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD, EE. UU.). Se cultivaron en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) que contenía 10% de suero fetal bovino (HyClone, GE Healthcare Life Sciences, Logan, UT, EE. UU.) y 1% de antibiótico-antimicótico (100 unidades/mL de penicilina, 1000 µg/mL de estreptomicina y 0,25 µg/mL de antimicótico Fungizone®, Gibco). Las células se cultivaron en matraces de cultivo celular y se mantuvieron en una incubadora de humedad con 5% de CO2 a 37 °C. Las células se subcultivaron una vez que alcanzaron una confluencia del 70-90% mediante tripsinización.
2.2. Tratamientos con OXA y OSMI-1
OXA y OSMI-1 (un inhibidor de la OGT) se adquirieron de MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, EE. UU.) y se resuspendieron en dimetilsulfóxido (DMSO). Las células SW620 se sembraron en tamaños de pozo adecuados (es decir, 5000 células/pozo para placas de 96 pocillos y 200 000 células/pozo para placas de 6 pocillos) durante 24 horas y, a continuación, se trataron con OXA durante 48 horas adicionales. Para el tratamiento con OSMI-1, se realizó un pretratamiento a 50 µM durante 1 hora antes del tratamiento con OXA. Se realizó un tratamiento con OSMI-1 en varias dosis (Figura S2 en los Datos suplementarios). Las células de control en todos los experimentos se trataron con 0,2% de DMSO como vehículo.
2.3. Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se determinó utilizando el ensayo de proliferación celular CellTiter 96® AQueous One Solution (MTS) de Promega Corporation (Madison, WI, EE. UU.), según se describió anteriormente con algunas modificaciones [[10]]. Brevemente, al final de los tratamientos, las células de los pocillos de las placas de 96 pocillos se incubaron con la solución MTS durante 2 horas y, a continuación, se determinaron las señales mediante un lector de placas de 96 pocillos (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.). Los resultados se expresan como un porcentaje en relación con el control no tratado. Cada experimento se realizó en al menos 3 réplicas independientes y 3 réplicas técnicas para cada condición.
2.4. Ensayo de proliferación celular
La proliferación celular se determinó utilizando el kit ELISA de proliferación celular BrdU (colorimétrico) de Abcam (AB126556; Abcam, Cambridge, Reino Unido), según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células de los pocillos de las placas de 96 pocillos se incubaron con la solución de BrdU durante 24 horas antes del punto final del tratamiento y, a continuación, se determinaron las señales mediante un lector de placas de 96 pocillos (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.) a una longitud de onda dual de 450/550 nm. Los resultados se expresan como un porcentaje en relación con el control no tratado. Cada experimento se realizó en al menos 3 réplicas independientes y 3 réplicas técnicas para cada condición.
2.5. Análisis citométrico de flujo de la apoptosis y la distribución del ciclo celular
Los perfiles apoptóticos y el análisis del ciclo celular de las células SW620 tratadas con OXA y tratamientos con O-GlcNAc se evaluaron mediante el analizador de células Muse® (EMD Millipore, Hayward, CA, EE. UU.) utilizando el kit Muse® Annexin V & Dead Cell Kit (Cytek Biosciences, San Diego, CA, EE. UU.) o el kit Muse® Cell Cycle (Cytek Biosciences, San Diego, CA, EE. UU.), según las instrucciones del fabricante. A continuación, las células se sometieron a la detección de la apoptosis o al análisis del ciclo celular utilizando el analizador de células MuseTM (EMD Millipore Corporation, Hayward, CA, EE. UU.). Los resultados se expresan como un porcentaje en relación con el control no tratado de la apoptosis total (7-AAD (-)/(+) y anexina V (+)) o la proporción de células en cada fase del ciclo celular (G0/G1, S y G2/M), respectivamente. Cada experimento se realizó en al menos 3 réplicas independientes.
2.6. Análisis inmunoblot
El inmunoblot se realizó según se describió anteriormente con algunas modificaciones [[16]]. Brevemente, las células se recogieron y se lisaron en tampón RIPA que contenía 1% de cóctel de inhibidores de proteasas (Sigma Aldrich) y 10 µM de TMG (un inhibidor de la OGA, MedChemExpress). Se midieron las concentraciones de proteína utilizando un ensayo de proteínas Bio Rad (Bio Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.). Se cargaron muestras de proteína (20 µg) en un gel SDS al 10%, se resolvieron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (EMD Millipore Corporation). Los niveles de O-GlcNAcilación, OGT, OGA, GFPT1 y actina se determinaron mediante inmunoblot con anticuerpos primarios, incluidos los anticuerpos contra proteínas modificadas con O-GlcNAc RL2 (1:1000; AB2739; Abcam, Cambridge, Reino Unido), OGT (1:1000; AB177941, Abcam), OGA (1:10000; AB124807, Abcam), GFPT1 (1:1000; AB125063) y actina (1:20000; mAb3700; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.), con una incubación nocturna a 4 °C en tampón de bloqueo de caseína al 1% en PBS (Bio Rad Laboratories), según se describió anteriormente [[17]]. Las membranas se incubaron con los anticuerpos secundarios correspondientes, incluidos los anticuerpos anti-conejo de cerdo (1:5000; P 0217; Dako; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) o las inmunoglobulinas anti-ratón de conejo (1:5000; P 0260; Dako; Agilent Technologies). Los inmunoblots se revelaron con el sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico Plus (Thermo Fisher Scientific) y las señales de proteína se detectaron con ImageQuant LAS4000 (GE Healthcare). Cada experimento se realizó en al menos 3 réplicas independientes.
2.7. Inhibición de la OGT
La inhibición de la OGT se realizó utilizando la tecnología Stealth RNAi, según se describió anteriormente con algunas modificaciones [[16]]. Los oligonucleótidos Stealth RNAi contra OGT (siOGT) y el dúplex negativo de control medio GC revuelto (siSC; n.º de catálogo 12935300) se adquirieron de Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Las secuencias de sentido y anti-sentido de siOGT fueron 5'-GGG UUA CCA GAA GAU GCC AUC GUA U-3' y 5'-AUA CGA UGG CAU CUU CUG GUA ACC C-3', respectivamente. Las células de los pocillos de las placas de 6 pocillos se transfectaron con 20 nM de siOGT o siSC utilizando el reactivo Lipofectamine® 3000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific) y se realizó según las instrucciones del fabricante. Después de 48 horas de transfección, las células se resujetaron en los pocillos adecuados y se trataron con OXA durante 48 horas adicionales para medir la viabilidad celular, la apoptosis y la distribución del ciclo celular, como se mencionó anteriormente.
2.8. Preparación de muestras para el espectrómetro de masas
Las muestras de proteína se obtuvieron de cuatro grupos, que incluyeron (1) siSC, (2) siSC con 10 µM de OXA, (3) siOGT y (4) siOGT con 10 µM de OXA en tres réplicas biológicas por grupo (total de muestras = 12). Al final de los tratamientos, las células se recogieron como pellets celulares y se almacenaron a -80 °C. Las células congeladas se lisaron en tampón de lisis (8 M de urea, 75 mM de NaCl y 50 mM de Tris, pH 8,2) que contenía 1% de cóctel de inhibidores de proteasas (Sigma Aldrich). Se midió la concentración de proteína utilizando un ensayo de proteínas Bio Rad (Bio Rad Laboratories). Se cargaron un total de 25 µg de cada muestra en un gel SDS al 10%, se resolvieron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (EMD Millipore Corporation). Las muestras se redujeron con 5 mM de ditiotreitol (DTT) a 56 °C durante 30 minutos, seguido de un paso de alquilación con 15 mM de yodoacetamida (IAM) en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, las muestras se digirieron en solución con 1 µg de Trypsin/LysC Mix (Promega). Las muestras se incubaron a 37 °C durante 4 horas para la digestión de LysC (8 M de urea) y, a continuación, se añadió tampón Tris de 50 mM (pH 8,2) para reducir la concentración de urea (
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