Proteína nucleolar 6 como un posible factor oncogénico en el cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) es una neoplasia común del tracto digestivo asociada con altas tasas de mortalidad y significativas propiedades invasivas. A pesar de los avances en la investigación, una comprensión exhaustiva de los mecanismos reguladores subyacentes al CCR sigue siendo esquiva.

El presente estudio tuvo como objetivo investigar el posible papel de la proteína nucleolar 6 (NOL6) y sus genes relacionados como nuevos biomarcadores para la proliferación celular en el CCR. Los hallazgos de este estudio podrían contribuir significativamente al diagnóstico precoz y a estrategias terapéuticas más eficaces para el CCR.

La línea celular humana de CCR, HCT116, se cultivó en condiciones estándar. Se utilizaron la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real y el análisis de inmunohistoquímica para medir los niveles de expresión de NOL6 en los tejidos de CCR. Se evaluó la proliferación celular mediante el ensayo MTT, el ensayo de recuento celular Celigo y los ensayos de formación de colonias, mientras que se empleó la citometría de flujo para evaluar la apoptosis celular. Además, se realizó un ensayo de migración transwell para evaluar la migración e invasión de las células de CCR. Se realizaron análisis proteómicos y transcriptómicos exhaustivos para identificar los genes y vías posteriores afectados por la inhibición de NOL6. La expresión de estos genes se validó posteriormente mediante Western blot. Se utilizaron modelos de ratón con xenoinjertos para determinar los efectos de NOL6 en el CCR in vivo. Se empleó la tecnología proteómica cuantitativa con etiquetas de tándem de masas (TMT) y el análisis bioinformático para identificar la vía funcional y las proteínas reguladas por NOL6.

El análisis de los datos del Proyecto del Genoma del Cáncer reveló una importante sobreexpresión de NOL6 en las células de CCR en comparación con las células normales adyacentes. En las células HCT116, la disminución de la expresión de NOL6 se asoció con una disminución de la proliferación y la formación de colonias, así como con un aumento de la apoptosis. Además, la inhibición de NOL6 produjo una disminución del peso y el volumen de los tumores en ratones desnudos, lo que sugiere su papel en la tumorigénesis. Los análisis TMT y Western blot revelaron que la inhibición de NOL6 suprimió la expresión de MCM3 y MCM7.

Este estudio demostró que NOL6 funciona como un oncogén que facilita la progresión del CCR, lo que sugiere su posible papel como un objetivo terapéutico para el tratamiento del CCR.

Citación: Song S, Zhang Y, Li L, Zhou K, Zhao Y, Yang Z, et al. (2026) Proteína nucleolar 6 como un posible factor oncogénico en el cáncer colorrectal. PLoS One 21(2): e0340047.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0340047

Editor: Yi-Hsien Hsieh, Chung Shan Medical University, TAIWÁN

Recibido: 31 de julio de 2025; Aceptado: 15 de diciembre de 2025; Publicado: 2 de febrero de 2026

Derechos de autor: © 2026 Song et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia Creative Commons Atribución, que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se cite al autor original y la fuente.

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes se encuentran en el artículo y en sus archivos de información complementaria.

Financiación: Este estudio fue apoyado por el Proyecto Científico y de la Salud Conjunto de la Fundación de Ciencias Naturales de Hunan en forma de una subvención otorgada a SS (2022JJ70003), el Proyecto “Jóvenes Talentos” de Hunan de Profesionales de la Salud de Alto Nivel en forma de una subvención otorgada a SS (20240304158), el Proyecto de Investigación en Salud de la Comisión Provincial de Salud de Hunan en forma de una subvención otorgada a SS (20255911), el Proyecto de Investigación en Salud de la Comisión Provincial de Salud de Hunan en forma de una subvención otorgada a JW (D202304017491) y el Proyecto de Investigación en Salud de la Comisión Provincial de Salud de Hunan en forma de una subvención otorgada a RH (W20242017). Los roles específicos de este autor se detallan en la sección de “contribuciones de los autores”. Los financiadores no participaron en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

El cáncer colorrectal (CCR) es una neoplasia común del tracto digestivo y la tercera causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer a nivel mundial. Anualmente, se diagnostican más de 1,9 millones de nuevos casos, lo que resulta en aproximadamente 900.000 muertes ^[1,2]. En China, el cáncer de recto representa aproximadamente el 50% de todos los casos de CCR, lo que es significativamente mayor que el aproximadamente 30% que se informa en los países occidentales ^[3]. A pesar de los importantes avances en la prevención y el tratamiento del cáncer que han mejorado considerablemente la tasa de supervivencia a 5 años de los pacientes con CCR en China ^[4,5], el pronóstico de estos pacientes sigue siendo desfavorable debido al diagnóstico y tratamiento tardíos. El diagnóstico y tratamiento precoces del CCR en una etapa curable son cruciales para reducir las tasas de mortalidad ^[4,6,7]. Los recientes avances en la elucidación de la patogénesis y los mecanismos moleculares subyacentes al CCR proporcionan información para la detección y el diagnóstico precoces ^[8]. Aunque se ha implicado a varios genes nucleolares, incluidos SNHG8, SNHG1 y NIFK, en el desarrollo del CCR [9–11], la red génica específica asociada con su desarrollo sigue estando en gran medida sin definir, con muchos genes aún no identificados.

El nucléolo es el sitio de almacenamiento del gen del ARNr, la síntesis y el procesamiento del ARNr y el ensamblaje de las subunidades ribosómicas. Un suministro adecuado de ribosomas es esencial para una síntesis de proteínas eficiente y una rápida proliferación celular en las células cancerosas [12–14]. En consecuencia, las proteínas nucleolares han surgido como posibles objetivos para las terapias anticancerígenas.

La proteína nucleolar 6 (NOL6), ubicada en el cromosoma 9p13 y que abarca 11.434 pares de bases, consta de 26 exones relativamente cortos y 25 intrones ^[15]. También se conoce como proteína asociada al ARN nucleolar (NRAP) y está altamente conservada en las especies ^[13,15]. En estudios preliminares, observamos que NOL6 está sobreexpresada en el CCR humano, lo que sugiere su posible papel como una proteína nucleolar objetivo para el CCR humano.

En este estudio, investigamos el papel de NOL6 en el CCR tanto in vitro como in vivo y planteamos su posible papel como un oncogén en el CCR. También determinamos los efectos de la inhibición de NOL6 sobre la proliferación y la apoptosis en las células de CCR, y proponemos que la inhibición de NOL6 inhibe la proliferación y detiene el ciclo celular. Los mecanismos específicos subyacentes a estos efectos se dilucidaron utilizando la tecnología de etiquetado y análisis de tándem de masas (TMT). Nuestros hallazgos demuestran que NOL6 funciona como un oncogén que facilita la progresión del CCR, lo que destaca su posible valor como un objetivo terapéutico.

Se obtuvieron muestras de CCR y tejidos para-carcinomatosos adyacentes de 97 pacientes con CCR que se sometieron a cirugía en el Departamento de Cirugía General del Primer Hospital del Pueblo de Chenzhou del 1 de diciembre de 2024 al 30 de mayo de 2025. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Primer Hospital del Pueblo de Chenzhou (2024109) y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes para garantizar que comprendieran plenamente el propósito y los procedimientos del estudio. Todas las muestras de tejido obtenidas se confirmaron como CCR y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido.

La línea celular humana de CCR, HCT116, se obtuvo de la Colección de Cultivos de la Academia China de Ciencias (Shanghái, China) y se cultivó en medio RPMI-1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino (SFB) y un 1% de penicilina/estreptomicina. Las células HEK-293T se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco que contenía un 10% de SFB. Todas las líneas celulares se cultivaron en una incubadora a 37 °C con un 5% de CO2. Las líneas celulares se autenticaron mediante la autenticación de repeticiones cortas en tándem por Genetic Testing Biotechnology Corporation y también se analizaron para detectar la contaminación por micoplasma.

Se utilizó la base de datos UALCAN para explorar los niveles de expresión de NOL6 en COAD y READ en función de las etapas individuales del cáncer. La curva de análisis de supervivencia entre los grupos de alta y baja expresión de NOL6 se obtuvo del trazador de Kaplan-Meier.

La transducción mediada por lentivirus se utilizó para introducir construcciones sintéticas de ARN de interferencia corta (ARNi) para dirigirse específicamente a NOL6, junto con oligonucleótidos de control no dirigidos. Las secuencias objetivo de interferencia de ARN se diseñaron cuidadosamente para unirse selectivamente al gen NOL6. Los objetivos de interferencia seleccionados, NOL6 shRNA1 (psc42498) y shRNA2 (psc42500), tenían las secuencias 5'-GCTAGTAATGGTGCCCAAT-3' y 5'-TCGGATTGATGCCTTCCTA-3', respectivamente. Estos dúplexes de ARNi dirigidos a NOL6 y el ARNi de control negativo se sintetizaron mediante Shanghai Genechem Co., Ltd., para crear construcciones recombinantes positivas, siguiendo el protocolo del fabricante. Se verificó la precisión de las secuencias de inserción y los plásmidos se purificaron para su uso posterior. Se produjeron adenovirus recombinantes utilizando la recombinación homóloga y se cultivaron en células 293T. Los viriones se recolectaron del sobrenadante del cultivo celular mediante centrifugación de gradiente de densidad y se almacenaron a -80 °C para su análisis posterior.

Para establecer una línea celular estable con inhibición de NOL6, las células HCT116 se infectaron con las partículas lentivirales shRNA1 (psc42498), shRNA2 (psc42500) y shNC. Las células se seleccionaron posteriormente utilizando 10 μg/ml de puromicina para garantizar que solo sobrevivieran las células con las construcciones de ARNi integradas.

Se extrajo el ARN total de las células utilizando el reactivo TRIzol (SuperfecTRI). Se evaluó la calidad y la cantidad del ARN extraído utilizando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Se utilizó un microgramo de ARN total para la transcripción inversa en ADN complementario (ADNc) utilizando el kit de transcripción inversa (Promega M-MLV), siguiendo el protocolo del fabricante. Posteriormente, se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real utilizando una mezcla maestra de PCR SYBR Green en un instrumento LightCycler 480, según nuestras investigaciones anteriores. Las condiciones de ciclismo térmico incluyeron un paso de desnaturalización inicial (a 95 °C durante 10 minutos), seguido de 45 ciclos de amplificación de desnaturalización (a 95 °C durante 10 segundos), hibridación (a 60 °C durante 30 segundos) y extensión (a 72 °C durante 30 segundos). Se utilizó la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control endógeno y se calcularon los niveles de expresión relativa de NOL6 utilizando el método 2-ΔCT. Los pares de cebadores específicos para NOL6 fueron 5'-TGAGGCACGGCTGTCTATGAT-3' (hacia adelante) y 5'-GGAGATGCAGGACATGGTC-3' (reverso).

Los niveles de expresión de proteínas en las secciones de tejido obtenidas del Primer Hospital del Pueblo se analizaron mediante inmunohistoquímica del 1 de diciembre de 2024 al 30 de mayo de 2025. El análisis de inmunohistoquímica se realizó según lo descrito anteriormente, con una ligera modificación ^[11,16]. Las secciones de tejido se desparafinaron con xileno, se rehidrataron con una serie de alcoholes graduados y se lavaron con agua destilada. Las secciones se incubaron luego durante la noche con el anticuerpo primario anti-NOL6 de conejo (NBP1-57231, Novus Bio) y se trataron con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 hora. Las secciones se contrateñeron con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron en portaobjetos. Se examinaron y cuantificaron la localización y los niveles de expresión de la proteína NOL6 bajo un microscopio.

Las células frescas se lavaron con solución de fosfato tamponado (PBS) y se lisaron con tampón RIPA suplementado con PMSF durante 30 minutos sobre hielo para obtener la proteína total. La concentración de proteína se determinó utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Beyotime Biotechnology). Se utilizaron 30 μg de proteína del lisado en un gel SDS-PAGE al 10% para separar las proteínas y luego las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore) mediante electroforesis de transferencia a 4 °C (300 mA, 150 minutos). Las membranas se incubaron luego durante la noche con los anticuerpos primarios especificados a 4 °C, seguidos de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas objetivo se visualizaron en la membrana utilizando un reactivo LumiGLO® 20× y un kit de peróxido 20×.

Tras la transfección lentiviral, las células HCT116 en la fase de crecimiento logarítmico se resuspendieron para formar una suspensión celular uniforme y se contaron para determinar el número total de células. Las células transfectadas se sembraron posteriormente en una placa de seis pocillos a una densidad de 1.000 células por pocillo, estableciendo pocillos triplicados para cada condición experimental. Las células sembradas se cultivaron en una incubadora ajustada a 37 °C con 5 % de CO2 durante 2 semanas. El medio de cultivo se renovó según fuera necesario durante el período de incubación, y las células se controlaron cada 3 días para evaluar su estado. Después de un período de incubación de 14 días, las colonias celulares se visualizaron mediante un microscopio (Olympus) y sus imágenes se documentaron para su posterior análisis. Posteriormente, las células se lavaron una vez con PBS, se fijaron con una solución de paraformaldehído al 4 % y se tiñeron con GIEMSA para visualizar las colonias. Después de la tinción, las células se lavaron a fondo con agua bidestilada (ddH2O) y se secaron al aire. Se fotografió la formación de colonias y se cuantificó el número de colonias en cada grupo.

Las células HCT116 transfectadas se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 2.000 células por pocillo y se cultivaron a 37 °C en una atmósfera que contenía 5 % de CO2. A partir del día siguiente a la inoculación, se añadieron 20 µL de MTT (Genview) al 5 mg/mL a cada pocillo durante 4 horas. El sobrenadante se aspiró y descartó por completo, seguido de la adición de 100 µL de DMSO (Shanghai Shiyi Chemicals Reagent) a cada pocillo. Las placas se agitaron suavemente durante 2 a 5 minutos para garantizar la disolución completa de los cristales. Se midió la absorbancia de cada pocillo y se obtuvieron los valores de densidad óptica (OD) a 490 nm utilizando un lector de microplacas acoplado a un enzima (Tecan Infinite). Cada punto temporal se ensayó por triplicado y el experimento se replicó tres veces.

Las células HCT116 en período de crecimiento logarítmico se recogieron y se digirieron con enzima pancreática al 0,05 % y se suspendieron en medio RPMI 1640, seguido del conteo celular. Se añadieron células HCT116 (100 µl; 1 × 106 células/ml) a cada pocillo de una placa de seis pocillos y se cultivaron a 37 °C con 5 % de CO2. Posteriormente, se realizó el ensayo Celigo® diariamente durante 5 días consecutivos.

Durante la fase de crecimiento logarítmico, las células shNOL6 y shNC se recogieron utilizando tripsina y se resuspendieron en un medio de crecimiento completo para formar una suspensión celular. En el ensayo de migración transwell, se colocaron las cámaras transwell en una placa de cultivo de 24 pocillos. El compartimento inferior se rellenó previamente con 750 µL de medio RPMI-1640 suplementado con 30 % de FBS. Se añadió una suspensión que contenía 1 × 105 células en 500 µL de medio libre de suero al compartimento superior. Después de un período de incubación de 72 horas, las células que habían migrado al compartimento inferior se fijaron, se tiñeron con cristal violeta y se fotografiaron para su cuantificación.

Para el ensayo de invasión, el compartimento superior se recubrió con Matrigel (Corning, EE. UU.) preenfriado antes de la siembra celular, y el protocolo experimental siguió un proceso similar al del ensayo de migración.

En primer lugar, se recogieron las células de las placas de seis pocillos (>1 × 106) y se lavaron dos veces con solución salina tamponada de Hanks (HBSS) fría al 1 ×. Las células recogidas se fijaron con etanol al 75 % y se almacenaron durante al menos 1 hora para el análisis del ciclo celular. Después de la rehidratación en PBS, las células se trataron con 20 µL de RNasa A (2 µg/ml) y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. Las células incubadas se tiñeron posteriormente con yoduro de propidio (PI, 50 µg/ml) durante 1 hora a 4 °C. Las células teñidas se resuspendieron en un tampón de tinción y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente. Después de la incubación, las células se analizaron utilizando un citómetro Millipore Guava (Millipore) y los datos se analizaron utilizando el software InCyteTM de Millipore.

Los ratones BALB/c nude se asignaron aleatoriamente a dos grupos experimentales, cada uno de los cuales comprendía 10 animales. Todos los ratones BALB/c nude se alojaron en un recinto con temperatura y humedad controladas, con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y acceso libre a alimentos y agua. Se recogieron las células HCT116 en la fase logarítmica de crecimiento, se resuspendieron para formar una suspensión celular homogénea y se contaron después de la transfección lentiviral. A continuación, se inocularon estos ratones con 5 × 106 células HCT116 transfectadas de forma estable suspendidas en 200 µL de PBS en la región de la axila derecha. Después de una semana de las inyecciones, se midió el volumen tumoral cada dos días. Se midieron los diámetros largo (L) y corto (W) del tumor utilizando un calibre de Vernier. El volumen tumoral (V) se calculó utilizando la fórmula: V = 6 × L × W2. Ningún ratón murió durante el experimento antes de cumplir los criterios para la eutanasia. Dos semanas después de la inoculación, se anestesiaron los ratones mediante inyección intraperitoneal de una solución de pentobarbital al 3 % a una dosis de 160 mg/kg y, a continuación, se les aplicó la eutanasia. Los tumores se extirparon cuidadosamente del lugar de la inoculación y se analizaron estadísticamente los pesos de los tejidos de xenoinjerto tumoral extirpados para evaluar las diferencias entre los grupos experimentales. Todos los procedimientos experimentales que involucraron animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (publicaciones del NIH números 80-23, revisada en 1996) y las Directrices éticas institucionales para experimentos con animales y fueron aprobados por el Comité de Ética del Primer Hospital del Pueblo de la ciudad de Chenzhou, Universidad del Sur de China.

Las células HCT116 infectadas con shNOL6 o shNC durante 72 horas se utilizaron para la extracción de proteínas. Las proteínas se extrajeron utilizando un tampón de lisis SDT y se cuantificaron utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA. Las muestras de proteínas extraídas y cuantificadas se etiquetaron utilizando el kit de etiquetado TMT (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Las muestras etiquetadas se mezclaron en proporciones iguales y se separaron utilizando un kit de fraccionamiento de péptidos de fase reversa de alto pH. Las fracciones de péptidos se separaron aún más utilizando un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento Easy-nLC (HPLC) (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) a una velocidad de flujo de nanolitros. Las muestras separadas se almacenaron hasta su posterior análisis.

Las muestras separadas se analizaron utilizando un espectrómetro de masas Q Exactive plus (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Los datos de espectrometría de masas originales se generaron como archivos RAW. Las proteínas presentes en las muestras se identificaron utilizando Proteome Discoverer 2.1 (Thermo Fisher Scientific) y se cuantificaron utilizando Mascot 2.6. Se consideró significativo entre dos grupos comparables (entre los grupos con expresión reducida de NOL6 y los grupos de control) un cambio de pliegue > 1,2 o < 0,83 y un valor de p < 0,05 (prueba t). Las proteínas significativamente abundantes se sometieron a diversos análisis bioinformáticos, incluidos el análisis de enriquecimiento de vías, el análisis de localización subcelular, el análisis de Gene Ontology (GO) y el análisis de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG).

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS y GraphPad Prism. Los datos se presentan como la media ± error estándar de la media (SEM) o la mediana (cuartil), según la distribución de los datos. Las diferencias significativas en las variables continuas emparejadas y no emparejadas se evaluaron utilizando la prueba t de Student o la prueba de rangos con signo de Wilcoxon, respectivamente. Para las comparaciones de datos no emparejados, se empleó una prueba t de Student de dos colas o un ANOVA de una vía. Las diferencias en la expresión o distribución de las variables categóricas se analizaron utilizando la prueba de chi-cuadrado de Pearson (χ2) o la prueba exacta de Fisher, según corresponda. El método de Kaplan-Meier, la prueba de rango logarítmico y el análisis de regresión de riesgos proporcional univariado de Cox se utilizaron para estimar posibles indicadores pronósticos. Cada experimento se realizó en tres réplicas para garantizar la fiabilidad de los resultados. Todos los valores de p fueron de dos colas y se estableció un umbral de p < 0,05 para determinar la significación estadística para todas las pruebas.

Para determinar los niveles de expresión de NOL6 en los tejidos de CRC, analizamos los datos del grupo de CRC en la base de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA). El resultado mostró una regulación al alza significativa de NOL6 en los tejidos de CRC en comparación con los controles normales mediante UALCAN (Fig. 1A-B). Un análisis adicional reveló los diferentes niveles de expresión de NOL6 en los diferentes estadios del cáncer colorrectal (Fig. 1C-1D). Además, se utilizó la inmunohistoquímica (IHC) para evaluar la expresión de NOL6 en 97 muestras de CRC y en los tejidos adyacentes no tumorales emparejados. Los resultados revelaron un aumento significativo de la tinción positiva para NOL6 en los tejidos cancerosos en comparación con los tejidos colorrectales normales (Fig. 1E). Además, encontramos que los pacientes que tienen niveles de expresión más altos de NOL6 tienen un peor pronóstico que los que tienen niveles más bajos, según el gráfico de Kaplan-Meier (Fig. 1F). Estos hallazgos demuestran colectivamente que NOL6 está regulado al alza en los tejidos de CRC.

(A) La expresión de NOL6 está aumentada en el adenocarcinoma de colon (COAD) en comparación con los tejidos normales. (B) La expresión de NOL6 está aumentada en el adenocarcinoma de colon y recto (READ) en comparación con los tejidos normales. (C) Se exploraron los niveles de expresión de COAD en función de los diferentes estadios del cáncer. (D) Se exploraron los niveles de expresión de READ en función de los diferentes estadios del cáncer. (E) Puntuación de IHC de NOL6 en tejido canceroso. Izquierda, imagen representativa; derecha, el resultado estadístico. Las barras de error representan el SEM. (F) Curva de Kaplan-Meier de la supervivencia global (OS) de COAD en función de la expresión de NOL6 mediante el gráfico de KM. *p < 0,05, p < 0,01, *p < 0,005, ****p < 0,001.

Para evaluar el efecto de NOL6 sobre la capacidad proliferativa de las líneas celulares de CRC, las células HCT116 se transfectaron con lentivirus que expresaba shNOL6 y shNC. El análisis de qRT-PCR indicó una disminución significativa de los niveles de expresión de ARNm de NOL6 en el grupo shNOL6 en comparación con el grupo de control (Fig. 2A) tras el tratamiento con shRNA. El ensayo MTT reveló que las tasas de proliferación celular del grupo shRNA de NOL6 fueron significativamente más bajas que las del grupo de control (Fig. 2B). Además, se evaluó la proliferación celular utilizando el citómetro de imagen Celigo (Nexcelom). Los resultados revelaron que la reducción de la expresión de NOL6 inhibió la proliferación de las células HCT116 (Fig. 2C). Además, el ensayo de formación de colonias indicó que el número de colonias formadas por HCT116 en el grupo shRNA de NOL6 fue significativamente menor que el del grupo de control (Fig. 2D). Estos resultados sugieren que el silenciamiento de NOL6 suprime la proliferación y la tumorigénesis de las células de CRC.

(A) Se evaluó la expresión de ARN de las células HCT116 infectadas con shNOL6 y shNC utilizando qRT-PCR. (B) La reducción de la expresión de NOL6 suprimió la capacidad de proliferación celular de las células HCT116, según lo determinado mediante el ensayo MTT. (C) La reducción de la expresión de NOL6 inhibió el crecimiento de las células HCT116, como se demostró mediante el sistema de imagen Celigo. Izquierda, la imagen de fluorescencia; derecha, el resultado estadístico. (D) La reducción de la expresión de NOL6 suprimió la formación de colonias en las células HCT116. Izquierda, la imagen representativa de las colonias celulares; derecha, el resultado estadístico. (E) La reducción de la expresión de NOL6 detuvo la progresión del ciclo celular en las células de CRC. Izquierda, la imagen representativa; derecha, el resultado estadístico. Las barras de error representan el SEM. *p < 0,05, p < 0,01, *p < 0,005, ****p < 0,001.

Para determinar la relación entre el efecto inhibidor de NOL6 sobre la proliferación celular de CRC y el arresto del ciclo celular, se realizó un análisis de citometría de flujo. También se determinaron las tasas de apoptosis de los grupos shNOL6 y shNC utilizando la citometría de flujo. Como se ilustra en la Fig. 2E, la proporción de células en la fase G1 (shNOL6 1: 52,3 % ± 0,96 % frente a 57,6 % ± 0,30 %, p < 0,05; shNOL6 2: 54,0 % ± 0,86 % frente a 57,6 % ± 0,30 %, p < 0,05), fase S (shNOL6 1: 36,7 % ± 1,11 % frente a 29,67 % ± 0,62 %, p < 0,05; shNOL6 2: 37,4 % ± 1,21 % frente a 29,7 % ± 0,62 %, p < 0,05) y G2/M (shNOL6 1: 11,0 % ± 0,70 % frente a 12,8 % ± 0,92 %, p > 0,05; shNOL6 2: 8,57 % ± 0,35 % frente a 12,8 % ± 0,92 %, p < 0,05), en comparación con el grupo de control. Estos resultados revelaron que las células del grupo shNOL6 aumentaron significativamente en la fase S y disminuyeron en la fase G1.

Para determinar el papel de NOL6 en el comportamiento migratorio e invasivo de las líneas celulares de CCRC, examinamos el potencial invasivo de las células HCT116 después de la inhibición de NOL6 utilizando el ensayo de transwell, siguiendo el protocolo del fabricante. Los resultados indicaron que el número de células HCT116 migratorias e invasivas era significativamente menor en el grupo shNOL6 que en el grupo shNC (Fig. 3), lo que sugiere que la inhibición de NOL6 inhibió la migración y la invasión celular en las células de CCRC. La inhibición de NOL6 inhibió el crecimiento tumoral in vivo.

(A) Los ensayos de migración en transwell demostraron que la inhibición de NOL6 inhibió la migración de las células HCT116 (aumento ×200). (B) Los ensayos de migración en transwell indicaron que la inhibición de NOL6 inhibió la migración celular (aumento ×200). Izquierda, la imagen representativa; derecha, el resultado estadístico. Las barras de error representan la SEM. *p < 0,05, p < 0,01, *p < 0,005, ****p < 0,001.

Para investigar el potencial inhibitorio de la inhibición de NOL6 sobre el crecimiento tumoral de CCRC, realizamos experimentos con animales in vivo. Los resultados demostraron que la inhibición de NOL6 disminuyó significativamente el volumen y el peso de los tumores en comparación con el grupo shNC (Fig. 4).

(A) La inhibición de NOL6 inhibió la formación de tumores subcutáneos en un modelo de ratón desnudo. (B) La inhibición de NOL6 disminuyó el peso tumoral. (C) La inhibición de NOL6 disminuyó el crecimiento tumoral in vivo. Las barras de error representan la SEM. *p < 0,05, p < 0,01, *p < 0,005, ****p < 0,001.

Para determinar los mecanismos subyacentes por los cuales NOL6 influye en el CCRC, empleamos tecnología proteómica cuantitativa etiquetada con TMT y análisis bioinformático. Se identificó un total de 1.501 genes expresados diferencialmente, que comprendían 828 genes sobreexpresados y 673 genes subexpresados, en el grupo de inhibición de NOL6 en comparación con el grupo shNC, como se muestra en el gráfico de dispersión (Fig. 5A). El análisis de enriquecimiento de dominios mostró que los genes expresados diferencialmente estaban significativamente enriquecidos en el dominio MCM, el dominio MCM OB y la proteína de mantenimiento de minicromosomas (Fig. 5B). El análisis de la vía KEGG reveló que estas proteínas estaban significativamente enriquecidas en varias vías, incluida la vía de microARN en el cáncer, las cascadas de complemento y coagulación y la vía de replicación del ADN en eucariotas (Fig. 5C). El análisis GO reveló además que las proteínas expresadas diferencialmente estaban asociadas principalmente con el espacio extracelular, el complejo MCM y el lumen de los gránulos alfa de las plaquetas (Fig. 5D). Estos hallazgos revelan el posible papel de NOL6 en la regulación de la expresión de los genes de la familia MCM.

(A) Gráfico de dispersión que ilustra la cuantificación de proteínas y el análisis diferencial. (B) Anotación y enriquecimiento de los dominios funcionales de las proteínas expresadas diferencialmente. (C) Análisis de enriquecimiento de las proteínas expresadas diferencialmente según los términos GO, incluidos el proceso biológico, el componente celular y la función molecular; (D) clasificación de vías mediante el enriquecimiento KEGG. El eje x representa el número de proteínas y el eje y representa el enriquecimiento de la vía KEGG; (E) niveles de expresión de MCM2, MCM3 y MCNA en diferentes grupos.

Tras la inhibición de NOL6, se analizaron los genes MCM2, MCM3 y MCM7 y se identificaron como elementos posteriores en la red de interacción génica, y se seleccionaron para una mayor investigación. Los niveles de expresión de las proteínas MCM2, MCM3 y MCM7 se evaluaron mediante ensayos de Western blotting. Los resultados mostraron que no hubo un cambio significativo en los niveles de expresión de la proteína MCM2; sin embargo, los niveles de proteína MCM3 y MCM7 se redujeron significativamente después de la inhibición de NOL6 (Fig. 5E). Estos hallazgos sugieren que la inhibición de NOL6 suprimió la expresión de MCM3 y MCM7.

Se ha identificado que NOL6 es un posible oncogén en varios cánceres, incluidos los carcinomas de próstata, gástrico y hepatocelular [17–20]. Sin embargo, su función específica en el CCRC no se comprende completamente. Dada su posible función reguladora en otros tipos de cáncer, es necesaria una mayor investigación sobre el papel de NOL6 en el CCRC. Este estudio encontró que NOL6 estaba sobreexpresado en los tejidos de CCRC y que su inhibición inhibió el crecimiento celular tanto in vitro como in vivo. Mecánicamente, la inhibición de NOL6 puede suprimir la expresión de MCM3 y MCM7.

Aunque se han desarrollado varias metodologías para el diagnóstico del CCRC, la identificación de oncogenes clásicos, como APC, TP53, KRAS y BRAF, ha sido fundamental para proporcionar biomarcadores de diagnóstico [21–25]. En particular, ciertos genes, como KRAS y BRAF, han surgido como posibles indicadores de la eficacia de las nuevas terapias dirigidas ^[26,27]. A pesar de los importantes avances en las intervenciones quirúrgicas y las estrategias de tratamiento multimodal, el pronóstico de los pacientes con CCRC sigue siendo desfavorable, principalmente debido al diagnóstico tardío ^[23,28]. Por lo tanto, es esencial una mayor investigación sobre los mecanismos genéticos subyacentes del CCRC, ya que podría revelar más marcadores pronósticos, factores moleculares predictivos y determinantes de la eficacia de la terapia dirigida.

Los estudios han asociado la localización nucleolar de NOL6 con la biogénesis ribosómica. Este gen codifica proteínas asociadas con el ARN nucleolar y está altamente conservado en varias especies ^[17,18]. Un estudio de Lin et al. demostró que la supresión de la expresión de NOL6 en las células resultó en la detención de la fase G1 y facilitó la muerte celular ^[29]. Estos hallazgos resaltan el papel de NOL6 en la regulación del procesamiento del ARNr y la progresión del ciclo celular.

Este estudio es el primero en demostrar el papel regulador de NOL6 en el desarrollo del CCRC. Los datos de muestra analizados de la base de datos TCGA revelaron niveles elevados de expresión de NOL6 en los tejidos de CCRC en comparación con los tejidos adyacentes. Además, se observó una correlación significativa entre la expresión de NOL6 y la etapa patológica TNM, lo que sugiere su papel en la progresión del CCRC. Además, la inhibición de NOL6 resultó en la supresión de la proliferación celular, la disminución de la capacidad de formación de colonias y la detención del ciclo celular. En particular, el peso y el volumen de los tumores en los ratones shNOL6 fueron significativamente menores, lo que fue consistente con nuestro estudio in vitro. Por lo tanto, hipotetizamos que NOL6 desempeña un papel crucial en la iniciación y la progresión del CCRC. Los avances en la tecnología de secuenciación ahora permiten un análisis más completo de la interacción entre los genes y las enfermedades. En este estudio, identificamos posibles objetivos posteriores tras la inhibición de NOL6. Los resultados revelaron que MCM2, MCM3, MCM7 y PCNA son componentes integrales de la red de NOL6. El análisis de Western blot confirmó además que la inhibición de NOL6 redujo la expresión de MCM3 y MCM7, lo que validó los hallazgos y la fiabilidad de los resultados. Los niveles elevados de expresión de los genes de la familia MCM, específicamente MCM2, MCM3 y MCM7, se correlacionaron significativamente con las etapas avanzadas del cáncer clínico. MCM3 y MCM7 se asociaron con resultados clínicos adversos y desempeñaron un papel crucial en la facilitación de la transición del ciclo celular G1/S, la proliferación, la migración y la invasión en el CCRC. En particular, el aumento de la expresión de ARNm de MCM3 y MCM7 se asoció con una mayor supervivencia general.

El microambiente tumoral y el estado inmunitario son determinantes críticos del pronóstico tumoral. Los estudios recientes han destacado el papel de circNOL6A3 en la regulación de la evasión inmunitaria en el cáncer colorrectal, donde se demostró que su eliminación redujo las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) y aumentó la infiltración de células T CD8 ^[32]. Además, la microbiota intestinal puede modular las respuestas al tratamiento tumoral al influir tanto en el microambiente tumoral como en la eficacia de los fármacos ^[33,34]. Ciertos productos naturales también han demostrado la capacidad de revertir la resistencia a la decitabina y remodelar el microambiente tumoral, mejorando así los resultados terapéuticos ^[35]. Aunque las funciones de NOL6 en el microambiente tumoral, la resistencia a los fármacos y la microbiota intestinal no están claras, una mayor investigación sobre su papel puede revelar nuevos objetivos candidatos para la terapia contra el cáncer.

En resumen, nuestros hallazgos sugieren que NOL6 funciona como un posible factor oncogénico en el CCRC al inducir la expresión de MCM2 y MCM7. Por lo tanto, NOL6 puede servir como biomarcador y objetivo terapéutico para el CCRC.