El análisis transcriptómico integrado revela un eje CEBPB-DUSP1 que impulsa la progresión tumoral en el cáncer colorrectal

El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres más comunes y letales en todo el mundo, impulsado por una combinación de mutaciones genéticas, alteraciones epigenéticas e interacciones complejas dentro del microambiente tumoral [^[1],^[2]]. Aunque los importantes avances terapéuticos han prolongado la supervivencia de los pacientes, los mecanismos moleculares subyacentes a la iniciación, la progresión y la resistencia terapéutica del CCR aún no se comprenden completamente. El esclarecimiento de estos mecanismos es esencial para el desarrollo de nuevos marcadores diagnósticos y estrategias de tratamiento más eficaces. Estudios recientes han destacado el papel crucial de los factores de transcripción en la orquestación de los programas de expresión génica que impulsan la tumorigénesis [^[3]].

La proteína beta de unión al CCAAT/enhancer (CEBPB) es un factor de transcripción básico de cremallera leucina (bZIP) que tradicionalmente se asocia con la regulación inmunitaria y las respuestas inflamatorias. Sin embargo, los estudios realizados en la última década han revelado funciones multifacéticas de la CEBPB en varios tipos de cáncer, donde puede promover o suprimir el crecimiento tumoral, dependiendo del contexto celular y los cofactores que interactúan [^[4]]. En el cáncer de mama, se ha implicado a la CEBPB en la inducción de una transición epitelio-mesenquimal (TEM) parcial, la regulación de las citocinas promotoras del tumor y la modulación del microambiente inmunosupresor [^[5],^[6]]. En el cáncer de pulmón, la expresión aberrante de la CEBPB se correlaciona con una mayor migración e invasión celular, a menudo a través de la interacción con vías como la de NF-κB [^[7],^[8]]. Además, en el carcinoma hepatocelular (CHC), la CEBPB puede modular la oncogénesis asociada a la inflamación mediante la orquestación de la producción de citocinas y la promoción de un entorno propicio para la progresión tumoral [^[9],^[10]]. Estos estudios ilustran en conjunto que la CEBPB actúa en una intersección crítica entre la inflamación, la señalización inmunitaria y la supervivencia de las células tumorales, lo que la convierte en un objetivo atractivo para una mayor investigación.

Dentro del contexto del cáncer colorrectal, la evidencia acumulada sugiere que la expresión elevada de la CEBPB puede favorecer las características metastásicas y empeorar los resultados en los pacientes [^[11]–^[13]]. Sin embargo, los efectores específicos aguas abajo de la CEBPB en el CCR siguen estando solo parcialmente dilucidados. Abordar esta laguna es crucial, ya que el desciframiento de la red de transcripción controlada por la CEBPB podría permitir el descubrimiento de nuevos biomarcadores para la detección temprana y posibles objetivos terapéuticos para mitigar la agresividad de la enfermedad.

El análisis transcriptómico integrado a gran escala ha surgido como un enfoque potente para dilucidar dichas redes reguladoras. Al aprovechar grandes conjuntos de datos (por ejemplo, del Proyecto del Genoma del Cáncer) junto con estudios funcionales in vitro e in vivo, los investigadores pueden identificar factores de transcripción candidatos que impulsan los principales fenotipos del cáncer [^[14]]. A diferencia de los estudios de un solo conjunto de datos o de una sola ómica, los análisis transcriptómicos integrados permiten la validación cruzada de los resultados, reducen los falsos positivos y ofrecen una imagen más completa de los complejos circuitos de regulación génica. Por ejemplo, el enriquecimiento de motivos dentro de los genes expresados diferencialmente compartidos (DEG) puede revelar factores de transcripción clave, como la CEBPB, que orquestan múltiples vías oncogénicas. Los experimentos de validación posteriores, que incluyen los ensayos de reportero de luciferasa y la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), ayudan a confirmar los genes diana directos y a cuantificar el impacto funcional de estos factores de transcripción.

En el presente trabajo, aplicamos un análisis transcriptómico multicapa para descubrir nuevos genes diana regulados por la CEBPB en el CCR. Específicamente, identificamos la DUSP1 (fosfatasa de dualidad 1) como un objetivo aguas abajo clave y demostramos que la CEBPB se une directamente al promotor de la DUSP1 para modular su transcripción. La DUSP1 es un regulador negativo importante de las vías MAPK, que están frecuentemente desreguladas en el CCR, y que influyen en procesos como la proliferación celular, las respuestas al estrés y la metástasis. Al explorar los cambios de transcripción impulsados por la CEBPB y correlacionarlos con los datos de los pacientes, mostramos que este eje CEBPB-DUSP1 puede contribuir a la progresión del CCR. Nuestro estudio arroja luz sobre un mecanismo previamente poco apreciado por el cual la CEBPB promueve los procesos tumorigénicos, destacando posibles vías terapéuticas para interceptar esta vía oncogénica.

En general, nuestros hallazgos proporcionan nuevas perspectivas sobre cómo la CEBPB da forma al panorama tumoral en el cáncer colorrectal y subrayan el poder de los análisis transcriptómicos integrados para revelar factores de transcripción clave y sus objetivos. Al dilucidar el papel del eje regulador CEBPB-DUSP1, allanamos el camino para nuevas intervenciones terapéuticas destinadas a restablecer el equilibrio de la señalización MAPK desregulada y mitigar la progresión del CCR.

Métodos y materiales

Fuentes de datos

Analizamos muestras de tejidos sanos y de cáncer colorrectal de tres conjuntos de datos transcriptómicos disponibles públicamente: TCGA-COAD (43 muestras de tejidos sanos y 43 de tumores), GSE100179 (20 muestras de tejidos sanos y 20 de tumores) y GSE196006 (21 muestras de tejidos sanos y 21 de tumores)[^[15],^[16]].

Los datos de RNA-seq para el cáncer colorrectal se obtuvieron del Proyecto del Genoma del Cáncer (TCGA-COAD) a través del portal de datos del Genomic Data Commons (GDC) (https://portal.gdc.cancer.gov/; ID del proyecto: TCGA-COAD) y del NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) con los números de acceso GSE196006 y GSE100179 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Las matrices de expresión a nivel de gen utilizadas para estos análisis se proporcionan como información complementaria delimitada por tabulaciones (Datos suplementarios 1).

Preprocesamiento de los datos brutos de secuenciación de ARN a granel

Para analizar los datos de RNA-seq a granel, comenzamos con el preprocesamiento de las lecturas de secuenciación brutas. Se realizó una evaluación de la calidad de los datos brutos utilizando FastQC, que evalúa la calidad de las lecturas y elimina las secuencias por debajo de un umbral de calidad definido. El recorte de adaptadores y la eliminación de secuencias de baja complejidad se realizaron utilizando Trimmomatic, lo que garantiza que solo se retengan las lecturas de alta calidad para el análisis posterior. Las lecturas procesadas se alinearon con el genoma de referencia humano (hg38) utilizando el alineador HISAT2, elegido por su eficiencia en el procesamiento de grandes conjuntos de datos y su precisión en el mapeo de lecturas al genoma. Después de la alineación, se obtuvieron los recuentos de lecturas por gen utilizando HTSeq-count, que asigna las lecturas a los genes anotados en función de los datos de alineación. Para tener en cuenta la variabilidad en la profundidad de la secuenciación y la longitud del gen, aplicamos DESeq2 para la normalización. Este paso de normalización corrige los sesgos técnicos y garantiza que las comparaciones de la expresión génica entre diferentes muestras reflejen una variación biológica genuina. Este flujo de trabajo permitió un procesamiento de datos robusto y preparó el escenario para el análisis de expresión diferencial posterior.

Análisis de expresión diferencial

Para identificar los genes con diferencias de expresión significativas entre las muestras de tumores y tejidos sanos o entre los grupos experimentales, realizamos un análisis de expresión diferencial sobre los datos de recuento normalizados. El análisis se llevó a cabo utilizando DESeq2, una herramienta estadística diseñada para los datos de RNA-seq. Los valores p se ajustaron para las pruebas múltiples utilizando el procedimiento de la tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini-Hochberg, y los genes expresados diferencialmente (DEG) se definieron como aquellos con |log2FC| > 0,5 y p-adj < 0,05. Este filtro de tamaño del efecto complementa el control de la FDR para priorizar los cambios biológicamente significativos y reducir las llamadas de efecto pequeño que pueden alcanzar la significación estadística. Coherente con estas especificaciones, el análisis integrado en los conjuntos de datos identificó 388 genes regulados al alza y 395 genes regulados a la baja (Tabla S3). Al aplicar el mismo flujo de trabajo DESeq2 y los mismos umbrales al RNA-seq de perturbación (HCT116; siCEBPB frente a siNC), se identificaron 138 genes regulados al alza y 153 genes regulados a la baja (Tabla S4).

Análisis de la ontología génica (GO)

Se realizó un análisis de enriquecimiento funcional de los DEG identificados utilizando la plataforma Metascape (http://metascape.org). Esta herramienta basada en la web se utilizó para analizar los términos de la ontología génica (GO) y las vías biológicas asociadas con los genes regulados al alza y los genes regulados a la baja, proporcionando información sobre las implicaciones funcionales de los cambios de transcripción observados en el cáncer colorrectal.

Cultivo de tejidos y células

Se obtuvieron especímenes de tumores de cáncer colorrectal (CCR) (n = 30) y tejidos adyacentes no tumorales (n = 28) de pacientes antes de recibir cualquier terapia en el Departamento de Medicina Interna, Hospital Provincial de Dermatología de Zhejiang (6 de marzo de 2024 hasta la fecha). Tras la resección quirúrgica, las muestras se conservaron inmediatamente en nitrógeno líquido para aplicaciones posteriores. Este estudio que involucra a participantes humanos se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética Institucional del Hospital Provincial de Dermatología de Zhejiang (Número de aprobación: 2024-80K). Todas las muestras de tejido de cáncer colorrectal y los tejidos adyacentes no tumorales se recolectaron de pacientes antes de cualquier tratamiento. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de la recolección de muestras. Todas las muestras recolectadas se anonimizaron antes del análisis para proteger la confidencialidad del paciente.

Las líneas celulares de cáncer colorrectal humano (HCT116) se obtuvieron del Banco de Células (Academia China de Ciencias). Las células se cultivaron en condiciones de humedad estándar a 37 °C con 5 % de CO2. Para los experimentos de silenciamiento génico, el ARN de interferencia pequeño dirigido a CEBPB (siCEBPB) y un control negativo (siNC) se sintetizaron por la empresa Qingke biotech (Shanghái, China) y se transfectaron en las células a una concentración final de 5 nM utilizando Lipofectamine® 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU.). Los fragmentos del promotor de DUSP1 (promotor 1: ?2000 a ?1500 pb, promotor 2: ?1500 a ?1000 pb, promotor 3: ?1000-0 pb) se clonaron a partir de HCT116 y se construyeron en el vector de reporte pGL3. Realizamos una mutagénesis dirigida al sitio utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5® (E0554S, New England Biolabs, Massachusetts, EE. UU.). La actividad de la luciferasa se detectó utilizando el kit de ensayo de reportero de luciferasa dual (Vazyme DL101 01).

Inmunohistoquímica y PCR cuantitativa en tiempo real

El corte y la tinción de los tejidos fueron realizados por Servicebio (Wuhan, China). Los tejidos se incubaron durante la noche con un anticuerpo anti-CEBPB (Santa Cruz, sc-56637). La puntuación de IHC se calculó como el porcentaje de células teñidas positivamente.

El ARN total de los tejidos y las células se aisló con el reactivo TRIzol™ (Invitrogen). La transcripción inversa se llevó a cabo con el kit de transcripción inversa de ADN complementario de alta capacidad (Thermo Fisher, Cat. 4368814), utilizando 5 µg de ARN en un volumen de reacción de 20 µL. El sistema de reacción de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) y los niveles de expresión génica se calcularon utilizando el método 2^(-ΔΔCt) como se informó anteriormente [^[12]].

Fuentes de datos

Analizamos muestras de tejidos sanos y de cáncer colorrectal de tres conjuntos de datos transcriptómicos disponibles públicamente: TCGA-COAD (43 muestras de tejidos sanos y 43 de tumores), GSE100179 (20 muestras de tejidos sanos y 20 de tumores) y GSE196006 (21 muestras de tejidos sanos y 21 de tumores)[^[15],^[16]].

Los datos de RNA-seq para el cáncer colorrectal se obtuvieron del Proyecto del Genoma del Cáncer (TCGA-COAD) a través del portal de datos del Genomic Data Commons (GDC) (https://portal.gdc.cancer.gov/; ID del proyecto: TCGA-COAD) y del NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) con los números de acceso GSE196006 y GSE100179 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Las matrices de expresión a nivel de gen utilizadas para estos análisis se proporcionan como información complementaria delimitada por tabulaciones (Datos suplementarios 1).

Preprocesamiento de los datos brutos de secuenciación de ARN a granel

Para analizar los datos de secuenciación de ARN masiva (bulk RNA-seq), comenzamos con el preprocesamiento de las lecturas de secuenciación en bruto. Se realizó una evaluación de la calidad de los datos en bruto utilizando FastQC, que evalúa la calidad de las lecturas y elimina las secuencias por debajo de un umbral de calidad definido. El recorte de adaptadores y la eliminación de secuencias de baja complejidad se realizaron utilizando Trimmomatic, asegurando que solo se conservaran las lecturas de alta calidad para el análisis posterior. Las lecturas procesadas se alinearon con el genoma de referencia humano (hg38) utilizando el alineador HISAT2, elegido por su eficiencia en el procesamiento de grandes conjuntos de datos y su precisión en el mapeo de lecturas al genoma. Después de la alineación, se obtuvieron los recuentos de lecturas por gen utilizando HTSeq-count, que asigna las lecturas a los genes anotados en función de los datos de alineación. Para tener en cuenta la variabilidad en la profundidad de la secuenciación y la longitud del gen, aplicamos DESeq2 para la normalización. Este paso de normalización corrige los sesgos técnicos y garantiza que las comparaciones de la expresión génica entre diferentes muestras reflejen una variación biológica genuina. Este flujo de trabajo permitió un procesamiento de datos robusto y sentó las bases para el análisis diferencial de expresión posterior.

Análisis de la expresión diferencial

Para identificar los genes con diferencias de expresión significativas entre las muestras tumorales y las muestras sanas, o entre los grupos experimentales, realizamos un análisis de la expresión diferencial sobre los datos de recuento normalizados. El análisis se llevó a cabo utilizando DESeq2, una herramienta estadística diseñada para los datos de RNA-seq. Los valores p se ajustaron para las pruebas múltiples utilizando el procedimiento de la tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini-Hochberg, y los genes expresados diferencialmente (DEGs) se definieron como aquellos con |log2FC| > 0,5 y p-adj < 0,05. Este filtro de tamaño del efecto complementa el control de FDR para priorizar los cambios biológicamente significativos y reducir las detecciones de bajo efecto que pueden alcanzar la significación estadística. Coherente con estas especificaciones, el análisis integrado en todos los conjuntos de datos identificó 388 genes regulados al alza y 395 genes regulados a la baja (Tabla S3). Al aplicar el mismo flujo de trabajo DESeq2 y los mismos umbrales a la secuenciación de ARN de perturbación (HCT116; siCEBPB vs siNC), se identificaron 138 genes regulados al alza y 153 genes regulados a la baja (Tabla S4).

Análisis de la ontología génica (GO)

Se realizó un análisis de enriquecimiento funcional de los DEGs identificados utilizando la plataforma Metascape (http://metascape.org). Esta herramienta basada en la web se utilizó para analizar los términos de la ontología génica (GO) y las vías biológicas asociadas con los genes regulados al alza y los genes regulados a la baja, proporcionando información sobre las implicaciones funcionales de los cambios transcripcionales observados en el cáncer colorrectal.

Cultivo de tejidos y células

Se obtuvieron especímenes tumorales de cáncer colorrectal (CRC) (n = 30) y tejidos adyacentes no tumorales (n = 28) de pacientes antes de recibir cualquier terapia en el Departamento de Medicina Interna, Hospital Provincial de Dermatología de Zhejiang (del 6 de marzo de 2024 hasta la fecha). Tras la resección quirúrgica, las muestras se conservaron inmediatamente en nitrógeno líquido para aplicaciones posteriores. Este estudio que involucra a participantes humanos se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética Institucional del Hospital Provincial de Dermatología de Zhejiang (Número de aprobación: 2024-80K). Todas las muestras de tejido de cáncer colorrectal y los tejidos adyacentes no tumorales se recolectaron de pacientes antes de cualquier tratamiento. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de la recolección de muestras. Todas las muestras recolectadas se anonimizaron antes del análisis para proteger la confidencialidad del paciente.

Las líneas celulares de CRC humano HCT116 se obtuvieron del Banco de Células (Academia China de Ciencias). Las células se cultivaron en condiciones estándar de humedad a 37 °C con 5 % de CO2. Para los experimentos de silenciamiento génico, se sintetizó ARN de interferencia pequeño dirigido a CEBPB (siCEBPB) y un control negativo (siNC) por la empresa Qingke biotech (Shanghái, China) y se transfectó en las células a una concentración final de 5 nM utilizando Lipofectamine® 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Los fragmentos del promotor de DUSP1 (promotor 1: -2000 a -1500 pb, promotor 2: -1500 a -1000 pb, promotor 3: -1000-0 pb) se clonaron a partir de HCT116 y se construyeron en el vector de informe pGL3. Realizamos una mutagénesis dirigida al sitio utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5® (E0554S, New England Biolabs, Massachusetts, USA). La actividad de la luciferasa se detectó utilizando el kit de ensayo de reportero de luciferasa dual (Vazyme DL101 01).

Inmunohistoquímica y PCR cuantitativa en tiempo real

El corte y la tinción de los tejidos fueron realizados por Servicebio (Wuhan, China). Los tejidos se incubaron durante la noche con un anticuerpo anti-CEBPB (Santa Cruz, sc-56637). La puntuación de IHC se calculó como el porcentaje de células teñidas positivamente.

El ARN total de los tejidos y las células se aisló con el reactivo TRIzol™ (Invitrogen). La transcripción inversa se llevó a cabo con el kit de transcripción inversa de cDNA de alta capacidad (Thermo Fisher, Cat. 4368814), utilizando 5 µg de ARN en un volumen de reacción de 20 µL. El sistema de reacción de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) y los niveles de expresión génica se calcularon utilizando el método 2^(-ΔΔCt) como se informó anteriormente [^[12]].

Resultados

El análisis integrado de cáncer colorrectal y muestras sanas revela diferencias moleculares clave

Utilizando tres conjuntos de datos públicos disponibles de TCGA-COAD y la base de datos GEO (GSE196006, GSE100179) que incluían muestras de cáncer colorrectal y muestras sanas, realizamos un análisis integrado para descubrir firmas moleculares clave. El análisis de componentes principales (PCA) reveló que los grupos de tumores y grupos sanos se segregaron en grupos distintos, con una variabilidad intergrupal que superaba la variabilidad intra-muestra (Fig. 1A). Este hallazgo destaca las diferencias moleculares robustas entre los tejidos tumorales y normales. El análisis de la expresión génica diferencial identificó 388 genes regulados comúnmente y 395 genes regulados comúnmente en todos los conjuntos de datos después de integrar todas las muestras y comparar los grupos individuales (Fig. 1B, Tabla S3).

Entre los genes significativamente desregulados, varios fueron particularmente notables por sus funciones en la biología del cáncer colorrectal (Fig. 1C). CEBPB se reguló al alza y se ha relacionado con la promoción de la progresión del cáncer colorrectal al mejorar las respuestas inflamatorias y la señalización del crecimiento tumoral. CXCR4, un receptor de quimiocinas clave, se sabe que impulsa la metástasis a través del aumento de la migración celular. La sobreexpresión de HIF1A destaca el papel de la adaptación a la hipoxia en el cáncer colorrectal. Además, las mutaciones de TP53, que se asocian comúnmente con la supresión tumoral alterada, se regularon prominentemente en nuestro análisis, mientras que la regulación a la baja de los genes supresores tumorales como KRT4 y los genes asociados a la diferenciación como GATA3 apuntan a mecanismos de diferenciación y adhesión celular alterados.

El análisis de enriquecimiento funcional reveló una regulación al alza significativa de las vías y los términos críticos para la progresión del cáncer colorrectal (Fig. 1D). La vía del cáncer colorrectal en sí estaba muy enriquecida, lo que enfatiza la activación de la señalización relacionada con el cáncer canónico. La vía de señalización de HIF-1 sugiere un papel central para la adaptación a la hipoxia y la reprogramación metabólica en el microambiente tumoral. La regulación al alza de la vía de señalización de TGF-beta y la transición epitelio-mesenquimal (EMT) refleja una mayor invasión tumoral y potencial metastásico. Además, el enriquecimiento de términos como la organización de la matriz extracelular y la vía de señalización de FoxO se alinea con la remodelación del microambiente tumoral y la resistencia a la apoptosis. La familia FoxO (FOXO1/3/4/6) comprende factores de transcripción sensibles al estrés que imponen el arresto del ciclo celular y la apoptosis, y se ven frecuentemente afectados por la señalización hiperactiva de PI3K-AKT y MAPK en el cáncer colorrectal.

Por el contrario, los términos relacionados con la función epitelial normal y la regulación inmunitaria se regularon significativamente a la baja (Fig. 1E). El movimiento del cílio epitelial, que es crítico para mantener la función de barrera epitelial, se suprimió, lo que indica una alteración de la homeostasis celular en los tejidos tumorales. De manera similar, las vías involucradas en el desarrollo del epitelio y la diferenciación de las células epiteliales disminuyeron, lo que respalda el fenotipo desdiferenciado característico de las células de cáncer colorrectal. La adhesión célula-sustrato y la adhesión célula-célula epitelial también se regularon a la baja, lo que es consistente con la EMT y la reducción de la polaridad celular. Además, las vías relacionadas con el sistema inmunitario, como la red inmunitaria intestinal para la producción de IgA, mostraron una actividad reducida, lo que sugiere mecanismos de evasión inmunitaria.

En conjunto, estos análisis revelan alteraciones moleculares clave en el cáncer colorrectal, destacando las vías críticas involucradas en la progresión tumoral y las funciones epiteliales alteradas. Estos hallazgos proporcionan una comprensión clara de las diferencias biológicas subyacentes entre los tejidos tumorales y sanos, ofreciendo información valiosa para futuros estudios.

Análisis de la red de factores de transcripción en el cáncer colorrectal

Realizamos un análisis de la red de factores de transcripción de los genes expresados diferencialmente (DEGs) para explorar los mecanismos moleculares que impulsan la progresión del cáncer colorrectal (Fig. 2A). Entre los factores de transcripción, se descubrió que CEBPB (proteína de unión a CCAAT/enhancer beta) regula el mayor número de DEGs. CEBPB desempeña un papel central en la regulación de las respuestas inmunitarias, la inflamación y la diferenciación celular. En el cáncer colorrectal, la regulación al alza de CEBPB se asocia con un aumento de la señalización inflamatoria, lo que contribuye al crecimiento y la metástasis del tumor. También interactúa con otros factores de transcripción como NF-B, promoviendo la supervivencia celular y la resistencia a la apoptosis, lo que es fundamental para la supervivencia y la proliferación de las células cancerosas. Dada su amplia función reguladora, la regulación al alza de CEBPB en el cáncer colorrectal sugiere su importante participación en la tumorigénesis y la progresión.

Además de CEBPB, encontramos una regulación al alza de otros factores de transcripción clave, como SNAIL, OCT4 y BCLAF1. SNAIL es un inductor conocido de la transición epitelio-mesenquimal (EMT), un proceso que promueve la invasión y la migración del tumor. Su regulación al alza en el cáncer colorrectal respalda el potencial metastásico de la enfermedad. De manera similar, OCT4, que normalmente se asocia con la pluripotencia de las células madre, desempeña un papel en el mantenimiento de las células madre cancerosas en los tumores de cáncer colorrectal, lo que contribuye a la resistencia a la terapia y la recurrencia. BCLAF1, que participa en la regulación de la apoptosis, se regula al alza en el cáncer colorrectal, lo que podría permitir que las células cancerosas eviten la muerte celular, lo que facilita la progresión del tumor.

Por el contrario, se descubrió que varios factores de transcripción críticos para la función epitelial normal, como FOXD3, MIER3, VGLL4, CDX2 y ATF6, se regularon a la baja. FOXD3 es importante para mantener la identidad de las células epiteliales, y su regulación a la baja puede contribuir a la pérdida de las características epiteliales, lo que promueve un fenotipo tumoral más invasivo. MIER3, que regula la proliferación y la apoptosis celular, cuando se regula a la baja, podría respaldar la supervivencia de las células cancerosas al evitar los controles de crecimiento normales. VGLL4, un regulador negativo de la vía de señalización de Hippo, normalmente participa en el control del crecimiento celular, y su regulación a la baja podría promover una proliferación descontrolada. CDX2, que es esencial para la diferenciación del epitelio intestinal, se regula a la baja en el cáncer colorrectal, lo que perjudica los procesos de diferenciación normales y ayuda a la progresión del tumor. Por último, ATF6, un regulador clave en el término de la respuesta del retículo endoplásmico, cuando se regula a la baja, puede afectar las respuestas al estrés celular en el microambiente tumoral, lo que contribuye a la supervivencia de las células tumorales.

También examinamos la expresión de los genes diana regulados por CEBPB (Figura 2B) y descubrimos que varios de ellos están fuertemente asociados con la biología del cáncer colorrectal. Entre los genes diana con expresión aumentada, destacamos seis que están estrechamente relacionados con el cáncer colorrectal: LGALS9, GLUT1, IGFBP3, CDK4, DUSP1 y HIF1A. LGALS9, un miembro de la familia de las galectinas, participa en la adhesión y migración celular, procesos que son cruciales para la metástasis del cáncer. GLUT1, un transportador de glucosa, se sobreexpresa para apoyar las mayores demandas metabólicas de las células cancerosas. IGFBP3, un inhibidor de los factores de crecimiento similares a la insulina, regula la supervivencia celular y la apoptosis, y su sobreexpresión puede ayudar a las células del cáncer colorrectal a resistir la muerte celular. CDK4, un regulador clave del ciclo celular, promueve la proliferación celular, una característica distintiva del cáncer. DUSP1, una fosfatasa que regula la señalización de MAPK, participa en las respuestas celulares al estrés y la inflamación, y su disminución puede reprimir la supervivencia de las células tumorales en condiciones adversas. Finalmente, HIF1A, un factor central en la respuesta celular a la hipoxia, desempeña un papel fundamental en el crecimiento tumoral al promover la angiogénesis y la reprogramación metabólica en el microambiente tumoral hipóxico.

Curiosamente, investigamos la importancia pronóstica de CEBPB en el CRC y evaluamos su expresión en muestras clínicas. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier mostró que los pacientes con altos niveles de transcripción de CEBPB presentaban una supervivencia global significativamente más corta en comparación con aquellos con niveles bajos (prueba de Log-rank, p = 0,0071). La razón de riesgos (HR = 0,012) destaca aún más la correlación inversa entre la expresión elevada de CEBPB y el pronóstico del paciente (Figura 2C). En consonancia con estos hallazgos, el análisis de inmunohistoquímica (IHQ) de CEBPB de muestras de tejido primario reveló un aumento notable de las células positivas para CEBPB en los tumores de CRC en relación con los tejidos adyacentes normales (Figura 2D). En general, estos datos sugieren que CEBPB puede servir como un posible biomarcador de mal pronóstico y como un posible objetivo para nuevas intervenciones terapéuticas en el CRC.

Continuando con nuestra exploración de las redes de factores de transcripción en el CRC, realizamos experimentos dirigidos para silenciar CEBPB en HCT116, con el objetivo de dilucidar su papel fundamental en la regulación de genes y la modulación de vías dentro del microambiente tumoral (Figura 3A). Realizamos un análisis de secuenciación de ARN masivo en líneas celulares de cáncer colorrectal después del silenciamiento de CEBPB para explorar su impacto en la expresión génica (Figura 3B, Datos S2, Tabla S4). El diagrama de dispersión reveló numerosos genes con una expresión significativamente alterada. Entre estos, genes como HIF1A y EGFR se encontraron notablemente disminuidos, mientras que BCL2A1, FABP1, DUSP1 y CDKN1A se encontraron con expresión aumentada. HIF1A, un factor clave en la adaptación a la hipoxia, mostró una expresión reducida, lo que indica aún más un crecimiento tumoral deteriorado en condiciones hipóxicas. EGFR, un conocido impulsor de la proliferación celular, se encontró con expresión disminuida, lo que se alinea con la capacidad proliferativa reducida de las células cancerosas después del silenciamiento de CEBPB. En contraste, la sobreexpresión de CDKN1A reforzó el arresto del ciclo celular observado en las células tumorales, mientras que FABP1 y BCL2A1 sugieren ajustes metabólicos y apoptóticos en el estado posterior al silenciamiento.

El análisis de enriquecimiento funcional reveló varios términos con expresión aumentada asociados con la supresión tumoral (Figura 3C). Términos como la diferenciación de células epiteliales y la organización de la matriz extracelular apuntan a una restauración parcial de la homeostasis epitelial y a una reducción del potencial de invasión en las células del cáncer colorrectal. El proceso apoptótico se enriqueció, lo que enfatiza el aumento de la muerte celular tumoral después del silenciamiento de CEBPB. La senescencia celular también surgió como un término significativo, lo que refleja el arresto del crecimiento irreversible inducido en estas células. Además, términos como la unión estrecha y la regulación negativa de la proliferación celular sugieren un refuerzo de la arquitectura normal de las células epiteliales y la supresión del crecimiento de las células cancerosas. En conjunto, estos hallazgos respaldan la idea de que el silenciamiento de CEBPB desplaza a las células cancerosas hacia un fenotipo menos agresivo. En contraste, los términos con expresión disminuida proporcionaron información sobre las vías de promoción tumoral interrumpidas (Figura 3D). La vía de señalización PI3K-Akt y la vía de señalización TNF, ambas cruciales para la inflamación y la supervivencia de las células cancerosas, se encontraron con expresión disminuida, lo que deteriora aún más la progresión tumoral. La vía de señalización TGF-beta, implicada en la EMT, se suprimió, lo que sugiere un potencial metastásico reducido. La vía de señalización HIF-1 mostró una actividad disminuida, lo que corrobora la reducción de las adaptaciones impulsadas por la hipoxia.

Identificamos un subconjunto de genes de rescate que estaban desregulados durante la progresión del cáncer colorrectal y que se invirtieron después del silenciamiento de CEBPB, a los que se denominó "genes de rescate" (Figura 3E). Entre estos, DUSP1, HIF1A, EGFR, CDKN1A y KRT4 fueron notables. DUSP1, como se discutió anteriormente, desempeña un papel fundamental en la regulación de la señalización de MAPK. Además de la supresión de la proliferación tumoral mencionada anteriormente, su reexpresión después del silenciamiento de CEBPB también puede contribuir a la reducción de las respuestas inflamatorias mediadas por MAPK. HIF1A, que se destacó previamente por su papel en la hipoxia, también influye en la reprogramación metabólica. Su disminución aquí puede indicar una glicólisis deteriorada, una característica distintiva del metabolismo tumoral. EGFR, que ya se reconoció por su papel proliferativo, también puede contribuir a la reducción de la motilidad de las células cancerosas después de la supresión. CDKN1A, más allá de su función establecida en el arresto del ciclo celular, puede actuar de forma sinérgica con otros genes relacionados con la senescencia, lo que amplifica la inhibición del crecimiento. KRT4, que se relacionó previamente con la diferenciación epitelial, puede promover aún más la adhesión y suprimir la EMT después del rescate. El análisis funcional de estos genes de rescate reveló un enriquecimiento en procesos como la vía de señalización de MAPK, la diferenciación de células epiteliales, la senescencia celular y la unión de moléculas de adhesión celular (Figura 3F).

Para investigar si CEBPB regula directamente la red de expresión génica a través del nivel de transcripción, primero realizamos un análisis de motivos e identificamos un sitio de unión canónico de CEBPB enriquecido en varios genes de interés. En particular, DUSP1 surgió como uno de los objetivos con la puntuación más alta [^[17]] (Figura 4A-4B). A continuación, examinamos la expresión de DUSP1 en la cohorte TCGA COAD y descubrimos que era significativamente menor en las muestras tumorales en comparación con los tejidos normales (Figura 4C). Estos datos sugieren que los niveles reducidos de DUSP1 pueden estar relacionados con la tumorigénesis del cáncer colorrectal.

Para determinar si CEBPB se une y regula el promotor de DUSP1, escaneamos la región aguas arriba de 2 kilobases del sitio de inicio de la transcripción de DUSP1 e identificamos tres posibles motivos de unión a CEBPB (Promotores 1, 2 y 3; Figura 4D). Luego, clonamos estos fragmentos en un constructo de reportero de luciferasa. Los ensayos de transfección transitoria en células HCT116 revelaron que cada fragmento del promotor de DUSP1 exhibió una regulación al alza significativa de la actividad de la luciferasa en la disminución de CEBPB (Figura 4E). El promotor 2 mostró la inducción más fuerte, seguido de los promotores 1 y 3, lo que es consistente con el hecho de que CEBPB funciona como un potente regulador transcripcional de DUSP1. Para validar si los motivos predichos son necesarios para la activación transcripcional mediada por CEBPB, introdujimos mutaciones puntuales en los tres motivos de unión a CEBPB dentro del promotor de DUSP1 (Figura 4F). Los ensayos de luciferasa revelaron que la mutación de estos núcleos de unión redujo significativamente la activación transcripcional observada en los constructos de promotor de tipo salvaje (Figura 4G). Específicamente, ninguno de los promotores mutantes exhibió cambios significativos en la actividad de la luciferasa después del silenciamiento de CEBPB, lo que indica que la pérdida de los sitios de unión canónicos abolió la respuesta del promotor dependiente de CEBPB.

Estos resultados confirman que los motivos identificados son elementos de unión funcionales esenciales para la activación del promotor de DUSP1 por CEBPB. En conjunto, estos hallazgos indican que CEBPB se dirige directamente al promotor de DUSP1 y modula su actividad transcripcional, proporcionando así información mecanicista sobre cómo CEBPB influye en las vías de señalización clave en el cáncer colorrectal.

Análisis integrado de muestras de cáncer colorrectal y muestras sanas revela diferencias moleculares clave

Utilizando tres conjuntos de datos disponibles públicamente de TCGA-COAD y la base de datos GEO (GSE196006, GSE100179) que incluían muestras de cáncer colorrectal y muestras sanas, realizamos un análisis integrado para descubrir firmas moleculares clave. El análisis de componentes principales (PCA) reveló que los grupos de tumores y sanos se segregaron en grupos distintos, con una variabilidad intergrupal que excedía la variabilidad intra-muestra (Figura 1A). Este hallazgo destaca las sólidas diferencias moleculares entre los tejidos tumorales y normales. El análisis de expresión génica diferencial identificó 388 genes comúnmente con expresión aumentada y 395 genes comúnmente con expresión disminuida en los conjuntos de datos después de integrar todas las muestras y comparar los grupos individuales (Figura 1B, Tabla S3).

Entre los genes significativamente desregulados, varios fueron particularmente notables por sus funciones en la biología del cáncer colorrectal (Figura 1C). CEBPB se encontró con expresión aumentada y se ha implicado en la promoción de la progresión del cáncer colorrectal al mejorar las respuestas inflamatorias y la señalización del crecimiento tumoral. CXCR4, un receptor de quimiocinas clave, se sabe que impulsa la metástasis a través de un aumento de la migración celular. La sobreexpresión de HIF1A destaca el papel de la adaptación a la hipoxia en el cáncer colorrectal. Además, las mutaciones de TP53, que se asocian comúnmente con una supresión tumoral deteriorada, se encontraron con expresión aumentada en nuestro análisis, mientras que la disminución de los genes supresores tumorales como KRT4 y los genes asociados con la diferenciación como GATA3 apuntan a mecanismos de diferenciación y adhesión celular interrumpidos.

El análisis de enriquecimiento funcional reveló una regulación al alza significativa de las vías y los términos críticos para la progresión del cáncer colorrectal (Figura 1D). La vía del cáncer colorrectal en sí estaba muy enriquecida, lo que enfatiza la activación de la señalización relacionada con el cáncer. La vía de señalización HIF-1 sugiere un papel central para la adaptación a la hipoxia y la reprogramación metabólica en el microambiente tumoral. La regulación al alza de la vía de señalización TGF-beta y la transición epitelio-mesenquimal (EMT) refleja un potencial de invasión y metástasis tumoral mejorado. Además, el enriquecimiento de términos como la organización de la matriz extracelular y la vía de señalización FoxO se alinea con la remodelación del microambiente tumoral y la resistencia a la apoptosis. La familia FoxO (FOXO1/3/4/6) comprende factores de transcripción sensibles al estrés que imponen el arresto del ciclo celular y la apoptosis y que se ven frecuentemente afectados por la hiperactividad de las vías de señalización PI3K-AKT y MAPK en el cáncer colorrectal.

Por el contrario, los términos relacionados con la función epitelial normal y la regulación inmunitaria se encontraron significativamente disminuidos (Figura 1E). El movimiento de cilios epiteliales, que es crítico para mantener la función de barrera epitelial, se suprimió, lo que indica una homeostasis celular interrumpida en los tejidos tumorales. De manera similar, las vías involucradas en el desarrollo del epitelio y la diferenciación de las células epiteliales disminuyeron, lo que respalda el fenotipo dediferenciado característico de las células del cáncer colorrectal. La adhesión célula-sustrato y la adhesión célula-célula epitelial también se encontraron con expresión disminuida, lo que es consistente con la EMT y la polaridad celular reducida. Además, las vías relacionadas con la inmunidad, como la red inmunitaria intestinal para la producción de IgA, mostraron una actividad reducida, lo que sugiere mecanismos de evasión inmunitaria.

En conjunto, estos análisis revelan alteraciones moleculares clave en el cáncer colorrectal, destacando las vías críticas involucradas en la progresión tumoral y las funciones epiteliales interrumpidas. Estos hallazgos proporcionan una comprensión clara de las diferencias biológicas subyacentes entre los tejidos tumorales y sanos, lo que ofrece información valiosa para futuros estudios.

Análisis de la red de factores de transcripción en el cáncer colorrectal

Realizamos un análisis de redes de factores de transcripción de genes expresados diferencialmente (DEG) para explorar los mecanismos moleculares que impulsan la progresión del cáncer colorrectal (Fig. 2A). Entre los factores de transcripción, se encontró que CEBPB (proteína de unión a CCAAT/enhancer beta) regula el mayor número de DEG. CEBPB desempeña un papel central en la regulación de las respuestas inmunitarias, la inflamación y la diferenciación celular. En el cáncer colorrectal, la sobreexpresión de CEBPB se asocia con un aumento de la señalización inflamatoria, lo que contribuye al crecimiento y la metástasis del tumor. También interactúa con otros factores de transcripción, como NF-B, promoviendo la supervivencia celular y la resistencia a la apoptosis, lo cual es fundamental para la supervivencia y la proliferación de las células cancerosas. Dada su amplia función reguladora, la sobreexpresión de CEBPB en el cáncer colorrectal sugiere su importante participación en la tumorigénesis y la progresión.

Además de CEBPB, encontramos una sobreexpresión de otros factores de transcripción clave, como SNAIL, OCT4 y BCLAF1. SNAIL es un inductor conocido de la transición epitelio-mesenquimal (EMT), un proceso que promueve la invasión y la migración del tumor. Su sobreexpresión en el cáncer colorrectal apoya el potencial metastásico de la enfermedad. De manera similar, OCT4, que normalmente se asocia con la pluripotencia de las células madre, desempeña un papel en el mantenimiento de las células madre cancerosas en los tumores colorrectales, lo que contribuye a la resistencia a la terapia y a la recurrencia. BCLAF1, que participa en la regulación de la apoptosis, se sobreexpresa en el cáncer colorrectal, lo que potencialmente permite que las células cancerosas eviten la muerte celular, facilitando la progresión del tumor.

Por el contrario, se encontró que varios factores de transcripción críticos para la función epitelial normal, como FOXD3, MIER3, VGLL4, CDX2 y ATF6, estaban regulados a la baja. FOXD3 es importante para mantener la identidad de las células epiteliales, y su regulación a la baja puede contribuir a la pérdida de las características epiteliales, promoviendo un fenotipo tumoral más invasivo. MIER3, que regula la proliferación celular y la apoptosis, cuando se regula a la baja, podría favorecer la supervivencia de las células cancerosas al eludir los controles normales del crecimiento. VGLL4, un regulador negativo de la vía de señalización de Hippo, normalmente participa en el control del crecimiento celular, y su regulación a la baja podría promover una proliferación descontrolada. CDX2, esencial para la diferenciación del epitelio intestinal, se regula a la baja en el cáncer colorrectal, lo que perjudica los procesos normales de diferenciación y favorece la progresión del tumor. Por último, ATF6, un regulador clave en la respuesta al estrés del plegamiento de proteínas, cuando se regula a la baja, puede perjudicar las respuestas al estrés celular en el microambiente tumoral, lo que contribuye a la supervivencia de las células tumorales.

También examinamos la expresión de los genes diana regulados por CEBPB (Fig. 2B) y encontramos que varios de ellos están fuertemente asociados con la biología del cáncer colorrectal. Entre los genes diana sobreexpresados, destacamos seis que están estrechamente relacionados con el cáncer colorrectal: LGALS9, GLUT1, IGFBP3, CDK4, DUSP1 y HIF1A. LGALS9, un miembro de la familia de las galectinas, participa en la adhesión y la migración celular, procesos que son cruciales para la metástasis del cáncer. GLUT1, un transportador de glucosa, se sobreexpresa para satisfacer las mayores demandas metabólicas de las células cancerosas. IGFBP3, un inhibidor de los factores de crecimiento similares a la insulina, regula la supervivencia celular y la apoptosis, y su sobreexpresión puede ayudar a las células cancerosas del cáncer colorrectal a resistir la muerte celular. CDK4, un regulador clave del ciclo celular, promueve la proliferación celular, una característica distintiva del cáncer. DUSP1, una fosfatasa que regula la señalización de MAPK, participa en las respuestas celulares al estrés y la inflamación, y su regulación a la baja puede reprimir la supervivencia de las células tumorales en condiciones adversas. Por último, HIF1A, un factor central en la respuesta celular a la hipoxia, desempeña un papel fundamental en el crecimiento tumoral al promover la angiogénesis y la reprogramación metabólica en el microambiente tumoral hipóxico.

Curiosamente, investigamos la importancia pronóstica de CEBPB en el CRC y evaluamos su expresión en muestras clínicas. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier mostró que los pacientes con altos niveles de transcritos de CEBPB tenían una supervivencia general significativamente más corta en comparación con aquellos con niveles bajos (prueba de Log-rank, p = 0,0071). La razón de riesgos (HR = 0,012) destaca aún más la correlación inversa entre la elevación de la expresión de CEBPB y el pronóstico del paciente (Fig. 2C). En consonancia con estos hallazgos, el análisis de inmunohistoquímica (IHC) de CEBPB de muestras de tejido primario reveló un aumento notable de las células positivas para CEBPB en los tumores de CRC en relación con los tejidos adyacentes normales (Fig. 2D). En general, estos datos sugieren que CEBPB puede servir como un posible biomarcador de mal pronóstico y como un objetivo candidato para nuevas intervenciones terapéuticas en el CRC.

La inhibición de CEBPB revela posibles objetivos terapéuticos en el cáncer colorrectal

Continuando con nuestra exploración de las redes de factores de transcripción en el CRC, realizamos experimentos dirigidos para inhibir CEBPB en HCT116, con el objetivo de dilucidar su papel fundamental en la regulación de genes y la modulación de vías dentro del microambiente tumoral (Fig. 3A). Realizamos un análisis de ARN-seq a granel en líneas celulares de cáncer colorrectal después de la inhibición de CEBPB para explorar su impacto en la expresión génica (Fig. 3B, Datos suplementarios 2, Tabla suplementaria 4). El diagrama de dispersión reveló numerosos genes significativamente alterados. Entre estos, genes como HIF1A y EGFR se regularon a la baja de forma prominente, mientras que BCL2A1, FABP1, DUSP1 y CDKN1A se regularon al alza. HIF1A, un factor clave en la adaptación a la hipoxia, mostró una expresión reducida, lo que indica aún más una alteración del crecimiento tumoral en condiciones hipóxicas. EGFR, un impulsor conocido de la proliferación celular, se reguló a la baja, lo que se alinea con la capacidad proliferativa reducida de las células cancerosas después de la inhibición de CEBPB. En contraste, la regulación al alza de CDKN1A reforzó el arresto del ciclo celular observado en las células tumorales, mientras que FABP1 y BCL2A1 sugieren ajustes metabólicos y apoptóticos en el estado posterior a la inhibición.

El análisis de enriquecimiento funcional reveló varios términos regulados al alza asociados con la supresión tumoral (Fig. 3C). Los términos como la diferenciación de las células epiteliales y la organización de la matriz extracelular apuntan a una restauración parcial de la homeostasis epitelial y a una reducción del potencial de invasión en las células cancerosas del cáncer colorrectal. El proceso apoptótico se enriqueció, lo que enfatiza el aumento de la muerte de las células tumorales después de la inhibición de CEBPB. La senescencia celular también surgió como un término significativo, lo que refleja el arresto del crecimiento irreversible inducido en estas células. Además, los términos como la unión estrecha y la regulación negativa de la proliferación celular sugieren un refuerzo de la arquitectura normal de las células epiteliales y una supresión del crecimiento de las células cancerosas. En conjunto, estos hallazgos respaldan la idea de que la inhibición de CEBPB desplaza a las células cancerosas hacia un fenotipo menos agresivo. En contraste, los términos regulados a la baja proporcionaron información sobre las vías de promoción tumoral interrumpidas (Fig. 3D). La vía de señalización PI3K-Akt y la vía de señalización TNF, ambas cruciales para la inflamación y la supervivencia de las células cancerosas, se regularon a la baja, lo que perjudicó aún más la progresión del tumor. La vía de señalización TGF-beta, implicada en la EMT, se suprimió, lo que sugiere un potencial metastásico reducido. La vía de señalización HIF-1 mostró una actividad disminuida, lo que corroboró la reducción de las adaptaciones impulsadas por la hipoxia.

Identificamos un subconjunto de genes de rescate que estaban desregulados durante la progresión del cáncer colorrectal y que se invirtieron después de la inhibición de CEBPB, a los que nos referimos como "genes de rescate" (Fig. 3E). Entre estos, DUSP1, HIF1A, EGFR, CDKN1A y KRT4 fueron notables. DUSP1, como se discutió anteriormente, desempeña un papel fundamental en la regulación de la señalización de MAPK. Además de la supresión de la proliferación tumoral mencionada anteriormente, su reexpresión después de la inhibición de CEBPB también puede contribuir a la reducción de las respuestas inflamatorias mediadas por MAPK. HIF1A, que ya se destacó por su papel en la hipoxia, también influye en la reprogramación metabólica. Su regulación a la baja aquí puede indicar una alteración de la glucólisis, una característica distintiva del metabolismo tumoral. EGFR, que ya se reconoció por su papel proliferativo, también puede contribuir a la reducción de la motilidad de las células cancerosas después de la supresión. CDKN1A, más allá de su función establecida en el arresto del ciclo celular, puede actuar de forma sinérgica con otros genes relacionados con la senescencia, lo que amplifica la inhibición del crecimiento. KRT4, que se relacionó previamente con la diferenciación epitelial, puede promover aún más la adhesión y suprimir la EMT después del rescate. El análisis funcional de estos genes de rescate reveló un enriquecimiento en procesos como la vía de señalización de MAPK, la diferenciación de las células epiteliales, la senescencia celular y la unión de moléculas de adhesión celular (Fig. 3F).

CEBPB se une directamente al promotor de DUSP1 y modula su transcripción en el CRC

Para investigar si CEBPB regula directamente la red de expresión génica a través del nivel de transcripción, primero realizamos un análisis de motivos e identificamos un sitio de unión canónico de CEBPB enriquecido en varios genes de interés. En particular, DUSP1 surgió como uno de los objetivos con la puntuación más alta [^[17]] (Fig. 4A-4B). A continuación, examinamos la expresión de DUSP1 en la cohorte TCGA COAD y encontramos que era significativamente menor en las muestras de tumor en comparación con los tejidos normales (Fig. 4C). Estos datos sugieren que los niveles reducidos de DUSP1 pueden estar relacionados con la tumorigénesis del cáncer colorrectal.

Para determinar si CEBPB se une y regula el promotor de DUSP1, escaneamos la región aguas arriba de 2 kilobases del sitio de inicio de la transcripción de DUSP1 e identificamos tres posibles motivos de unión a CEBPB (Promotores 1, 2 y 3; Fig. 4D). Luego, clonamos estos fragmentos en un constructo de reportero de luciferasa. Los ensayos de transfección transitoria en células HCT116 revelaron que cada fragmento del promotor de DUSP1 exhibió una regulación al alza significativa de la actividad de la luciferasa en la inhibición de CEBPB (Fig. 4E). El promotor 2 mostró la inducción más fuerte, seguido de los promotores 1 y 3, lo que es consistente con el hecho de que CEBPB funciona como un potente regulador transcripcional de DUSP1. Para validar si los motivos predichos son necesarios para la activación transcripcional mediada por CEBPB, introdujimos mutaciones puntuales en los tres motivos de unión a CEBPB dentro del promotor de DUSP1 (Fig. 4F). Los ensayos de luciferasa revelaron que la mutación de estos núcleos de unión redujo significativamente la activación transcripcional observada en los constructos del promotor de tipo salvaje (Fig. 4G). Específicamente, ninguno de los promotores mutantes exhibió cambios significativos en la actividad de la luciferasa después de la inhibición de CEBPB, lo que indica que la pérdida de los sitios de unión canónicos abolió la respuesta del promotor dependiente de CEBPB.

Estos resultados confirman que los motivos identificados son elementos de unión funcionales esenciales para la activación del promotor de DUSP1 por parte de CEBPB. En conjunto, estos hallazgos indican que CEBPB se dirige directamente al promotor de DUSP1 y modula su actividad transcripcional, proporcionando así información mecanicista sobre cómo CEBPB puede influir en las vías de señalización clave en el cáncer colorrectal.

Discusión

En este estudio, proporcionamos nuevas pruebas de que CEBPB regula directamente DUSP1 a nivel transcripcional y que esta interacción puede promover la tumorigénesis del cáncer colorrectal. Nuestros hallazgos se basan en observaciones anteriores de que CEBPB, que normalmente participa en la inflamación y las respuestas al estrés, se sobreexpresa en el CRC y se correlaciona con la mala supervivencia de los pacientes. Al identificar tres motivos de unión a CEBPB conservados dentro del promotor de DUSP1 y demostrar una activación transcripcional significativa en los ensayos de reportero, hemos descubierto una base mecanicista de cómo CEBPB puede controlar la expresión de DUSP1 [^[18]]. Nuestro análisis de mutación puntual mostró que la alteración de las secuencias centrales conservadas dentro de las regiones de unión predichas abolió por completo la activación del promotor, lo que respalda la especificidad y la necesidad de estos motivos para la transcripción impulsada por CEBPB.

Curiosamente, si bien CEBPB a menudo funciona como un activador transcripcional, nuestros datos clínicos indican que la expresión de DUSP1 se reduce con frecuencia en las muestras de tejido de CRC en comparación con los controles normales. Una explicación plausible es que el impacto de CEBPB en el promotor de DUSP1 puede depender de cofactores adicionales o cambios epigenéticos presentes en el microambiente tumoral. Alternativamente, CEBPB podría modular la transcripción de DUSP1 de manera dependiente del contexto, activando la expresión en algunas condiciones y, al mismo tiempo, colaborando con otras señales oncogénicas para reprimir o anular las funciones supresoras de tumores de DUSP1 [^[19]]. Los estudios futuros que analicen estas dinámicas (potencialmente a través de ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), perfiles de modificación de histonas o análisis de interacción de cromatina de largo alcance) podrían ayudar a aclarar la compleja regulación de DUSP1 [^[20]]. Dentro de la CRC, la evidencia acumulada sugiere que la expresión elevada de CEBPB favorece las características metastásicas y empeora los resultados. Varios estudios previos en cáncer colorrectal y otros cánceres han manipulado experimentalmente la expresión de CEBPB y, en algunos casos, han evaluado el crecimiento tumoral en modelos animales, y consistentemente informan que CEBPB ejerce efectos pro-tumorales. Por ejemplo, se ha demostrado que UBQLN4 es activado por C/EBPB, lo que promueve la señalización oncogénica de Wnt/ -catenina en la CRC. En modelos de cáncer colorrectal asociado a colitis ulcerosa, la sobreexpresión de CEBPB se ha relacionado con un aumento del crecimiento tumoral a través de la activación de la vía NF- B/STAT3 [^[21]–^[23]].

La importancia funcional del eje CEBPB–DUSP1 se subraya por el papel establecido de DUSP1 en la regulación fina de las vías de señalización de MAPK, que son fundamentales para la supervivencia y la proliferación de las células de CRC [^[24], ^[25]]. Los niveles reducidos de DUSP1 en las células tumorales pueden conducir a una hiperactivación de MAPK, lo que alimenta el crecimiento y la metástasis del tumor. Además, la desregulación de MAPK puede favorecer un microambiente tumoral inmunosupresor y contribuir a la resistencia al tratamiento. Por extensión, restablecer los niveles de DUSP1 (ya sea a través de la inhibición de CEBPB o la regulación ascendente directa de DUSP1) podría representar una estrategia viable para restaurar una señalización de MAPK controlada y reducir la agresividad del tumor.

Otro aspecto importante de nuestros resultados radica en su relevancia clínica. La correlación de la alta expresión de CEBPB con resultados desfavorables, junto con la disminución observada de DUSP1 en la CRC, destaca el potencial de este eje regulador como objetivo tanto diagnóstico como terapéutico [^[26]]. Desde el punto de vista de un biomarcador, la combinación de los niveles de expresión de CEBPB y DUSP1 puede mejorar la precisión pronóstica. Terapéuticamente, se podrían explorar inhibidores de moléculas pequeñas o enfoques basados en ácidos nucleicos que bloqueen la unión de CEBPB al promotor de DUSP1 (o que estabilicen la proteína DUSP1). Además, dado que CEBPB está implicado en varias vías inflamatorias, el tratamiento del eje CEBPB–DUSP1 también podría mitigar la inflamación crónica que a menudo acompaña la progresión de la CRC [^[27]].

Sin embargo, ciertas limitaciones de nuestro estudio merecen ser reconocidas. Primero, si bien nuestros ensayos de luciferasa y análisis de motivos sugieren fuertemente una unión directa, los enfoques de confirmación, como ChIP–qPCR o la edición del genoma (por ejemplo, CRISPR/Cas9), establecerían de manera más definitiva las consecuencias funcionales de la ocupación de CEBPB en estos sitios promotores. En segundo lugar, debido a la heterogeneidad de los subtipos y microambientes de CRC, los trabajos futuros deberían validar nuestros hallazgos en diversas líneas celulares y modelos de xenoinjerto derivados de pacientes. En tercer lugar, la interacción entre DUSP1 y otras fosfatasas u otras vías oncogénicas podría modular el impacto neto en la progresión del tumor, lo que requeriría un análisis más completo a nivel de sistemas para apreciar plenamente las implicaciones terapéuticas [^[28]].

En resumen, nuestro trabajo identifica una nueva relación transcripcional en la que CEBPB regula directamente a DUSP1 y propone que la desregulación de este eje contribuye al fenotipo agresivo de la CRC. Estos conocimientos no solo aclaran la complejidad funcional de CEBPB en el cáncer colorrectal, sino que también allanan el camino para nuevas estrategias terapéuticas destinadas a restaurar una señalización de MAPK controlada. Los esfuerzos futuros se centrarán en verificar estos hallazgos en cohortes de pacientes más grandes, explorar terapias combinadas que se dirijan a múltiples nodos oncogénicos y determinar si la modulación de la actividad de CEBPB–DUSP1 puede mejorar significativamente los resultados clínicos de los pacientes con CRC avanzada.