El aceite de pescado mitiga la miostenosis y mejora la eficacia de la quimioterapia en un modelo preclínico de cáncer colorrectal

Este estudio tuvo como objetivo evaluar si la administración de una dieta que contuviera aceite de pescado era eficaz para reducir la miosteatosis tumoral y la asociada a la quimioterapia, y para mejorar la respuesta tumoral al tratamiento.

A ratas Fischer 344 hembra se les administró una dieta de control durante todo el estudio (grupo control) o se cambió a una dieta que contenía aceite de pescado (2,0 g/100 g de dieta) una semana antes de la implantación del tumor (aceite de pescado a largo plazo) o al inicio de la quimioterapia (aceite de pescado adyuvante). La quimioterapia (irinotecán más 5-fluorouracilo) se inició 2 semanas después de la implantación del tumor (ciclo 1) y 1 semana después (ciclo 2). Los animales de referencia no recibieron tumor ni tratamiento y solo consumieron la dieta de control. Todas las mediciones del músculo esquelético se realizaron en el gastrocnemio. Para evaluar la miosteatosis, los lípidos se evaluaron histológicamente mediante tinción con Rojo de Aceite y el contenido total de triglicéridos se cuantificó mediante cromatografía de gases. La expresión de los factores de transcripción adipogénicos se evaluó a nivel de ARNm mediante RT-PCR en tiempo real.

La administración de una dieta que contenía aceite de pescado redujo significativamente el aumento de los lípidos neutros en el músculo esquelético y el contenido total de triglicéridos (p < 0,001) y la expresión de los factores de transcripción adipogénicos (p < 0,01) asociados al tumor y a la quimioterapia, en comparación con los animales alimentados con una dieta de control. La dieta de aceite de pescado adyuvante fue tan eficaz como la dieta de aceite de pescado a largo plazo para mitigar el contenido de grasa en el músculo esquelético asociado a la quimioterapia y para reducir el volumen tumoral durante la quimioterapia en comparación con los animales alimentados con una dieta de control (p < 0,01).

Las dietas de aceite de pescado a largo plazo y adyuvante son igualmente eficaces para reducir la miosteatosis asociada a la quimioterapia, lo que puede ocurrir al reducir la expresión de los factores de transcripción implicados en la adipogénesis/lipogénesis, y para mejorar la respuesta tumoral a la quimioterapia en un modelo neoplásico.

Citación: Almasud AA, Giles KH, Miklavcic JJ, Martins KJB, Baracos VE, Putman CT, et al. (2017) El aceite de pescado mitiga la miosteatosis y mejora la eficacia de la quimioterapia en un modelo preclínico de cáncer de colon. PLoS ONE 12(8): e0183576.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0183576

Editor: Wolf-Hagen Schunck, Max Delbrueck Center for Molecular Medicine, ALEMANIA

Recibido: 6 de febrero de 2017; Aceptado: 7 de agosto de 2017; Publicado: 23 de agosto de 2017

Derechos de autor: © 2017 Almasud et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se cite al autor original y la fuente.

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes se encuentran en el artículo y en sus archivos de información complementaria.

Financiación: Este estudio fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (259704). Alaa Almasud recibió financiación del Ministerio de Educación Superior de Arabia Saudita, Oficina Cultural de Arabia Saudita. Kaitlin Giles recibió financiación de la beca Queen Elizabeth II de la Universidad de Alberta.

Conflictos de intereses: Los autores han declarado que no existen conflictos de intereses.

La práctica clínica tiene como objetivo mejorar la eficacia de los fármacos quimioterapéuticos para reducir el crecimiento tumoral y, al mismo tiempo, mitigar los efectos secundarios nocivos. Un enfoque para mejorar el índice terapéutico de las terapias antineoplásicas es combinar los fármacos citotóxicos con factores adyuvantes que mejoren la eficacia antitumoral y reduzcan los efectos secundarios nocivos. Se han identificado alteraciones patológicas en el músculo esquelético en pacientes con cáncer que se someten a tratamiento, incluyendo la pérdida de masa muscular y la acumulación de grasa [1–7]. En concreto, la miosteatosis, definida como la acumulación patológica de grasa en el músculo esquelético, está surgiendo como un importante factor pronóstico en el entorno oncológico [2,4–6]. La baja densidad del músculo esquelético, que refleja una alta infiltración de grasa en el músculo esquelético, se asocia con una menor supervivencia libre de progresión y enfermedad ^[2,6] y con una menor supervivencia global ^[2,4,5] en pacientes con cáncer tratados con diversas terapias, incluida la quimioterapia. Por lo tanto, la identificación de un factor adyuvante para la quimioterapia que pueda proteger contra la miosteatosis, además de mejorar la citotoxicidad tumoral, sería de gran beneficio.

Los ácidos grasos poliinsaturados omega-3, el ácido eicosapentaenoico [EPA, 20:5n-3] y el ácido docosahexaenoico [DHA, 22:6n-3], que son muy abundantes en el aceite de pescado, están surgiendo como prometedores adyuvantes nutricionales para la quimioterapia, ya que se ha demostrado que reducen las toxicidades asociadas a los fármacos y mejoran los efectos antitumorales en una variedad de agentes antineoplásicos en varios modelos preclínicos in vitro e in vivo (revisado por ^[8]). También hay pruebas cada vez mayores de ensayos clínicos que sugieren que la suplementación con EPA y DHA mejora los resultados de los pacientes durante la quimioterapia contra el cáncer, incluyendo una mejor condición del músculo esquelético y una mayor tasa de respuesta tumoral (revisado por ^[9]). En concreto, demostramos que los pacientes con cáncer de pulmón no microcítico avanzado que se suplementaron con EPA y DHA durante el tratamiento mostraron una mejoría en la masa muscular esquelética, menos tejido adiposo intramuscular y mejores respuestas tumorales en comparación con aquellos que no tomaron aceite de pescado (tratamiento estándar) ^[10,11]. Por lo tanto, el EPA y el DHA pueden proteger contra la miosteatosis y, al mismo tiempo, mejorar la respuesta tumoral a los agentes antineoplásicos. Si bien se ha demostrado que el EPA y el DHA mejoran la miosteatosis en otras condiciones patológicas humanas (revisado por ^[12]), aún no se ha investigado en el entorno oncológico. Se requieren modelos preclínicos adecuados para investigar las características biológicas y las causas de la miosteatosis asociada al cáncer, así como los mecanismos a través de los cuales el EPA y el DHA pueden ejercer sus efectos protectores en el estado tumoral, con y sin quimioterapia.

Si bien condiciones como la resistencia a la insulina y la obesidad sugieren que el metabolismo alterado de los ácidos grasos en el músculo esquelético puede ser responsable de la acumulación patológica de grasa en el músculo ^[13], la miosteatosis asociada al cáncer también puede implicar mecanismos relacionados con la adipogénesis. En concreto, se ha demostrado que el cáncer aumenta la expresión de los genes adipogénicos en el músculo esquelético, incluyendo la proteína de unión a CCAAT/enhancer (C/EBP), un potente activador de la adipogénesis ^[14]. C/EBPα, β y δ, y el receptor activado por el proliferador de peroxisomas (PPARγ), son importantes factores de transcripción implicados en la robusta expresión de los genes de los adipocitos ^[15]. Por ejemplo, se ha demostrado que la sobreexpresión de C/EBPα y/o PPARγ convierte los mioblastos en adipocitos al promover la adipogénesis y la lipogénesis ^[16], y aumenta los triglicéridos (TG) en el músculo esquelético in vivo ^[17]. La reducción de la relación n-6/n-3 disminuyó la expresión de PPARγ e inhibió la adipogénesis en la línea celular de preadipocitos 3T3-L1 ^[18]. In vivo, la administración de una dieta rica en aceite de pescado previno la miosteatosis (inducida por una dieta rica en grasas basada en sebo) sin cambios en la oxidación de los ácidos grasos, lo que sugiere un mecanismo alternativo por el cual los ácidos grasos n-3 modifican el contenido de grasa en el músculo esquelético ^[19]. En conjunto, parece que la miosteatosis asociada al cáncer puede implicar mecanismos relacionados con la expresión de los genes de los adipocitos, que potencialmente pueden modificarse en presencia de la suplementación con ácidos grasos n-3.

Hemos establecido un modelo animal para estudiar las interacciones entre el tumor (ratas con el tumor de colon Ward) y la quimioterapia, combinando irinotecán (CPT-11) y 5-fluorouracilo (5-FU) ^[20,21], que representa un régimen de tratamiento de primera línea para el cáncer colorrectal y que produce un nivel de toxicidad similar al observado en humanos tratados con esta combinación de fármacos. El estudio actual tuvo como objetivo identificar un modelo preclínico de miosteatosis asociada al cáncer y, a continuación, aplicar este modelo para investigar los efectos de la suplementación con EPA y DHA en el contenido de grasa del músculo esquelético asociado al tumor y a la quimioterapia, así como en la respuesta tumoral a la quimioterapia. Además, queríamos determinar si la administración de EPA y DHA en la dieta al inicio de la quimioterapia (adyuvante) era capaz de producir efectos similares en comparación con una dieta administrada al inicio, antes de la implantación del tumor (a largo plazo). Hipotetizamos que la suplementación con EPA y DHA prevendría la miosteatosis asociada al tumor antes del tratamiento, y que tanto la dieta de aceite de pescado a largo plazo como la dieta adyuvante mitigarían de forma similar la acumulación de grasa en el músculo esquelético asociada a la quimioterapia a través de la inhibición de la señalización de los factores de transcripción adipogénicos/lipogénicos, así como mejorarían la respuesta tumoral a la quimioterapia.

Los procedimientos experimentales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales de la Universidad de Alberta y se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices del Consejo Canadiense para el Cuidado de Animales.

A ratas Fischer 344 hembra (n = 72) con un peso promedio de 127 ± 18 g y de 11 a 12 semanas de edad se les administró, procedentes de Charles River (St. Constant, QC, Canadá). Los informes de salud del proveedor indicaron que la colonia de la que se obtuvieron las ratas estaba libre de patógenos virales y parasitarios conocidos; se detectaron patógenos bacterianos klebsiella pneumoniae, estreptococo y estafilococo aureus en la colonia. Las ratas se alojaron dos por jaula, con cama, tubos y bolas para el enriquecimiento ambiental, y se cubrieron con tapas filtrantes durante el período de aclimatación de siete días y una por jaula cuando se asignaron las dietas iniciales. Las ratas recibieron doce horas de un ciclo de luz:oscuridad por día y se mantuvieron en una sala con presión de aire positiva a una temperatura constante (22 °C). Se proporcionó agua y comida ad libitum durante todo el experimento. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo durante el ciclo de luz en la instalación de animales.

El diseño experimental se describe en la Fig. 1. Inicialmente, a todas las ratas se les administró una dieta de control durante el período de aclimatación de siete días y, a continuación, una semana antes de la implantación del tumor, las ratas se asignaron aleatoriamente a una de las tres dietas seleccionando la asignación del grupo al azar: 1) dieta de control (n = 24); 2) dieta de aceite de pescado a largo plazo (n = 24); 3) dieta de aceite de pescado adyuvante (dieta de control hasta que se inició la quimioterapia, y luego se cambió a la dieta de aceite de pescado; n = 16).

Las barras muestran la duración del tiempo que cada grupo estuvo en el estudio. Las líneas discontinuas muestran cuándo se produjeron las intervenciones indicadas.

Para examinar un posible modelo preclínico de miosteatosis asociada al cáncer, dos semanas después de la implantación del tumor, a las ratas que recibieron la dieta de control se les administró eutanasia (n = 8) o se les administró un ciclo (ciclo 1; n = 8) o dos ciclos (ciclo 2; n = 8) de quimioterapia. Para investigar los efectos de la suplementación con EPA y DHA antes y durante el tratamiento con quimioterapia, a un grupo de ratas que recibieron la dieta de aceite de pescado a largo plazo se les administró eutanasia dos semanas después de la implantación del tumor (n = 8), mientras que las ratas restantes que recibieron la dieta de aceite de pescado a largo plazo y la dieta de aceite de pescado adyuvante se sometieron a un ciclo (n = 8 cada una) o dos ciclos (n = 8 cada una) de quimioterapia. Las ratas que sirvieron como grupo de referencia (n = 8) no se sometieron a la implantación del tumor ni recibieron quimioterapia, consumieron solo la dieta de control durante todo el estudio y, de otro modo, se manipularon de la misma manera que los grupos experimentales.

El carcinoma primario de colon Ward (0,05 g; proporcionado por el Dr. Y. Rustum, Roswell Park Institute, Buffalo, NY, EE. UU.) se trasplantó subcutáneamente en la región lateral de las ratas bajo anestesia suave con isoflurano. El tamaño del tumor se calculó según lo descrito anteriormente ^[20,21]. El volumen tumoral se registró cada dos días antes del inicio de la quimioterapia y todos los días durante las dos semanas en que se administró la quimioterapia. Durante la quimioterapia, el volumen tumoral relativo de cada animal se comparó con el volumen de referencia (día 0).

El día en que se inició la quimioterapia se designó como día 0. El ciclo 1 consistió en CPT-11 (50 mg/kg de peso corporal, vía intraperitoneal) administrado el día 0 y 5-FU (50 mg/kg de peso corporal, vía intraperitoneal) administrado el día 1. El ciclo 2 consistió en el mismo régimen de fármacos que se produjo una semana después del ciclo 1 (días 7 y 8, respectivamente). Se administró atropina (1 mg/kg de peso corporal, vía subcutánea) inmediatamente antes de cada inyección de CPT-11 para aliviar los síntomas colinérgicos de inicio temprano ^[20].

Se alimentó a los animales con una dieta basal (mezcla basal Teklad TD.84172 sin fuente de grasa, Harlan Teklad, Madison, WI) a la que se añadió grasa (20 g/100 g; Tabla 1). Se añadieron diferentes mezclas de grasas disponibles comercialmente (es decir, estearina de colza, aceite de oliva, aceite de girasol y aceite de colza con o sin aceite de pescado (Ocean Nutrition Canada, Dartmouth, NS, Canadá)) a las dietas para garantizar que los contenidos de grasas saturadas, monoinsaturadas y poliinsaturadas fueran similares entre la dieta de control y la dieta con aceite de pescado, y que solo difirieran en sus contenidos de EPA y DHA. Ambas dietas contenían un 40% de energía total procedente de grasas, un 40% de carbohidratos y un 20% de proteínas, lo que representa la proporción promedio estimada de macronutrientes que consumen habitualmente los humanos. Se midió la ingesta de alimentos cada dos días antes del inicio de la quimioterapia y todos los días durante las dos semanas en que se administró la quimioterapia. Durante la quimioterapia, se comparó la ingesta de alimentos relativa de cada animal con la ingesta de alimentos relativa promedio antes de la quimioterapia (día -14 al día 0).

Se registró el peso corporal en los mismos días que el volumen tumoral. El peso corporal se convirtió en peso corporal libre de tumores para la interpretación de los datos y el análisis estadístico. El peso corporal durante la quimioterapia se expresó en relación con el peso corporal de cada animal en el día 0.

Todas las ratas fueron sacrificadas por asfixia con dióxido de carbono (CO2). En el momento del sacrificio, se aislaron, pesaron y congelaron los músculos gastrocnemios en isopentano fundido enfriado en nitrógeno líquido (-156 °C), y se almacenaron a -80 °C hasta su posterior análisis.

Los músculos gastrocnemios congelados se cortaron en secciones transversales mediante criotomía (10 μm de espesor) y se tiñeron para determinar el contenido de lípidos neutros utilizando Oil Red O, según se describió previamente ^[22]. Las secciones se enjuagaron luego en agua destilada y se contratiñeron (5 min) con Hematoxilina de Mayer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) para delimitar las fibras para las mediciones del área de sección transversal (CSA), antes de otro enjuague en agua destilada. Las secciones se visualizaron bajo un microscopio de luz compuesto ZEISS AXIO (AX10 Scope A.1, Carl Zeiss Group, Toronto, ON, Canadá) con un aumento de 200×. Se tomaron imágenes a color con una cámara digital Optronics MacroFire (Optronics, Goleta, CA, EE. UU.) utilizando un sistema confocal y de multiphotón espectral Leica TCS-SP2 (Leica Camera, Solms, Alemania). Se realizó un análisis cualitativo y cuantitativo de la tinción con Oil Red O de forma ciega y se analizaron los resultados utilizando el software Volocity 6.3 (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, EE. UU.). Se analizaron un promedio de 800 ± 23 fibras por músculo para la cuantificación de las fibras que expresaban la tinción con Oil Red O. El CSA de las fibras del músculo esquelético se midió utilizando el software Image J en 200 fibras por músculo.

Se homogeneizó el músculo gastrocnemio (100 mg) en 1,6 ml de solución de cloruro de calcio (CaCl2; 0,025%) con cuentas de vidrio (0,5 mm de diámetro; FastPrep ®-24, MP Biomedicals, Santa Ana, CA, EE. UU.) en intervalos de 20 segundos durante un total de 1 minuto. Las muestras se colocaron en hielo durante al menos 15 segundos entre cada intervalo de homogeneización. Los lípidos se extrajeron utilizando cloroformo/metanol, según se describió previamente ^[23]. La fracción de TG se aisló en placas G, según se describió previamente [24, 25]. La banda de TG se raspó de las placas G y se añadió el estándar interno C15:0 (10,2 mg/100 ml de hexano), seguido de la saponificación. Luego, se metiló el TG, según se describió previamente ^[25]. La composición de ácidos grasos se determinó utilizando análisis de cromatografía de gases con detector de ionización de llama en un Varian 3900 (Varian Instruments, Georgetown, ON, Canadá), según se describió previamente ^[25]. Los picos de ácidos grasos saturados, monoinsaturados y poliinsaturados se separaron entre 6 y 24 longitudes de cadena de carbono y se identificaron utilizando un estándar de ácidos grasos de composición conocida (GLC461, Sigma-Aldrich). La cantidad de ácidos grasos dentro de las fracciones de TG se calculó por comparación con la concentración conocida del estándar C15:0.

Se extrajo el ARN total del músculo gastrocnemio (10 mg) utilizando el kit de aislamiento de ARN total MagMax-96 (Ambion, Austin, TX, EE. UU.) siguiendo el protocolo del fabricante. Para evaluar la cantidad y la calidad del ARN, se utilizaron un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE) y un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.), respectivamente. Luego, se diluyeron las muestras con agua libre de nucleasas a 7 ng/μl. Se utilizó un kit de transcripción inversa de cDNA de alta capacidad (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) para transcribir el ARN a cDNA siguiendo el protocolo del fabricante. Se utilizaron sondas TaqMan® pre-diseñadas con una etiqueta de 6-carboxifluoresceína fosforamidita (FAM™) en el extremo 5' y conjuntos de cebadores (Applied Biosystem) para dirigir los siguientes genes: C/EBPα (Rn01764319m1), C/EBPβ (Rn02532096s1), C/EBPδ (Rn00560963s1), PPARα (Rn00440945m1) y SREBP-1c (Mm00550339g1). El rRNA 18S (Rn03928990g1) fue estable en todas las muestras y, por lo tanto, se utilizó como control endógeno. Se realizó qRT-PCR en 1 μl de muestras de cDNA, en triplicado, en un termociclador ABI 7900HT (Applied Biosystems). Los cambios relativos en la expresión génica se determinaron utilizando el método de análisis 2-ΔΔCT ^[26].

Se analizó el resultado primario, la acumulación de grasa en el músculo esquelético. Además, se evaluaron tres resultados secundarios: factores de transcripción adipogénicos, peso del músculo esquelético y área de sección transversal, y la respuesta tumoral a la quimioterapia.

Los datos se resumen como media ± DE. Se utilizaron análisis de varianza (ANOVA) de una vía y de dos vías con medidas repetidas para probar las diferencias en la ingesta de alimentos, los cambios en el peso corporal y el volumen tumoral antes y durante el tratamiento con quimioterapia, respectivamente. Se utilizó un ANOVA de una vía para probar las diferencias en la tinción con Oil Red O, el contenido total de TG, los cambios en la expresión de ARNm y el contenido de ácidos grasos. Cuando se observó una diferencia significativa, se realizó un análisis post hoc utilizando el modelo de Bonferroni o se realizaron comparaciones planificadas en los datos en los que se establecieron hipótesis a priori. Se utilizó una correlación de Pearson para probar las relaciones entre la expresión de ARNm de varios factores de transcripción adipogénicos/lipogénicos y el contenido total de TG. Se informó la significación estadística cuando el valor p