El estado de metilación de LINE-1 se correlaciona significativamente con la recurrencia posterapéutica en pacientes con cáncer de colon en estadio III que reciben quimioterapia adyuvante con FOLFOX-4.

Los niveles de metilación de los elementos nucleotídicos dispersos largos (LINE-1) son representativos del estado de metilación a nivel del genoma y son cruciales para mantener la estabilidad genómica y la expresión. Su impacto pronóstico en pacientes con cáncer de colon que reciben quimioterapia adyuvante no se ha establecido completamente. Evaluamos la asociación entre el estado de metilación de LINE-1 y las características clinicopatológicas y los resultados oncológicos postoperatorios en pacientes con cáncer de colon en estadio III.

Se incluyeron 129 pacientes con cáncer de colon en estadio III de la clasificación UICC que habían recibido resección radical y quimioterapia adyuvante con FOLFOX. La metilación global se estimó mediante el análisis del estado de metilación de LINE-1 en el tumor utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con bisulfito (PCR) y el ensayo de secuenciación piro. Los datos demográficos, los datos clinicopatológicos y los resultados postoperatorios fueron registrados por investigadores capacitados. Las mediciones de resultados incluyeron la recurrencia postoperatoria y la supervivencia libre de enfermedad. Se realizaron análisis univariante, multivariante y de supervivencia para identificar los factores pronósticos de los resultados oncológicos.

La metilación de LINE-1 de los 129 pacientes se midió en una escala de 0 a 100 (media 63,3; mediana 63,7, desviación estándar 7,1). La hipometilación de LINE-1 fue más común en pacientes de 65 años o más (61,7% ± 7,6% frente a 64,6 ± 6,4, p = 0,019) y en aquellos con recurrencia posterapéutica (61,7 ± 7,4 frente a 64,3 ± 6,7, p = 0,041). Considerando el ajuste de riesgos, se encontró que la hipometilación de LINE-1 fue un factor de riesgo independiente de recurrencia posterapéutica (OR ajustada = 14,1, p = 0,012). El análisis de Kaplan-Meier indicó que los pacientes en el grupo de baja metilación tuvieron un período de supervivencia libre de enfermedad más corto (p = 0,01). En un análisis estratificado que incluyó a 48 pacientes con recurrencia posterapéutica, se encontró que aquellos que experimentaron un período de supervivencia libre de enfermedad más corto (6 meses) parecían tener niveles de metilación de LINE-1 más bajos que los pacientes que presentaron recurrencia después de 6 meses (56,68 ± 15,75 frente a 63,55 ± 7,57, p = 0,041).

Hubo un riesgo significativamente mayor de recurrencia postoperatoria temprana y un período de supervivencia libre de enfermedad más corto en pacientes con cáncer de colon en estadio III que presentaban un estado de hipometilación de LINE-1 después de ser tratados con resección radical y quimioterapia con FOLFOX.

Citación: Lou Y-T, Chen C-W, Fan Y-C, Chang W-C, Lu C-Y, Wu I-C, et al. (2015) El estado de metilación de LINE-1 se correlaciona significativamente con la recurrencia posterapéutica en pacientes con cáncer de colon en estadio III que reciben quimioterapia adyuvante con FOLFOX-4. PLoS ONE 10(4): e0123973.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0123973

Editor académico: John Souglakos, Universidad de Creta, GRECIA

Recibido: 7 de octubre de 2014; Aceptado: 24 de febrero de 2015; Publicado: 28 de abril de 2015

Derechos de autor: © 2015 Lou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se cite al autor original y la fuente.

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes se encuentran en el artículo y en sus archivos de información complementaria.

Financiación: Este estudio fue apoyado por la Fundación de Investigación de la Universidad Médica de Kaohsiung (KMU-1M-30), el Centro de Biomarcadores y Fármacos Biotecnológicos de la Universidad Médica de Kaohsiung (KMU-TP103C03, KMU-TP103H11) y la Beca de Biosignatura en Cánceres Colorrectales, Academia Sinica, Taiwán. CWC y JYW recibieron la financiación. Los financiadores no participaron en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Conflictos de intereses: Los autores han declarado que no existen conflictos de intereses.

En los últimos años, se ha observado un aumento constante de los casos de cáncer colorrectal (CCR) en todo el mundo. Según las estimaciones de GLOBOCAN presentadas en 2008, el CCR es el tercer cáncer más común en hombres y el segundo más común en mujeres ^[1]. Debido a la proliferación de dietas y estilos de vida poco saludables en Taiwán, el CCR se ha convertido en la tercera causa más común de muertes relacionadas con el cáncer. En los últimos años, más de 4000 pacientes con CCR han muerto anualmente (http://www.doh.gov.tw/statistic/index.htm; accedido en diciembre de 2013). Sin embargo, las recientes mejoras en la detección de tumores y la terapia adyuvante han aumentado la esperanza de vida de los pacientes con CCR ^[2]. No obstante, a pesar de la cirugía curativa y la quimioterapia adyuvante, todavía hay un número considerable de pacientes que experimentan recurrencia tumoral durante su período de seguimiento. Se han propuesto varios programas de vigilancia postoperatoria para detectar la posibilidad de recurrencia en una etapa temprana. Los investigadores médicos también han llegado a un consenso sobre la vigilancia de rutina de los pacientes con CCR en estadio II y III que han sido tratados con cirugía curativa [3–5]. Al mismo tiempo, muchos investigadores continúan buscando biomarcadores sofisticados capaces de detectar eficazmente la recurrencia asintomática del CCR después de la cirugía. En la actualidad, algunos biomarcadores son prometedores, pero aún están lejos de ser aplicables a la mayoría de los pacientes. Mientras tanto, la identificación de grupos de alto riesgo que son propensos a la recurrencia parece ser otra táctica entre las estrategias de vigilancia postoperatoria intensiva utilizadas en estas poblaciones susceptibles.

El CCR se desarrolla debido a alteraciones genéticas y epigenéticas. En la última década, muchos estudios han investigado el papel de los factores epigenéticos en el desarrollo del CCR en pacientes [6, 7]. La epigenética, que se ha descrito como un puente entre la genética y el medio ambiente, se ha encontrado que tiene una estrecha relación con la biología del cáncer [8, 9]. Las alteraciones epigenéticas pueden ser hereditarias, pero estos factores también son reversibles y pueden resultar útiles para dilucidar muchos aspectos ambiguos de la carcinogénesis y la recurrencia tumoral en pacientes con CCR. Además, dado que los eventos epigenéticos pueden ser revertidos, podemos regular el proceso de modificación química, incluido el potencial de actividad antineoplásica [7, 10].

Entre los diversos eventos epigenéticos, la metilación del ADN es un componente clave de la epigenética en el genoma de los mamíferos que da como resultado la adición de un grupo metilo (CH3) en la posición 5 del anillo de citosina. Se observan con frecuencia dos patrones de metilación principales en el CCR: uno es la hipermetilación, que generalmente involucra las islas CpG, y el otro es la hipometilación, que a menudo involucra secuencias de ADN repetidas [6, 8]. Aunque los informes sobre la hipermetilación en las neoplasias superan a los informes sobre la hipometilación, esta última parece haberse convertido en un tema de intensa investigación en los últimos años [9, 11]. Además, los niveles de metilación pueden verse afectados por las técnicas de muestreo, las ubicaciones del tumor, los factores ambientales y la edad del paciente [9, 12–15].

La hipometilación global del ADN puede conducir a la inestabilidad genética. Su estrecha relación con una amplia variedad de neoplasias, incluido el CCR, se ha informado en estudios anteriores [6, 7, 9]. Los retroelementos, secuencias repetidas de elementos nucleares dispersos largos (LINE-1), ocurren en casi el 18% del genoma humano ^[16]. Estos retroelementos pueden causar efectos perjudiciales en la célula huésped, pero generalmente se inhiben mediante mecanismos supresores. Sin embargo, los retroelementos pueden contribuir a la tumorigénesis en diferentes entornos. La metilación global se puede medir indirectamente mediante la evaluación del estado de metilación de LINE-1 ^[17]. Estudios anteriores han demostrado que el ensayo de secuenciación piro para la metilación de LINE-1 es cuantitativo, eficaz y reproducible [18–20].

Recientemente, muchos estudios epigenéticos han dilucidado la relación entre la metilación de LINE-1 y los cánceres. Se ha sugerido que el grado de hipometilación de LINE-1 sirve como un factor independiente para determinar los resultados oncológicos desfavorables en pacientes con CCR [18, 21, 22]. Ogino et al. encontraron que la hipometilación de LINE-1 es un factor de riesgo independiente, lo que indica una alta mortalidad específica del cáncer y una mortalidad general en pacientes con cáncer de colon ^[21]. Sunami et al. también informaron que existe una relación lineal entre la progresión de la metilación de LINE-1 y la progresión del tumor ^[23]. Goel et al. informaron que el cáncer colorrectal hereditario no polipósico (HPNCC) se asoció con un grado más bajo de metilación de LINE-1 ^[24]. Además, algunos estudios han encontrado que el CCR de inicio temprano se asocia con una menor metilación de LINE y han destacado su potencial papel como biomarcador pronóstico en pacientes con CCR más jóvenes [18, 25]. Sin embargo, muchos investigadores han propuesto LINE-1 como un marcador prometedor para predecir el pronóstico del CCR. Por lo tanto, se deben controlar más factores de confusión relacionados con el paciente y el tratamiento para generar conclusiones más convincentes, especialmente a la luz de las estrategias modernas que destacan los tratamientos personalizados para diferentes etapas del CCR.

En consecuencia, en este estudio, nos centramos exclusivamente en la población de cáncer de colon en estadio III. Investigamos el estado de metilación tumoral de LINE-1 de pacientes con cáncer de colon en estadio III después de ser tratados con resección radical y quimioterapia adyuvante con FOLFOX. En este estudio, se prestó especial atención a sus resultados oncológicos, incluida la recurrencia postoperatoria y la mortalidad específica del cáncer. Al controlar otros posibles factores pronósticos, buscamos examinar el impacto pronóstico de la metilación de LINE-1 en pacientes con cáncer de colon en estadio III.

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Investigación del Hospital Universitario de Kaohsiung (KMUHIRB-20120043) en Kaohsiung, Taiwán. Todos los participantes en este estudio firmaron un formulario de consentimiento informado.

Revisamos retrospectivamente los registros de todos los pacientes con cáncer de colon que fueron tratados quirúrgicamente en el Hospital Universitario de Kaohsiung entre enero de 2008 y julio de 2012. Inicialmente, se incluyeron un total de 150 pacientes con cáncer de colon en estadio III que se sometieron a resección radical y quimioterapia adyuvante con FOLFOX. Catorce pacientes fueron excluidos porque no se dispuso de muestras de tejido óptimas. De los 136 pacientes restantes, se excluyeron siete porque los datos clínicos de los pacientes eran incompletos. Por lo tanto, un total de 129 pacientes cumplieron los requisitos para el análisis final (Fig. 1). Todos los pacientes recibieron un seguimiento regular cada 2 a 3 meses hasta el fallecimiento o hasta el 30 de junio de 2013.

Todos los participantes del estudio recibieron quimioterapia adyuvante con FOLFOX-4 de acuerdo con las pautas del centro para el tratamiento del cáncer. Se utilizó el siguiente protocolo para la administración de la quimioterapia con FOLFOX-4: oxaliplatino 85 mg/m2 se infundió durante un período de dos horas en el día 1; leucovorina 200 mg/m2 se infundió simultáneamente con oxaliplatino durante un período de dos horas en el día 1, seguido de un bolo de 5-FU 400 mg/m2; luego, se administró una infusión continua de 5-FU 600 mg/m2 durante 22 horas. Este protocolo se repitió cada dos semanas × 12 ciclos.

Las características del paciente, incluido el edad, el sexo, la ubicación del tumor y las características clinicopatológicas, se obtuvieron de los registros médicos electrónicos y las historias clínicas. Las características clinicopatológicas y las etapas de los tumores primarios se definieron utilizando los criterios propuestos por la Comisión Conjunta Americana sobre el Cáncer/Unión Internacional para el Control del Cáncer (AJCC/UICC) ^[26]. Los grados histológicos se clasificaron de la siguiente manera: bien diferenciado (WD), moderadamente diferenciado (MD) o pobremente diferenciado (PD). Como se informó en un estudio anterior, las ubicaciones del tumor se categorizaron como proximal o distal al ángulo esplénico ^[27]. La invasión vascular, la invasión perineural, la profundidad de la invasión tumoral y la metástasis de los ganglios linfáticos fueron factores que se categorizaron particularmente antes de realizar una comparación adicional, ya que cada factor se consideró como un factor de riesgo independiente [28–31].

Estos especímenes de tejido incluidos en parafina y fijados en formalina (FFPE) obtenidos de 129 pacientes se revisaron para identificar los sitios representativos del cáncer. Los bloques de tejido FFPE se microdiseccionaron para obtener secciones de 10 μm de cada muestra. Luego, se realizó el tratamiento con bisulfito del ADN tumoral con un kit de bisulfito EpiTech (Quiagen, Valencia, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Además del proceso de conversión de ADN con bisulfito de sodio mencionado anteriormente (kits EpiTech Bisulfite Fast FFPE; Qiagen; n.º 59844), los ensayos de pirosecuenciación también comprendieron la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (kit Pyromark PCR; Qiagen; n.º 978703) y la secuenciación de la secuencia diana mediante el ensayo de secuenciación por síntesis (reactivos Pyromark Gold Q24; Qiagen; n.º 970802). Este ensayo amplifica una región del elemento LINE-1. Las condiciones de la PCR fueron 45 ciclos de 95 °C durante 20 s, 50 °C durante 20 s, 72 °C durante 20 s, seguidos de 72 °C durante 5 min. Los resultados de la metilación de LINE-1 se obtuvieron en una escala continua de 1 a 100 utilizando el ensayo de pirosecuenciación.

El desarrollo de recurrencia del cáncer tras la cirugía y la supervivencia libre de enfermedad (SLE) se utilizaron como puntos finales principales para garantizar que las inferencias causales sobre los resultados observados se atribuyeran principalmente al cáncer. El desarrollo de una nueva recurrencia local o lesiones metastásicas distantes después de la cirugía se consideró como recurrencias postoperatorias. Al calcular los resultados de la SLE, se excluyeron los casos de mortalidad postoperatoria que ocurrieron dentro de los 30 días. También se excluyeron los individuos que murieron por causas distintas al CCRC del análisis de resultados. En relación con el resultado del tratamiento con el régimen FOLFOX, la SLE se definió como el tiempo transcurrido desde el inicio de la quimioterapia con FOLFOX hasta la recurrencia.

Los datos se analizaron utilizando el paquete estadístico SPSS, versión 17.0 (SPSS. Inc., Chicago, IL). Se utilizaron la prueba t de Student, la prueba chi-cuadrado de Pearson, la prueba exacta de Fisher y la prueba de Kruskal-Wallis para comparar las características demográficas y clinicopatológicas entre los grupos según sus diferentes mediciones de resultados. Todas las variables se dicotomizaron posteriormente para generar una razón de probabilidades no ajustada en el análisis univariante que se realizó a continuación. Se realizó un análisis de regresión logística múltiple para identificar las variables que estaban significativamente relacionadas con la probabilidad de recurrencia tumoral o supervivencia específica del cáncer. Los modelos de regresión se ajustaron para los efectos de las variables de confusión. Los resultados del análisis de regresión logística se informaron como razón de probabilidades ajustada (OR) con un intervalo de confianza del 95 % (IC). La evaluación comparativa de los resultados a largo plazo se realizó analizando las curvas de supervivencia mediante el método de Kaplan-Meier. Las curvas de SLE se compararon mediante la prueba de Log-rank. Todas las pruebas de significación fueron bicolas, y los valores de P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

La edad media al momento de la cirugía para estos 129 pacientes fue de 61,6 años (rango, 30 a 87 años), y 81 pacientes eran hombres (62,8 %). Las características clinicopatológicas se detallan en la Tabla 1. Todos los pacientes recibieron quimioterapia adyuvante con FOLFOX. El tiempo medio de seguimiento fue de 24 meses (RIC: 16,9 a 36). Se informó de recurrencia tumoral en 48 pacientes, mientras que 34 pacientes murieron durante su período de seguimiento.

Aunque los niveles de metilación de LINE-1 en los 129 tumores colorrectales (Fig. 2) estaban ampliamente distribuidos (rango, 37,4 a 77,9 en una escala de 0 a 100), aún mostraron una distribución normal (prueba de Kolmogorov-Smirnov; P > 0,05). El nivel medio de metilación de LINE-1 en el colon ascendente, transverso, descendente, sigmoide y recto fue de 66,41 ± 5,23 %, 60,71 ± 7,26 %, 61,53 ± 10,45 %, 63,32 ± 6,34 % y 61,33 ± 8,05 %, respectivamente. El nivel de metilación fue significativamente mayor en el colon ascendente en comparación con otros sitios (p = 0,042). El nivel medio de metilación de LINE-1 en el grupo de supervivencia fue de 63,8 ± 6,6 % frente a 61,9 ± 8,2 % en el grupo de mortalidad (p = 0,164). En relación con la recurrencia tumoral postoperatoria, el nivel medio de metilación de LINE-1 fue significativamente menor en el grupo de recurrencia en comparación con el grupo sin recurrencia (61,7 ± 7,4 % frente a 64,3 ± 6,7 %; p = 0,041). Dado que no existe un umbral universalmente aceptado para definir si el nivel de metilación de LINE es óptimo o anormal, dividimos los niveles de metilación en dos grupos utilizando un análisis de la curva característica del receptor (ROC) que tuviera una sensibilidad y especificidad equilibradas. El valor de corte fue del 70,15 %, ya que el área bajo la curva (AUC) fue de 0,593.

Examinamos los niveles de metilación de LINE-1 en los diferentes grupos categorizados por las variables que se enumeran en la Tabla 1. Para una mejor comparación, la edad se dicotomizó en dos grupos, con un valor de corte de 65 años. Como se muestra en la Tabla 2, en el análisis univariante que incorporó nueve variables, se demostró que los niveles de metilación de LINE-1 eran significativamente diferentes entre el grupo de 65 años o más y el grupo de menos de 65 años (64,6 % frente a 61,7 %, respectivamente; p = 0,019).

La Tabla 3 muestra los resultados del análisis univariante y multivariante en relación con las mediciones de resultados de la recurrencia posterapéutica. Los grados histológicos se dividieron en dos grupos, uno que incorporaba especímenes bien diferenciados (BD) y moderadamente diferenciados (MD), y el otro que comprendía especímenes pobremente diferenciados (PD). Debido a un número limitado de casos T1, los estadios T se dicotomizaron en agrupaciones "T1+T2" y "T3+T4". Los niveles de metilación de LINE-1 se dicotomizaron en grupos "bajo" y "alto" según un valor de corte de 70,15 % generado por nuestro análisis ROC anterior. Posteriormente, se aplicó una regresión logística con selección directa. La metilación de LINE-1 pareció ser el único factor pronóstico independiente para el resultado oncológico de la recurrencia tumoral posterapéutica (OR ajustada = 14,1, p = 0,012).

Los datos de seguimiento estuvieron disponibles para los 129 participantes. El tiempo medio de supervivencia fue de 25 (RIC: 19 a 40) meses para los pacientes que sobrevivieron, 19,1 (RIC: 12,9 a 26,7) meses para los pacientes que murieron y 24 (RIC: 16,9 a 36) meses para la cohorte general. Para evaluar las implicaciones pronósticas de la metilación de LINE-1, nos centramos en la recurrencia postoperatoria y la SLE después de tener en cuenta los hallazgos del análisis multivariante. El método de Kaplan-Meier mostró que se observaron más casos de recurrencia postoperatoria y una SLE media más corta en el grupo de baja metilación de LINE-1 (Fig. 3, p = 0,010).

Las curvas que representan los efectos sobre la recurrencia postoperatoria de la metilación de LINE-1 cuando se dividen en pacientes con metilación "baja" y "alta".

Basándonos en la evidencia sobre la SLE media más corta en el grupo de baja metilación de LINE-1, hipotetizamos que existe alguna asociación entre el nivel de metilación de LINE-1 y la SLE en el grupo de recurrencia. Para detectar el umbral de SLE que causa diferencias significativas en los niveles de metilación de LINE-1, introdujimos cuatro umbrales empíricos de SLE (3, 6, 9 y 12 meses) y dividimos a todos los pacientes con recurrencia en grupos de "recurrencia temprana" (SLE más corta o igual al umbral) y grupos de "recurrencia tardía" (SLE más larga que el umbral). Cuando el umbral de SLE es de seis meses, el grupo de recurrencia temprana pareció tener un nivel medio de metilación de LINE-1 significativamente menor (Tabla 4).

En este estudio, demostramos que la hipometilación de LINE-1 se asocia con una mayor recurrencia postoperatoria y una SLE más corta en pacientes con cáncer colorrectal en estadio III, que se han sometido a cirugía radical y quimioterapia posterior con FOLFOX. Estudios previos han informado que la progresión tumoral, la supervivencia o la recurrencia de los pacientes con CCRC pueden diferir según el nivel de metilación de LINE-1 [21, 23, 32]. Sin embargo, dado que estos estudios incluyeron poblaciones diversas y diferentes procedimientos de tratamiento, existió una clara heterogeneidad en sus hallazgos. Solo evaluamos las implicaciones pronósticas de los niveles de metilación de LINE-1 en una población homogénea que comprendía pacientes con cáncer colorrectal en estadio III, que habían recibido resección radical y quimioterapia adyuvante con FOLFOX. Nuestros resultados confirmaron los hallazgos previamente informados por Ahn et al. sobre la influencia pronóstica de la hipometilación de LINE-1 en pacientes con CCRC en estadio III que se sometieron a resección ^[33]. Enfatizaron que la hipometilación del ADN fue un biomarcador factible de recurrencia en los casos de CRC proximal, pero no en los distales. Al incluir ajustes de factores de confusión, como la ubicación del tumor (proximal frente a distal) en nuestro estudio, encontramos que los niveles bajos de metilación de LINE-1 (inferiores a 70,15) siguieron siendo un factor de riesgo sólido que tenía aproximadamente ocho veces más riesgo de recurrencia postoperatoria.

El concepto de los dos colones se utiliza convencionalmente para indicar características moleculares discretas mediante la clasificación dicotómica de los tumores cólicos proximales y distales. En estudios previos, se ha observado con mayor frecuencia la inestabilidad cromosómica (ICN) en los CRCs distales ^[34]. Por otro lado, la inestabilidad de microsatélites (MSI) y las mutaciones de BRAF son más comunes en los CRCs proximales ^[35-37]. Sin embargo, Yamauchi et al. encontraron recientemente que las frecuencias de fenotipo de metilador de islas CpG alto (CIMP), MSI alto y mutaciones de BRAF aumentan gradualmente desde el recto hasta el colon ascendente ^[38]. Este hallazgo desafió profundamente el concepto convencional del modelo de los dos colones que se ha utilizado durante varias décadas. En nuestros propios datos, aunque nuestra comparación de los niveles de metilación de LINE-1 en los pacientes con cáncer de colon derecho e izquierdo indicó una significación estadística marginal, observamos que el nivel medio de metilación fue significativamente mayor en los tumores del colon ascendente en comparación con los de otros sitios. Recomendamos que siempre se deben considerar los factores de confusión específicos del sitio al realizar estudios de investigación sobre alteraciones genéticas o epigenéticas.

Aunque existe un creciente cuerpo de evidencia que respalda la importancia pronóstica de la metilación de LINE-1, aún no se ha establecido un umbral que defina si el nivel de metilación medido está hipermetilado o hipometilado. Saito et al. observaron el impacto pronóstico de la metilación de LINE-1 en el cáncer de pulmón de células no pequeñas manteniendo un umbral alto del 90 % ^[39]. Antelo et al. definieron la hipometilación de LINE-1 en pacientes jóvenes con CCRC utilizando un valor de corte del 65 % y afirmaron que aquellos pacientes que tenían < 65 % de metilación de LINE-1 tenían una peor supervivencia general ^[18]. En nuestro estudio, categorizamos los niveles de metilación de LINE-1 en grupos de niveles altos y bajos basándonos en los conceptos de investigadores anteriores [40, 41]. Para identificar con precisión un valor de corte óptimo para la metilación de LINE-1 en pacientes que informan recurrencia tumoral después de la cirugía radical del CCRC, realizamos un análisis ROC. Para los datos continuos obtenidos de estas muestras, se encontró que el área bajo la curva (AUC) fue de 0,593, y el 70,15 % se consideró como el valor de corte de metilación con una sensibilidad y especificidad equilibradas. Con un valor de corte más alto y un rendimiento discriminatorio más pobre, nuestro resultado fue ligeramente diferente del informado en el estudio previo de Baba et al. ^[25]. En una población heterogénea que comprendía CRCs de todos los estadios, lograron un mejor AUC de 0,62 al considerar un valor de corte de 60 %. Sin embargo, existe margen para mejorar el rendimiento diagnóstico a medida que se realicen más estudios a gran escala basados en poblaciones estratificadas y diferentes ubicaciones tumorales.

Muchos investigadores han continuado explorando con entusiasmo el mecanismo por el cual la metilación de LINE-1 está asociada con los resultados oncológicos. La hipometilación de LINE-1 resulta en la activación transcripcional de una posible carcinogénesis ^[9,16]. Una expresión aumentada de LINE-1 después de la hipometilación puede resultar en inestabilidad cromosómica (CIN), que se ha denominado como un fenotipo característico en cánceres más invasivos con peor pronóstico ^[13,16]. Además, Hur et al. informaron recientemente que existen pruebas que demuestran que la hipometilación de LINE-1 sirve como una característica crucial en las metástasis del CRC, especialmente en las metástasis hepáticas ^[42]. Esto está en buena concordancia con la diferencia estadísticamente significativa entre los niveles de metilación de LINE-1 de los grupos de recurrencia y no recurrencia de nuestro estudio (Tabla 2). De las 48 recurrencias de cáncer de colon en nuestra cohorte de estudio, hubo 14 casos de metástasis hepáticas. Sin embargo, los niveles de metilación de LINE-1 de los pacientes con cáncer de colon con metástasis hepáticas no mostraron una diferencia significativa en comparación con aquellos con otras recurrencias. En contraste con las perspectivas de investigadores anteriores, hemos demostrado un hallazgo fundamental que la hipometilación de LINE-1 tiene cierta influencia en la recurrencia temprana (DFS menor de 6 meses) en la cohorte que finalmente experimentó recurrencia. Estos resultados enfatizan el papel crucial de la metilación de LINE-1 en el desarrollo de la recurrencia del cáncer de colon, especialmente la recurrencia temprana. Por lo tanto, es necesario diseñar estrategias de vigilancia frecuentes y tempranas para guiar el seguimiento postoperatorio de los pacientes que pertenecen al grupo de hipometilación.

Se deben considerar varias limitaciones al interpretar los hallazgos de nuestro estudio. Primero, algunos factores influyentes de la metilación global no pudieron ser controlados. Debido a que la población del estudio no fue reclutada de forma prospectiva, ciertos factores ambientales o información relacionada con el paciente no pudieron ser registrados durante la cirugía. Por ejemplo, se ha informado que la irradiación ionizante, el tabaquismo y la actividad física causan variaciones en la metilación de LINE-1 [43–45]. Para evitar introducir más sesgos de recuerdo, no intentamos controlar estos posibles factores de confusión en nuestro estudio. Además, basándose en este ensayo, podría ser éticamente inaceptable realizar un estudio que asigne aleatoriamente a los pacientes con o sin la administración de quimioterapia adyuvante con FOLFOX. Sugerimos que el estado de metilación podría utilizarse como un factor de estratificación. En segundo lugar, el número de participantes en el estudio es limitado y la población excluida sigue siendo considerable. La porción excluida podría tener algún impacto en los resultados generales si también se incluyera. Además, la duración del seguimiento podría extenderse para dilucidar el impacto pronóstico en la mortalidad específica por cáncer. A pesar de estas limitaciones, pudimos demostrar que las características clinicopatológicas eran distintas y los pronósticos eran diferentes para los subgrupos de metilación formados a partir de una población asiática homogénea.

Nuestros resultados indican que, a pesar de ser tratados con cirugía radical y quimioterapia adyuvante con FOLFOX, los pacientes con cáncer de colon en estadio III con hipometilación de LINE-1 experimentaron recurrencias postoperatorias tempranas y un DFS más corto.

Los autores agradecen a Ming-Yii Hwang por proporcionar sugerencias útiles en versiones anteriores de este manuscrito.

Concebido y diseñado los experimentos: YTL CWC JYW. Realizado los experimentos: YTL YCF CWC CYL CWH. Analizado los datos: YTL CWC WCC ICW WHH. Contribuido con reactivos/materiales/herramientas de análisis: YTL YCF CWC WCC JYW. Redactado el artículo: YTL CWC JYW.