Quimioinmunoterapia con oxaliplatino e interleucina-7 inhibe la metástasis del cáncer de colon en ratones

La combinación de inmunoterapia y quimioterapia ha demostrado ser prometedora para el cáncer. La interleucina-7 (IL-7) puede potenciar potencialmente las respuestas inmunitarias contra el tumor, mientras que el oxaliplatino (OXP), un fármaco a base de platino, puede promover un microambiente inmunitario favorable y estimular las respuestas inmunitarias anticancerígenas. Evaluamos la actividad antitumoral de la IL-7 en combinación con OXP contra un carcinoma de colon murino in vitro e in vivo, y estudiamos el microambiente inmunitario tumoral para investigar si el tratamiento combinado afecta a las poblaciones de células inmunitarias locales. Utilizando modelos de metástasis pulmonar y abdominal mediante la inoculación de células de cáncer de colon CT26 en ratones, evaluamos la eficacia antitumoral de la combinación de IL-7 y OXP en modelos de ratones. El microambiente inmunitario tumoral se evaluó mediante análisis citométrico de flujo y tinción inmunohistoquímica. Nuestro estudio demostró que la administración in vivo de IL-7 en combinación con OXP inhibió notablemente el crecimiento de los tumores en los modelos de metástasis pulmonar y abdominal del cáncer de colon. La IL-7 por sí sola no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento tumoral en los ratones, y la IL-7 no alteró la sensibilidad celular al OXP en el cultivo. El efecto antitumoral de la combinación de IL-7 y OXP se correlacionó con un marcado aumento en el número de células T CD8+ activadas infiltrantes tumorales y una marcada disminución en el número de células T reguladoras (Treg) en el bazo. Nuestros datos sugieren que el tratamiento con OXP más IL-7 inhibe el crecimiento de las células tumorales mediante la inmunorregulación en lugar de la citotoxicidad directa. Nuestros hallazgos justifican una mayor evaluación de la combinación de IL-7 y quimioterapia como una nueva terapia experimental contra el cáncer.

Citación: Gou H-F, Huang J, Shi H-S, Chen X-c, Wang Y-S (2014) Quimio-inmunoterapia con oxaliplatino e interleucina-7 inhibe la metástasis del cáncer de colon en ratones. PLoS ONE 9(1): e85789.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085789

Editor: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, Italia

Recibido: 16 de septiembre de 2013; Aceptado: 5 de diciembre de 2013; Publicado: 21 de enero de 2014

Derechos de autor: © 2014 Gou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se cite al autor original y la fuente.

Financiación: Los autores no declaran haber recibido ningún apoyo o financiación.

Conflictos de intereses: Los autores han declarado que no existen conflictos de intereses.

El oxaliplatino (OXP), que se utiliza habitualmente en el cáncer colorrectal, se ha descubierto recientemente que aumenta la inmunogenicidad de las células cancerosas e induce la muerte celular inmunogénica ^[1]. Además, se ha comprobado que el OXP puede mejorar la respuesta inmunitaria contra los tumores al disminuir las células reguladoras/supresoras: células T reguladoras (Treg) y células supresoras derivadas del mieloide (MDSC), y aumentar la proporción de linfocitos T citotóxicos CD8+ (células efectoras) frente a las poblaciones celulares inmunosupresoras en el microambiente tumoral ^[2], ^[3], ^[4].

La interleucina-7 (IL-7) es una de las citoquinas relacionadas con la interleucina-2 (IL-2) que comparten y señalan a través de la cadena ?- para afectar la proliferación, el desarrollo y la homeostasis de las células T ^[5], ^[6], ^[7], ^[8]. La IL-7 es producida por una variedad de células estromales en el timo y la médula ósea, y también por células endoteliales vasculares, epitelio intestinal, queratinocitos y células dendríticas foliculares ^[9], ^[10]. La IL-7 representa un tratamiento potencial para mejorar la reconstitución de las células T y la eficacia de las vacunas, ya que tiene acciones distintas sobre diferentes subconjuntos de células T ^[11]. La IL-7 también promueve la actividad citotóxica de las células T específicas del antígeno ^[12], ^[13], ^[14]. La IL-7 fue consistentemente tan eficaz como la IL-2 en el mantenimiento de las células T ^[13], ^[14]. Por ejemplo, se ha demostrado que las líneas celulares tumorales transfectadas con el gen de la IL-7 redujeron la tumorigenicidad dependiente de las células T en modelos murinos ^[15], ^[16]. De manera similar, la administración local o sistémica de IL-7 tiene efectos antitumorales al mejorar la respuesta inmunitaria contra los tumores ^[17], ^[18], ^[19], ^[20], ^[21], especialmente cuando se combina con otros tratamientos inmunológicos. La capacidad de mejorar la respuesta inmunitaria contra las neoplasias de la IL-7 tiene importantes implicaciones para la inmunoterapia en el tratamiento de los tumores.

La combinación de quimioterapia con modificadores de la respuesta inmunitaria, como la interleucina 2 (IL-2) o el interferón-γ (IFN-γ), denominada quimio-inmunoterapia, ha demostrado una prometedora actividad antitumoral en el melanoma ^[22], ^[23]. Tradicionalmente, se consideraba que los agentes quimioterapéuticos citotóxicos tenían efectos inmunosupresores y eran perjudiciales para la inmunidad antitumoral debido a sus efectos citostáticos y citotóxicos inespecíficos. Sin embargo, existen pruebas cada vez mayores que demuestran que, en determinadas condiciones, algunos de estos agentes pueden afectar al microambiente inmunológico tumoral y estimular las respuestas inmunitarias anticancerígenas ^[3], ^[4], ^[24], ^[25], ^[26]. Es un desarrollo lógico combinar estos agentes quimioterapéuticos citotóxicos inmunostimulantes con modificadores de la respuesta inmunitaria.

Basándonos en lo anterior, planteamos la hipótesis de que la combinación de IL-7 y OXP puede aumentar su actividad antitumoral al inducir la expansión de las células T y bloquear las vías inhibitorias de las células T en el microambiente inmunitario tumoral. En nuestro estudio, evaluamos la actividad antitumoral de la IL-7 en combinación con OXP contra un carcinoma de colon murino in vitro e in vivo, y examinamos el microambiente inmunitario tumoral para investigar si este tratamiento combinado afecta a las poblaciones de células inmunitarias locales. Nuestros datos muestran que OXP más IL-7 es significativamente más eficaz que la IL-7 o el OXP solos en la inhibición del crecimiento tumoral in vivo. Nuestros datos sugieren que el tratamiento con OXP más IL-7 inhibe el crecimiento de las células tumorales mediante la inmunorregulación en lugar de la citotoxicidad directa.

La línea celular de carcinoma de colon CT26 se obtuvo del American Type Culture Collection (ATCC). Las células se cultivaron de forma rutinaria en monocapa en matraces de cultivo de tejido cuadrados de 75 cm2 en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2 en el aire. El medio de cultivo contenía RPMI 1640 (Life Technologies, Bedford, MA) suplementado con un 10% de FBS y 100 U/ml de penicilina. La línea celular estaba libre de micoplasma.

Se adquirieron ratones hembra BALB/c libres de patógenos (de 6 a 8 semanas de edad) de Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd, Beijing. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Sichuan. Todos los experimentos con animales se realizaron en condiciones libres de patógenos específicos, de acuerdo con las directrices institucionales.

Antes de la inyección in vivo en ratones, las células cancerosas en la fase de crecimiento exponencial se recogieron, se lavaron tres veces con PBS, se contaron y se diluyeron en esta solución antes de la inyección in vivo. Para establecer un modelo de metástasis pulmonar, se inyectaron un total de 1×106 células de cáncer de colon CT26 en la vena de la cola de ratones BALB/c sinogénicos. Para establecer un modelo de metástasis abdominal, se inyectaron un total de 1×106 células de cáncer de colon CT26 por vía intraperitoneal. A continuación, se monitorizaron los ratones portadores de tumores para controlar el desarrollo y la progresión del tumor.

El día 6 después de la inoculación del tumor en cada modelo, se aleatorizaron en 4 grupos con 8 ratones en cada grupo para la administración posterior de la siguiente manera: grupo de control (solución tampón de fosfato, PBS), grupo de IL-7, grupo de OXP y grupo de IL-7 combinado con OXP. En el modelo de metástasis abdominal, el OXP se administró por vía intraperitoneal a una dosis de 5 mg/kg cada 3 días durante 12 días. En el modelo de metástasis pulmonar, el OXP se administró por vía intravenosa a una dosis de 5 mg/kg cada 3 días durante 12 días. La IL-7 (5 ug/día) se administró por vía intraperitoneal diariamente durante 12 días.

Los animales se sacrificaron el día 13 después del primer tratamiento. Se contaron los nódulos tumorales metastásicos en las regiones subpleurales de los pulmones bajo un microscopio de disección y se pesaron. Se contaron los nódulos tumorales metastásicos que se sembraron en la cavidad abdominal a simple vista y se pesaron.

La IL-7 humana recombinante (IL-7) se compró a Shanghai PrimeGene Bio-Tech Co., Ltd y se diluyó en agua destilada estéril. El OXP se compró a Sanofi-Aventis (Francia) y se diluyó en glucosa estéril. Los anticuerpos fluorescentes conjugados para citometría de flujo anti-ratón (Abs) CD4, CD8, CD69, CD11b, CD11c, Gr-1 y anticuerpos isotipo-emparejados se obtuvieron de BD Pharmingen. F4/80 se obtuvo de BioLegend. El kit de tinción de células T reguladoras de ratón se obtuvo de eBioscience. Los pares de anticuerpos de inmunohistoquímica para CD8 de ratón se compraron a ABGENT. Ki-67 se compró a Novus Biologicals, y el kit de detección de apoptosis se compró a (Promega Corp., Madison, WI).

Se utilizó el ensayo de placa de pocillos de 96 pocillos de bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-iltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio para determinar las cantidades relativas de células en los pocillos después de la exposición a diversos agentes. Las células CT26 se sembraron a 1000 células/pocillo en placas de 96 pocillos y, a continuación, se incubaron durante 24 horas más. En estos ensayos se utilizaron cinco pocillos de réplica. A continuación, se añadieron diferentes gradientes de concentración de IL-7 (25 ng/ml, 50 ng/ml, 75 ng/ml, 100 ng/ml) y OXP (10 umol/l, 30 umol/l, 50 umol/l) en los pocillos y se incubaron durante 24 h, 48 h en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2 a 37°C. Todos los ensayos incluyeron controles adecuados. Al final de la incubación, las células viables se cuantificaron utilizando el bromuro de 3-(4, 5-dimetil-2-iltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolio (MTT). Brevemente, se añadieron 20 µl de la solución de MTT de reserva (5 mg/ml) a cada pocillo de un ensayo. Después de 2 h de incubación, se eliminó el medio y el colorante convertido se solubilizó con DMSO (150 UL/pocillo). La absorbancia del colorante convertido se midió a una longitud de onda de 540 nm. La conversión a número de células se basó en una curva estándar. El porcentaje de supervivencia celular (tasa de supervivencia) se calculó dividiendo el valor de absorbancia de la muestra tratada por el del control no tratado dentro de cada grupo.

En los momentos indicados, se recogieron los tumores y los bazo de los ratones, se picaron en pequeños fragmentos y se dispersaron mecánicamente en 3-5 ml de medio RPMI frío. Las células tumorales se digirieron en 1 mg/ml de colagenasa IV (Sigma) y 0,1 mg/ml de DNasa (Sigma) en RPMI 1640 a 37°C durante 1 h. Las células del bazo se privaron de eritrocitos mediante lisis osmótica y se ajustaron a una concentración de 1×105 células en 100 ul de PBS. Después de esto, las suspensiones celulares únicas de células tumorales y esplenocitos se tiñeron durante 30 minutos sobre hielo con 1 ug de los siguientes anticuerpos fluorocromados, CD4, CD8, CD69, CD11b, CD11c, F4/80 o anticuerpos isotipo-emparejados y, a continuación, se lavaron una vez con PBS. La tinción intracelular de FoxP3 se realizó utilizando el kit de tinción de células T reguladoras de ratón, según las instrucciones del fabricante. Las células se adquirieron en un citómetro de flujo FACSCablibur (BD Biosciences) y se recogieron 10.000-20.000 eventos seleccionados. Los datos recogidos se analizaron con el software FlowJo 7.6. En el análisis citométrico, seleccionamos los datos utilizando el diagrama de dispersión bivariada FSC y SSC, y luego dibujamos una región alrededor del grupo de linfocitos y, a continuación, seleccionamos el histograma de fluorescencia en ellos. Esta selección, en la vista FSC vs SSC, una vez establecida, se aplica entonces al análisis de todas las muestras posteriores. Se sacrificaron tres ratones de cada grupo para evaluar la expresión del marcador CD de los inmunocitos.

Los tumores extirpados se fijaron en formaldehído al 10% y se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 4 um de espesor. Las secciones se utilizaron para el análisis de la expresión de CD8 y Ki-67 mediante tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo monoclonal correspondiente. Las muestras se inmunotintieron mediante un protocolo estándar de estreptavidina-biotina marcada. Brevemente, las secciones de 4 µm se montaron en portaobjetos silanizados y se dejaron secar durante la noche a 37°C. Después de la desparafinación y la recuperación del antígeno, las secciones de tejido se incubaron con el anticuerpo CD8 (dilución 1:250) y el anticuerpo Ki-67 (dilución 1:200) a 37°C durante 1 h y, a continuación, a 4°C durante la noche. A continuación, las secciones se incubaron con inmunoglobulina G de cabra biotinilada (Zymed Laboratories Inc, EE. UU.) y, a continuación, con estreptavidina marcada con peroxidasa (Zymed Laboratories Inc, EE. UU.). Se utilizó 3,3'-diaminobencidina como cromógeno y hematoxilina como contratinción. Se analizaron tres ratones por grupo.

Se observó el grado de infiltración de células CD8+ en más de 10 campos microscópicos independientes de alto aumento (×200) para cada muestra de tejido. Se seleccionaron los cinco campos microscópicos con la distribución más abundante dentro del nido de células cancerosas. Se contó el número promedio de células T CD8+ en los cinco campos microscópicos ^[27]. La determinación de la actividad proliferativa mediante inmunohistoquímica de Ki-67 se realizó de forma cuantitativa contando las células tumorales inmunorreactivas en las áreas de tinción más intensa. En cada muestra, se analizaron un mínimo de 1000 células tumorales en las áreas microscópicas que mostraban el mayor grado de inmunotinción, y los resultados se expresaron como el porcentaje de células positivas ^[28].

Las secciones, las mismas que se utilizaron para el análisis de inmunohistoquímica, se utilizaron para el análisis in situ de la apoptosis mediante TUNEL. La tinción TUNEL se realizó con un kit de detección de células apoptóticas in situ siguiendo el protocolo del fabricante. Las láminas se observaron bajo un microscopio de fluorescencia Olympus equipado con una cámara de dispositivo de acoplamiento de carga. Las imágenes se adquirieron con objetivos de ×10 y ×40 utilizando el software Image-Pro. El índice de apoptosis se determinó calculando el número promedio de núcleos de células apoptóticas en 5 campos microscópicos de alto aumento (×400) seleccionados de una región central en las áreas tumorales viables, evitando las áreas que contenían necrosis ^[29].

Se utilizó PRISM versión 5.0 (GraphPad Software) para dibujar gráficos y realizar análisis estadísticos. Los resultados se informan como media ± error estándar (EE). Se realizaron comparaciones dobles utilizando la prueba t de Student no pareada. Se consideró que P