Enfoque en HIF-2? en Cáncer Colorrectal Revela una Vulnerabilidad Ferropótica Dependiente de la Síntesis de Colesterol

El carcinoma colorrectal (CCR) es una neoplasia común con un alarmante aumento en la incidencia y la mortalidad entre individuos menores de 55 años. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para el CCR avanzado.

El CCR se caracteriza por una importante hipoxia tisular que surge de la dinámica del intercambio contracorriente en el flujo sanguíneo, las variaciones en la demanda de oxígeno, el metabolismo tumoral alterado y la proximidad a un lumen anóxico. Los factores inductibles por la hipoxia (HIF) orquestan transcripcionalmente la respuesta celular a la hipoxia y están involucrados en la proliferación celular, la supervivencia, la muerte celular, la migración y el metabolismo.

Específicamente, el HIF-2α juega un papel importante en la progresión del CCR. La expresión de HIF-2α está elevada en el CCR en comparación con el epitelio colónico normal y se correlaciona con una menor supervivencia [^[1]]. La deleción específica del HIF-2α en el epitelio intestinal murino disminuye notablemente la formación de tumores [^[2]]. Mecanísticamente, el HIF-2α promueve la carcinogénesis colorrectal a través del reclutamiento de neutrófilos intratumorales [^[3]], la desregulación de la homeostasis del hierro [^[4]], la potenciación de la actividad de la proteína asociada a Yes [^[5]] y la activación del eje ciclooxigenasa 2 / prostaglandina E2 [^[6]].

Recientemente, el HIF-2α ha surgido como un objetivo terapéutico. PT2385 es un inhibidor de moléculas pequeñas oral, de primera en su clase, dirigido al HIF-2α. Fue el primer antagonista de HIF-2α probado en humanos y condujo al desarrollo de belzutifan, un compuesto aprobado por la FDA [^[7]]. PT2385 bloquea la dimerización de HIF-2α con ARNT para prevenir la transcripción del gen diana de HIF-2α. El desarrollo clínico se centró inicialmente en el carcinoma de células renales (CCR), donde la pérdida del supresor tumoral von Hippel-Lindau (VHL) impulsa la acumulación constitutiva de HIF-2α [^[8]]. Dada la evidencia preclínica de HIF-2α en el CCR murino, hipotetizamos que la inhibición de HIF-2α podría representar una estrategia terapéutica viable.

Mostramos que la inhibición de HIF-2α por sí sola no suprime el CCR in vitro o in vivo. A continuación, realizamos un cribado metabólico CRISPR imparcial e identificamos la biosíntesis de colesterol como una vulnerabilidad crítica. La inhibición combinada de HIF-2α e inhibición de la 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) suprimieron sinérgicamente el crecimiento del CCR y mejoraron la muerte celular. La HMG-CoA reductasa (HMGCR) es la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis de colesterol y el objetivo farmacológico de las estatinas, una clase de agentes seguros y ampliamente prescritos para enfermedades cardiovasculares [^[9]].

Mecanísticamente, demostramos que el aumento de la muerte celular observada con la combinación de inhibición de HIF-2α e HMGCR está mediado por la ferroptosis. La ferroptosis es una muerte celular caracterizada por un aumento del hierro intracelular, la oxidación de los fosfolípidos y la pérdida de la función de la glutatión peroxidasa 4 (GPX4) [^[10]]. Si bien se están investigando nuevos agentes inductores de la ferroptosis como terapias contra el cáncer [^[11]], nuestros hallazgos resaltan el potencial de reutilizar las estatinas con la inhibición de HIF-2α para la terapia del CCR.

Resultados:

La inhibición de HIF-2α no afecta el crecimiento del CCR in vitro o in vivo.

Para evaluar el potencial terapéutico de la inhibición de HIF-2α en el CCR, evaluamos si PT2385 alteró el crecimiento del CCR in vitro. En condiciones de normoxia (21% O2), PT2385 no tuvo ningún efecto sobre la proliferación de HCT116 o SW480 (Fig. 1A). A continuación, hipotetizamos que la reducción de la disponibilidad de oxígeno podría sensibilizar las células de CCR a PT2385. Sin embargo, incluso en condiciones de hipoxia (2% O2), PT2385 no alteró el crecimiento de HCT116 o SW480 (Fig. 1B).

A continuación, implantamos células HCT116 y SW480 en ratones inmunodeficientes y administramos PT2385 o vehículo (Fig. 1C). PT2385 no alteró la cinética del crecimiento tumoral ni el volumen tumoral final (Fig. 1D). La muerte celular (TUNEL) y la proliferación (Brdu) no se vieron afectadas en HCT116 y SW480 (Fig. 1E).

Para identificar las dependencias metabólicas que surgen de la inhibición de HIF-2α, realizamos un cribado metabólico CRISPR imparcial (Fig. 1F). Se compararon los perfiles de aptitud genética entre las células tratadas con vehículo y PT2385. Las principales dependencias metabólicas incluyeron la fosfatidilinositol 4-quinasa beta (PI4KB), la descarboxilasa de mevalonato difosfato (MVD) y la adenosilhomocisteinasa (AHCY) (Fig. 1G). También se identificaron genes de la biosíntesis de colesterol, incluidos la proteína activadora de la escisión del elemento de unión del regulador del esterol (SCAP), la fosfomevalonato quinasa (PMVK) y la HMGCR (Fig. 1G).

La combinación de inhibición de HIF-2α e inhibición de HMGCR suprime el crecimiento del CCR y mejora la muerte celular

Se probaron inhibidores de moléculas pequeñas selectivos combinados con PT2385 para evaluar objetivos específicos identificados en nuestro cribado CRISPR. IN-10, un inhibidor de PI4KB, no tuvo ningún impacto en la proliferación de HCT116 o SW480 con PT2385 (SFig. 1A). El 6-fluoromevalonato (6FM), un inhibidor de MVD, tampoco logró mejorar la eficacia de PT2385 (SFig. 1B). Finalmente, la hidrocloruro de 3-deazaneplanocina A (DZNep), un inhibidor dual de EZH2 y AHCY, tampoco afectó la proliferación del CCR con PT2385 (SFig. 1C).

Sin embargo, el cribado CRISPR identificó la biosíntesis de colesterol como una vía esencial general de interés bajo la inhibición de HIF-2α. Para dirigirse a esto con relevancia clínica, empleamos estatinas. Simvastatina (Fig. 2A), atorvastatina (SFig. 2A) y pitavastatina (SFig. 2A) mostraron una supresión sinérgica del crecimiento en las células HCT116 y SW480 con PT2385. La concentración inhibitoria media (IC50) de simvastatina también se redujo cuando se combinó con PT2385 (SFig. 2B). Los ensayos de formación de colonias confirmaron el impacto a largo plazo de la inhibición combinada (Fig. 2B y SFig. 2C).

A continuación, validamos estos hallazgos utilizando enfoques genéticos. Previamente generamos y publicamos la reducción de la expresión de HIF-2α (KD) en células HCT116 [^[12]]. Para extender estas observaciones, establecimos un segundo modelo de KD de HIF-2α en células SW480, lo que se confirmó mediante Western blot (Fig. 2C). La eliminación de HIF-2α tuvo éxito tanto en presencia como en ausencia de FG4592, un inhibidor de la prolil hidroxilasa del factor inducible por hipoxia que imita la respuesta hipóxica. Estas células mostraron una proliferación reducida cuando se trataron con simvastatina (Fig. 2D), atorvastatina (SFig. 2D) o pitavastatina (SFig. 2D). Por el contrario, la eliminación de HMGCR inducible por doxiciclina mediante ARN de interferencia (shRNA) en HCT116 y SW480 se validó mediante qPCR (Fig. 2E) y mostró una mayor sensibilidad a PT2385 (Fig. 2E). Los ensayos de Sytox Green también mostraron una mayor muerte celular, lo que apoya que la supresión sinérgica del crecimiento se debió a la muerte celular en lugar de a la reducción de la proliferación (Fig. 2F, SFig. 2E).

La inhibición de HIF-2α y la inhibición de HMGCR se sinergizan a través de la ferroptosis

Para explorar el mecanismo que impulsa la muerte celular, evaluamos un panel de inhibidores de la muerte celular. La inhibición de la apoptosis o la necroptosis no disminuyó la muerte celular después del tratamiento combinado con estatinas y PT2385 (SFig. 3A). La adición de liproxstatin-1, un inhibidor selectivo de la ferroptosis, al tratamiento combinado con estatinas y PT2385 disminuyó el grado de muerte celular según lo evaluado por los ensayos de Sytox Green (Fig. 3A, SFig. 4A). También se cuantificaron las especies reactivas de oxígeno (ROS) lipídicas, un sello distintivo de la ferroptosis. PT2385 más estatinas elevaron significativamente las ROS lipídicas y este efecto se abolió con liproxstatin-1 (Fig. 3B, SFig. 4B).

Para evaluar aún más el papel del hierro en este proceso, evaluamos el hierro ferroso intracelular utilizando FerroOrange. El tratamiento combinado con simvastatina y PT2385 aumentó modestamente el hierro ferroso citosólico en HCT116 y SW480 (Fig. 3C), mientras que los niveles de hierro mitocondrial con Mito-FerroGreen no cambiaron (Fig. 3D).

Para investigar aún más la base metabólica de esto, se realizó un perfilado metabolómico LC/MS de células HCT116 tratadas con simvastatina y ARN de interferencia (shRNA) aleatorio, shRNA de KD de HIF-2α solo y simvastatina con shRNA de KD de HIF-2α. Entre 119 metabolitos, 42 se alteraron significativamente entre la simvastatina y el shRNA aleatorio y la simvastatina y el shRNA de KD de HIF-2α (p < 0,05; Fig. 3E). Los principales intermedios del estrés oxidativo, incluida la γ-glutamilcisteína (un precursor del glutatión), el NAD, el NADH y el glutatión oxidado y reducido, se agotaron en el grupo combinado (Fig. 3E). Los intermedios del estrés oxidativo se compararon luego entre los tres grupos experimentales (simvastatina y shRNA aleatorio, KD de HIF-2α solo y KD de HIF-2α con tratamiento con simvastatina; Fig. 3F). Las diferencias más pronunciadas son entre el grupo de simvastatina y shRNA aleatorio frente al grupo de simvastatina con KD de HIF-2α. En general, esto sugiere que la inhibición de HIF-2α disminuye la capacidad antioxidante para mejorar la susceptibilidad a la peroxidación lipídica y la ferroptosis.

También probamos los niveles de proteína GPX4 en células de CCR HCT116 y SW480 tratadas con control de vehículo, PT2385, simvastatina y PT2385 combinado con simvastatina (SFig. 4C). La inhibición de HIF-2α con PT2385 no tiene ningún efecto sobre la expresión de la proteína GPX4. La simvastatina por sí sola disminuye la expresión de la proteína GPX4. El tratamiento combinado con PT2385 y simvastatina da como resultado una disminución más pronunciada de la proteína GPX4, especialmente en las células SW480. Esto sugiere que, si bien la inhibición de HIF-2α por sí sola no suprime directamente GPX4, sensibiliza las células a la inhibición de la vía del mevalonato. GPX4 es una selenoproteína y la vía del mevalonato es necesaria para la síntesis de selenoproteínas, ya que produce isopentenil pirofosfato (IPP), un intermedio esencial para incorporar selenocisteína en las selenoproteínas. En última instancia, estos hallazgos respaldan que la vía del mevalonato es fundamental para la síntesis de selenoproteínas en el CCR y que la focalización dual con PT2385 y simvastatina puede comprometer aún más las defensas mediadas por GPX4 a nivel celular para mejorar la ferroptosis.

También cuantificamos las gotas de lípidos en las células de CCR tratadas con PT2385, estatinas (atorvastatina y simvastatina) y tratamientos combinados (SFig. 5A). PT2385 no parece inducir significativamente la biogénesis de gotas de lípidos. Por lo tanto, es poco probable que el tratamiento con PT2385 por sí solo predisponga a la resistencia a la ferroptosis debido a la secuestro de lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados (PUFA).

Finalmente, también evaluamos si el tratamiento con PT2385 disminuye la producción de la vía de biosíntesis de colesterol de modo que la inhibición adicional con estatinas pueda ser lo que impulse el defecto en el crecimiento tumoral. Realizamos una PCR cuantitativa para evaluar la expresión de varios genes de la biosíntesis de colesterol y, en última instancia, no encontramos diferencias estadísticamente y biológicamente significativas (SFig. 5B).

La inhibición de HIF-2α y la inhibición de HMGCR disminuyen el crecimiento tumoral a través de la potenciación de la ferroptosis in vivo

Para la validación in vivo, establecimos modelos de xenoinjerto utilizando células HCT116 y SW480 y aleatorizamos los ratones en cinco grupos de tratamiento: vehículo, PT2385 solo, atorvastatina sola, PT2385 más atorvastatina y PT2385 más atorvastatina con liproxstatin-1 (Fig. 4A). Se eligió atorvastatina porque es una estatina de alta intensidad que se prefiere clínicamente a la simvastatina por su mayor potencia para reducir el colesterol [^[13]]. La combinación de PT2385 y atorvastatina redujo significativamente la cinética del crecimiento tumoral (Fig. 4B) y el volumen tumoral final (Fig. 4C). La adición de liproxstatin-1 revirtió por completo estos efectos, lo que demuestra la dependencia de la ferroptosis.

La citometría de flujo reveló proporciones significativamente mayores de células muertas en los tumores tratados con PT2385 más atorvastatina, un efecto que se abolió con liproxstatin-1 (Fig. 4D). De manera similar, los niveles de ROS lipídicos aumentaron en los tumores que recibieron tratamiento combinado, pero esto también se revirtió con liproxstatin-1 (Fig. 4E). Esto demuestra que la inhibición dual de HIF-2α y HMGCR suprime sinérgicamente el crecimiento del CCR in vivo a través de la ferroptosis.

A continuación, implantamos células HCT116 y SW480 en ratones inmunodeprimidos y administramos PT2385 o vehículo (Fig. 1C). PT2385 no alteró la cinética del crecimiento tumoral ni el volumen tumoral final (Fig. 1D). La muerte celular (TUNEL) y la proliferación (Brdu) no se vieron afectadas en HCT116 y SW480 (Fig. 1E).

Para identificar las dependencias metabólicas que surgen de la inhibición de HIF-2?, realizamos un cribado metabólico CRISPR no sesgado (Fig. 1F). Se compararon los perfiles de aptitud genética entre las células tratadas con vehículo y PT2385. Las principales dependencias metabólicas incluyeron la fosfatidilinositol 4-quinasa beta (PI4KB), la mevalonato difosfato descarboxilasa (MVD) y la adenosilhomocisteinasa (AHCY) (Fig. 1G). También se identificaron genes de la biosíntesis del colesterol, incluidos el factor de activación de la escisión de la proteína de unión al elemento regulador del esterol (SCAP), la fosfomevalonato quinasa (PMVK) y HMGCR (Fig. 1G).

La combinación de la inhibición de HIF-2? y la inhibición de HMGCR suprime el crecimiento del CRC y mejora la muerte celular

Se probaron inhibidores selectivos de moléculas pequeñas combinados con PT2385 para evaluar los objetivos específicos identificados en nuestro cribado CRISPR. IN-10, un inhibidor de PI4KB, no tuvo ningún impacto en la proliferación de HCT116 o SW480 con PT2385 (SFig. 1A). El 6-fluoromevalonato (6FM), un inhibidor de MVD, tampoco logró mejorar la eficacia de PT2385 (SFig. 1B). Finalmente, el hidrocloruro de 3-deazaneplanocina A (DZNep), un inhibidor dual de EZH2 y AHCY, tampoco afectó la proliferación del CRC con PT2385 (SFig. 1C).

Sin embargo, el cribado CRISPR identificó la biosíntesis del colesterol como una vía esencial general de interés bajo la inhibición de HIF-2?. Para abordar esto con relevancia clínica, utilizamos estatinas. Simvastatina (Fig. 2A), atorvastatina (SFig. 2A) y pitavastatina (SFig. 2A) mostraron una supresión sinérgica del crecimiento con PT2385 en las células HCT116 y SW480. La concentración inhibitoria media (IC50) de simvastatina también se redujo cuando se combinó con PT2385 (SFig. 2B). Los ensayos de formación de colonias confirmaron el impacto a largo plazo de la inhibición combinada (Fig. 2B y SFig. 2C).

A continuación, validamos estos hallazgos utilizando enfoques genéticos. Previamente generamos y publicamos la reducción de la expresión de HIF-2? (KD) en células HCT116 [^[12]]. Para ampliar estas observaciones, establecimos un segundo modelo de KD de HIF-2? en células SW480, lo que se confirmó mediante Western blot (Fig. 2C). La eliminación de HIF-2? tuvo éxito tanto en presencia como en ausencia de FG4592, un inhibidor de la prolil hidroxilasa del factor inducible por hipoxia, que imita la respuesta hipóxica. Estas células mostraron una proliferación reducida cuando se trataron con simvastatina (Fig. 2D), atorvastatina (SFig. 2D) o pitavastatina (SFig. 2D). Por el contrario, la KD de HMGCR inducible por doxiciclina en HCT116 y SW480 se validó mediante qPCR (Fig. 2E) y mostró una mayor sensibilidad a PT2385 (Fig. 2E). Los ensayos de Sytox Green también mostraron una mayor muerte celular, lo que apoya que la supresión sinérgica del crecimiento se debió a la muerte celular en lugar de a la reducción de la proliferación (Fig. 2F, SFig. 2E).

La inhibición de HIF-2? y la inhibición de HMGCR actúan de forma sinérgica a través de la ferroptosis

Para explorar el mecanismo que impulsa la muerte celular, evaluamos un panel de inhibidores de la muerte celular. La inhibición de la apoptosis o la necroptosis no disminuyó la muerte celular tras el tratamiento combinado con estatinas y PT2385 (SFig. 3A). La adición de liproxstatina-1, un inhibidor selectivo de la ferroptosis, al tratamiento combinado con estatinas y PT2385 disminuyó el grado de muerte celular según lo evaluado por los ensayos de Sytox Green (Fig. 3A, SFig. 4A). También se cuantificaron las especies reactivas de oxígeno (ROS) lipídicas, un sello distintivo de la ferroptosis. PT2385 más estatinas elevaron significativamente las ROS lipídicas y este efecto se abolió con liproxstatina-1 (Fig. 3B, SFig. 4B).

Para evaluar aún más el papel del hierro en este proceso, evaluamos el hierro ferroso intracelular utilizando FerroOrange. El tratamiento combinado con simvastatina y PT2385 aumentó modestamente el hierro ferroso citosólico en HCT116 y SW480 (Fig. 3C), mientras que los niveles de hierro mitocondrial con Mito-FerroGreen no cambiaron (Fig. 3D).

Para investigar aún más la base metabólica de esto, se realizó un perfilado metabolómico LC/MS de células HCT116 tratadas con simvastatina y shRNA revuelta, shRNA de KD de HIF-2? sola y simvastatina con shRNA de KD de HIF-2?. Entre 119 metabolitos, 42 se alteraron significativamente entre la simvastatina y la shRNA revuelta y la simvastatina y la shRNA de KD de HIF-2? (p < 0,05; Fig. 3E). Entre los principales intermedios del estrés oxidativo se incluyen la ?-glutamilcisteína (un precursor del glutatión), NAD, NADH y el glutatión oxidado y reducido, que se agotaron en el grupo combinado (Fig. 3E). A continuación, se compararon los intermedios del estrés oxidativo entre los tres grupos experimentales (simvastatina y shRNA revuelta, KD de HIF-2? sola y KD de HIF-2? con tratamiento con simvastatina; Fig. 3F). Las diferencias más pronunciadas se observan entre la simvastatina y la shRNA revuelta en comparación con los grupos de simvastatina con KD de HIF-2?. En general, esto sugiere que la inhibición de HIF-2? disminuye la capacidad antioxidante para mejorar la susceptibilidad a la peroxidación lipídica y la ferroptosis.

También probamos los niveles de proteína GPX4 en las células CRC de HCT116 y SW480 tratadas con vehículo de control, PT2385, simvastatina y PT2385 combinado con simvastatina (SFig. 4C). La inhibición de HIF-2? con PT2385 no tuvo ningún efecto sobre la expresión de la proteína GPX4. La simvastatina sola disminuyó la expresión de la proteína GPX4. El tratamiento combinado con PT2385 y simvastatina produjo una disminución más pronunciada de la proteína GPX4, especialmente en las células SW480. Esto sugiere que, si bien la inhibición de HIF-2? sola no suprime directamente GPX4, sensibiliza a las células a la inhibición de la vía del mevalonato. GPX4 es una selenoproteína y la vía del mevalonato es necesaria para la síntesis de selenoproteínas, ya que produce isopentenil pirofosfato (IPP), un intermedio esencial para la incorporación de selenocisteína en las selenoproteínas. En última instancia, estos hallazgos respaldan que la vía del mevalonato es fundamental para la síntesis de selenoproteínas en el CRC y que la focalización dual con PT2385 y simvastatina puede comprometer aún más las defensas mediadas por GPX4 a nivel celular para mejorar la ferroptosis.

También cuantificamos las gotas de lípidos en las células CRC tratadas con PT2385, estatinas (atorvastatina y simvastatina) y tratamientos combinados (SFig. 5A). PT2385 no parece inducir significativamente la biogénesis de gotas de lípidos. Por lo tanto, es poco probable que el tratamiento con PT2385 solo predisponga a la resistencia a la ferroptosis debido a la secuestro de lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados (PUFA).

Finalmente, también evaluamos si el tratamiento con PT2385 disminuye la producción de la vía de la biosíntesis del colesterol de modo que la inhibición adicional con estatinas pueda ser lo que impulse el defecto del crecimiento tumoral. Realizamos una PCR cuantitativa para evaluar la expresión de varios genes de la biosíntesis del colesterol y, en última instancia, encontramos que no existen diferencias estadísticamente y biológicamente significativas (SFig. 5B).

La inhibición de HIF-2? y la inhibición de HMGCR disminuyen el crecimiento tumoral a través de la potenciación de la ferroptosis in vivo

Para la validación in vivo, establecimos modelos de xenoinjerto utilizando células HCT116 y SW480 y aleatorizamos los ratones en cinco grupos de tratamiento: vehículo, PT2385 solo, atorvastatina sola, PT2385 más atorvastatina y PT2385 más atorvastatina con liproxstatina-1 (Fig. 4A). Se eligió atorvastatina porque es una estatina de alta intensidad que se prefiere clínicamente a la simvastatina por su mayor potencia para reducir el colesterol [^[13]]. La combinación de PT2385 y atorvastatina redujo significativamente la cinética del crecimiento tumoral (Fig. 4B) y el volumen tumoral final (Fig. 4C). La adición de liproxstatina-1 revirtió por completo estos efectos, lo que demuestra la dependencia de la ferroptosis.

La citometría de flujo reveló proporciones significativamente mayores de células muertas en los tumores tratados con PT2385 más atorvastatina, un efecto que se abolió con liproxstatina-1 (Fig. 4D). De manera similar, los niveles de ROS lipídicos aumentaron en los tumores que recibieron tratamiento combinado, pero esto también se revirtió con liproxstatina-1 (Fig. 4E). Esto demuestra que la inhibición dual de HIF-2? y HMGCR suprime sinérgicamente el crecimiento del CRC in vivo a través de la ferroptosis.

Discusión:

Nuestro estudio demuestra que, a diferencia del RCC, la inhibición farmacológica de HIF-2? sola no perjudica el crecimiento del CRC. Sin embargo, la inhibición concurrente de HIF-2? y la biosíntesis del colesterol con estatinas produce un efecto antitumoral sinérgico al inducir la ferroptosis, lo que destaca las diferencias específicas del tipo de tumor en la dependencia de HIF-2?.

Dada la evidencia previa de la contribución de HIF-2? a la tumorigénesis del cáncer colorrectal, inicialmente esperábamos que PT2385 suprimiera el crecimiento del CRC [^[3]–^[6]]. Sin embargo, PT2385 no tuvo ningún efecto sobre la proliferación del CRC in vitro o in vivo. Una explicación es que la pérdida genética completa de HIF-2? durante la iniciación del tumor altera fundamentalmente la biología del tumor, mientras que la inhibición farmacológica aguda en tumores establecidos puede ser insuficiente para interrumpir las vías compensatorias. Además, los antagonistas de moléculas pequeñas, como PT2385, bloquean la dimerización de HIF-2/ARNT, pero es posible que no repliquen por completo las amplias consecuencias transcripcionales y metabólicas de la deleción de HIF-2?. Estas distinciones sugieren que la inhibición farmacológica puede revelar vulnerabilidades dependientes del contexto en lugar de imitar la ablación genética, lo que nos llevó a investigar las vulnerabilidades metabólicas de la inhibición de HIF-2?.

Un cribado metabólico CRISPR no sesgado identificó la biosíntesis del colesterol como una vulnerabilidad principal bajo la inhibición de HIF-2?. Sin embargo, la inhibición farmacológica de varios de los principales objetivos, como PI4KB, MVD y AHCY, no sensibilizó aún más a las células CRC a la inhibición de HIF-2?. Esto puede deberse a que la eliminación genética a través de CRISPR puede proporcionar una pérdida de función más completa, mientras que la inhibición farmacológica puede dar lugar solo a una supresión parcial, lo que permite que la actividad proteica residual enmascare el fenotipo de sensibilización. Además, la variabilidad en la biodisponibilidad o la especificidad de los fármacos podría diluir el efecto del inhibidor. En última instancia, priorizamos las estrategias farmacológicas dirigidas a HMGCR debido a su relevancia traslacional.

La validación farmacológica y genética funcional demostró que la inhibición de HMGCR actuó de forma sinérgica con la inhibición de HIF-2? en múltiples líneas celulares de CRC. Este efecto fue consistente en varias estatinas, lo que demuestra un efecto de clase en lugar de una propiedad específica del fármaco. La inhibición dual promovió la ferroptosis. El tratamiento combinado aumentó la muerte celular y la peroxidación lipídica, ambos efectos se invirtieron con el inhibidor de la ferroptosis, liproxstatina-1. El perfilado metabolómico demostró el agotamiento de los principales metabolitos antioxidantes y la alteración del amortiguamiento redox, lo que se alinea con informes anteriores de que las estatinas disminuyen la expresión de GPX4 y alteran las vías antioxidantes para sensibilizar a las células a la peroxidación lipídica [^[14]].

Curiosamente, estos hallazgos parecen paradójicos en comparación con nuestro trabajo anterior, así como con estudios independientes de otro laboratorio, que muestran que la inhibición de HIF-2? aumenta la resistencia a la ferroptosis [^[4], ^[15]]. Esto se evidencia aún más por la incapacidad de mejorar la muerte celular mediante la combinación de un inductor de la ferroptosis, RSL3, con la inhibición de HIF-2? sola (datos no mostrados). Esto puede explicarse por el rearreglo metabólico que se produce con la inhibición dual de las vías de HIF-2? y la biosíntesis del colesterol. La inhibición de HIF-2? sola disminuye los antioxidantes celulares, la capacidad de peroxidación lipídica y confiere resistencia a la ferroptosis. Sin embargo, la inhibición simultánea de la biosíntesis del colesterol parece empujar a las células más allá de un umbral metabólico. Aquí, la reducción de los antioxidantes por la inhibición de HIF-2? coopera con el deterioro de GPX4 inducido por las estatinas para sensibilizar a las células a la ferroptosis. Esto destaca los efectos dependientes del contexto de la inhibición de HIF-2? sobre la ferroptosis. Además, las estatinas también pueden bloquear la síntesis de la coenzima Q10 (CoQ10, ubiquinona) [^[16]]. La CoQ10 es esencial para limitar el estrés oxidativo y la disminución de la CoQ10 puede aumentar aún más la susceptibilidad a las especies reactivas de oxígeno.

Más allá de aumentar la sensibilidad al estrés oxidativo y potenciar el efecto de la alteración de GPX4, otras posibles razones por las que la inhibición de la biosíntesis de colesterol y la inhibición de HIF-2α sinergizan para inducir la muerte de las células de CRC incluyen la modulación del almacenamiento de lípidos y el estrés del retículo endoplásmico (RE). En RCC, el almacenamiento de lípidos dependiente de HIF-2α a través de la perilipina 2 (PLIN2) permite que las células tumorales se protejan de las fuentes de estrés del RE [^[17]]. Podría existir un mecanismo similar en las células de CRC, donde la inhibición de HIF-2α puede alterar el contenido de lípidos del RE, alterar la homeostasis del RE y desencadenar la respuesta de las proteínas mal plegadas, lo que, en combinación con las alteraciones inducidas por las estatinas en el estrés oxidativo, desencadena la ferroptosis.

Clínicamente, belzutifan (MK-6482) es el inhibidor de HIF-2α de nueva generación derivado de PT2385 [^[7]]. Aunque utilizamos PT2385 debido a su disponibilidad comercial, estudios previos en ratones han demostrado que PT2385 y belzutifan presentan una eficacia y una interacción con el objetivo equivalentes [^[18]]. Por lo tanto, nuestros hallazgos son directamente relevantes para belzutifan. No obstante, serán esenciales futuros estudios que utilicen belzutifan con estatinas. Nuestros datos proporcionan la primera evidencia de que las estatinas pueden sensibilizar a CRC a la inhibición de HIF-2α, revelando una interacción letal sintética. También es importante considerar los efectos de estos fármacos sobre las células no cancerosas. Las estatinas pueden provocar mialgias, mientras que el efecto secundario más común de los inhibidores de HIF-2α incluye la anemia. Cabe destacar que los efectos secundarios más prominentes de estos dos fármacos son en gran medida diferentes, lo que reduce el potencial de toxicidad acumulativa. Por lo tanto, aunque ambos agentes requieren una monitorización clínica adecuada, su uso combinado es probablemente tolerable para los tejidos normales. Dada la amplia disponibilidad, seguridad y bajo costo de las estatinas, este enfoque podría tener un potencial traslacional significativo.

Materiales y métodos:

Líneas celulares y reactivos

Las células HCT116 y SW480 (ATCC) se cultivaron en DMEM con L-glutamina, D-glucosa y piruvato de sodio, 10% de suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor y 1% de mezcla antibiótica-antimicótica. IN-10 y DZNep se compraron a MedChemExpress. 6FM, Ferroorange (Cat# SCT210) MitoFerroGreen (Cat# SCT262) se compraron a MilliporeSigma. Atorvastatina, pitavastatina, simvastatina, Z-Vad, necrostatina-1 y FG4592 se compraron a Cayman Chemical (Cat# 10493, 15414, 10010344, 15294). Sytox Green se compró a Thermo Fisher Scientific (Cat# S7020).

Animales y tratamientos

Los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan (PRO00011805). Se inocularon ratones nudosos inmunocomprometidos, machos y hembras, de entre seis y ocho semanas de edad, con 2 millones de células HCT116 o SW480 implantadas como un tumor en el flanco inferior. Los tratamientos diarios comenzaron el día 7 después de que aparecieran los tumores visibles. El vehículo de administración oral fue PEG 400:Kolliphor (7:3). El vehículo de inyección intraperitoneal fue solución salina estéril. PT2385 se administró por vía oral a 30 mg/kg, atorvastatina por vía oral a 10 mg/kg y liproxstatina por inyección intraperitoneal a 10 mg/kg.

Western Blotting

Se prepararon lisados celulares totales según lo descrito previamente [^[19]]. Se utilizaron anticuerpos primarios, incluido el anticuerpo anti-HIF-2α (Novus Biological, Cat # NB100–122), el anticuerpo anti-GPX4 (Protein Tech, Cat# 67763–1) y el anticuerpo anti-β-actina (Protein Tech, Cat # 66009–1) a una dilución de 1:1000. Se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante a una dilución de 1:2000 y los inmunoblot se desarrollaron utilizando un sistema de imagen Chemidoc.

Ensayos de crecimiento

El crecimiento celular se midió con el lector de imágenes multimodo Cytation 5 con BioSpa adjunto (Agilent BioTek). Se sembraron células (~500/pocillo) en placas de 96 pocillos. Se adquirieron imágenes de referencia después de 24 horas y luego se aplicaron inmediatamente los tratamientos. El número de células se cuantificó cada 24 horas y se normalizó a los valores de referencia.

Cribado CRISPR y análisis

La biblioteca de genes metabólicos knockout de CRISPR humano fue un regalo de David Sabatini (Addgene, 110066) [^[20]]. Brevemente, se dirigen aproximadamente 3.000 enzimas metabólicas, transportadores de moléculas pequeñas y factores de transcripción relacionados con el metabolismo. Existen aproximadamente 30.000 sgRNA que corresponden a aproximadamente 10 sgRNA/gen, además de 500 sgRNA de control. Se sembraron 75 × 106 células HCT116 a 5 x 105 células/ml en placas de seis pocillos. Cada pocillo contenía 3 ml de DMEM, 10 µg/ml de polibreno y la biblioteca de cribado CRISPR. El objetivo era lograr una representación de 1.000 veces de cada sgRNA en la biblioteca. Se realizó una espinfección mediante centrifugación a 1.200 g durante 45 minutos a 37 °C. Después de 24 horas, se reemplazó el medio. Las células se incubaron durante 24 horas adicionales antes de la selección con puromicina (1 µg/ml). Después de tres días de selección con puromicina, las células se trataron con DMSO o 10 µM de PT-2385. Las células se pasaron cada 3-4 días. Después de 14 divisiones, se aisló el ADN genómico de 15 millones de células en cada condición (kit DNeasy, Qiagen).

Los insertos de sgRNA se amplificaron por PCR utilizando la polimerasa Takara Ex Taq, se purificaron y se secuenciaron (NextSeq Illumina). Las lecturas se mapearon a la biblioteca de referencia de sgRNA, permitiendo solo coincidencias exactas, y se cuantificó la abundancia de cada sgRNA. Para cada sgRNA, se calculó una puntuación diferencial como el logaritmo de 2 del cambio en la abundancia entre las muestras tratadas con DMSO y PT-2385. Las puntuaciones diferenciales a nivel de gen se determinaron promediando las puntuaciones de todos los sgRNA que se dirigían al mismo gen. La puntuación del gen para cada condición se definió como la mediana del logaritmo de 2 del cambio en la abundancia entre las poblaciones tratadas con PT-2385 y el vehículo.

Generación de líneas celulares de shRNA

Se generaron líneas celulares genéticamente modificadas constitutivamente activas utilizando el sistema de shRNA lentiviral EPAS1 GIPZ humano disponible comercialmente, que se dirige a la región del marco de lectura abierto (Horizon). Las líneas celulares inducibles por doxiciclina utilizaron el sistema pLKO.1-Tet On (Addgene, 21915) [^[21]]. Las secuencias de shRNA se clonaron en los vectores de fondo pLKO.1, se validó la secuencia y se produjo el lentivirus con el Vector Core de la Universidad de Michigan. Las células se transfectaron mediante espinfección a 900 g durante 1 hora en presencia de polibreno 10 µg/ml. Después de 24 horas, se cambió el medio y se permitió que las células se recuperaran durante 24 horas antes de agregar puromicina 2 µg/ml.

Secuencias de cebadores de shRNA:

HCT116 HMGCR FWD:

CCGGCAACAGGTCGAAGATCAATTTCTCGAGAAATTGATCTTCGACCTGTTGTTTTT

HCT116 HMGCR REV:

AATTAAAAACAACAGGTCGAAGATCAATTTCTCGAGAAATTGATCTTCGACCTGTTG

SW480 HMGCR FWD:

CCGGTAGCCGTTAGTGGTAACTATTCTCGAGAATAGTTACCACTAACGGCTATTTTT

SW480 HMGCR REV:

AATTAAAAATAGCCGTTAGTGGTAACTATTCTCGAGAATAGTTACCACTAACGGCTA

Citometría de flujo para Sytox Green, FerroOrange y Mito-FerroGreen

Se sembraron células en placas de seis pocillos y se trataron durante 16 horas. Se agregaron Mito-FerroGreen (5 µM) y FerroOrange (1 µM) durante 30 minutos a 37 °C. Luego, las células se lavaron y se procesaron para la citometría de flujo. Para los ensayos de Sytox Green, las células se sembraron a una densidad de 100.000 células/pocillo en una placa de 24 pocillos. Después de sembrar durante 24 horas, se aplicaron los tratamientos durante 24 horas adicionales. Para recolectar las células, se aspiró el medio, se lavaron una vez con PBS y luego se rasparon de la placa. Las células se resuspendieron en PBS con una solución de trabajo de 1 M de Sytox Green. El pellet de células se incubó durante 45 minutos a 37 grados, se lavó con PBS y luego se procesó para la citometría de flujo.

Medición de ROS lipídicos

Se sembraron células HCT116 o SW480 (1 x 106) en placas de 12 pocillos. Después de 24 horas, las células se trataron según lo indicado durante 16 horas. Las células se recolectaron, se lavaron y se incubaron con 5 µM de C11-BODIPY (Thermo Fisher) durante 30 minutos a 37 °C. Se utilizó un período de incubación similar para los estudios in vivo y la evaluación de los ROS lipídicos de los tumores murinos. La citometría de flujo cuantificó la intensidad de la fluorescencia. Se analizaron un mínimo de 20.000 células por condición utilizando el software FlowJo.

Tinción de gotas de lípidos y microscopía

Se recubrieron placas Ibidi μ-Slide 8 pocillos de fondo alto (Ibidi, 80807) con 10 µg/cm2 de fibronectina humana (Sigma-Aldrich, FC010) siguiendo las recomendaciones del proveedor. Luego, se sembraron 15.000 células SW480 y 10.000 células HCT116 por pocillo y se incubaron a temperatura ambiente en la campana de bioseguridad durante 30 minutos antes de colocarlas en la incubadora. Al día siguiente, se reemplazó el medio de cultivo por un medio que contenía 0,2% de DMSO, 10 µM de PT2385, 5 µM de atorvastatina, 3 µM de simvastatina, PT2385 y atorvastatina combinados, PT2385 y simvastatina combinados, o 200 µM de ácido oleico (Cayman Chemical, 24659) complejo con albúmina bovina libre de ácidos grasos (Goldbio, A-421–10) en una relación molar de 5:1 en el medio de cultivo [^[22]]. Al día siguiente, las células se lavaron una vez con un medio de tinción (DMEM sin rojo fenol con glucosa alta (Thermo Scientific, 31053028), suplementado con 4 mM de L-glutamina (Research Products International, G36040) y 1 mM de piruvato (Agilent technologies 103578–100)). Luego, las células se incubaron con 2 µg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen H3570) y 1 µg/ml de BODIPY 493/503 (Cayman Chemical, 25892) disueltos en medio de tinción durante 25 minutos a 37 °C y 5% de CO2. Se tiñó un pocillo no tratado por línea celular con Hoechst solo como control no teñido para el tinte BODIPY. Luego, las células se lavaron una vez con medio de tinción sin tintes y se reemplazó el medio de tinción por un medio de tinción suplementado con 10% de FBS y 1% de mezcla antibiótica-antimicótica antes de la imagen.

Las células se visualizaron en un microscopio confocal Zeiss LSM 980 Airyscan 2 con detección espectral configurado para la multiplexación con una línea láser de 405 nm para la visualización del tinte Hoechst y una línea láser de 488 nm para la visualización del tinte BODIPY. El microscopio se configuró para mantener 37 °C y 5% de CO2 con humedad y se estabilizó durante 30 minutos antes de la imagen. Se tomaron imágenes con un objetivo de aceite de 63x con una apertura numérica de 1,4 a 2x del campo de visión. Se tomaron 35 pilas z para cada imagen en el centro de la célula. El postprocesamiento de la imagen se realizó con el software Zen 3.4 (edición Blue).

Cuantificación de gotas de lípidos

Para las células HCT116, se tomaron 2 imágenes para las condiciones de DMSO y el control no teñido, y al menos 3 imágenes para todas las demás condiciones. Primero, las imágenes se configuraron como proyecciones de intensidad máxima y se restó el valor de píxel máximo en el canal BODIPY de las imágenes de control no teñidas del canal BODIPY de todas las demás imágenes. Luego, se aplicó un valor de umbral manual a los canales BODIPY y Hoechst en todas las condiciones para generar máscaras binarias para cada canal. Las células se segmentaron manualmente en cada imagen dibujando ROI alrededor de las máscaras nuclear y BODIPY para cada célula. Luego, se calculó el área de la máscara BODIPY para cada ROI.

Para las células SW480, se tomaron 2 imágenes para la condición de control no teñida y al menos 3 imágenes para todas las demás condiciones. Las imágenes se analizaron de la misma manera que para las células HCT116, excepto que el umbral se determinó mediante FIJI utilizando el cálculo automático del umbral con el algoritmo MaxEntropy. Todo el análisis de imágenes se realizó en FIJI [^[23]].

El área de la máscara BODIPY/célula se analizó y se representó gráficamente utilizando R v4.3.2 [^[24]] con los paquetes dplyr [^[25]] y ggplot2 [^[26]]. Se realizó un ANOVA de una vía con una prueba post hoc de Tukey HSD para determinar la significación estadística.

Ensayo de formación de colonias

Se sembraron células en triplicado biológico en placas de seis pocillos a 500 células por pocillo. El medio y los tratamientos se reponían cada 5 días. Los ensayos finalizaron a los 14 días fijando las células con formaldehído tamponado al 10% frío durante 10 minutos y tiñéndolas con solución de cristal violeta al 1% y solución de metanol al 10% durante 30 minutos. Las colonias se contaron manualmente mediante un observador ciego al estudio.

Metabolómica

Se sembraron células a una concentración de 1 millón/pocillo en placas de 6 pocillos. Después de 24 horas, las células se trataron durante 24 horas. El aislamiento de metabolitos se realizó utilizando metanol al 80%. La concentración de proteínas para la normalización se determinó procesando un pocillo paralelo. Las soluciones celulares se liofilizaron utilizando un concentrador SpeedVac. Los gránulos de metabolitos se resuspendieron en una mezcla de metanol/agua al 50:50 para cromatografía líquida (CL) – espectrometría de masas (EM). Las muestras se analizaron en un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento Agilent 1290 Infinity II Bio LC, acoplado a un Agilent 6470 QQQ. Los datos se recopilaron, procesaron y analizaron utilizando parámetros publicados [^[27], ^[28]]. Cada nivel de abundancia de metabolito se centró en la mediana en todas las muestras y se transformó en log2 para obtener la abundancia relativa para la comparación intergrupal. La significación estadística se determinó mediante una ANOVA de una vía con un umbral de significación de p < 0,05.

Estadísticas

Las pruebas t no pareadas determinaron las diferencias estadísticas entre 2 grupos. Se consideró que un valor de p inferior a 0,05 era estadísticamente significativo. Todas las pruebas estadísticas se realizaron utilizando el software Prism (GraphPad) o Excel.

Líneas celulares y reactivos

Las células HCT116 y SW480 (ATCC) se cultivaron en DMEM con L-glutamina, D-glucosa y piruvato de sodio, suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor al 10% y una mezcla de antibióticos-antimicóticos al 1%. IN-10 y DZNep se compraron a MedChemExpress. 6FM, Ferroorange (Cat# SCT210) MitoFerroGreen (Cat# SCT262) se compraron a MilliporeSigma. Atorvastatina, pitavastatina, simvastatina, Z-Vad, necrostatina-1 y FG4592 se compraron a Cayman Chemical (Cat# 10493, 15414, 10010344, 15294). Sytox Green se compró a Thermo Fisher Scientific (Cat# S7020).

Animales y tratamientos

Los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan (PRO00011805). Se inocularon ratones nudosos inmunocomprometidos, machos y hembras de seis a ocho semanas de edad, con 2 millones de células HCT116 o SW480 implantadas como un tumor en el flanco inferior. Los tratamientos diarios comenzaron el día 7 después de que aparecieran los tumores visibles. El vehículo de administración oral fue PEG 400:Kolliphor (7:3). El vehículo de inyección intraperitoneal fue solución salina estéril. PT2385 se administró por vía oral a 30 mg/kg, atorvastatina por vía oral a 10 mg/kg y liproxstatina por inyección intraperitoneal a 10 mg/kg.

Western Blotting

Se prepararon lisados celulares totales como se describió previamente [^[19]]. Se utilizaron anticuerpos primarios, incluido el anticuerpo HIF-2α (Novus Biological, Cat # NB100–122), el anticuerpo GPX4 (Protein Tech, Cat# 67763–1) y el anticuerpo β-actina (Protein Tech, Cat # 66009–1) a una dilución de 1:1000. Se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante a una dilución de 1:2000 y los inmunoblot se desarrollaron utilizando un sistema de imagen Chemidoc.

Ensayos de crecimiento

El crecimiento celular se midió con el lector de imágenes multimodo Cytation 5 con BioSpa acoplado (Agilent BioTek). Se sembraron células (~500/pocillo) en placas de 96 pocillos. Se adquirieron imágenes de referencia después de 24 horas y luego se aplicaron inmediatamente los tratamientos. El número de células se cuantificó cada 24 horas y se normalizó a los valores de referencia.

Cribado CRISPR y análisis

La biblioteca de genes metabólicos knockout de CRISPR humano fue un regalo de David Sabatini (Addgene, 110066) [^[20]]. Brevemente, se dirigen aproximadamente 3000 enzimas metabólicas, transportadores de moléculas pequeñas y factores de transcripción relacionados con el metabolismo. Existen aproximadamente 30 000 sgRNA que corresponden a aproximadamente 10 sgRNA/gen, además de 500 sgRNA de control. Se sembraron 75 × 106 células HCT116 a 5 x 105 células/ml en placas de seis pocillos. Cada pocillo contenía 3 ml de DMEM, 10 µg/ml de polibreno y la biblioteca de virus de cribado CRISPR. El objetivo era lograr una representación de 1000 veces de cada sgRNA en la biblioteca. Se realizó una espinfección mediante centrifugación a 1200 g durante 45 minutos a 37 °C. Después de 24 horas, se reemplazó el medio. Las células se incubaron durante 24 horas adicionales antes de la selección con puromicina (1 µg/ml). Después de tres días de selección con puromicina, las células se trataron con DMSO o 10 µM de PT-2385. Las células se pasaron cada 3-4 días. Después de 14 divisiones, se aisló el ADN genómico de 15 millones de células en cada condición (kit DNeasy, Qiagen).

Los insertos de sgRNA se amplificaron por PCR utilizando la polimerasa Takara Ex Taq, se purificaron y se secuenciaron (NextSeq Illumina). Las lecturas se mapearon a la biblioteca de referencia de sgRNA, permitiendo solo coincidencias exactas, y se cuantificó la abundancia de cada sgRNA. Para cada sgRNA, se calculó una puntuación diferencial como el cambio log2 en la abundancia entre las muestras tratadas con DMSO y PT-2385. Las puntuaciones diferenciales a nivel de gen se determinaron promediando las puntuaciones de todos los sgRNA que se dirigían al mismo gen. La puntuación del gen para cada condición se definió como la mediana del cambio log2 en la abundancia entre las poblaciones tratadas con PT-2385 y el vehículo.

Generación de líneas celulares shRNA

Se generaron líneas celulares genéticamente modificadas constitutivamente activas utilizando el sistema de shRNA lentiviral EPAS1 GIPZ humano disponible comercialmente, que se dirige a la región del marco de lectura abierto (Horizon). Las líneas celulares inducibles por doxiciclina utilizaron el sistema pLKO.1-Tet On (Addgene, 21915) [^[21]]. Las secuencias de shRNA se clonaron en los vectores de fondo pLKO.1, se validó la secuencia y se produjo el lentivirus con el Vector Core de la Universidad de Michigan. Las células se transfectaron mediante espinfección a 900 g durante 1 hora en presencia de polibreno 10 µg/ml. Después de 24 horas, se cambió el medio y se permitió que las células se recuperaran durante 24 horas antes de agregar puromicina 2 µg/ml.

Secuencias de cebadores shRNA:

HCT116 HMGCR FWD:

CCGGCAACAGGTCGAAGATCAATTTCTCGAGAAATTGATCTTCGACCTGTTGTTTTT

HCT116 HMGCR REV:

AATTAAAAACAACAGGTCGAAGATCAATTTCTCGAGAAATTGATCTTCGACCTGTTG

SW480 HMGCR FWD:

CCGGTAGCCGTTAGTGGTAACTATTCTCGAGAATAGTTACCACTAACGGCTATTTTT

SW480 HMGCR REV:

AATTAAAAATAGCCGTTAGTGGTAACTATTCTCGAGAATAGTTACCACTAACGGCTA

Secuencias de cebadores shRNA:

HCT116 HMGCR FWD:

CCGGCAACAGGTCGAAGATCAATTTCTCGAGAAATTGATCTTCGACCTGTTGTTTTT

HCT116 HMGCR REV:

AATTAAAAACAACAGGTCGAAGATCAATTTCTCGAGAAATTGATCTTCGACCTGTTG

SW480 HMGCR FWD:

CCGGTAGCCGTTAGTGGTAACTATTCTCGAGAATAGTTACCACTAACGGCTATTTTT

SW480 HMGCR REV:

AATTAAAAATAGCCGTTAGTGGTAACTATTCTCGAGAATAGTTACCACTAACGGCTA

Citometría de flujo para Sytox Green, FerroOrange y Mito-FerroGreen

Las células se sembraron en placas de seis pocillos y se trataron durante 16 horas. Mito-FerroGreen (5 µM) y FerroOrange (1 M) se agregaron durante 30 minutos a 37 °C. Luego, las células se lavaron y se procesaron para la citometría de flujo. Para los ensayos de Sytox Green, las células se sembraron a una densidad de 100 000 células/pocillo en una placa de 24 pocillos. Después de sembrar durante 24 horas, se aplicaron los tratamientos durante 24 horas adicionales. Para recolectar las células, se aspiró el medio, se lavaron las células una vez con PBS y luego se rasparon de la placa. Las células se resuspendieron en PBS con una solución de trabajo de Sytox Green al 1 M. El pellet celular se incubó durante 45 minutos a 37 grados, se lavó con PBS y luego se procesó para la citometría de flujo.

Medición de ROS lipídicos

Se sembraron células HCT116 o SW480 (1 x 106) en placas de 12 pocillos. Después de 24 horas, las células se trataron según lo indicado durante 16 horas. Las células se recolectaron, se lavaron y se incubaron con 5 µM de C11-BODIPY (Thermo Fisher) durante 30 minutos a 37 °C. Se utilizó un período de incubación similar para los estudios in vivo y la evaluación de los ROS lipídicos de los tumores murinos. La citometría de flujo cuantificó la intensidad de la fluorescencia. Se analizaron un mínimo de 20 000 células por condición utilizando el software FlowJo.

Tinción de gotas lipídicas y microscopía

Las placas Ibidi µ-Slide de 8 pocillos (Ibidi, 80807) se recubrieron con 10 µg/cm2 de fibronectina humana (Sigma-Aldrich, FC010) siguiendo las recomendaciones del proveedor. Luego, se sembraron 15 000 células SW480 y 10 000 células HCT116 por pocillo y se incubaron a temperatura ambiente en la campana de bioseguridad durante 30 minutos antes de colocarlas en la incubadora. Al día siguiente, se reemplazó el medio de cultivo por un medio que contenía 0,2% de DMSO, 10 µM de PT2385, 5 µM de atorvastatina, 3 µM de simvastatina, PT2385 y atorvastatina combinados, PT2385 y simvastatina combinados, o 200 µM de ácido oleico (Cayman Chemical, 24659) complejo con albúmina bovina libre de ácidos grasos (Goldbio, A-421–10) en una relación molar de 5:1 en el medio de cultivo [^[22]]. Al día siguiente, las células se lavaron una vez con un medio de tinción (DMEM sin rojo fenol con alta concentración de glucosa (Thermo Scientific, 31053028), suplementado con 4 mM de L-glutamina (Research Products International, G36040) y 1 mM de piruvato (Agilent technologies 103578–100)). Luego, las células se incubaron con 2 µg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen H3570) y 1 µg/ml de BODIPY 493/503 (Cayman Chemical, 25892) disueltos en medio de tinción durante 25 minutos a 37 °C y 5% de CO2. Una pocillo sin tratar por línea celular se tiñó solo con Hoechst como control sin tinción para el tinte BODIPY. Luego, las células se lavaron una vez con medio de tinción sin tintes y se reemplazó el medio de tinción por un medio de tinción suplementado con 10% de FBS y 1% de mezcla de antibióticos-antimicóticos antes de la imagen.

Las células se visualizaron en un microscopio confocal Zeiss LSM 980 Airyscan 2 con detección espectral configurado para la multiplexación con una línea láser de 405 nm para la imagen del tinte Hoechst y una línea láser de 488 nm para la imagen del tinte BODIPY. El microscopio se configuró para mantener 37 °C y 5% de CO2 con humedad y se estabilizó durante 30 minutos antes de la imagen. Se tomaron imágenes con un objetivo de aceite de 63x con una apertura numérica de 1,4 a 2x del campo de visión. Se tomaron 35 pilas z para cada imagen en el centro de la célula. El postprocesamiento de la imagen se realizó con el software Zen 3.4 (edición Blue).

Cuantificación de gotas lipídicas

Para las células HCT116, se tomaron 2 imágenes para las condiciones de DMSO y el control sin tinción, y al menos 3 imágenes para todas las demás condiciones. Primero, las imágenes se configuraron como proyecciones de intensidad máxima y el valor de píxel máximo en la imagen del canal BODIPY del control sin tinción se restó del canal BODIPY para todas las demás imágenes. Luego, se aplicó un valor de umbral manual a los canales BODIPY y Hoechst en todas las condiciones para generar máscaras binarias para cada canal. Las células se segmentaron manualmente en cada imagen dibujando ROI alrededor de las máscaras nuclear y BODIPY para cada célula. Luego, se calculó el área de la máscara BODIPY para cada ROI.

Para las células SW480, se tomaron 2 imágenes para la condición de control sin tinción y al menos 3 imágenes para todas las demás condiciones. Las imágenes se analizaron de la misma manera que para las células HCT116, excepto que el umbral se determinó mediante FIJI utilizando el cálculo automático del umbral con el algoritmo MaxEntropy. Todo el análisis de imágenes se realizó en FIJI [^[23]].

El área de la máscara BODIPY/célula se analizó y se representó gráficamente utilizando R v4.3.2 [^[24]] con los paquetes dplyr [^[25]] y ggplot2 [^[26]]. Se realizó una ANOVA de una vía con una prueba post hoc de Tukey HSD para determinar la significación estadística.

Ensayo de formación de colonias

Las células se sembraron en triplicado biológico en placas de seis pocillos a 500 células por pocillo. El medio y los tratamientos se rellenaron cada 5 días. Los ensayos finalizaron a los 14 días fijando las células con formaldehído tamponado al 10% frío durante 10 minutos y tiñéndolas con solución de cristal violeta al 1% y metanol al 10% durante 30 minutos. Las colonias se contaron manualmente mediante un observador ciego al estudio.

Metabolómica

Las células se sembraron a 1 millón/pocillo en placas de 6 pocillos. Después de 24 horas, las células se trataron durante 24 horas. El aislamiento de metabolitos se realizó utilizando metanol al 80%. La concentración de proteínas para la normalización se determinó procesando un pocillo paralelo. Las soluciones celulares se liofilizaron utilizando un concentrador SpeedVac. Los gránulos de metabolitos se resuspendieron en una mezcla de metanol/agua al 50:50 para cromatografía líquida (CL) – espectrometría de masas (EM). Las muestras se analizaron en un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento Agilent 1290 Infinity II Bio LC, acoplado a un Agilent 6470 QQQ. Los datos se recopilaron, procesaron y analizaron utilizando parámetros publicados [^[27], ^[28]]. Cada nivel de abundancia de metabolito se centró en la mediana en todas las muestras y se transformó en log2 para obtener la abundancia relativa para la comparación intergrupal. La significación estadística se determinó mediante una ANOVA de una vía con un umbral de significación de p < 0,05.

Estadísticas

Se utilizaron pruebas t no pareadas para determinar las diferencias estadísticas entre dos grupos. Se consideró que un valor de p inferior a 0,05 era estadísticamente significativo. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Prism (GraphPad) o Excel.