La quimioterapia sensibiliza a las células iniciadoras del cáncer de colon a la citotoxicidad mediada por las células T Vδ9Vδ2.

El cáncer de colon comprende una pequeña población de células madre iniciadoras del cáncer (CMIC) que son responsables del mantenimiento del tumor y de la resistencia a las terapias contra el cáncer, lo que posiblemente permite la recapitulación del tumor una vez que se detiene el tratamiento. Las combinaciones de terapias basadas en el sistema inmunitario con quimioterapia y otros agentes antitumorales pueden ser de gran beneficio clínico en el tratamiento del cáncer de colon. Sin embargo, las terapias celulares basadas en el sistema inmunitario aún no se han probado en la población de CMIC del cáncer de colon. Aquí, demostramos que el tratamiento con bajas concentraciones de agentes quimioterapéuticos de uso común, 5-fluorouracilo y doxorrubicina, sensibiliza las CMIC del cáncer de colon a la citotoxicidad de las células T Vδ9Vδ2. La citotoxicidad de las células T Vδ9Vδ2 se produjo en gran medida mediante la interacción de TRAIL con DR5, tras el reconocimiento dependiente de NKG2D de los objetivos de las CMIC del cáncer de colon. Concluimos que la activación in vivo de las células T Vδ9Vδ2 o la administración adoptiva de células T Vδ9Vδ2 expandidas ex vivo a intervalos adecuados después de la quimioterapia puede aumentar sustancialmente las actividades antitumorales y representar una nueva estrategia para la inmunoterapia del cáncer de colon.

Citación: Todaro M, Orlando V, Cicero G, Caccamo N, Meraviglia S, Stassi G, et al. (2013) La quimioterapia sensibiliza a las células iniciadoras del cáncer de colon a la citotoxicidad mediada por las células T Vδ9Vδ2. PLoS ONE 8(6): e65145.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065145

Editor: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Public de la Santé (CRP-Santé), Luxemburgo

Recibido: 5 de marzo de 2013; Aceptado: 23 de abril de 2013; Publicado: 6 de junio de 2013

Derechos de autor: © 2013 Todaro et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se cite al autor original y la fuente.

Financiación: Este trabajo ha sido apoyado por subvenciones del Ministerio italiano de Instrucción, Universidad e Investigación (contrato n.º 2008L57JXW para FD), el Ministerio de Salud italiano (Progetto Ricerca Finalizzata 2007 “Células madre en diferentes condiciones patológicas: enfoques terapéuticos innovadores” para FD), el Istituto Superiore di Sanità Oncoproteomic Project 2007-527/B/3A/3 (para GS y FD) y la Universidad de Palermo. Los financiadores no participaron en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Conflictos de intereses: Los autores declaran no tener conflictos de intereses financieros o comerciales. El autor correspondiente, Francesco Dieli, es un editor académico de PLOS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLOS ONE sobre el intercambio de datos y materiales.

En los últimos años, nuevos conocimientos en la investigación del cáncer han sugerido que la capacidad de iniciar y mantener el crecimiento tumoral es una característica única de un pequeño subconjunto de células cancerosas con propiedades de células madre dentro de la masa tumoral, denominadas "células madre cancerosas" (CMC) o "células iniciadoras del cáncer" (CMIC) ^[1]. La quimioterapia sigue siendo la principal opción de tratamiento para muchos cánceres avanzados y tiene actividad antitumoral citotóxica a través de una variedad de mecanismos. Sin embargo, la mayoría de los cánceres son resistentes a las terapias actuales debido a las CMIC de ciclo lento, la ubicación de estas células dentro de nichos hipóxicos ^[2], ^[3] y porque las células malignas tienen la capacidad de desarrollar mecanismos para resistir o escapar de los efectos citotóxicos de la quimioterapia ^[4], que incluyen la regulación al alza de varias proteínas transportadoras de unión a ATP, la capacidad de reparación activa del ADN y la sobreexpresión de moléculas antiapoptóticas que causan cambios en las vías de señalización que controlan la proliferación, la diferenciación y la apoptosis ^[5].

Varios estudios han demostrado que el tratamiento de las células tumorales con fármacos quimioterapéuticos induce o aumenta su sensibilidad a la citotoxicidad por linfocitos NK o T; por lo tanto, las combinaciones de terapias celulares basadas en el sistema inmunitario con quimioterapia y otros agentes antitumorales pueden ser de gran beneficio clínico en el tratamiento de muchas formas de cáncer ^[6].

Las células T γδ son de particular interés para su uso en tales terapias combinadas debido a su potente citotoxicidad antitumoral y la relativa facilidad de generación in vitro ^[7]. Las células T γδ humanas se pueden dividir en dos poblaciones principales según la expresión de la cadena γ ^[8]: las células T γδ que expresan la cadena Vδ1 se encuentran con mayor frecuencia en los tejidos mucosos, donde participan en el mantenimiento de la integridad del tejido epitelial frente al daño, la infección o la transformación tumoral, mientras que las células T γδ que expresan la cadena Vδ2 emparejada con la cadena Vδ9 (en adelante, células T Vδ9Vδ2) predominan en la sangre periférica y los órganos linfoides secundarios ^[9]. Si bien los ligandos reconocidos por las células Vδ1 aún se desconocen, las células T Vδ9Vδ2 reconocen antígenos no peptídicos mediante un mecanismo no restringido por el MHC, una característica importante que las distingue de las células T αβ ^[9]. Específicamente, las células T Vδ9Vδ2 reconocen los fosfoantígenos que se producen a través de las vías de biosíntesis de isoprenoides ^[10]–^[12]. Los fosfoantígenos no son estimulantes a niveles fisiológicos, pero las células transformadas e infectadas producen niveles más altos de intermediarios metabólicos que son capaces de activar las células T Vδ9Vδ2 ^[13]–^[15]. En consecuencia, las células T Vδ9Vδ2 también pueden activarse, a través de un mecanismo indirecto, por aminobisfosfonatos, una clase de fármacos que se utilizan para tratar ciertas enfermedades óseas, que inhiben la farnesil pirofosfato sintasa y provocan la acumulación de metabolitos aguas arriba endógenos, como el isopentenil pirofosfato (IPP) ^[16]. Las células T Vδ9Vδ2 pueden contribuir indirectamente a la defensa inmunitaria contra las células cancerosas, produciendo citocinas típicas de las células Th1, Th2 o Th17 ^[17]–^[19], o interactuando con las células dendríticas ^[20], los macrófagos ^[21] y las células B ^[22]–^[24]. Además, las células T Vδ9Vδ2 realizan una actividad citotóxica directa y potente sobre las células cancerosas, que se media de manera muy similar a las células T CD8 y las células NK, a través de las vías perforina/granzima, Fas/FasL, TNF/TNF-R y TRAIL-TRAIL-R ^[10].

En este estudio, hemos evaluado el potencial de sinergia de la combinación de quimioterapia y citotoxicidad mediada por las células T Vδ9Vδ2 para la terapia antitumoral. Específicamente, dado que las CMIC del cáncer de colon son resistentes tanto a los fármacos quimioterapéuticos como a la citotoxicidad mediada por las células T Vδ9Vδ2, hemos determinado si la quimioterapia se puede utilizar para sensibilizar los objetivos de las CMIC del cáncer de colon a la citotoxicidad de las células T Vδ9Vδ2, basándonos en tres líneas de evidencia: (1) el trabajo pionero de Mattarollo y sus colegas ^[25] ha demostrado altos niveles de citotoxicidad contra líneas celulares derivadas de tumores sólidos con un tratamiento combinado que utiliza células T Vδ9Vδ2 y agentes quimioterapéuticos; (2) las células T γδ productoras de IL-17 desempeñan un papel decisivo en las respuestas inmunitarias contra el cáncer inducidas por la quimioterapia en el ratón ^[26]; (3) el tratamiento de las CMIC del cáncer de colon con el bisfosfonato zoledronato aumenta su sensibilidad a la muerte celular mediada por las células T Vδ9Vδ2 ^[27].

Mostramos aquí que los fármacos quimioterapéuticos que se utilizan actualmente para el tratamiento de los pacientes con cáncer de colon, el 5-fluorouracilo y la doxorrubicina, son capaces de sensibilizar las CMIC del cáncer de colon a la muerte celular mediada por las células T Vδ9Vδ2 y demostramos que los mecanismos subyacentes involucran a NKG2D y TRAIL.

Anteriormente, informamos que el cáncer de colon comprende una gran mayoría de células diferenciadas y una pequeña población de CMIC que son responsables de la iniciación y el mantenimiento del tumor ^[28]. Para los fines de este estudio, purificamos y propagamos esferoides de cáncer de colon a partir de fragmentos quirúrgicos de 5 pacientes con carcinoma de colon. Estas líneas de esferoides de cáncer se identificaron mediante la expresión de CD133 y el antígeno epitelial específico ESA, mostraron adherencia a las placas de cultivo en presencia de suero y posteriormente se diferenciaron en grandes células de colon poligonales que expresan marcadores epiteliales de colon, como la vilina, lo que sugiere que los esferoides de cáncer de colon mantuvieron la capacidad de diferenciarse in vitro en células similares a los enterocitos. Lo más importante es que, cuando se inyectaron por vía subcutánea en ratones NOD/SCID, un pequeño número de esferoides de cáncer de colon, pero no las células diferenciadas derivadas de los esferoides, conservaron la capacidad de formar un tumor que se asemejaba estrechamente al tumor original humano (Figura S1 complementaria).

Las CMIC se caracterizan por una alta resistencia a los fármacos y las toxinas en general que se dirigen a las células que se proliferan rápidamente y evitan a las células de división lenta, debido a la regulación al alza de varias proteínas transportadoras de unión a ATP, la capacidad de reparación activa del ADN, la sobreexpresión de moléculas antiapoptóticas que causan cambios en las vías de señalización que controlan la proliferación, la diferenciación y la apoptosis ^[5]. En consecuencia, la exposición de 5 líneas diferentes de CMIC del cáncer de colon (CMIC #1 a CMIC #5) a 5-FU (2,5 y 25 µg/ml) (Figura 1A) o DXR (0,025 y 0,25 µM) (Figura 1B) durante 24 a 72 horas tuvo prácticamente ningún efecto citotóxico significativo, según lo determinado por la tinción con PI. Las dosis más altas de 5-FU (250 µg/ml) y DXR (2,5 µM) causaron una citotoxicidad baja, pero detectable, de las líneas de CMIC que osciló entre el 15 ± 5 % y el 23 ± 6 % (media ± DE). Por el contrario, el 5-FU y el DXR fueron totalmente capaces de matar 3 líneas de células cancerosas de colon diferenciadas, DLD-1, SW620 y SW403, y 2 líneas de células diferenciadas (CDC #3 y CDC #4) obtenidas de dos pacientes (P #3 y P #4) de las que también se obtuvieron las líneas de CMIC, con un aumento de la citotoxicidad dependiente de la dosis de hasta el 85 %. La viabilidad de las células no tratadas fue superior al 90 % (Figuras 1A y 1B).

Las CMIC del cáncer de colon, las líneas de células cancerosas de colon diferenciadas DLD-1, SW620, SW403, CDC #3 y CDC #4 se trataron con diferentes concentraciones de 5-FU o DXR durante 48 horas. La citotoxicidad (% ± DE) se determinó por el grado de reducción de las células viables con la capacidad de retener CFSE y excluir PI (CFSEhigh PI-). Se muestra un experimento representativo de tres.

De manera análoga a su resistencia a la quimioterapia, las cinco líneas de CMIC del cáncer de colon probadas también fueron resistentes a la citotoxicidad mediada por las células T Vδ9Vδ2, incluso cuando se utilizó una relación E:T de 50:1 (Figura 2A). La escasa actividad citotóxica contra las CMIC del cáncer de colon no fue una característica intrínseca de las células T Vδ9Vδ2, porque las líneas de células cancerosas de colon diferenciadas DLD-1, SW620, SW403, CDC #3 y CDC #4 fueron eliminadas eficazmente por dos líneas de células T Vδ9Vδ2, COLD2-1 y COLD2-2, obtenidas de dos pacientes diferentes con cáncer de colon (P #3 y P #4) (Figura 2A), así como por las líneas de células T Vδ9Vδ2 obtenidas de sujetos sanos (datos no mostrados). Como control, todas las líneas de células T Vδ9Vδ2 probadas no pudieron matar la línea de células de colon normales CCL-241 (Figura 2A).

(A) Porcentaje de citotoxicidad de 2 líneas diferentes de células T Vδ9Vδ2, COLD2-1 y COLD2-2 obtenidas de 2 pacientes afectados por cáncer de colon, contra células de esferoides de cáncer de colon de 5 pacientes diferentes (CMIC #1 a CMIC #5), líneas de células cancerosas de colon diferenciadas DLD-1, SW620, SW403, CDC #3 y CDC #4, y la línea de células de colon normales CCL-241, a una relación E:T de 50:1. (B) Tres diferentes CMIC de colon (CMIC #2, CMIC #4 y CMIC #5) tratadas con o sin 5-FU (2,5 a 250 µg/ml) o DXR (0,025 a 2,5 µM) durante 48 horas se probaron para determinar su sensibilidad a dos líneas diferentes de células T Vδ9Vδ2, COLD2-1 y COLD2-2 obtenidas de 2 pacientes afectados por cáncer de colon y utilizadas a una relación E:T de 20:1. Los resultados indican la citotoxicidad de los objetivos tumorales tras 6 horas de cocultivo con las líneas de células T Vδ9Vδ2. Los datos son el porcentaje medio ± DE de 5 experimentos diferentes, cada uno realizado por triplicado.

En estudios previos, hemos demostrado que el zoledronato sensibiliza a las células tumorales de colon (CTC) a la citotoxicidad de las células T Vδ9Vδ2 ^[27]. A continuación, se evaluó la capacidad de las células T Vδ9Vδ2 para destruir las CTC de colon después de tratar los objetivos con quimioterapia. Los resultados representativos obtenidos con tres líneas de CTC diferentes (CTC#2, CTC#4 y CTC#5) se muestran en la Figura 2B. La citotoxicidad de las células T Vδ9Vδ2 se mejoró en todos los casos mediante el pretratamiento de las CTC con quimioterapia. En detalle, casi se produjo una lisis completa de las líneas de CTC como resultado de la combinación de las dosis más altas de 5-FU (250 µg/ml) o DXR (2,5 µM) y las células T Vδ9Vδ2, con porcentajes de muerte celular superiores al 90% a una relación E:T de 20:1. El tratamiento de los objetivos con dosis más bajas de quimioterapia (2,5 y 25 µg/ml de 5-FU y 0,025 y 0,25 µM de DXR) resultó en una mayor destrucción de las líneas de CTC por las células T Vδ9Vδ2, lo que indica que la quimioterapia y las células T Vδ9Vδ2 tienen una actividad aditiva, incluso cuando se utilizan a dosis subóptimas.

Para dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la sensibilización de las CTC a la citotoxicidad de las células T Vδ9Vδ2 mediada por la quimioterapia, nos centramos en la expresión del ARNm que codifica para las moléculas conocidas por ser ligandos de los receptores activadores clave de las células T Vδ9Vδ2 y los receptores de muerte, antes y después de la exposición de las CTC a los agentes quimioterapéuticos. Como se muestra en la Figura 3, todas estas moléculas se expresaron constitutivamente en las CTC, aunque la expresión varió constantemente entre las diferentes líneas de CTC; sin embargo, no se observaron diferencias importantes en todas las líneas de CTC probadas para la expresión de HLA-clase I, ICAM-1, CD155, CD112, MICA/B y ULPBP1-4 antes y después de la exposición a los agentes quimioterapéuticos.

RT-PCR de la expresión del ARNm que codifica para diferentes moléculas de superficie en las CTC de colon tratadas o no con 5-FU (25 µg/ml) o DXR (0,25 µM) durante 48 horas. Los datos representan los valores medios ± DE de 4 experimentos separados, cada uno realizado con esferoides de cáncer de colon de 5 pacientes diferentes (CTC#1 a CTC#5).

La expresión de los receptores de muerte Fas (CD95), TNF-R1, DR4 (TRAIL-R1) y DR5 (TRAIL-R2) aumentó en la mayoría de las líneas de CTC después de la exposición a los agentes quimioterapéuticos (Figura 3), pero el aumento de la expresión de Fas, TNF-R1 y DR4 no alcanzó significación estadística. El mayor y significativo aumento solo se observó para la expresión de DR5 después de la exposición de las CTC a 5-FU y, aunque en menor medida, a DXR (Figura 3). La regulación al alza de DR5 después de 48 horas de exposición de las CTC de colon a la quimioterapia se confirmó mediante citometría de flujo tras la tinción con anticuerpos monoclonales específicos (Figura 4).

Las CTC de colon se trataron con medio, 5-FU (25 µg/ml) o DXR (0,25 µM) durante 48 horas, se lavaron exhaustivamente y se tiñeron con anticuerpos monoclonales anti-DR5. Los histogramas de citometría de flujo muestran DR5. La intensidad media de fluorescencia (IMF) para la tinción de DR5 se indica en la esquina superior derecha de cada panel. Las líneas punteadas representan el anticuerpo monoclonal de control isotípico, mientras que el histograma relleno en gris representa el anticuerpo monoclonal anti-DR5.

Las células T Vδ9Vδ2 explotan diferentes vías para la destrucción de las células tumorales que se basan en la secreción de citocinas proinflamatorias y moléculas proapoptóticas o en la lisis dependiente del contacto celular a través de interacciones similares a las de las células NK o dependientes del TCR ^[9]. Evaluamos los mecanismos responsables de la destrucción de las CTC sensibilizadas a la quimioterapia por las células T Vδ9Vδ2, bloqueando individualmente los receptores TCR o NKG2D. La citotoxicidad de las líneas de CTC de colon pretratadas con quimioterapia por dos líneas diferentes de células T Vδ9Vδ2 se inhibió significativamente mediante el anticuerpo monoclonal anti-NKG2D, mientras que el TCR de las células T Vδ9Vδ2 parece desempeñar un papel menor, como lo indica el fracaso de los anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-pan-TCR para inhibir la citotoxicidad (Figura 5). Además, la destrucción de las células T Vδ9Vδ2 de los objetivos sensibilizados a la quimioterapia se evaluó en presencia de mevastatina, que inhibe la 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA y previene la acumulación mediada por zoledronato de fosfoantígenos endógenos como el IPP. La mevastatina no inhibió la destrucción de todas las líneas de CTC de colon pretratadas con quimioterapia por dos líneas diferentes de células T Vδ9Vδ2 alogénicas (Figura 5), lo que indica que la sensibilización de las CTC a la citotoxicidad de las células T Vδ9Vδ2 inducida por la quimioterapia no depende de la producción de metabolitos del mevalonato.

La línea de células T Vδ9Vδ2 COLD2-1 se cultivó con dos CTC de colon tratadas con quimioterapia (CTC#3 y CTC#5) a una relación E:T de 20:1, en presencia de anticuerpos bloqueantes contra el TCR, CD3, NKG2D o en presencia de mevastatina. Los niveles de citotoxicidad específicos logrados por la línea de células T Vδ9Vδ2 COLD2-1 fueron de 65±11 para CTC#3 y 71±9 para CTC#5. Los datos son la media ± DE de dos experimentos realizados por triplicado. El porcentaje de inhibición con el anticuerpo monoclonal anti-NKG2D fue significativamente diferente de los valores en todos los demás grupos (*p