Identificación de posibles biomarcadores metabólicos del cáncer de recto y del efecto de la quimiorradioterapia neoadyuvante.

Presentamos un estudio piloto sobre la viabilidad de la determinación de los niveles circulantes de paraoxonasa-1 (PON1) y compuestos relacionados con el metabolismo energético como biomarcadores para la evaluación de pacientes con cáncer de recto (CR), y los efectos producidos por la radiquimioterapia neoadyuvante (RQN). Estudiamos a 32 pacientes tratados con radioterapia y quimioterapia concomitante con capecitabina, y a 48 sujetos control. Identificamos que, antes de la RQN, la PON1 y el α-cetoglutarato fueron los parámetros que mejor discriminaron entre los pacientes con CR y el grupo control. El análisis de las características de funcionamiento del receptor (ROC) de la combinación de los dos parámetros mostró un área bajo la curva (AUC) de 0,918. Además, los pacientes que presentaron una respuesta patológica completa (RPC) al tratamiento tuvieron concentraciones plasmáticas más bajas de valina antes de la RQN (AUC de 0,826). Los pacientes que sufrieron una recurrencia tuvieron concentraciones más bajas de succinato (AUC de 0,833). Los resultados del presente estudio ilustran la utilidad de investigar las alteraciones en el estrés oxidativo y el metabolismo en el CR. Debido al pequeño número de pacientes estudiados, nuestros resultados deben considerarse preliminares, pero sugieren que la determinación de los niveles circulantes de PON1 y α-cetoglutarato podría ser una herramienta valiosa para el diagnóstico precoz del CR, mientras que la determinación de valina y succinato podría predecir eficazmente la RPC y la aparición de la recurrencia.

Citación: Rodríguez-Tomàs E, Arenas M, Gómez J, Acosta J, Trilla J, López Y, et al. (2021) Identificación de posibles biomarcadores metabólicos del cáncer de recto y del efecto de la radiquimioterapia neoadyuvante. PLoS ONE 16(4): e0250453.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0250453

Editor: Anna Halama, Weill Cornell Medical College in Qatar, CATAR

Recibido: 22 de diciembre de 2020; Aceptado: 7 de abril de 2021; Publicado: 22 de abril de 2021

Derechos de autor: © 2021 Rodríguez-Tomàs et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Atribución, que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se cite al autor original y la fuente.

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes se encuentran en el artículo y en los archivos de información complementaria.

Financiación: Esta investigación fue financiada por ASSOCIACIÓ ONCOLÒGICA DR. AMADEU PELEGRÍ, número de subvención AODAP-2017 (M.A. y J.C.). Los financiadores no participaron en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Conflictos de intereses: Los autores han declarado que no existen conflictos de intereses.

El cáncer de recto (CR) es el octavo cáncer más común en el mundo. Está asociado con una alta mortalidad y morbilidad, y está aumentando su prevalencia en personas jóvenes. La radiquimioterapia neoadyuvante (RQN) es el tratamiento estándar para los pacientes con esta enfermedad [1–4]. Sin embargo, los datos sobre los efectos de este tratamiento sobre el metabolismo son escasos. Se ha sugerido que las alteraciones metabólicas son elementos esenciales en el desarrollo de la carcinogénesis ^[5] y, de hecho, el metabolismo del cáncer se ha convertido en un importante tema de investigación en los últimos años. Examinar las diferencias metabólicas entre los pacientes con cáncer y las personas sanas puede proporcionar información importante para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas y el descubrimiento de nuevos biomarcadores para el diagnóstico, el pronóstico y el seguimiento de la enfermedad ^[6].

El desarrollo de la metabolómica dirigida ha permitido a los investigadores utilizar métodos prácticos y precisos para estudiar una gran cantidad de metabolitos en pequeñas muestras de tejido, extractos celulares o fluidos biológicos. Estudios recientes han subrayado el importante papel del metabolismo energético en el desarrollo y la progresión del tumor, y han destacado el fenómeno clave de que el metabolismo energético en su conjunto se adapta a las altas demandas de síntesis de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos necesarias para la proliferación de las células tumorales. Estudios recientes de nuestro grupo informaron que las concentraciones plasmáticas de los productos de la glucólisis, el ciclo del ácido cítrico y el metabolismo de los aminoácidos están considerablemente alteradas en pacientes con cáncer de mama, pulmón y cabeza y cuello, y que la radioterapia (RT) fue un factor para rectificar estas alteraciones [7–9].

Las alteraciones metabólicas en el cáncer están relacionadas con el estrés oxidativo ^[10]. Uno de los principales sistemas que protege a la célula del estrés oxidativo es la paraoxonasa-1 (PON1). La PON1 es una enzima antioxidante que se encuentra en las membranas de la mayoría de las células y, también, en la circulación unida a las lipoproteínas de alta densidad (HDL). La función original que se atribuyó a la PON1 es la de una lactonasa, ya que las lactonas lipofílicas forman parte de sus principales sustratos. Es esta capacidad catalítica la que permite a la PON1 degradar los peróxidos de lípidos dentro de la célula y en las lipoproteínas en circulación. Además, la PON1 tiene actividad esterasa y degrada los xenobióticos organofosforados, como la paraoxona, el fenilacetato y los agentes nerviosos ^[11]. Un reciente metaanálisis mostró una disminución de la actividad de la PON1 en suero en pacientes con cáncer, lo que sugiere una capacidad disminuida para combatir el estrés oxidativo, con posibles implicaciones en la proliferación celular, la promoción de la inestabilidad genética y las alteraciones en la sensibilidad celular a la quimioterapia ^[12]. Hemos demostrado previamente que la RT se asoció con un aumento de los niveles de PON1 en suero en pacientes con cáncer [13, 14].

El presente artículo presenta un estudio piloto sobre la viabilidad de la determinación de los niveles circulantes de PON1 y compuestos relacionados con el metabolismo energético como biomarcadores para la evaluación de pacientes con CR, y los efectos producidos por la RQN.

Este fue un estudio longitudinal y prospectivo de 32 pacientes con CR (hombres, n = 22; mujeres, n = 10) ingresados en nuestro hospital entre marzo de 2014 y junio de 2018. Los tumores se clasificaron según el sistema de estadificación TNM ^[15]. Fueron diagnosticados con CR localmente avanzado (estadio de cáncer II o III, y T3/4 y N0/1/2, según el sistema clínico TNM). Todos los pacientes aceptaron una visita clínica un mes después de la RQN, pero solo un pequeño subgrupo de 14 pacientes aceptó que se les extrajera una nueva muestra de sangre. La RT se administró cinco días a la semana, durante 4 a 6 semanas, y la dosis de radiación final total fue de 50,4 Gy (1,8 Gy/día) en la pelvis, con un refuerzo en el área del tumor de 5,4 Gy. Todos los participantes recibieron quimioterapia concomitante con capecitabina junto con las sesiones de RT. Se utilizó el sistema de Dworak para estimar el grado de regresión tumoral (GRT) después de la RQN ^[16]. La cirugía se realizó entre 6 y 8 semanas después del final de la RQN. Se obtuvieron muestras de sangre de cada paciente antes de la RQN y un mes después de la RQN y antes de la cirugía. Los alícuotas de suero y plasma EDTA se almacenaron a -80 °C hasta que se realizaron las determinaciones bioquímicas por lotes. Para las comparaciones, se utilizaron muestras almacenadas (n = 48) de voluntarios sanos y con edades similares sin alteraciones hepáticas, cuyos datos se describieron previamente ^[17]. Los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Universitari de Sant Joan (Proyecto 14/2014). Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito, siempre que se garantizara el anonimato de los datos.

La actividad de la PON1 en suero se midió como la velocidad de hidrólisis del fenilacetato a 280 nm, en un tampón de Tris-HCl de 9 mM, pH 8,0, suplementado con 0,9 mM de CaCl2, según se informó previamente ^[18]. La concentración de PON1 en suero se determinó mediante ELISA interno con anticuerpos policlonales de conejo generados contra el péptido sintético CRNHQSSYQTRLNALREVQ, que es una secuencia específica para la PON1 madura ^[19]. Las concentraciones de metabolitos involucrados en la glucólisis, el ciclo del ácido cítrico y el metabolismo de los aminoácidos se analizaron mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas de tiempo de vuelo cuádrupolo con una fuente de impacto electrónico (GC-EI-QTOF-MS), como se describió previamente ^[20]. Los análisis se realizaron con un cromatógrafo de gases 7890A acoplado a una fuente de impacto electrónico, a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuádrupolo 7200 equipado con un módulo de autosampler 7693 y una columna J&W Scientific HP-5MS (columna J&W Scientific HP-5MS, 30 m × 0,25 mm, 0,25 μm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). Se obtuvieron curvas de calibración para cada metabolito trazando las concentraciones estándar en función del área del pico. La recuperación de cada metabolito osciló entre el 83 % y el 99 %. Las actividades de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) en suero, y el CEA y el CA19.9 se analizaron mediante pruebas estándar en un sistema Roche Modular Analytics P800 (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza).

Para el cálculo del tamaño de la muestra para la comparación entre pacientes y controles, consideramos una diferencia media de ± 10 μg/L de la concentración de PON1 como punto final. Aceptando un nivel de significación de 0,05 y un nivel de error de 0,2 en un contraste bilateral, se requirió un mínimo de 11 sujetos de control y 16 pacientes. Las diferencias entre dos grupos independientes se evaluaron utilizando la prueba U de Mann-Whitney. Se utilizó la prueba de rangos con signo de Wilcoxon para las comparaciones de variables dependientes. El coeficiente de correlación de Spearman se utilizó para evaluar el grado de asociación entre las variables. El efecto combinado de las características clínicas y demográficas sobre las variables bioquímicas seleccionadas se evaluó mediante ANOVA. Todos los cálculos estadísticos y las representaciones gráficas se realizaron utilizando el paquete estadístico para las ciencias sociales (SPSS 22.0, Chicago, IL, EE. UU.) y GraphPad Prism 6.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). Se consideraron significativas las diferencias con un valor de p < 0,05. Las frecuencias se expresaron como medianas y rangos intercuartílicos para las variables cuantitativas y como frecuencias y porcentajes para las variables cualitativas. Para el análisis metabolómico, los datos se importaron y analizaron utilizando MetaboAnalyst 3.0 (http://www.metaboanalyst.ca/) y el programa ‘R’ versión 4.0.2 (https://www.r-project.org/). Se realizó un análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLSDA) para el análisis multivariante. La magnitud relativa de las variaciones observadas se evaluó utilizando la puntuación de importancia en la proyección (VIP). Se incluyeron mapas de calor y matrices de correlación para una representación visual de los metabolitos individuales y para resumir los resultados predichos. Las matrices de correlación de pares de Spearman se analizaron con el paquete ggcorr en R (https://www.rdocumentation.org/packages/GGally/versions/1.5.0/topics/ggcorr). Se analizaron las redes de correlación para representar las correlaciones de Spearman entre los grupos de estudio, utilizando el paquete qgraph del software Rstudio. El umbral se determinó en 0,05. Para identificar patrones biológicamente significativos a través de los cambios en la concentración de los metabolitos, utilizamos un análisis cuantitativo de enriquecimiento (QEA) a través de MetaboAnalyst 4.0. Este análisis se utilizó para identificar los patrones metabólicos subyacentes a los cambios significativos en las concentraciones de los metabolitos. QEA tiene en cuenta los recuentos y la estadística Q calculada para cada metabolito para el análisis de enriquecimiento ^[21]. La precisión diagnóstica de las variables bioquímicas medidas se evaluó mediante curvas ROC ^[22].

Todos los datos clínicos y bioquímicos brutos de este estudio se muestran en el Conjunto de datos S1, y las principales características clínicas del grupo de control y de los pacientes con RC, antes y después de la quimiorradioterapia neoadyuvante (QRNA), se muestran en la Tabla 1. Se observaron diferencias significativas en la edad, el sexo, la dislipidemia, la hipertensión arterial y el índice de masa corporal (IMC) entre los pacientes con cáncer y el grupo de control. El IMC fue mayor en los pacientes con RC y disminuyó después de la QRNA. La mayoría de los tumores presentaban una localización media en el recto (entre 5 y 10 cm del margen anal). En cuanto a la clasificación clínica TNM (antes de recibir cualquier tratamiento oncológico), la mayoría de los pacientes se clasificaron como T3, N1, M0, siendo el estadio III el predominante. Una vez analizada la pieza quirúrgica, la mayoría de los pacientes presentaban un T3, N0, M0 patológico, y casi la mitad de las piezas quirúrgicas mostraban un grado 3 de Dworak, lo que indica fibrosis con células tumorales dispersas con/sin mucina acelular. Los efectos tóxicos del tratamiento se muestran en la Tabla 2. La dermatitis perianal (grado I) fue el efecto secundario temprano más prevalente. Ninguno de estos pacientes presentó efectos secundarios tardíos. La mayoría de los pacientes con RC no sufrieron recurrencia una vez superado el cáncer, y se observó una supervivencia global del 81% durante un período de cuatro años como mediana.

Observamos concentraciones y actividades séricas de PON1 significativamente más bajas en los pacientes con RC antes de la QRNA en comparación con el grupo de control. El tratamiento se asoció con un aumento de las concentraciones de PON1. No encontramos diferencias significativas en los niveles de aminotransferasas entre los pacientes y el grupo de control, ni antes ni después de la terapia. Las concentraciones de antígeno carcinoembrionario (CEA) disminuyeron después de la QRNA, pero no encontramos diferencias significativas en las concentraciones de antígeno 19.9 (CA 19.9) (Tabla 3). Las diferencias en las concentraciones séricas de PON1 entre los pacientes con RC antes de la QRNA y el grupo de control se mantuvieron cuando se ajustaron por las diferencias en las características clínicas y demográficas (Tabla 4).

Los cambios en las concentraciones de los metabolitos analizados en los pacientes con RC antes de la QRNA en comparación con el grupo de control se muestran en la Figura 1. Encontramos concentraciones significativamente más altas de glucosa, piruvato y glutamina en el plasma de los pacientes con RC. Además, las concentraciones de lactato, alanina, valina, leucina, fumarato, malato, α-cetoglutarato, glutamato y aconitato fueron significativamente más bajas (Figura 1A). El cambio medio en las concentraciones de los metabolitos también se representa en un diagrama de burbujas. Los metabolitos α-cetoglutarato y glutamina mostraron las mayores diferencias, con cambios medios de -1,84 y 1,62, respectivamente (Figura 1B). Al comparar las alteraciones metabólicas después de la QRNA frente a antes de la QRNA, encontramos aumentos significativos en el lactato (1,1 de cambio medio) y el fumarato (1,1 de cambio medio) y una disminución en la glutamina (-1,1 de cambio medio) (Figura 2).

(A) Vista esquemática de las diferencias en los metabolitos relacionados con la vía glucolítica, el ciclo del ácido cítrico y las vías de los aminoácidos entre el grupo de control y los pacientes con RC. Los colores indican las comparaciones estadísticas, como se muestra en la leyenda. (B) Cambios medios en las concentraciones de los metabolitos expresados como diagramas de burbujas. El tamaño de las burbujas estima la magnitud del cambio. Los colores representan un aumento estadísticamente significativo (rojo), una disminución (azul) o una falta de significación (gris). QRNA: Quimiorradioterapia neoadyuvante.

(A) Vista esquemática de las diferencias en los metabolitos relacionados con la vía glucolítica, el ciclo del ácido cítrico y las vías de los aminoácidos entre el grupo de control y los pacientes con RC. Los colores indican las comparaciones estadísticas, como se muestra en la leyenda. (B) Cambios medios en las concentraciones de los metabolitos expresados como diagramas de burbujas. El tamaño de las burbujas estima la magnitud del cambio. Los colores representan un aumento estadísticamente significativo (rojo), una disminución (azul) o una falta de significación (gris).

La representación tridimensional de PLSDA mostró que la combinación de los metabolitos analizados permitió una diferenciación completa entre los grupos de control y RC antes de la QRNA. Por el contrario, encontramos un grado considerable de superposición al comparar los pacientes antes y después del tratamiento. La puntuación VIP indicó que el metabolito más relevante para distinguir a los pacientes con RC del grupo de control fue el α-cetoglutarato. Los mapas de calor mostraron una clara diferencia entre los niveles de metabolitos entre los pacientes y los controles, pero estas diferencias no fueron tan evidentes al comparar los pacientes antes y después de la QRNA (Figura 3). Las diferencias en las concentraciones de α-cetoglutarato en el plasma entre los pacientes con RC antes de la QRNA y el grupo de control se mantuvieron cuando se ajustaron por las diferencias en las características clínicas y demográficas (Tabla 5).

De izquierda a derecha, análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLSDA), puntuaciones de importancia de la variable en la proyección (VIP) del PLSDA y análisis de mapas de calor que comparan a los pacientes con RC y al grupo de control (A) y a los pacientes con RC antes y después de la QRNA (B).

El análisis de correlaciones de Spearman entre los diferentes metabolitos antes y después de la QRNA se representa como matrices de correlación (Figura 4). Hubo múltiples correlaciones significativas entre los diferentes metabolitos, tanto antes como después de la QRNA. La actividad sérica de PON1 mostró relaciones inversas con el glutamato y el lactato antes de la QRNA. Además, se encontraron correlaciones directas después de la QRNA con la leucina y la isoleucina, y correlaciones inversas con el glutamato, el fumarato, el citrato y el malato.

La magnitud y la dirección de la correlación de la concentración de los metabolitos antes (A) y después (B) del tratamiento se muestran mediante el tamaño del círculo (cuanto más grande, más fuerte) y los colores (correlación positiva en azul oscuro y correlación negativa en rosa), respectivamente. a = p