La secuenciación por nanoporos revela el paisaje oculto de las transducciones cortas de L1 en cáncer colorrectal.

Los elementos nucleares largos dispersos (LINE1 o L1) son retrotransposones, elementos genéticos repetitivos que tienen la capacidad de crear copias de sí mismos e insertarse en nuevos loci del genoma. Los L1 siguen siendo los únicos retrotransposones autónomos activos en el genoma humano, lo que significa que no dependen de las proteínas de otros retrotransposones. Los retrotransposones, incluidos los L1, se movilizan a través de un intermediario de ARN mensajero (ARNm) en un mecanismo conocido como copia y pegado^[1].

Aproximadamente el 17% del genoma humano está compuesto por elementos L1, sin embargo, no todos ellos conservan la capacidad de retrotransposición^[2]. De los aproximadamente 500.000 elementos L1 estimados en el genoma humano, solo alrededor de 100 L1 específicos de humanos (L1HS) han conservado su capacidad de retrotransponerse^[3]–^[5]. La mayoría de los elementos L1 están truncados, lo que los hace incompetentes para la transposición, ya que solo los elementos de longitud completa (6 kb) con 2 marcos de lectura abiertos intactos son capaces de hacerlo^[6].

Nuevas copias de L1 surgen de la transcripción inversa dirigida por el sitio diana (TPRT)^[7], donde la cola de ARNm se hibrida con un sitio diana polí(T), que funciona como un cebador para la transcripción inversa (TI). Como resultado de la TPRT, la inserción contiene las características de la retrotransposición: duplicación del sitio diana, sitio de corte de la endonucleasa y una cola poli(A). En la TPRT, la TI se inicia desde el extremo 3' de la secuencia L1, lo que a menudo conduce a un producto truncado con solo el extremo 3' del elemento y la incapacidad de movilizarse aún más. Además, la inserción puede truncarse mediante una inversión 5', que surge de un mecanismo poco conocido llamado cebado gemelo^[8].

Aproximadamente el 25% de las inserciones de L1 contienen secuencias más allá del extremo 3' del L1 de origen^[9]. Estas inserciones, las transducciones 3', se producen cuando la secuencia genómica aguas abajo se transcribe a medida que la maquinaria de transcripción de L1 omite la señal de poliadenilación en el extremo 3' de los elementos L1^[10]. En la mayoría de los casos, la señal de poliadenilación canónica (AATAAA) o una variación de la misma, detiene la transcripción 10-30 pares de bases aguas abajo^[11]. Dado que la TI se inicia desde el extremo 3' del ADN de L1, la secuencia transducida es la primera en ser transcrita inversamente después de la cola poli(A). Basándose en el contenido de la secuencia insertada, las transducciones se pueden dividir en dos categorías: transducciones asociadas, que contienen tanto la secuencia L1 como la secuencia genómica 3' aguas abajo, y transducciones huérfanas, que incluyen solo la secuencia genómica 3' aguas abajo. En ambos casos, la secuencia única fuera del elemento se puede utilizar como una huella dactilar para identificar el L1 de origen que produce las nuevas inserciones^[12]. Esto no es posible con las inserciones de L1 solo, que contienen solo la secuencia repetitiva de L1.

Los elementos L1 están silenciados en la mayoría de los tejidos somáticos adultos mediante un mecanismo epigenético clave, la metilación del promotor, lo que contribuye a la supresión de su actividad de transcripción^[13]. Sin embargo, se han detectado bajos niveles de actividad de L1 en las células germinales y en el desarrollo embrionario temprano^[14],^[15], en el colon sano^[16] y en el cerebro^[17]. Además de los tejidos somáticos sanos, se producen nuevas inserciones de L1 en muchos cánceres, donde la hipometilación a nivel del genoma, una característica del cáncer, puede conducir a la desregulación del promotor de L1^[18],^[19]. Si bien la desmetilación del promotor es insuficiente para impulsar la expresión de L1^[20], se cree que es el principal interruptor para la transcripción de L1^[16].

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común a nivel mundial, que causa casi 1 millón de muertes por cáncer cada año^[21]. Los tumores colorrectales exhiben algunos de los niveles más altos de retrotransposición somática de L1 entre los cánceres humanos^[22]. El papel de la actividad de L1 en el cáncer aún no se comprende completamente, ya que muchas inserciones se producen dentro de los intrones de genes que no están implicados en la tumorigénesis^[23]. Sin embargo, en casos raros, se ha demostrado que las inserciones somáticas de L1 truncan el gen supresor de tumores APC, lo que contribuye al inicio del cáncer colorrectal^[24]–^[26]. Además, la alta actividad de L1 se ha asociado con una mala supervivencia en el CCR^[25].

Estudios previos de inserciones somáticas de L1 en el cáncer han utilizado transducciones 3' para identificar los L1 de origen activos^[9],^[16],^[22],^[27]. Estos estudios han demostrado constantemente que un pequeño número de L1 "calientes" altamente activos representan la mayoría de las transducciones observadas, con un L1 en el cromosoma 22q12.1 reconocido en todos ellos. Este es un ejemplo de un elemento estromboliano, un L1 que es frecuentemente activo pero produce pocas inserciones por tumor, en contraste con los elementos plinianos que son raramente activos pero generan numerosas inserciones cuando se activan^[22]. Los esfuerzos para identificar y caracterizar estos L1 activos se han basado tradicionalmente en ensayos de retrotransposición en células cultivadas^[4],^[5] y enfoques de secuenciación de lectura corta^[9],^[16],^[22],^[25]. Sin embargo, estos métodos son limitados en su capacidad para resolver las secuencias de inserción.

En este estudio, aplicamos la secuenciación de lectura larga de nanoporos para investigar la retrotransposición de L1 en el cáncer colorrectal. Las lecturas de secuenciación largas nos permiten identificar los elementos de origen activos y realizar un análisis detallado de las secuencias de transducción y explorar las características de los diferentes elementos L1 de origen en el CCR. Además, integramos información sobre los niveles de metilación del ADN de los elementos L1 de origen y estudiamos la relación entre la metilación y la actividad de transducción en tejidos con y sin actividad de transducción. En total, nuestros resultados proporcionan un catálogo detallado de la actividad de L1 en muestras de cáncer colorrectal, junto con la metilación del elemento de origen.

Resultados

Mapeo de alta resolución de las transducciones somáticas de L1 en el cáncer colorrectal

Para caracterizar el panorama de los elementos L1 activos en el cáncer colorrectal (CCR), realizamos una secuenciación de nanoporos Oxford de lectura larga y aplicamos TraDetIONS^[28] en 56 tumores primarios de cáncer colorrectal y 12 tejidos de colon normales emparejados. Este enfoque permitió una precisión estimada del 93-96% en la detección de inserciones somáticas de L1^[28]. Para detectar los L1 de origen activos a partir del conjunto de inserciones somáticas resultante, nos centramos en las transducciones 3'. Las transducciones se identificaron mediante la utilización de secuencias de inserción reconstruidas que se mapean dentro de 3 kb de los L1 de origen candidatos (Métodos: detección de elementos TE y transducción). De todas las inserciones somáticas de L1 detectadas, 349/1531 (23%) contenían transducciones 3' rastreables, lo que permitió una asignación confiable a sus loci de origen. Todas las transducciones somáticas detectadas se originaron en un total de 43 elementos L1HS de longitud completa distintos (Datos suplementarios S1 y S2). El número de transducciones por muestra de tumor se correlacionó fuertemente con el número total de inserciones somáticas de L1 por muestra (Pearson, r = 0,77, p = 2,7 × 10^-12), lo que indica que la carga de transducción puede servir como un indicador de la actividad general de retrotransposición (Fig. 1a y Datos suplementarios S3).

En las muestras de CCR con más de dos transducciones detectadas, múltiples L1 de origen contribuyeron a la carga de inserción general, y algunos tumores exhibieron actividad de transducción en hasta 12 fuentes distintas (Datos suplementarios S2 y S3 y Fig. 1b). La actividad de los L1 de origen varió en los tumores; por ejemplo, el L1 fijo 22q12.1-1 estaba activo en 17 tumores, pero produjo solo un pequeño número de inserciones por tumor, mientras que el L1 polimórfico en 6p24.1-1 estaba activo en solo cuatro tumores, pero generó 68 inserciones en una sola muestra, el mayor número de inserciones en nuestra cohorte. El L1 polimórfico en Xp22.2-1 mostró un comportamiento intermedio, contribuyendo a aproximadamente 10 inserciones en varios tumores. Esta variabilidad tanto en el número de transducciones por muestra como en el número de muestras en las que está activo se asemeja a los patrones estrombolianos y plinianos de comportamiento de L1 descritos previamente^[22], donde algunos loci son frecuentemente pero modestamente activos, y otros son raramente activos pero capaces de producir grandes ráfagas de inserciones cuando se activan. Sin embargo, la mayoría de las fuentes en nuestros datos no siguen este modelo bimodal, sino que se sitúan entre los dos extremos, lo que sugiere un espectro en lugar de una clasificación binaria. Nuestros hallazgos refuerzan la idea de que la retrotransposición somática suele estar impulsada por un pequeño subconjunto de elementos L1HS variablemente activos.

Como se esperaba, las transducciones somáticas detectadas en este estudio exhibieron las características de la retrotransposición, y más del 99% de las transducciones mostraron al menos una característica (348/349) (Datos suplementarios S4). Además, las transducciones asociadas con la secuencia L1 y la secuencia de transducción se caracterizan a menudo por dos colas poli(A): una del L1 de origen original y la otra de la nueva transducción (Fig. S1). De las 217 transducciones asociadas, el 72% (215/297) presentaron dos colas poli(A) dentro de la secuencia insertada (Datos suplementarios S4).

Además de las transducciones somáticas, identificamos 153 transducciones de la línea germinal que se originaron en 70 L1 de origen. Dieciocho de los L1 de origen somáticamente activos también estaban activos en la línea germinal (Fig. 1c). Estos elementos compartidos representaron el 80% de todas las inserciones somáticas, pero solo el 30% de las inserciones de la línea germinal. Esto sugiere que las transducciones en la línea germinal se originan en un conjunto más diverso de L1 de origen.

Las transducciones cortas evitan la detección, pero son detectables con enfoques basados en etiquetas

Para evaluar la actividad relativa de los L1 de origen en diferentes plataformas y en una cohorte más amplia de CCR, comparamos las tasas de inserción somática en nuestras muestras secuenciadas con nanoporos con las obtenidas de conjuntos de datos de secuenciación del genoma completo de lectura corta. Las comparaciones de lectura corta incluyeron una cohorte de CCR interna (344 tumores con normales correspondientes, de los cuales 50 se superpusieron con el conjunto de datos de nanoporos) analizada con xTea^[29] (Métodos: detección de elementos TE y transducción), así como conjuntos de datos disponibles públicamente procesados con TraFiC-mem^[9],^[22] (Fig. 2a). Para mayor coherencia, restringimos el conjunto de datos PCAWG a los tumores de cáncer colorrectal (Datos suplementarios S1). Debido a la mayor profundidad de secuenciación, esperaríamos que la secuenciación de lectura corta produjera más inserciones somáticas por muestra. Sin embargo, varios L1 de origen individuales mostraron una mayor actividad en nuestros datos de nanoporos. Para comprender esta discrepancia, examinamos la distribución de la longitud de las secuencias transducidas y descubrimos que los L1 de origen con una actividad inesperadamente alta producían transducciones cortas (Fig. 2b). Solo los elementos en los que la mayoría de la secuencia de transducción era más larga que 100 pb (22q12.1-1, 14q23.1-1) se detectaron con mayor frecuencia en cualquiera de los estudios basados en lectura corta (Fig. 2a, b). En total, el 71% (248/349) de las transducciones identificadas por nanoporos eran más cortas que 100 pb (Fig. 2b y Datos suplementarios S4). Estas transducciones cortas rara vez se detectaron en los conjuntos de datos de lectura corta, probablemente debido a la dificultad de mapear secuencias cortas y de baja información cerca de los L1 de origen altamente repetitivos.

Para investigar más a fondo la detección de transducciones cortas, analizamos 50 muestras de CCR con transducciones detectadas por TraDetIONS utilizando datos de nanoporos y por xTea utilizando datos de Illumina. De 341 inserciones de transducción 3' somáticas detectadas por nanoporos, 75 (22%) también se clasificaron como transducciones por xTea, y el 73% de ellas (55/75) compartieron el mismo L1 de origen asignado (Datos suplementarios S2). En particular, el 87% (48/55) de las secuencias transducidas tenían más de 100 pb. Por el contrario, nanoporos identificó 174 inserciones como transducciones que xTea había clasificado como L1 solo: el 96% (166/174) de ellas tenían una secuencia transducida más corta de 100 pb. Estos resultados respaldan aún más nuestra observación de que los métodos de lectura corta están sesgados hacia la detección de transducciones más largas y, a menudo, no logran resolver los L1 de origen de las inserciones con transducciones cortas.

Dado que las fuentes L1 tienden a producir inserciones con longitudes de transducción muy distintas (Tabla 1), la omisión de transducciones cortas ha sesgado nuestro catálogo de elementos L1 activos. Según nuestros datos, muchos elementos con actividad previamente reportada ^[9], ^[22] muestran eventos de transducción sustancialmente más frecuentes (6p24.1-1, Xp22.2-1) (Fig. 2a). Además, identificamos 9 fuentes L1 con transducciones somáticas detectadas en nuestros datos que no tienen actividad reportada en estudios previos ^[4], ^[5], ^[9], ^[16], ^[22], ^[25] (Datos suplementarios S1). Las fuentes L1 tienen una actividad menor, que oscila entre 1 y 5 nuevas inserciones. La mayoría, 7 de 9 elementos, estaban presentes en el genoma de referencia (GRCh38) y 6 de 9 estaban fijados en la población según TraDetIONS ^[28]. De los siete elementos de referencia activos, cinco produjeron transducciones exclusivamente más cortas de 60 pb, lo que demuestra que la omisión de transducciones cortas ha impedido la identificación de estos L1 como activos.

Para evaluar si estas transducciones cortas están presentes pero no se detectan en los datos de lectura corta de Illumina, desarrollamos una estrategia basada en etiquetas que buscó secuencias exactas de 30 pb de las regiones 3' de las fuentes L1 candidatas en lecturas cortas de Illumina (Métodos: Detección basada en etiquetas en Illumina). Al aplicar este método a 356 genomas de lectura corta de CRC, identificamos 851 transducciones somáticas. La mayoría de ellas (94%, 883/941) mostraron una característica de eventos de retrotransposición genuinos (duplicación del sitio diana, sitio de corte de la endonucleasa o una cola de poli(A)).

Con la detección basada en etiquetas, volvimos a encontrar que Xp22.2-1, 22q12.1-1 y 6p24.1-1 se encuentran entre los elementos más activos, lo que valida nuestros hallazgos en los datos de Nanopore. Al comparar la frecuencia relativa de la detección basada en etiquetas con Nanopore, detectamos consistentemente más transducciones en el conjunto de datos de Nanopore (Datos suplementarios S2), probablemente debido al enfoque muy específico del método basado en etiquetas. De las diez fuentes más activas, solo 12p13.32-1 mostró más actividad en la detección basada en etiquetas. Esto podría deberse, por ejemplo, a que estos elementos se activan en una etapa posterior y no se detectan con la cobertura moderada del secuenciamiento de Nanopore.

Para validar experimentalmente las transducciones, realizamos un secuenciamiento dirigido por PCR de 20 transducciones detectadas por Nanopore y 20 transducciones detectadas por el método basado en etiquetas (Métodos: PCR y secuenciación; Información suplementaria: Validación de transducciones dirigidas). Pudimos validar la presencia de inserción en 18 de 20 llamadas de Nanopore y en 13 de 20 llamadas de lectura corta basadas en etiquetas. La presencia de transducciones se validó para 18 de 18 y 8 de 11 inserciones (Datos suplementarios S5). Diez llamadas de Nanopore también se detectaron con xTea, sin embargo, se detectó que eran inserciones solo-L1. De estas, 10 de 10 se validaron para contener la transducción (Datos suplementarios S5). Se demostró que las transducciones detectadas por Nanopore son verdaderamente somáticas, ya que las muestras normales correspondientes no mostraron ninguna banda en condiciones similares. Una de las llamadas de Illumina mostró una banda tenue en la muestra normal, posiblemente como resultado de un mosaicismo somático o una contaminación (Datos suplementarios S3). Estos hallazgos respaldan que nuestras llamadas detectan eventos de transducción reales que, de otro modo, pasarían desapercibidos con la detección previa.

En conjunto, estos resultados indican que las transducciones cortas 3' acompañan con frecuencia a las inserciones somáticas de L1, pero se detectan sistemáticamente de forma insuficiente por los métodos actuales de análisis de secuenciación de lectura corta. Este sesgo técnico ha distorsionado previamente nuestra visión del panorama de los elementos L1 activos en los genomas del cáncer, favoreciendo los L1 que generan transducciones más largas y más fáciles de resolver.

La variación en la longitud de la inserción refleja el estado de inversión 5' y el origen de la línea germinal

Aprovechando las ventajas del secuenciamiento de lectura larga de Nanopore, investigamos cómo varía la longitud de la inserción de L1 en diferentes contextos biológicos y mecanicistas. Primero, evaluamos cómo la longitud de la inserción se relaciona con la clase de inserción (solo, emparejada, huérfana). Descubrimos que las transducciones emparejadas son las más largas (mediana: 445 pb), las transducciones huérfanas son las más cortas (mediana: 335 pb) y las solo-L1 (mediana: 390 pb) se encuentran en un punto intermedio (p < 4 × 10-4, prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis, Fig. 3a y Datos suplementarios S6), y se observa el mismo efecto en la línea germinal (medianas: 1520 pb, 968 pb, 1277 pb, respectivamente) (p = 0,017, Kruskal-Wallis, Fig. 3a), como se informó ^[16]. Además, las inserciones de la línea germinal son más largas en todas las clases de inserción (Fig. 3a). Para investigar si esta diferencia surge de elementos distintos que se activan en la línea germinal y en el soma, investigamos las longitudes dentro de las fuentes L1 que se activaron en ambas (produciendo más de 2 inserciones somáticas y de la línea germinal). Surge el mismo patrón dentro de todas las fuentes L1 (Fig. 3b), lo que sugiere que las inserciones de la línea germinal son más largas que las inserciones somáticas por razones que no se pueden explicar por las características de las fuentes L1 individuales.

Cuando se examinan las características de las inserciones en el contexto de sus fuentes L1, encontramos que las longitudes de inserción medianas difieren entre las inserciones de diferentes fuentes L1 (p = 0,01556, prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis, Tabla 1 y Datos suplementarios S4). Además de las longitudes de inserción, la tasa de inversiones 5' varía entre las fuentes L1 (Tabla 1 y Datos suplementarios S4). Para investigar el papel que tiene la secuencia de inserción en la formación de inversiones, analizamos los loci de los puntos de ruptura relacionados con la inversión dentro de la secuencia L1 (Métodos: Análisis de inversión). Los propios elementos L1 son propensos a las inversiones en múltiples loci, siendo el más prominente 250 pb aguas arriba de su extremo 3' (Fig. S4a). Esto apoya el hallazgo de que las inserciones con secuencia L1, las solo-L1 y las transducciones emparejadas, tienen una frecuencia más alta de inversiones (30%, 30%) que las transducciones huérfanas sin secuencia L1 (16%) (Datos suplementarios S7). Además, cuando las inserciones se dividen en función de sus fuentes L1, solo las fuentes con una alta tasa de inversión contienen grupos de puntos de ruptura en su secuencia transducida aguas abajo (Fig. S4b), lo que demuestra que las fuentes L1 con una alta tasa de inversión contienen sitios de inversión adicionales más allá de la secuencia L1 compartida.

Como se informó previamente ^[28], las inserciones con un evento de inversión 5' tienden a ser más largas que las inserciones sin una inversión. Al comparar las tasas de inversión para las fuentes L1 y sus longitudes medianas, surge una tendencia: cuanto mayor es la tasa de inversión 5', mayor es la longitud de inserción mediana (Tabla 1). El mismo efecto se puede observar con los tipos de inserción: la tasa de inversiones 5' sigue las longitudes medianas de las clases de inserción tanto en la línea germinal como en las inserciones somáticas (Datos suplementarios S7). Por lo tanto, cuando se tiene en cuenta la presencia de inversiones 5', las diferencias en la longitud de la inserción entre las clases de inserción y las fuentes L1 se vuelven menos pronunciadas (Fig. 3c). Además, la diferencia en las longitudes de inserción por fuente L1 se vuelve no significativa cuando se tiene en cuenta el efecto de las inversiones 5' (prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis, valores de p de 0,09871 y 0,3016; Datos suplementarios S4). Esto sugiere que dos componentes principales influyen en la longitud de la inserción: la presencia de una inversión 5' y el estado somático de la inserción.

Las transducciones a menudo terminan con señales de poliadenilación

La longitud de la transducción varía entre las diferentes fuentes L1 y a menudo se limita a valores distintos (Fig. 2b y Tabla 1). Para investigar los factores que contribuyen a esta variación en la longitud de la transducción, evaluamos el papel de la fuerza de la señal de poliadenilación (PAS) aguas abajo de las fuentes L1 activas. Se espera que los loci y la fuerza de la PAS influyan en la longitud de la transducción, con señales fuertes cerca del extremo 3' de las fuentes L1 que producen transducciones cortas.

Aplicamos un modelo de matriz de ponderación de posición ^[30] para cuantificar la fuerza de la PAS aguas abajo de cada fuente L1 (Métodos: Detección de poliadenilación; Datos suplementarios S8). Los motivos de PAS canónicos suelen estar ubicados entre 10 y 30 pb aguas arriba de los sitios de terminación de la transcripción ^[11], y, en consecuencia, para 274 de 349 (79%) de los puntos finales de transducción, una PAS (puntuación > 8,1) ocurrió dentro de esta ventana. Por ejemplo, la PAS canónica 9 pb aguas abajo de Xp22.2-1 terminó 68 de 72 transducciones que surgieron del L1 (Fig. 4a). Sin embargo, no todos los puntos de terminación frecuentes coincidieron con una PAS fuerte, e identificamos dos patrones anormales asociados con la terminación de la transducción. Primero, varios puntos finales recurrentes en 6p24.1-1 carecían de un motivo de PAS de alta puntuación cerca del límite de inserción (Fig. 4a), lo que sugiere que la terminación de la transcripción puede ocurrir en ausencia de una PAS fuerte. En segundo lugar, con la fuente L1 22q12.1-1, la transcripción a menudo evita la PAS canónica interna y termina más abajo en un sitio de menor puntuación (Fig. 4a y Fig. S5), lo que indica que las PAS canónicas no necesariamente actúan como señales de terminación efectivas. Existen más ejemplos de estos patrones para otras fuentes L1 (Fig. S5).

Para comprender si la fuerza de la PAS dentro de la fuente L1 afecta a que los L1 produzcan transducciones, calculamos la fuerza de la PAS dentro de los elementos L1HS de referencia. Los elementos transduccionalmente activos se enriquecieron tanto para PAS débiles como fuertes (Fig. 4b). Si bien los elementos inactivos contenían principalmente la PAS canónica (84%, 247/294), el 4% de los elementos inactivos (12/294) albergaban solo una PAS débil (puntuación < 8), lo que sugiere una predisposición potencial para generar transducciones si estuvieran transcripcionalmente activos.

Estos hallazgos indican que la arquitectura de la PAS contribuye a la longitud de la transducción y a la elección del sitio de terminación ^[31], sin embargo, la terminación de la transcripción no está determinada únicamente por la fuerza de la PAS y puede implicar características de secuencia o estructurales adicionales.

Los eventos de transducción atípicos y multigeneracionales complican el panorama de la transducción

El secuenciamiento de Nanopore proporciona acceso a las secuencias internas de las inserciones. Al crear anotaciones detalladas de ellas, pudimos identificar casos inusuales de eventos de transducción. Presentamos cuatro fuentes L1, con características únicas que muestran la complejidad de las transducciones y complican su detección.

En primer lugar, identificamos una cascada de transducción L1 multigeneracional: un L1 de referencia en chrX: 1193529-1194131 que da lugar a una inserción de la línea germinal en chr15: 84597670, que contiene una secuencia de transducción 3' identificable. Esta inserción de la línea germinal se movilizó posteriormente en el soma, generando una inserción somática en chr11: 2170882 que retuvo la etiqueta 3' original del L1 de referencia, así como una segunda etiqueta de transducción del intermedio de la inserción de la línea germinal.

El segundo evento de transducción inusual es una inserción somática de longitud completa 6p12.3-1. Las inserciones somáticas de longitud completa (> 5990 pb) son eventos raros, ya que informamos 5 de ellos, que constituyen el 0,3% de todos los L1 somáticos (5/1531). Uno de ellos, la inserción en 6p12.3-1, dio lugar a cinco inserciones somáticas aguas abajo en el tumor correspondiente, siendo responsable de 5 de 68 de las inserciones somáticas en la muestra. Junto con los ejemplos informados previamente ^[9], ^[22], esto demuestra cómo los nuevos elementos de longitud completa tienen capacidades de inserción que pueden tener un potencial efecto en cascada en el tumor.

En tercer lugar, identificamos cuatro inserciones somáticas derivadas del elemento L1 en 9q31.3-1, todas terminadas en la misma ubicación genómica: chr9: 108,805,090 (GRCh38), que corresponde a una PAS en un elemento L1 truncado situado a unos 2,4 kb aguas abajo de la fuente L1. Si bien estas inserciones incluían la secuencia L1 del elemento L1 truncado aguas abajo, no incluían ninguna secuencia del L1 fuente original 9q31.3-1 y, por lo tanto, se clasificaron como transducciones huérfanas.

El cuarto caso identificado es un grupo de L1s que denominamos elementos proxy. Son elementos L1 truncados en el genoma de referencia que contienen secuencias transducidas de su fuente original, la cual a su vez está ausente del genoma de referencia. Por lo tanto, la nueva progenie del L1 original estará vinculada al elemento truncado, ya que el proxy contiene la secuencia L1 además de la secuencia transducida para el alineamiento. Identificamos dos elementos proxy en el genoma de referencia GRCh38 (Suplemento: Proxies de referencia para elementos L1 polimórficos) que inicialmente se asociaron con transducciones detectadas mediante secuenciación de nanoporos. Sin embargo, la identificación de elementos proxy permitió la correcta reasignación de estas transducciones a sus fuentes originales. En total, 83 inserciones somáticas fueron reasignadas debido a los proxies.

Elementos como el L1 9q31.3-1 y los elementos proxy son ejemplos de la compleja naturaleza de la retrotransposición, lo que dificulta la identificación de las fuentes activas. Están vinculados a elementos truncados en lugar de a sus fuentes originales y, por lo tanto, podrían descartarse. Su presencia destaca los beneficios de la secuenciación de lecturas largas, que ofrece la oportunidad de asignar inserciones más complejas a sus L1s de origen.

La hipometilación del promotor L1 se asocia con la actividad de transducción en diferentes loci y tejidos

Los promotores L1 suelen estar metilados en las células normales^[32], pero se sabe que experimentan hipometilación en varios cánceres, incluido el CRC^[33],^[34]. Además, la metilación del promotor L1 de origen se ha asociado con su actividad en líneas celulares^[16],^[20], lo que nos llevó a investigar si la metilación del promotor L1 se correlaciona con la actividad de transducción somática de L1 en el CRC. Para abordar esto, utilizamos la secuenciación de lecturas largas de nanoporos para cuantificar los niveles de metilación del promotor de los L1s de origen de referencia en tumores de CRC y tejidos normales.

Caracterizamos los patrones de metilación de diferentes elementos L1 de origen utilizando la secuenciación de nanoporos (Métodos: Análisis de la metilación del ADN). La visualización de los patrones de metilación alrededor de dos elementos L1 de referencia activos (22q12.1-1, Xp22.2-1) reveló una clara disminución de los valores de metilación en el área que precede y se superpone al elemento L1 tanto en los tumores de CRC como en el colon normal (Fig. 5a, b y Fig. S6 del material suplementario), en concordancia con la literatura previa^[16]. La disminución más significativa se observó en las muestras de tumores de CRC, especialmente en las muestras que mostraron actividad de transducción (Fig. 5a, b). El elemento ligado al cromosoma X, Xp22.2-1, también reveló diferencias específicas del sexo: las muestras de CRC masculinas con transducciones mostraron una reducción notable en la metilación del promotor. Por otro lado, las mujeres tienen dos copias de los cromosomas X, pero debido a la compensación de la dosis, una copia del cromosoma se silencia durante el desarrollo temprano. La señal de metilación en Xp22.2-1 se atenuó en las mujeres, probablemente disminuyendo solo en la copia activa del cromosoma X, lo que debilitó la señal (Fig. S7 del material suplementario).

Para generalizar la conexión entre la metilación de L1 y la actividad de transducción, calculamos los valores promedio de metilación para 100 pares de bases aguas arriba y aguas abajo de los extremos 5' de L1HS. Como caso de estudio, utilizamos un L1 de origen con actividad en la mayoría de las muestras, 22q12.1-1, y comparamos el número de transducciones en las muestras con la metilación promedio del L1 de origen. Las muestras con transducciones mostraron una metilación promedio más baja que aquellas sin transducciones, aunque hubo variación entre las muestras negativas para la transducción (Fig. 5c) (r = 0,274, IC del 95% [–0,501, 0,012], p = 0,041). Al ampliar este análisis a todos los L1s de origen fijos con cobertura suficiente (75% de las muestras de CRC; n = 14), encontramos que los niveles de metilación eran significativamente más bajos en las muestras con actividad de transducción detectable en comparación con aquellas sin ella (p = 0,0044, IC del 95% [–16,5, –3,23], prueba t de Welch; Fig. 5d). Estos resultados respaldan la relación entre la hipometilación local del promotor y la activación del L1 de origen.

Dado que se ha demostrado que la metilación del elemento de origen se correlaciona con la actividad de transducción en el CRC, ampliamos el análisis para incluir otros tejidos como conjuntos de control: colon normal, leiomioma uterino (LU) y miometrio. Clasificamos los L1s de origen según su actividad observada en el CRC: activo (>3 muestras de CRC con transducción positiva), baja actividad (1-2 muestras) o inactivo (sin transducciones somáticas). Las muestras de CRC mostraron los niveles de metilación de L1 más bajos en comparación con otros tipos de tejidos. Los valores promedio de metilación para los elementos L1 con transducciones fueron más bajos en comparación con los valores de metilación recopilados de los elementos inactivos (Fig. 5e). Inesperadamente, las diferencias de metilación entre los elementos L1 activos e inactivos no solo se observaron en el CRC, sino que también estuvieron presentes en todos los tipos de tejidos estudiados. Sin embargo, las diferencias en otros tejidos no fueron tan drásticas como en el CRC.

Finalmente, examinamos un subconjunto de elementos L1 inactivos con bajas puntuaciones PAS (3 muestras de CRC positivas para la transducción), baja actividad (1-2 muestras) o inactivo (sin transducciones somáticas). Las muestras de CRC mostraron los niveles de metilación de L1 más bajos en comparación con otros tipos de tejidos. Los valores promedio de metilación para los elementos L1 con transducciones fueron más bajos en comparación con los valores de metilación recopilados de los elementos inactivos (Fig. 5e). Inesperadamente, las diferencias entre los elementos L1 activos e inactivos no solo se observaron en el CRC, sino que también estuvieron presentes en todos los tipos de tejidos estudiados. Sin embargo, las diferencias en otros tejidos no fueron tan drásticas como en el CRC.

Finalmente, examinamos un subconjunto de elementos L1 inactivos con bajas puntuaciones PAS (