El cáncer rectal con capacidad de reparación de desajustes funcional (pMMR RC) se caracteriza por opciones terapéuticas limitadas y un pronóstico desfavorable, atribuibles en gran medida a la complejidad del microambiente inmunológico tumoral. Las estructuras linfoidas tisulares (TLS), que son agregados linfoidos ectópicos que se desarrollan dentro de los tumores, constituyen un componente crucial de este microambiente y han mostrado una significativa relevancia pronóstica.
Sin embargo, la heterogeneidad en la maduración de subtipos de TLS dentro del microambiente inmunológico tumoral, así como sus asociaciones con características clínico-patológicas y resultados para el paciente, permanecen mal definidas.
Este estudio tuvo como objetivo caracterizar de manera exhaustiva los patrones de distribución espacial y la relevancia pronóstica de subtipos de TLS en pacientes con pMMR RC. Analizamos retrospectivamente secciones de tejido de 155 pacientes con pMMR RC que habían sometido a resección radical. Los subtipos de maduración de TLS fueron identificados mediante tinción hematoxilina-eosina e inmunohistoquímica, con su distribución espacial cuantificada y asociada al pronóstico. El número de todos los subtipos de maduración de TLS en el margen invasivo fue significativamente mayor que en la región central del tumor (margen invasivo vs región central del tumor, P
El cáncer de recto (CR) sigue siendo una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo, y sus tasas de incidencia y mortalidad muestran una tendencia ascendente persistente [[1]]. Aunque se han logrado avances significativos con los tratamientos estándar, como la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia, los resultados de los pacientes con CR siguen siendo subóptimos [[1–3]], lo que subraya la urgente necesidad de estrategias terapéuticas innovadoras y más eficaces.
En los últimos años, la terapia de bloqueo de puntos de control inmunitario (ICB) ha logrado un notable éxito clínico en varios tumores sólidos, incluido el CR. Sin embargo, la mayoría de los casos de CR son de reparación deficiente del emparejamiento (pMMR), lo que limita su respuesta al ICB y produce malos resultados clínicos. Cada vez hay más evidencia que sugiere que esta resistencia terapéutica puede deberse, en parte, a una infiltración insuficiente de células inmunitarias en el microambiente tumoral [[3]]. Las estructuras linfoides terciarias (TLS), que son agregados linfoides ectópicos que se forman en tejidos no linfoides bajo estímulos inflamatorios crónicos (por ejemplo, trastornos autoinmunitarios, infecciones persistentes y neoplasias), representan un proceso linfangiogénico impulsado por la exposición sostenida a señales inflamatorias mediadas por quimioquinas y citocinas [[4], [5]]. Como componente crítico del microambiente tumoral, las TLS se han relacionado fuertemente con las respuestas inmunitarias antitumorales, la eficacia de la inmunoterapia y los resultados de los pacientes [[6–8]]. En particular, la evidencia emergente sugiere diferencias significativas en la composición de las TLS entre los pacientes que responden y los que no responden al ICB [[8]], lo que sugiere su potencial como biomarcadores predictivos de la respuesta al tratamiento. Además, las TLS presentan estados de maduración heterogéneos dentro de los tumores, y su gradiente de maduración ha surgido como un determinante crítico del pronóstico del paciente [[6]]. Esta asociación se ha validado en varias neoplasias, incluido el melanoma, el carcinoma de células renales claras, el cáncer de vejiga y el carcinoma de células escamosas de pulmón [[9–14]]. No obstante, la organización espacial y la heterogeneidad de la maduración de las TLS dentro del microambiente inmunitario del CR pMMR, así como su relevancia clínica, siguen estando poco caracterizadas.
Para abordar esta laguna, caracterizamos sistemáticamente la distribución espacial y los estados de maduración de las TLS en el microambiente del CR pMMR mediante inmunohistoquímica y evaluamos sus asociaciones con las características clinicopatológicas y el pronóstico. Estos hallazgos pueden proporcionar nuevos conocimientos sobre la arquitectura inmune tumoral e identificar posibles dianas inmunomoduladoras para optimizar las estrategias terapéuticas en el CR pMMR.
Materiales y métodos
Pacientes y base de datos
En este estudio, se recopilaron datos clinicopatológicos y muestras conservadas en parafina de 155 pacientes con CR pMMR confirmado por patología que se sometieron a resección quirúrgica radical en el Sexto Hospital Afiliado de la Universidad de Sun Yat-sen (Guangzhou, China) entre enero de 2016 y diciembre de 2018. Todos los pacientes estaban libres de metástasis a distancia y no habían recibido previamente radioterapia, terapia dirigida o inmunoterapia. Los parámetros clínicos y patológicos se extrajeron de los registros médicos y de patología. El diagnóstico patológico se basó en la Clasificación de Tumores del Sistema Digestivo de la Organización Mundial de la Salud (OMS), 5.ª edición [[15]]. El estadio tumoral se clasificó según el Manual de estadificación del Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer/Unión Internacional Contra el Cáncer (AJCC/UICC) (8.ª edición) [[16]]. Los datos clínicos y patológicos incluyeron la edad, el tamaño del tumor, el sexo, la invasión linfovascular (LVI), la invasión perineural (PNI), la diferenciación tumoral, la gemación tumoral, la quimioterapia adyuvante, la preservación del esfínter, el estadio patológico tumoral (pT), el estadio patológico de los ganglios (pN) y el sistema de estadificación patológico del tumor, los ganglios y las metástasis (pTNM) (Tabla 1).
Tinción inmunohistoquímica
Los bloques de tejido fijados en formalina y conservados en parafina se cortaron en secciones de 4 μm de espesor y se montaron en portaobjetos de vidrio recubiertos de silano, se desparafinaron en xileno y se rehidrataron en etanol graduado (100 %, 95 %, 90 %, 80 % y 70 %; 2 minutos cada uno). La recuperación del antígeno se realizó en un tampón de citrato (pH 6,0) durante 8 minutos, seguido de peróxido de hidrógeno al 3 % durante 20 minutos para eliminar la actividad de la peroxidasa endógena y el bloqueo de proteínas en suero libre durante 30 minutos. Posteriormente, las secciones se incubaron con anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche, seguido de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante a temperatura ambiente durante 1 hora. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology, China): anti-CD3 (#ZA-0503), anti-CD19 (#ZM-0038), anti-CD21 (#ZA-0525) y anti-Bcl6 (#ZM-0011). Se utilizó 3,3'-diaminobencidina para la visualización, produciendo señales cromogénicas marrones. Las láminas se contrateñeron con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron. Todas las láminas teñidas se escanearon y se digitalizaron utilizando un escáner de alta resolución (Shengqiang SQS-120P, Shenzhen, China).
Definición de la división de la región tumoral
El número de fenotipos de TLS se cuantificó en distintas regiones anatómicas según el protocolo estandarizado del Grupo de Trabajo Internacional sobre Linfocitos Infiltrantes Tumorales [[17]]. El área tumoral se dividió sistemáticamente en dos compartimentos histológicos: el tumor central (CT) y el borde invasor (IM), siguiendo las directrices establecidas (Figura suplementaria S1).
Definición y detección de TLS
Se identificaron tres fenotipos de maduración de TLS: TLS tempranos (E-TLS), TLS similares a folículos primarios (PFL-TLS) y TLS similares a folículos secundarios (SFL-TLS) (Figura suplementaria S2) [[18], [19]]. La detección de TLS se realizó en tres pasos. En primer lugar, se identificaron todos los agregados linfocíticos dentro del tejido tumoral. La tinción inmunohistoquímica para CD19 y CD3 distinguió los E-TLS de los grupos de células linfocíticas inespecíficos. Se excluyeron los TLS si solo estaban presentes grupos de células CD19+ o CD3+ sin colocalización. Los grupos de células de forma redondeada ayudaron a diferenciar los E-TLS de los PFL-TLS/SFL-TLS. Posteriormente, la tinción con Bcl6 y CD21 identificó los centros germinales maduros característicos de los SFL-TLS, lo que los distinguió de los PFL-TLS. Tras esta exhaustiva caracterización morfológica e inmunohistoquímica, el número de TLS por sección de tejido se cuantificó manualmente por dos patólogos independientes. Bcl6, un regulador clave de la maduración de las células B [[20]], y CD21, un marcador de la diferenciación de las células plasmáticas en los centros germinales [[21]], sirvieron como indicadores definitorios para la clasificación de TLS.
Identificación y cuantificación de la gemación tumoral
La gemación tumoral (TB) se definió como la presencia de una sola célula tumoral o un grupo de hasta cuatro células tumorales en el IM del cáncer colorrectal. La cuantificación siguió las recomendaciones de la Conferencia Internacional sobre la Gemación Tumoral de 2016 [[22]]. Se seleccionó un campo de "punto caliente" (0,785 mm2) en el frente invasor y la TB se clasificó como baja (Bd1, 0-4 brotes/0,785 mm2), intermedia (Bd2, 5-9 brotes/0,785 mm2) y alta (Bd3, ≥ 10 brotes/0,785 mm2).
Análisis estadístico
Se registraron y analizaron sistemáticamente las características clinicopatológicas. Con fines analíticos, la variable continua de la edad se dicotomizó en la mediana. Las variables categóricas se expresan como frecuencias o porcentajes y se compararon utilizando las pruebas de chi-cuadrado de Pearson o las pruebas de chi-cuadrado de Yates con corrección de continuidad. La normalidad de los datos se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk; se aplicaron las pruebas de Mann-Whitney U para las variables continuas que no seguían una distribución normal. Los pacientes se estratificaron en grupos negativos y positivos para TLS. Se utilizó el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para evaluar la supervivencia, con pruebas de rango logarítmico para las comparaciones univariadas. Las variables con P < 0,05 se incluyeron en los modelos de riesgos proporcionales de Cox para el análisis multivariado con el fin de identificar los factores pronósticos independientes. El análisis estadístico y las representaciones gráficas se realizaron utilizando GraphPad Prism (versión 8.0) y el software IBM SPSS (versión 22.0). Se fijó un nivel de significación estadística bilateral de P < 0,05.
La gemación tumoral (GT) se definió como la presencia de una única célula tumoral o un grupo de hasta cuatro células tumorales en el margen de invasión (MI) del cáncer colorrectal. La cuantificación siguió las recomendaciones de la Conferencia Internacional sobre el Consenso de la Gemación Tumoral de 2016 [[22]]. Se seleccionó un campo de “punto caliente” (0,785 mm²) en el frente invasor y la GT se clasificó como baja (Bd1, 0–4 gemaciones/0,785 mm²), intermedia (Bd2, 5–9 gemaciones/0,785 mm²) y alta (Bd3, ≥10 gemaciones/0,785 mm²).
Análisis estadístico
Las características clinicopatológicas se registraron y analizaron sistemáticamente. Para fines analíticos, la variable continua de la edad se dicotomizó en la mediana. Las variables categóricas se expresan como frecuencias o porcentajes y se compararon mediante las pruebas de chi-cuadrado de Pearson o chi-cuadrado de Yates con corrección de continuidad. La normalidad de los datos se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk; se aplicaron las pruebas de Mann-Whitney U para las variables continuas que no presentaban una distribución normal. Los pacientes se estratificaron en grupos TLS-negativos y TLS-positivos. Se utilizó el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para evaluar la supervivencia, con pruebas de rango logarítmico para las comparaciones univariadas. Las variables con P < 0,05 se incluyeron en modelos de riesgos proporcionales de Cox para el análisis multivariado con el fin de identificar factores pronósticos independientes. El análisis estadístico y las representaciones gráficas se realizaron utilizando el software GraphPad Prism (versión 8.0) y IBM SPSS (versión 22.0). La significación estadística bilateral se estableció en P < 0,05.
Resultados
Características de los pacientes
Este estudio incluyó a 155 pacientes con cáncer colorrectal pMMR. De ellos, 94 (60,6 %) eran hombres, 73 (47,1 %) tenían >61 años y 60 (38,7 %) presentaban tumores primarios >3,5 cm de tamaño. Todos los pacientes fueron diagnosticados patológicamente con adenocarcinoma, incluyendo 13 (8,4 %) poco diferenciados, 20 (12,9 %) bien diferenciados y 122 (78,7 %) moderadamente diferenciados. Se observó invasión linfovascular (ILV) y perineural (IPN) en 19 (12,3 %) y 14 (9,0 %) pacientes, respectivamente. En cuanto al estadio tumoral, 27 pacientes (17,4 %) se clasificaron como pT1-2 y 128 (82,6 %) como pT3-4. Se detectó metástasis en los ganglios linfáticos en 71 pacientes (45,8 %). Según la 8ª edición de la AJCC, 21 (13,5 %) estaban en estadio I, 63 (40,6 %) en estadio II y 71 (45,8 %) en estadio III. Para la evaluación de la GT, 109 pacientes (70,3 %) presentaban un grado bajo o intermedio (Bd1-2), mientras que 46 (29,7 %) presentaban un grado alto (Bd3). Se administró quimioterapia adyuvante a 84 pacientes (54,2 %), mientras que 71 (45,8 %) no recibieron quimioterapia postoperatoria. Se realizó con éxito una cirugía conservadora del esfínter en 133 pacientes (85,8 %) (Tabla 1).
Las características únicas de la distribución espacial de los TLS en el cáncer colorrectal pMMR
Se observó un número significativamente mayor de TLS totales en la región del MI que en la región del CT (P < 0,001) (Figura 1A). Para determinar si este sesgo espacial se aplicaba a los diferentes subtipos de maduración, se realizaron análisis inmunohistoquímicos exhaustivos. De manera consistente, el número de TLS en etapa temprana (E-TLS), TLS proliferativos linfocíticos (PFL-TLS) y TLS en etapa folicular (SFL-TLS) fue significativamente mayor en la región del MI que en la región del CT (P < 0,001, 61 años y 60 (38,7 %) presentaban tumores primarios >3,5 cm de tamaño. Todos los pacientes fueron diagnosticados patológicamente con adenocarcinoma, incluyendo 13 (8,4 %) poco diferenciados, 20 (12,9 %) bien diferenciados y 122 (78,7 %) moderadamente diferenciados. Se observó ILV e IPN en 19 (12,3 %) y 14 (9,0 %) pacientes, respectivamente. En cuanto al estadio tumoral, 27 pacientes (17,4 %) se clasificaron como pT1-2 y 128 (82,6 %) como pT3-4. Se detectó metástasis en los ganglios linfáticos en 71 pacientes (45,8 %). Según la 8ª edición de la AJCC, 21 (13,5 %) estaban en estadio I, 63 (40,6 %) en estadio II y 71 (45,8 %) en estadio III. Para la evaluación de la GT, 109 pacientes (70,3 %) presentaban un grado bajo o intermedio (Bd1-2), mientras que 46 (29,7 %) presentaban un grado alto (Bd3). Se administró quimioterapia adyuvante a 84 pacientes (54,2 %), mientras que 71 (45,8 %) no recibieron quimioterapia postoperatoria. Se realizó con éxito una cirugía conservadora del esfínter en 133 pacientes (85,8 %) (Tabla 1).
Las características únicas de la distribución espacial de los TLS en el cáncer colorrectal pMMR
Se observó un número significativamente mayor de TLS totales en la región del MI que en la región del CT (P < 0,001) (Figura 1A). Para determinar si este sesgo espacial se aplicaba a los diferentes subtipos de maduración, se realizaron análisis inmunohistoquímicos exhaustivos. De manera consistente, el número de E-TLS, PFL-TLS y SFL-TLS fue significativamente mayor en la región del MI que en la región del CT (P < 0,001,
¡Aún no hay comentarios. Sé el primero en comentar!