Caracterización funcional de CASP, una isoforma de CUX1, que revela su papel promotor de tumores en cáncer colorrectal a través de señalización mediada por TRIM21.

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer tumor maligno más común a nivel mundial y ocupa el segundo lugar en términos de mortalidad.^[1] Su incidencia ha disminuido en los países de altos ingresos, en gran medida debido a programas de detección eficaces, mientras que ha aumentado, especialmente en los países desarrollados.^[2],^[3] A diferencia de otros tumores, el CCR es uno de los pocos cánceres que experimenta una transformación maligna de adenoma a carcinoma en un período de aproximadamente 5 a 10 años. Para identificar posibles dianas terapéuticas que permitan comprender y alterar los procesos oncogénicos, nuestro estudio previo reveló las firmas proteicas en el panorama tisular del CCR, que evoluciona desde el colon normal hasta pólipos hiperplásicos, adenomas, adenocarcinoma no especificado (AC) o adenocarcinoma mucinoso (MC) mediante espectrometría de masas de tipo "shotgun" y adquisición independiente de datos (DIA).^[4] Sin embargo, el análisis se limitó a la expresión proteica, sin incorporar los datos con factores pronósticos u otras variables relevantes. Por lo tanto, es imprescindible identificar nuevos biomarcadores que presenten tanto expresión ectópica como correlación con la supervivencia de los pacientes.

Reinvestigamos los datos de expresión proteica utilizando una versión actualizada del software DIA-NN.^[4],^[5] A través de recursos de datos y análisis bioinformáticos en TCGA, el producto de corte alternativo (CASP) resultó ser de particular interés entre las 21 proteínas identificadas que se asocian con el pronóstico de los pacientes. Además, a diferencia de su conocido gen parental, CUT-like homeobox 1 (CUX1_), el producto proteico de esta variante de corte es una proteína poco estudiada, con un papel apenas caracterizado, y pocos estudios publicados hasta la fecha.^[6],^[7]

Antes de la transcripción y el corte alternativo para generar CASP, CUX1, el homólogo mamífero del gen Drosophila cut, se identificó a partir de la purificación de la proteína de desplazamiento de CCAAT (CDP) y también se conoce como CDP/CUT o CUT-like1 (CUTL1).^[8]
CUX1 es un factor de transcripción expresado de forma ubicua que se asocia con la proliferación, diferenciación, migración, invasión y respuesta al daño del ADN.^[9],^[10] Cabe destacar que CUX1 tiene un papel paradójico, tanto como supresor tumoral como oncogén, dependiendo de las isoformas en determinadas circunstancias.^[11] Estas isoformas incluyen un dominio homeodominio único y diferentes repeticiones del dominio de unión al ADN. El ARNm de longitud completa genera una proteína con un peso molecular de 200 kDa durante la traducción (p200 CUX1), mientras que el ARNm más corto genera una proteína con un peso molecular de 75 kDa (p75 CUX1) durante la traducción posterior, y p200 CUX1 produce una proteína con un peso molecular de 110 kDa (p110 CUX1) bajo la hidrólisis de la enzima proteolítica L.^[12] Sin embargo, el producto de corte alternativo (CASP), que se corta entre el exón 14 y el 25 y termina en el exón 33, es una excepción (Figura S1). CASP solo tiene una región C-terminal única y una región conservada evolutivamente de hélice alfa.^[7] Al carecer de los cuatro dominios de unión al ADN conocidos en CUX1, se informó que se localiza subcelularmente en el aparato de Golgi sin una función conocida.^[6] Esta pequeña proteína poco estudiada despertó nuestro interés en el cáncer.

Este estudio identifica CASP, una variante de corte localizada en el Golgi de CUX1, que se encuentra específicamente sobreexpresada en adenomas y carcinomas colorrectales. El silenciamiento de CASP inhibió la proliferación y la migración de las células de CCR, mientras que la expresión de CASP promovió significativamente la proliferación y la migración de las células de CCR in vitro e in vivo. Mecánicamente, se demostró que CASP regula negativamente los niveles de proteína de la ligasa de ubiquitina E3 que contiene el motivo de tripleta 21 (TRIM21) y modula positivamente la vía MAPK.^[13],^[14] Además, el análisis clinicopatológico reveló una correlación entre la expresión de CASP y la reparación de errores de emparejamiento (MMR)/inestabilidad de microsatélites (MSI) o la funcionalidad de la mutación de TP53, con una menor expresión de CASP observada en muestras deficientes en MMR o con TP53 de tipo salvaje. Estos hallazgos destacan a CASP como una posible proteína oncogénica y sugieren que el direccionamiento de la progresión tumoral mediada por CASP podría ser una estrategia terapéutica prometedora.

Resultados

Alteración de la expresión de CASP en pacientes con CCR

Los datos brutos de la proteómica adquiridos mediante DIA se conservan de forma permanente, como las huellas dactilares. A medida que el software de análisis de datos o las bibliotecas avanzan, el reanálisis de estos conjuntos de datos puede generar información adicional. Utilizando DIA-NN, reanalizamos los perfiles proteómicos de muestras de tejido fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE) de pacientes con pólipos hiperplásicos (n = 18), adenomas (n = 22) y CCR (n = 30), y márgenes negativos normales (n = 20) como controles, de nuestro estudio previo para identificar proteínas expresadas de forma diferencial que estén implicadas en la progresión del cáncer. Al intersectar las proteínas expresadas de forma diferencial entre los tejidos normales y los adenomas (Figura S2A) y los tejidos normales y el CCR (Figura S2B), identificamos 248 proteínas superpuestas (Figura 1A).

Para investigar más a fondo sus posibles funciones en el CCR, evaluamos la importancia pronóstica de sus genes correspondientes utilizando la base de datos TCGA, lo que reveló 21 genes desregulados que se asociaron significativamente con el pronóstico. En particular, el gen CUX1 despertó interés (Figura 1A). Sin embargo, en nuestra matriz proteómica, este gen corresponde al transcrito de corte alternativo CASP, que mostró una expresión elevada en los tejidos de adenoma y cáncer de colon (Figura 1B). Para investigar más a fondo la expresión de CASP en el CCR, analizamos sus niveles transcripcionales basándonos en la sonda específica de CASP 202367at en los tejidos intestinales normales (n = 54), pólipos (n = 48), tejidos de CCR (n = 185), metástasis hepáticas (n = 46) y metástasis pulmonares (n = 20) del conjunto de datos GSE41258. La expresión de CASP se elevó significativamente en los tejidos de CCR en comparación con los tejidos normales, con una expresión aún mayor en las metástasis hepáticas del CCR (Figura 1C). Posteriormente, se realizó inmunoblotting en seis pares de tejidos de CCR recién congelados y sus márgenes quirúrgicos normales correspondientes, lo que reveló una sobreexpresión significativa de CASP en los tejidos de CCR en comparación con los tejidos normales emparejados (Figuras S2D y S2E). De manera similar, la expresión de CASP se elevó notablemente en las líneas celulares de CCR en comparación con la línea celular de epitelio intestinal normal NCM460 (Figuras 1D y 1E). Un análisis adicional mediante inmunohistoquímica (IHQ) de muestras derivadas de pacientes (n = 108) y muestras de colon normales emparejadas (n_ = 108) en dos matrices de tejidos (TMA) verificó que la expresión de la proteína CASP era significativamente mayor en los tejidos de CCR que en los tejidos normales, después de excluir las muestras con tejidos faltantes (un tumor y 20 muestras normales) (Figura 1F).

Además, basándose en los resultados de la IHQ, las muestras de CCR con puntuaciones de 9 o 12 se clasificaron como de alta expresión (n = 30), mientras que las que tenían puntuaciones de 0 a 4 se clasificaron como de baja expresión (n = 23). CASP mostró una tendencia a una mayor expresión en el grupo con MMR competente, con una menor expresión en el grupo con MMR deficiente, que también exhibió una diferenciación más pobre (Tabla 1). Sin embargo, la expresión de CASP no se correlacionó significativamente con la edad, el sexo, la ubicación del tumor, el tamaño del tumor, el estadio TNM, la producción de moco, la invasión vascular o la invasión perineural (Tabla 1). Para confirmar aún más la correlación entre la expresión de CASP, el estado de MSI y otros parámetros clínicos, analizamos los conjuntos de datos GSE41258 y GSE39582. Los resultados demostraron de forma consistente una reducción de la expresión de CASP en las muestras deficientes en MMR en ambos conjuntos de datos (Figura 1G, superior). Además, la expresión de CASP se asoció con las mutaciones de TP53, mostrando niveles más altos en las muestras con TP53 mutado (Figura 1G, inferior). Dado la fuerte correlación entre CASP y el estado de MSI/MMR en los conjuntos de datos GSE41258 y GSE39582, exploramos más a fondo el panorama inmunitario estratificando a los pacientes en grupos de CASP alto y CASP bajo basándonos en la sonda específica de CASP (202367_at). Utilizando tanto los algoritmos xCell como CIBERSORT, observamos distintos patrones de infiltración inmunitaria asociados con la expresión de CASP.

Específicamente, el grupo de CASP bajo exhibió puntuaciones inmunitarias y ambientales significativamente más altas, así como un aumento de la infiltración de macrófagos M1 en ambos grupos. En conjunto, estos análisis indican que la disminución de CASP se relaciona con un microambiente tumoral inflamado en el CCR (Figura S3). Para aclarar aún más la asociación entre la transcripción de CASP y el pronóstico, analizamos la sonda específica de CASP 202367_at en la base de datos GEO (GSE41258 y GSE14333). Una alta expresión de CASP se asoció con una menor supervivencia general (Figura 1H) o supervivencia libre de enfermedad (Figura 1I) en los pacientes con CCR. Por lo tanto, nuestros análisis indican que la expresión ectópica de CASP se asocia con el CCR y se correlaciona con la supervivencia del paciente en ciertos grupos.

CASP promovió la proliferación del CCR tanto in vitro como in vivo

Para explorar la función biológica de CASP en el CCR, primero examinamos su localización subcelular, confirmando informes anteriores de que se encontraba predominantemente en el aparato de Golgi (Figura 1J). Luego, utilizamos la línea celular de CCR HCT116 para estudios de ganancia de función y DLD-1, LoVo y HT-29 para estudios de pérdida de función según los niveles basales de CASP (Figuras 2A y S4A). La sobreexpresión de CASP en HCT116 mejoró la proliferación (Figura 2B) y aumentó tanto el número como el tamaño de las colonias en comparación con el control (Figura 2C). Por el contrario, la inhibición de CASP en las células DLD-1, LoVo y HT29 redujo notablemente su capacidad de formación de colonias y su capacidad proliferativa (Figuras 2B y 2C). Cabe destacar que, tras reintroducir la expresión de CASP, la proliferación se restauró y aumentó con niveles elevados de CASP en DLD-1 (Figura 2D).

A continuación, investigamos el papel de CASP en la proliferación del CCR in vivo utilizando un modelo de xenoinjerto con células con CASP silenciado (CASP-KD) y células de control inyectadas por vía subcutánea en ratones desnudos. Coherente con los resultados in vitro, las células DLD-1 (Figura 2E) y LoVo (Figura S4B) con baja expresión de CASP exhibieron tasas de crecimiento tumoral reducidas. Los volúmenes tumorales en el grupo CASP-KD fueron significativamente menores en comparación con los controles (Figura 2E, superior). Además, la proporción de células positivas para Ki67 fue significativamente menor en el grupo CASP-KD que en el control revuelto (Figura 2E, inferior). En conjunto, estos resultados sugieren que CASP promueve la proliferación del CCR tanto in vitro como in vivo.

Para dilucidar aún más el papel regulador de CASP en la proliferación del CCR, se realizó un análisis del ciclo celular en las células de CCR con CASP silenciado. La citometría de flujo reveló que el silenciamiento de CASP en las células DLD-1 y LoVo aumentó significativamente la proporción de células en la fase G1, al tiempo que disminuía la proporción de células en la fase S, lo que indica un arresto en la fase G1 y una inhibición de la proliferación celular (Figura 2F).

Un análisis adicional mediante Western blot (WB) mostró que el silenciamiento de CASP condujo a una disminución de los niveles de proteína de c-Myc y ciclina D1, dos reguladores clave de la progresión del ciclo celular, junto con un aumento de p21, un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclinas. Estos cambios moleculares se alinearon con los efectos fenotípicos observados debido a la desregulación de CASP en la proliferación celular (Figura 2G). Por lo tanto, estos hallazgos respaldan colectivamente que CASP regula la proliferación de las células de CCR modulando la expresión de proteínas esenciales relacionadas con el ciclo celular.

CASP promovió la metástasis del CCR tanto in vitro como in vivo

Para investigar el papel de CASP en la metástasis del CCR, realizamos ensayos de migración e invasión transdérmica, que mostraron que el silenciamiento de CASP inhibió significativamente las capacidades de migración e invasión de las células DLD-1 y LoVo (Figura 3A). Por el contrario, la sobreexpresión de CASP en las células DLD-1 y HCT116 mejoró notablemente estas capacidades (Figura 3B).

A continuación, examinamos el papel de CASP en la promoción de la metástasis del CRC in vivo mediante la inyección en la vena caudal de células LoVo-shCASP-1 (que expresan de forma estable la luciferasa) en ratones inmunodeficientes NSG, junto con células de control. La imagen de bioluminiscencia reveló una fluorescencia pulmonar reducida en ambos grupos al día 12. Al día 22, la intensidad de la fluorescencia en el grupo de control aumentó significativamente y superó la del grupo CASP-KD, con una diferencia estadísticamente significativa observada al día 34 (p < 0,01) (Figuras 3C y 3D). Tras sacrificar los ratones, la imagen de fluorescencia ex vivo de los tejidos hepáticos y pulmonares mostró metástasis hepáticas en dos ratones del grupo de control, mientras que no se detectaron en el grupo CASP-KD. En los pulmones, el grupo de control exhibió una tasa de metástasis del 100%, mientras que el grupo CASP-KD mostró una tasa de metástasis reducida del 75%. Además, la intensidad de la fluorescencia de los tumores metastásicos pulmonares en el grupo de control fue significativamente mayor que en el grupo CASP-KD, lo que coincide con los resultados de la imagen in vivo (Figura 3E). La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) del tejido pulmonar confirmó además que el número de focos metastásicos en el grupo CASP-KD fue significativamente menor que en el grupo de control (Figura 3F). En conjunto, estos hallazgos indican que la inhibición de CASP suprime significativamente el potencial metastásico de las células de CRC in vivo.

Para corroborar estas observaciones, se realizó un análisis de Western blot para examinar las moléculas asociadas a la metástasis, centrándose en las proteínas relacionadas con la transición epitelio-mesenquimal (EMT) y las metaloproteinasas de la matriz (MMP). La inhibición de CASP resultó en la disminución de N-cadherina, vimentina y MMP-9, mientras que la sobreexpresión de CASP condujo a la regulación al alza (Figura 3G). En conjunto, estos resultados subrayan el papel crucial de CASP en la metástasis del CRC.

CASP promovió las vías de señalización MAPK en las células de CRC

Para dilucidar aún más los mecanismos por los cuales CASP promueve la progresión del CRC, se realizó una secuenciación de ARN en las células DLD-1 CASP-KD y sus contrapartes de control. El análisis identificó 64 genes regulados al alza que estaban relacionados negativamente con la inhibición de CASP (Figura 4A) y 40 genes regulados a la baja que estaban relacionados positivamente con la inhibición de CASP (Figura 4B). Un diagrama de dispersión mostró los genes expresados diferencialmente en total entre los grupos de control y CASP-KD, utilizando un umbral de cambio de pliegue > 2 y p < 0,05 (Figura 4C). Entre los genes regulados al alza, CD44 y PKM surgieron como puntos de interés. CD44, un marcador bien conocido de las células madre cancerosas, está involucrado en múltiples vías críticas para la autorrenovación de las células madre, la proliferación tumoral, la EMT y la invasión. PKM, particularmente el isoforma PKM2, es crucial para la proliferación celular. El análisis de Western blot confirmó que la inhibición de CASP en las células DLD-1 redujo significativamente los niveles de proteína de CD44 y PKM2, lo que coincide con los resultados de la secuenciación de ARN (Figura S5F).

El análisis de enriquecimiento de la vía KEGG de los genes regulados al alza reveló que CASP influye principalmente en las vías de señalización MAPK, así como en las vías relacionadas con el cáncer (Figura 4D). El análisis de enriquecimiento funcional de la ontología génica (GO) destacó aún más la regulación positiva de CASP de la cascada MAPK, una vía que está críticamente involucrada en la progresión del CRC (Figura 4E). Además, el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) sugirió que CASP activa las vías de señalización MAPK en las células de CRC (Figura 4F). El análisis de Western blot en las células DLD-1 y LoVo confirmó que los niveles de CASP se correlacionan positivamente con la activación de la vía MAPK. Específicamente, la inhibición de CASP suprimió la fosforilación de MEK1/2 y ERK1/2, mientras que la sobreexpresión de CASP resultó en su regulación al alza (Figura 4G). Además, CASP puede afectar la vía de señalización de Wnt (Figura S5C), ya que la molécula clave β-catenina se reguló al alza en las células DLD-1 CASP-OE mediante Western blot e inmunofluorescencia, mientras que se redujo en las células DLD-1 CASP-KD (Figuras S5D y S5E).

Además, para explorar el efecto de la variación de la expresión de CASP en el CRC a nivel de proteína, se dividieron 30 casos de CRC en datos de espectrometría de masas (MS) en un grupo de alta expresión y un grupo de baja expresión. El análisis de enriquecimiento funcional de GO de las proteínas expresadas diferencialmente (DEPs) mostró que el transporte de vesículas de Golgi y la glicosilación se enriquecieron predominantemente en las proteínas reguladas al alza en el grupo de alta expresión (Figura S5A), mientras que la adhesión célula-sustrato y la organización de la matriz extracelular se enriquecieron principalmente en las proteínas reguladas al alza en el grupo de baja expresión (Figura S5B).

CASP dificulta la señalización MAPK al regular negativamente la estabilidad de la proteína TRIM21

Para dilucidar aún más los mecanismos moleculares por los cuales CASP influye en el CRC, se emplearon la co-inmunoprecipitación (Co-IP) y la espectrometría de masas (MS) para identificar las proteínas que interactúan con CASP. Las proteínas identificadas se sometieron a análisis de enriquecimiento funcional y de vías de señalización de GO y KEGG, lo que reveló que las proteínas que interactúan con CASP están involucradas principalmente en el empalme de ARN y el procesamiento del ARNm (Figura S6A). De manera consistente, la vía del espliceosoma surgió como una vía enriquecida (Figura S6B). Dado que CASP es un espliceosoma variable, las proteínas relacionadas con el empalme de ARNm identificadas son probablemente moléculas reguladoras ascendentes. Sin embargo, descubrir las proteínas interactivas reguladoras descendentes es crucial para comprender el papel pro-carcinogénico de CASP. Entre las 10 proteínas principales con las puntuaciones de interacción más altas, TRIM21 se señaló como una proteína de particular interés. TRIM21 es una proteína de localización dual que se encuentra tanto en el citoplasma como en el núcleo, caracterizada por un dominio N-terminal RING con actividad de E3 ligasa de ubiquitina y un dominio de hélice en espiral que media la ubiquitinación y la degradación de proteínas.^[15],^[16]

Los experimentos de Co-IP en células 293T con expresión exógena de TRIM21 y CASP (Figuras 5A y 5B), así como los experimentos de Co-IP endógenos en líneas celulares de CRC (DLD-1 y LoVo) (Figura 5C) confirmaron su interacción. Para identificar la región de unión funcional de CASP, probamos varias truncaciones de sus dominios de longitud completa. En las células DLD-1, encontramos que el dominio topológico citoplásmico N-terminal de CASP interactuó con TRIM21, mientras que el dominio topológico de Golgi C-terminal no lo hizo (Figura 5D). Examinamos además la regulación cruzada entre CASP y TRIM21. Nuestros datos indican que la modulación de los niveles de CASP regula negativamente la abundancia de la proteína TRIM21 sin alterar su expresión de ARNm (Figuras 5E y 5F), y esta observación se confirmó además en los tejidos tumorales de xenoinjerto (Figuras 5G y S6C). A nivel mecanicista, los ensayos de Co-IP mostraron que el agotamiento de CASP redujo marcadamente la poliubiquitinación de TRIM21 (Figura 5H). En concordancia con esto, los ensayos de persecución con cicloheximida (CHX) demostraron que la inhibición de CASP ralentizó significativamente la renovación de TRIM21 endógeno (Figuras 5I y 5J), al tiempo que aceleraba la degradación de c-Myc, un sustrato clave de TRIM21^[16] (Figuras 5K y 5L). Además, el tratamiento con el inhibidor del proteasoma MG132 condujo a una acumulación dependiente del tiempo de la proteína TRIM21 (Figura 5M), lo que indica que TRIM21 se elimina predominantemente mediante la degradación dependiente del proteasoma. En conjunto, estos hallazgos indican que CASP promueve la degradación proteasómica de TRIM21 al facilitar su ubiquitinación.

En conjunto, nuestros hallazgos demuestran que CASP interactúa con TRIM21 y funciona como su regulador ascendente, dirigiéndolo a la degradación proteasómica mediada por ubiquitina y proporcionando una base para futuros estudios sobre el papel de CASP en la progresión del CRC.

Para determinar si CASP ejerce sus efectos pro-tumorogénicos en el CRC al regular TRIM21, transfectamos transitoriamente el siRNA de TRIM21 en las células DLD-1 CASP-KD y sus contrapartes de control. Los ensayos de CCK-8 y de formación de colonias revelaron que la disminución de TRIM21 restauró la capacidad de proliferación de las células de CRC suprimida por la inhibición de CASP (Figura 5N), lo que sugiere que CASP puede regular la proliferación de las células de CRC a través de TRIM21. Luego, examinamos si CASP activa la vía de señalización MAPK a través de TRIM21. El análisis de Western blot mostró que la inhibición de CASP por sí sola redujo significativamente la expresión de MEK1/2 fosforilado (p-MEK1/2) y ERK1/2 fosforilado (p-ERK1/2). Sin embargo, la inhibición de TRIM21 redujo ligeramente la expresión de p-MEK1/2 y p-ERK1/2 en las células que expresaban CASP, mientras que en las células CASP-KD, la expresión de p-MEK1/2 y p-ERK1/2 se restauró marcadamente (Figura 5O).

Estos hallazgos sugieren que CASP activa la vía de señalización MAPK al interactuar y regular negativamente TRIM21, lo que en última instancia promueve su degradación mediada por ubiquitina.

Expresión alterada de CASP en pacientes con CRC

Los datos brutos de proteómica adquiridos mediante DIA se conservan permanentemente, como las huellas dactilares. A medida que el software de análisis de datos o la biblioteca avanzan, el reanálisis de estos conjuntos de datos puede generar información adicional. Utilizando DIA-NN, reanalizamos los perfiles de proteómica de muestras de tejido fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE) de pacientes con pólipos hiperplásicos (n = 18), adenomas (n = 22) y CRC (n = 30), y márgenes negativos normales (n = 20) como controles, de nuestro estudio anterior para identificar las proteínas expresadas diferencialmente involucradas en la progresión del cáncer. Al intersectar las proteínas expresadas diferencialmente entre los tejidos normales y los adenomas (Figura S2A) y los tejidos normales y el CRC (Figura S2B), identificamos 248 proteínas superpuestas (Figura 1A).

Para investigar aún más sus posibles funciones en el CRC, evaluamos la importancia pronóstica de sus genes correspondientes utilizando la base de datos TCGA, lo que reveló 21 genes desregulados que estaban significativamente asociados con el pronóstico. En particular, el gen CUX1 atrajo el interés (Figura 1A). Sin embargo, en nuestra matriz de proteómica, este gen corresponde al transcrito empalmado alternativamente CASP, que exhibió una expresión elevada en los tejidos de adenoma y cáncer de colon (Figura 1B). Para investigar aún más la expresión de CASP en el CRC, analizamos sus niveles transcripcionales en función de la sonda específica de CASP 202367at en los tejidos intestinales normales (n = 54), pólipos (n = 48), tejidos de CRC (n = 185), metástasis hepáticas (n = 46) y metástasis pulmonares (n = 20) del conjunto de datos GSE41258. La expresión de CASP fue significativamente mayor en los tejidos de CRC en comparación con los tejidos normales, con una expresión aún mayor en las metástasis hepáticas del CRC (Figura 1C). Posteriormente, se realizó un Western blot en seis pares de tejidos de CRC recién congelados y sus márgenes quirúrgicos normales correspondientes, lo que reveló una regulación al alza significativa de CASP en los tejidos de CRC en comparación con los tejidos normales emparejados (Figuras S2D y S2E). De manera similar, la expresión de CASP fue marcadamente mayor en las líneas celulares de CRC en comparación con la línea celular de epitelio intestinal normal NCM460 (Figuras 1D y 1E). Además, el análisis de inmunohistoquímica (IHC) de muestras derivadas de pacientes (n = 108) y muestras de colon normales emparejadas (n_ = 108) en dos matrices de tejidos (TMA) verificó que la expresión de la proteína CASP fue significativamente mayor en los tejidos de CRC que en los tejidos normales, después de excluir las muestras con tejidos faltantes (un tumor y 20 muestras normales) (Figura 1F).

Además, basándose en los resultados de la inmunohistoquímica (IHC), las muestras de CRC con puntuaciones de 9 o 12 se clasificaron como de alta expresión (n = 30), mientras que las que presentaban puntuaciones de 0 a 4 se clasificaron como de baja expresión (n = 23). CASP mostró una tendencia a una mayor expresión en el grupo con MMR competente, y una menor expresión en el grupo con MMR deficiente, que también presentaba una diferenciación más pobre (Tabla 1). Sin embargo, la expresión de CASP no se correlacionó significativamente con la edad, el sexo, la localización del tumor, el tamaño del tumor, el estadio TNM, la producción de moco, la invasión vascular o la invasión perineural (Tabla 1). Para confirmar aún más la correlación entre la expresión de CASP, el estado de MSI y otros parámetros clínicos, analizamos los conjuntos de datos GSE41258 y GSE39582. Los resultados demostraron de manera consistente una reducción de la expresión de CASP en las muestras con MMR deficiente en ambos conjuntos de datos (Figura 1G, superior). Además, la expresión de CASP se asoció con mutaciones de TP53, mostrando niveles más altos en las muestras con TP53 mutado (Figura 1G, inferior). Dado la fuerte correlación entre CASP y el estado de MSI/MMR en los conjuntos de datos GSE41258 y GSE39582, exploramos más a fondo el panorama inmunitario estratificando a los pacientes en grupos CASP-alto y CASP-bajo basándonos en la sonda específica de CASP (202367_at). Utilizando tanto los algoritmos xCell como CIBERSORT, observamos patrones distintos de infiltración inmune asociados con la expresión de CASP.

Específicamente, el grupo CASP-bajo exhibió puntuaciones significativamente más altas en los marcadores inmunitarios y del microambiente, así como un aumento de la infiltración de macrófagos M1 en ambas cohortes. En conjunto, estos análisis indican que la disminución de CASP está relacionada con un microambiente tumoral inflamado en la CRC (Figura S3). Para aclarar aún más la asociación entre la transcripción de CASP y el pronóstico, analizamos la sonda específica de CASP 202367_at en la base de datos GEO (GSE41258 y GSE14333). Una alta expresión de CASP se asoció con una menor supervivencia global (Figura 1H) o supervivencia libre de enfermedad (Figura 1I) en pacientes con CRC. Por lo tanto, nuestros análisis indican que la expresión ectópica de CASP se asocia con la CRC y se correlaciona con la supervivencia del paciente en ciertas cohortes.

CASP promovió la proliferación de la CRC tanto in vitro como in vivo

Para explorar la función biológica de CASP en la CRC, primero examinamos su localización subcelular, confirmando informes previos que indicaban que se encontraba predominantemente en el aparato de Golgi (Figura 1J). Luego, utilizamos la línea celular de CRC HCT116 para estudios de ganancia de función y DLD-1, LoVo y HT-29 para estudios de pérdida de función, según los niveles basales de CASP (Figuras 2A y S4A). La sobreexpresión de CASP en HCT116 mejoró la proliferación (Figura 2B) y aumentó tanto el número como el tamaño de las colonias en comparación con el control (Figura 2C). Por el contrario, la inhibición de CASP en las células DLD-1, LoVo y HT29 redujo notablemente su capacidad de formación de colonias y su capacidad proliferativa (Figuras 2B y 2C). Cabe destacar que, tras reintroducir la expresión de CASP, la proliferación se restauró y aumentó con niveles elevados de CASP en DLD-1 (Figura 2D).

A continuación, investigamos el papel de CASP en la proliferación de la CRC in vivo utilizando un modelo de xenoinjerto con CASP-KD (CASP-knockdown) y células de control inyectadas subcutáneamente en ratones desnudos. Coherente con los resultados in vitro, las células DLD-1 (Figura 2E) y LoVo (Figura S4B) con baja expresión de CASP mostraron tasas de crecimiento tumoral reducidas. Los volúmenes tumorales en el grupo CASP-KD disminuyeron significativamente en comparación con los controles (Figura 2E, superior). Además, la proporción de células Ki67-positivas fue significativamente menor en el grupo CASP-KD que en el control revuelto (Figura 2E, inferior). En conjunto, estos resultados sugieren que CASP promueve la proliferación de la CRC tanto in vitro como in vivo.

Para dilucidar aún más el papel regulador de CASP en la proliferación de la CRC, se realizó un análisis del ciclo celular en las células CRC CASP-KD. La citometría de flujo reveló que el knockdown de CASP en las células DLD-1 y LoVo aumentó significativamente la proporción de células en la fase G1, al tiempo que disminuía la proporción de células en la fase S, lo que indica un arresto en la fase G1 y una inhibición de la proliferación celular (Figura 2F).

Un análisis adicional mediante Western blot (WB) mostró que el knockdown de CASP condujo a una disminución de c-Myc y la ciclina D1, dos reguladores clave de la progresión del ciclo celular, junto con un aumento de p21, un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclinas. Estos cambios moleculares se alinearon con los efectos fenotípicos observados debido a la desregulación de CASP en la proliferación celular (Figura 2G). Por lo tanto, estos hallazgos en conjunto respaldan que CASP regula la proliferación de las células de CRC modulando la expresión de proteínas esenciales relacionadas con el ciclo celular.

CASP promovió la metástasis de la CRC tanto in vitro como in vivo

Para investigar el papel de CASP en la metástasis de la CRC, realizamos ensayos de migración e invasión de Transwell, que mostraron que el knockdown de CASP alteró significativamente las capacidades migratorias e invasivas de las células DLD-1 y LoVo (Figura 3A). Por el contrario, la sobreexpresión de CASP en las células DLD-1 y HCT116 mejoró notablemente estas capacidades (Figura 3B).

A continuación, examinamos el papel de CASP en la promoción de la metástasis de la CRC in vivo mediante la inyección en la vena caudal de células LoVo-shCASP-1 (que expresan de forma estable la luciferasa) en ratones inmunodeficientes NSG, junto con células de control. La imagen de bioluminiscencia reveló una fluorescencia pulmonar reducida en ambos grupos en el día 12. En el día 22, la intensidad de la fluorescencia en el grupo de control aumentó significativamente y superó la del grupo CASP-KD, con una diferencia estadísticamente significativa observada en el día 34 (p < 0,01) (Figuras 3C y 3D). Tras sacrificar los ratones, la imagen de fluorescencia ex vivo de los tejidos hepáticos y pulmonares mostró metástasis hepáticas en dos ratones del grupo de control, mientras que no se detectaron en el grupo CASP-KD. En los pulmones, el grupo de control exhibió una tasa de metástasis del 100%, mientras que el grupo CASP-KD mostró una tasa de metástasis reducida del 75%. Además, la intensidad de la fluorescencia de los tumores metastásicos pulmonares en el grupo de control fue significativamente mayor que en el grupo CASP-KD, lo que es consistente con los resultados de la imagen in vivo (Figura 3E). La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) del tejido pulmonar confirmó además que el número de focos metastásicos en el grupo CASP-KD fue significativamente menor que en el grupo de control (Figura 3F). En conjunto, estos hallazgos indican que el knockdown de CASP suprime significativamente el potencial metastásico de las células de CRC in vivo.

Para corroborar estas observaciones, se realizó un análisis de WB para examinar las moléculas asociadas a la metástasis, centrándose en las proteínas relacionadas con la transición epitelio-mesenquimal (TEM) y las metaloproteinasas de la matriz (MMP). El knockdown de CASP resultó en una disminución de la N-cadherina, la vimentina y la MMP-9, mientras que la sobreexpresión de CASP condujo a una regulación al alza (Figura 3G). En conjunto, estos resultados subrayan el papel crucial de CASP en la metástasis de la CRC.

CASP promovió las vías de señalización MAPK en las células de CRC

Para dilucidar aún más los mecanismos por los cuales CASP promueve la progresión de la CRC, se realizó una secuenciación de ARN en las células DLD-1 CASP-KD y sus contrapartes de control. El análisis identificó 64 genes regulados al alza que se relacionan negativamente con el knockdown de CASP (Figura 4A) y 40 genes regulados a la baja que se relacionan positivamente con el knockdown de CASP (Figura 4B). Un diagrama de dispersión mostró los genes expresados diferencialmente totales entre los grupos de control y CASP-KD, utilizando un corte de cambio de pliegue > 2 y p < 0,05 (Figura 4C). Entre los genes regulados al alza, CD44 y PKM surgieron como puntos de interés. CD44, un marcador bien conocido de las células madre cancerosas, está involucrado en múltiples vías críticas para la autorrenovación de las células madre, la proliferación tumoral, la TEM y la invasión. PKM, particularmente el isoforma PKM2, es crucial para la proliferación celular. El análisis de WB confirmó que el knockdown de CASP en las células DLD-1 redujo significativamente los niveles de proteína de CD44 y PKM2, lo que se alinea con los resultados de la secuenciación de ARN (Figura S5F).

El análisis de enriquecimiento de la vía KEGG de los genes regulados al alza reveló que CASP influye principalmente en las vías de señalización MAPK, así como en las vías relacionadas con el cáncer (Figura 4D). El análisis de enriquecimiento funcional de la ontología génica (GO) destacó aún más la regulación positiva de CASP de la cascada MAPK, una vía críticamente involucrada en la progresión de la CRC (Figura 4E). Además, el análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA) sugirió que CASP activa las vías de señalización MAPK en las células de CRC (Figura 4F). El análisis de WB en las células DLD-1 y LoVo confirmó que los niveles de CASP se correlacionan positivamente con la activación de la vía MAPK. Específicamente, el knockdown de CASP suprimió la fosforilación de MEK1/2 y ERK1/2, mientras que la sobreexpresión de CASP resultó en su regulación al alza (Figura 4G). Además, CASP puede afectar la vía de señalización de Wnt (Figura S5C), ya que la molécula clave β-catenina se reguló al alza en las células DLD-1 CASP-OE mediante WB e inmunofluorescencia, mientras que se redujo en las células DLD-1 CASP-KD (Figuras S5D y S5E).

Además, para explorar el efecto de la variación de la expresión de CASP en la CRC a nivel de proteína, se dividieron 30 casos de CRC en los datos de MS en un grupo de alta expresión y un grupo de baja expresión. El análisis de enriquecimiento funcional de GO de los DEPs mostró que el transporte de vesículas de Golgi y la glicosilación se enriquecieron predominantemente en las proteínas reguladas al alza en el grupo de alta expresión (Figura S5A), mientras que la adhesión célula-sustrato y la organización de la matriz extracelular se enriquecieron principalmente en las proteínas reguladas al alza en el grupo de baja expresión (Figura S5B).

CASP impide la señalización MAPK regulando negativamente la estabilidad de la proteína TRIM21

Para dilucidar aún más los mecanismos moleculares por los cuales CASP influye en la CRC, se emplearon la co-inmunoprecipitación (Co-IP) y la espectrometría de masas (MS) para identificar las proteínas que interactúan con CASP. Las proteínas identificadas se sometieron a análisis de enriquecimiento funcional y de vías de señalización de GO y KEGG, lo que reveló que las proteínas que interactúan con CASP están involucradas principalmente en el empalme de ARN y el procesamiento del ARNm (Figura S6A). De manera consistente, la vía del espliceosoma surgió como una vía enriquecida (Figura S6B). Dado que CASP es un espliceosoma variable, las proteínas relacionadas con el empalme de ARNm identificadas son probablemente moléculas reguladoras ascendentes. Sin embargo, descubrir las proteínas que interactúan y regulan a la baja es crucial para comprender el papel pro-canceroso de CASP. Entre las 10 proteínas principales con las puntuaciones de interacción más altas, TRIM21 se señaló como una proteína de particular interés. TRIM21 es una proteína de localización dual que se encuentra tanto en el citoplasma como en el núcleo, caracterizada por un dominio RING N-terminal con actividad de E3 ubiquitina ligasa y un dominio de hélice en espiral que media la ubiquitinación y la degradación de proteínas.^[15],^[16]

Los experimentos de co-inmunoprecipitación en células 293T con expresión exógena de TRIM21 y CASP (Figuras 5A y 5B), así como los experimentos de co-inmunoprecipitación endógena en líneas celulares de CCRC (DLD-1 y LoVo) (Figura 5C) confirmaron su interacción. Para identificar la región de unión funcional de CASP, probamos varias truncaciones de sus dominios de longitud completa. En las células DLD-1, encontramos que el dominio topológico citoplasmático N-terminal de CASP interactuaba con TRIM21, mientras que el dominio topológico del Golgi C-terminal no lo hacía (Figura 5D). Examinamos además el cruce regulatorio entre CASP y TRIM21. Nuestros datos indican que la modulación de los niveles de CASP regula negativamente la abundancia de la proteína TRIM21 sin alterar su expresión de ARNm (Figuras 5E y 5F), y esta observación se confirmó aún más en los tejidos tumorales de xenoinjertos (Figuras 5G y S6C). A nivel mecanicista, los ensayos de co-inmunoprecipitación mostraron que el agotamiento de CASP redujo significativamente la poliubiquitinación de TRIM21 (Figura 5H). En concordancia con esto, los ensayos de persecución con cicloheximida (CHX) demostraron que la inhibición de CASP ralentizó significativamente la renovación de TRIM21 endógeno (Figuras 5I y 5J), al tiempo que aceleraba la degradación de c-Myc, un sustrato clave de TRIM21 ^[16] (Figuras 5K y 5L). Además, el tratamiento con el inhibidor del proteasoma MG132 condujo a una acumulación dependiente del tiempo de la proteína TRIM21 (Figura 5M), lo que indica que TRIM21 se elimina predominantemente mediante la degradación dependiente del proteasoma. En conjunto, estos hallazgos indican que CASP promueve la degradación del proteasoma de TRIM21 al facilitar su ubiquitinación.

En conjunto, nuestros hallazgos demuestran que CASP interactúa con TRIM21 y funciona como su regulador ascendente, dirigiéndolo a la degradación del proteasoma mediada por ubiquitina y proporcionando una base para futuros estudios sobre el papel de CASP en la progresión del CCRC.

Para determinar si CASP ejerce sus efectos pro-tumorogénicos en el CCRC regulando TRIM21, transfectamos transitoriamente el siRNA de TRIM21 en las células DLD-1 con CASP-KD y sus contrapartes de control. Los ensayos de CCK-8 y formación de colonias revelaron que la reducción de TRIM21 restauró la capacidad de proliferación de las células de CCRC suprimida por la inhibición de CASP (Figura 5N), lo que sugiere que CASP puede regular la proliferación de las células de CCRC a través de TRIM21. Luego, examinamos si CASP activa la vía de señalización MAPK a través de TRIM21. El análisis WB mostró que la inhibición de CASP por sí sola redujo significativamente la expresión de MEK1/2 fosforilado (p-MEK1/2) y ERK1/2 (p-ERK1/2). Sin embargo, la inhibición de TRIM21 redujo ligeramente la expresión de p-MEK1/2 y p-ERK1/2 en las células que expresaban CASP, mientras que en las células con CASP-KD, la expresión de p-MEK1/2 y p-ERK1/2 se restauró notablemente (Figura 5O).

Estos hallazgos sugieren que CASP activa la vía de señalización MAPK interactuando y regulando negativamente TRIM21, lo que en última instancia promueve su degradación mediada por ubiquitina.

Discusión

Se sabe que el gen humano CUX1 se transcribe en múltiples isoformas que están conservadas evolutivamente y funcionalmente.^[17] Basándose en la localización subcelular, estas isoformas se pueden dividir en dos tipos: CDP de localización nuclear y CASP de localización en el Golgi.^[7] Los transcritos de localización nuclear terminan en el exón 24 del gen y pueden ser procesados o hidrolizados aún más en diferentes isoformas, que a menudo contienen dominios de repetición y homología truncados. En contraste, las isoformas de localización en el Golgi se extienden transcripcionalmente a exones distales, incluyendo en última instancia los exones 1-14 y 25-33 a través del empalme selectivo.

Los productos de localización nuclear han sido ampliamente estudiados, revelando que CUX1 sufre mutaciones puntuales somáticas y pérdida de heterocigosidad, lo que lleva a la inactivación funcional en varios cánceres. Dado que no se encuentran mutaciones en los alelos restantes, CUX1 parece funcionar como un gen supresor tumoral haploinsuficiente.^[18],^[19],^[20] La evidencia sugiere que la expresión reducida de CUX1 promueve la tumorigénesis, mientras que el aumento de la expresión facilita la progresión tumoral.^[21],^[22] Sin embargo, la isoforma de localización en el Golgi, que carece de los motivos de unión al ADN y otros dominios funcionales de CUX1, y conserva solo la porción conservada de la bobina en espiral, permanece poco estudiada. Investigaciones pioneras previas del grupo de Sean Munro demostraron que CASP se localizaba en el aparato de Golgi en lugar del núcleo, como se informó anteriormente, y parecía ser más antiguo evolutivamente que CDP porque solo este último estaba presente en plantas y hongos. Aunque la función de CASP no se dilucidó, parece probable que esté relacionada con la de giantina y golgina-84 porque las proteínas comparten una estructura general y residuos conservados del dominio de la membrana trans. Los estudios sobre el homólogo COY1 en Saccharomyces cerevisiae sugieren que la región de la membrana trans de este tipo de proteína de bobina en espiral de localización en el Golgi está involucrada en su función.^[6]

Nuestro estudio se centró en CASP del gen CUX1, utilizando datos proteómicos obtenidos de muestras de FFPE de tejidos normales, adenoma y carcinoma mediante DIA/MS combinado con bases de datos públicas. Se encontró que CASP se expresa de forma ectópica en adenomas y carcinomas, lo que sugiere que CASP podría servir como biomarcador para la detección temprana del CCRC. Dada su estructura génica inusual y conservada evolutivamente, CASP puede tener funciones específicas del Golgi independientes de CDP. Utilizando el CCRC como modelo, exploramos el posible papel de CASP en la tumorigénesis. Nuestro análisis reveló que la expresión de CASP estaba significativamente elevada en los tejidos de CCRC en comparación con los tejidos normales adyacentes y estaba asociada con un mal pronóstico. El análisis de correlación mostró que la expresión de CASP estaba relacionada con la funcionalidad de MMR y la mutación de TP53, con una expresión más baja observada en muestras deficientes en MMR o TP53 de tipo salvaje. Los análisis de infiltración inmune sugirieron que la baja expresión de CASP se asoció con un microambiente tumoral más inflamado en el CCRC, caracterizado por puntuaciones inmunitarias y ambientales más altas y un aumento de la infiltración de múltiples subconjuntos de células inmunitarias, particularmente macrófagos M1, lo que indica que la reducción de la expresión de CASP está relacionada con un microambiente tumoral inmunológicamente "caliente" en el CCRC, lo que puede tener implicaciones importantes para predecir o comprender las respuestas a la inmunoterapia. Funcionalmente, la regulación al alza de la expresión de CASP promovió la transición de la fase G1 a la fase S, mejorando la proliferación celular y la formación de colonias. Además, la expresión de CASP aumentó la motilidad y la metástasis de las células tumorales al influir en las moléculas relacionadas con EMT y MMP. Mecanísticamente, CASP regula negativamente la expresión de la proteína TRIM21 al promover su degradación mediada por ubiquitina a través de una interacción directa N-terminal, lo que a su vez influye en la vía MAPK y promueve la progresión del CCRC.

TRIM21 es un miembro de la familia de proteínas TRIM, que incluye más de 80 proteínas caracterizadas por dominios conservados, como un dominio de anillo N-terminal con actividad de ligasa de ubiquitina E3, un dominio de caja B y un dominio de bobina en espiral.^[15] Se ha implicado a TRIM21 en la regulación de la inflamación, la autoinmunidad y el cáncer.^[23],^[24],^[25] En este estudio, identificamos CASP como un regulador ascendente de TRIM21, revelando una interacción previamente no caracterizada entre las dos proteínas. Demostramos que CASP promueve la degradación mediada por ubiquitina de TRIM21, regulando así negativamente la estabilidad de la proteína TRIM21. En conjunto, nuestros hallazgos establecen un mecanismo molecular que está desregulado durante la progresión del CCRC. Se sabe que TRIM21 exhibe funciones duales en el cáncer, funcionando como un promotor o supresor tumoral dependiendo de los roles biológicos de sus sustratos de ubiquitinación.^[26],^[27] En este estudio, la inhibición mediada por siRNA de TRIM21 mejoró la proliferación de las células de CCRC, lo que sugiere que TRIM21 actúa como un supresor tumoral en el CCRC. Además, la reducción de la proliferación de las células de CCRC causada por la inhibición de CASP se revirtió cuando se suprimió la expresión de TRIM21, lo que indica que CASP puede promover la proliferación de las células de CCRC al regular TRIM21.

En este estudio, el análisis WB reveló que, en las células de CCRC con CASP-KD, la reducción de TRIM21 restauró la expresión de p-ERK1/2, lo que sugiere que CASP puede activar la vía MAPK al regular negativamente TRIM21. Sin embargo, Ye et al. informan que TRIM21 es un objetivo de ERK2 en el CCRC, y que ERK2 fosforila TRIM21, interrumpiendo así su interacción con c-Myc y previniendo la degradación de c-Myc, lo que sugiere que la señalización MAPK está aguas arriba de TRIM21,^[16] lo que parece inconsistente con nuestros hallazgos. Sin embargo, proponemos que nuestros resultados no son mutuamente excluyentes con los de Ye et al., sino más bien complementarios, apuntando colectivamente a un complejo bucle de retroalimentación que regula la señalización MAPK. Integrando los hallazgos de Ye et al. con respecto a la fosforilación mediada por ERK2, proponemos un modelo unificado: CASP actúa como un regulador de estabilidad ascendente, funcionando principalmente durante los estados patológicos o la activación temprana de la señal. Los niveles elevados de CASP parecen agotar TRIM21, creando un entorno permisivo para la activación de MAPK. Posteriormente, ERK2 activado puede fosforilar recíprocamente el TRIM21 restante, ajustando finamente su actividad de ligasa E3 hacia sustratos como c-Myc, que exhibe una rápida tasa de degradación tras la inhibición de CASP. Cabe destacar que, si bien la inhibición de CASP suprime significativamente la actividad de la vía, el efecto de activación de la sobreexpresión de CASP en p-ERK1/2 parece ser relativamente moderado. Interpretamos esta observación como consistente con un mecanismo de retroalimentación negativa: una vez que CASP desencadena la activación de MAPK, la regulación dependiente de ERK-TRIM21 probablemente limita la amplificación excesiva de la señal, proporcionando un apoyo adicional para esta red bidireccional. Además, el papel regulador de TRIM21 en la vía MAPK se ha caracterizado parcialmente en estudios anteriores. Por ejemplo, HTR1A interactúa con TRIM21 y PSMD7 para promover la degradación del proteasoma de TGF RII, suprimiendo así tanto la vía Smad canónica como la vía no canónica MEK/ERK/c-Myc de TGF . Esta inhibición previene la reorganización del citoesqueleto y EMT, regulando en última instancia la progresión tumoral.^[28] Además, TRIM21 puede inducir una expresión aberrante de IL-6 al modular el eje de señalización TRIB2-MAPK, lo que lleva a un desequilibrio en la relación Th1/Th2 de los linfocitos T.^[29] Cabe destacar que, según las investigaciones recientes, TRIM21 puede regular específicamente la fosforilación de ERK1/2 catalizando la poliubiquitinación K27 de ERK1/2, lo que potencia la interacción entre ERK1/2 y MEK1/2. Esta interacción mejorada promueve la activación de ERK1/2, lo que en última instancia impulsa la proliferación celular. Paradójicamente, la sobreexpresión de TRIM21 desencadena un bucle de retroalimentación negativa de la señalización de ERK1/2, lo que resulta en la supresión de los niveles de p-ERK1/2 y la inhibición de la proliferación celular.^[30]

Dado el localización en el Golgi de CASP, hipotetizamos que CASP no solo reduce los niveles globales de TRIM21, sino que crea una zona de TRIM21 agotada localmente en el Golgi. Esta eliminación espacial podría aliviar las señales inhibitorias sobre las vesículas nacientes que transportan cargas oncogénicas (por ejemplo, integrinas), generando pulsos de señalización compartimentalizados esenciales para la invasión, un modelo consistente con los roles de andamiaje de la matriz del Golgi^[31],^[32] que justifica futuros estudios de imagen de alta resolución. En el presente estudio, se muestra que CASP regula los niveles generales de p-ERK. Sin embargo, el trabajo previo ha demostrado que las proteínas de andamiaje asociadas al Golgi, como Sef, pueden interactuar y modular espacialmente la señalización MEK/ERK para evitar la translocación nuclear de ERK y retenerla dentro del citoplasma.^[33] Si CASP ejerce un control espacial similar sobre la activación de p-ERK, y qué sustratos pro-tumorogénicos podrían ser fosforilados por un grupo de ERK confinado localmente a medida que se encuentra con cargas en el Golgi, aún está por dilucidar.

En conclusión, nuestro estudio proporciona información mecanística sobre el papel funcional de CASP, un producto de empalme alternativo del gen CUX1 que es distinto de los CDPs. Al integrar datos proteómicos con TCGA y GEO, y validar los hallazgos mediante inmunohistoquímica (IHC), confirmamos la expresión ectópica de CASP en el CRC. Un análisis más profundo reveló que la expresión desregulada de CASP influyó profundamente en el comportamiento maligno de las células tumorales. A nivel mecanístico, demostramos que CASP interactúa con TRIM21 para promover su ubiquitinación y degradación, y esta regulación negativa de TRIM21 impulsa la progresión y metástasis tumoral al activar la vía de señalización MAPK.

Limitaciones del estudio

A pesar de estos hallazgos, nuestro estudio tiene varias limitaciones. En primer lugar, aún faltan análisis de cohortes a gran escala que evalúen la expresión ectópica de CASP en el CRC. En segundo lugar, no describimos completamente el mecanismo bioquímico por el cual CASP mejora la autoubiquitinación de TRIM21. Los estudios futuros que empleen ensayos de ligasa E3 reconstituidas y el mapeo de ubiquitinación específico de enlaces serán esenciales para determinar si CASP modula directamente la actividad enzimática de TRIM21 o facilita su autoensamblaje. Además, los mecanismos por los cuales CASP promueve la progresión tumoral requieren una mayor investigación. Específicamente, ¿cómo el complejo CASP-TRIM21 activa la señalización MAPK aguas abajo? ¿Qué papel juega este complejo en otros tipos de tumores? Finalmente, como proteína de la familia de las hélices enrolladas localizada en el Golgi, ¿influye CASP en el tráfico de vesículas en el CRC, como otras proteínas de esta clase? Estas preguntas aún deben ser abordadas.

Limitaciones del estudio

A pesar de estos hallazgos, nuestro estudio tiene varias limitaciones. En primer lugar, aún faltan análisis de cohortes a gran escala que evalúen la expresión ectópica de CASP en el CRC. En segundo lugar, no describimos completamente el mecanismo bioquímico por el cual CASP mejora la autoubiquitinación de TRIM21. Los estudios futuros que empleen ensayos de ligasa E3 reconstituidas y el mapeo de ubiquitinación específico de enlaces serán esenciales para determinar si CASP modula directamente la actividad enzimática de TRIM21 o facilita su autoensamblaje. Además, los mecanismos por los cuales CASP promueve la progresión tumoral requieren una mayor investigación. Específicamente, ¿cómo el complejo CASP-TRIM21 activa la señalización MAPK aguas abajo? ¿Qué papel juega este complejo en otros tipos de tumores? Finalmente, como proteína de la familia de las hélices enrolladas localizada en el Golgi, ¿influye CASP en el tráfico de vesículas en el CRC, como otras proteínas de esta clase? Estas preguntas aún deben ser abordadas.

Disponibilidad de recursos

Investigador principal

La información adicional y las solicitudes de recursos y reactivos deben dirigirse al investigador principal, Ting Chen (tchen2013@zju.edu.cn), quien se encargará de satisfacerlas.

Disponibilidad de materiales

Este estudio no generó nuevos materiales o reactivos únicos.

Disponibilidad de datos y código

•Los datos que se presentan en este artículo se compartirán a petición del investigador principal. Las imágenes originales de Western blot se depositaron en Mendeley Data: https://doi.org/10.17632/6mzk48brxt.1.
•Este artículo no presenta código original.
•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos que se presentan en este artículo está disponible a petición del investigador principal.

Investigador principal

La información adicional y las solicitudes de recursos y reactivos deben dirigirse al investigador principal, Ting Chen (tchen2013@zju.edu.cn), quien se encargará de satisfacerlas.

Disponibilidad de materiales

Este estudio no generó nuevos materiales o reactivos únicos.

Disponibilidad de datos y código

•Los datos que se presentan en este artículo se compartirán a petición del investigador principal. Las imágenes originales de Western blot se depositaron en Mendeley Data: https://doi.org/10.17632/6mzk48brxt.1.
•Este artículo no presenta código original.
•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos que se presentan en este artículo está disponible a petición del investigador principal.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Zhejiang Provincial Clinical Research Center for CANCER (2022E50008 y 2024ZY01056), Fundamental Research Funds for the Central Universities (226-2024-00062) y 10.13039/501100001809National Natural Science Foundation of China (82173220 y 82403888). El resumen gráfico se creó con BiorRender (https://www.biorender.com/).

Contribuciones de los autores

S.Z., Q.W. y T.C. diseñaron y supervisaron el estudio. B.Z. y W.H. recopilaron datos bioinformáticos y realizaron análisis bioinformáticos. B.Z., W.D., K.X. y L.L. desarrollaron la metodología. B.Z. y T.C. analizaron e interpretaron los datos. B.Z., T.C. y Q.W. redactaron y revisaron el manuscrito.

Declaración de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Declaración sobre el uso de IA generativa y tecnologías de asistencia por IA en el proceso de redacción

Durante la preparación de este trabajo, los autores utilizaron ChatGPT para mejorar el lenguaje y la legibilidad. Después de utilizar este servicio, los autores revisaron y editaron el contenido según fuera necesario y asumen la total responsabilidad del contenido de la publicación.

Métodos STAR

Tabla de recursos clave

Detalles del modelo experimental y de los participantes del estudio

Muestras clínicas

Se obtuvieron seis pares de tejidos de CRC recién congelados y tejidos de márgenes quirúrgicos normales correspondientes del Biobanco del Instituto del Cáncer de la Universidad de Zhejiang para la inmunohistoquímica (IHC). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes o sus representantes legales antes de la recolección de muestras. El uso de materiales biológicos humanos fue aprobado por el Comité de Ética del Segundo Hospital Afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang (Número de aprobación: 2020-666) y se llevó a cabo de acuerdo con las regulaciones institucionales y nacionales aplicables. Las características clínicas de los pacientes se resumen en la Tabla S1.

Se compraron arreglos de tejidos de cáncer de colon (TMA) de Shanghai OUTDO BIOTECH CO., LTD para IHC. Se utilizaron dos TMA: HCol-Ade060CS-01 (cuatro tejidos de colon normales y 28 pares de tejidos de cáncer de colon/tejidos adyacentes) y HColA160CS01 (80 pares de tejidos de cáncer de colon/tejidos adyacentes). Después de excluir los casos con núcleos de tejido faltantes, se retuvieron 28 muestras de CRC (27 con tejido adyacente correspondiente) de HCol-Ade060CS-01 y 79 muestras de CRC (70 con tejido adyacente correspondiente) de HColA160CS01 para todos los análisis posteriores. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes o sus representantes legales. El uso de estos TMA fue aprobado por el comité de ética del proveedor (Números de aprobación: SHYJS-CP-1410002 y SHYJS-CP-1701008), y se llevó a cabo de acuerdo con las normas reglamentarias aplicables. Las características clínicas de los pacientes se proporcionan en las Tablas S2 y S3.

Cultivo celular y líneas celulares

Las líneas celulares DLD-1, LoVo, HCT116, HT-29 y 293T se cultivaron con medio RPMI 1640 o DMEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific) que contenía un 10% de suero fetal bovino (FBS, BI Industry). Las células se incubaron a 37 °C con 5% de CO2.

Modelos animales

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina China de Zhejiang y se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices de Estudio Animal de la institución (Número ético: 20230123-05) y las regulaciones pertinentes. Para el modelo de xenoinjerto subcutáneo, se utilizaron ratones BALB/c hembra de 4 a 6 semanas de edad. Para el modelo metastásico, se utilizaron ratones NSG macho de 6 a 8 semanas de edad.

Detalles del método

Análisis bioinformático

Todos los perfiles de expresión de ARNm de CRC de nivel 3 y los datos clínicos de los pacientes con CRC se recuperaron de TCGA. Se excluyeron los genes con niveles de expresión inferiores a 1 en más del 50% de las muestras. Los archivos CEL sin procesar para GSE41258, GSE14333 y GSE39582 se descargaron del Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

Las diferencias de supervivencia entre los grupos con alta o baja expresión de CASP se evaluaron utilizando el método de Kaplan-Meier y se analizaron con la prueba de rango logarítmico mediante las funciones survfit y survdiff en el paquete R survival.^[34]

Los datos de masa de expresión se reanalizaron mediante la versión actualizada del software DIA-NN. Las proteínas expresadas diferencialmente (DEP) entre los subgrupos se seleccionaron según el valor de P < 0,05 y el cambio de pliegue > 2 basado en la prueba t de Student.

Los niveles de infiltración de células inmunitarias en las muestras de CRC se evaluaron utilizando los algoritmos CIBERSORT y xCELL. Se obtuvieron datos de expresión génica estandarizados de los conjuntos de datos de GEO. El algoritmo CIBERSORT, que emplea una regresión de vectores de soporte lineal para deconvolucionar los datos de transcriptómica, se aplicó para estimar las proporciones relativas de 22 fenotipos de células inmunitarias humanas.^[35] Simultáneamente, se utilizó el algoritmo xCELL para calcular las puntuaciones de enriquecimiento para 64 tipos de células inmunitarias y estromales basadas en el análisis de enriquecimiento de firmas génicas.^[36]

Inmunohistoquímica (IHC)

Se utilizó un anticuerpo anti-CASP de conejo (1:3000, 11733-1-AP, Proteintech) para la tinción IHC. La expresión de CASP se evaluó mediante la puntuación de reactividad inmune (IRS), que se calcula como IRS = intensidad de la tinción × porcentaje de células positivas. El porcentaje de células positivas se clasificó de la siguiente manera: 0 (negativo), 1 (80%). La intensidad se clasificó de la siguiente manera: 0 (sin tinción), 1 (débilmente positivo, amarillo claro), 2 (moderadamente positivo, amarillo-marrón) y 3 (fuertemente positivo, marrón) (Figura S2C). La expresión de CASP se clasificó como baja (IRS ≤ 4) o alta (IRS ≥ 9).

Construcción de líneas celulares estables con sobreexpresión y silenciamiento de CASP

Se diseñaron shRNA específicos que se dirigen a CASP y una secuencia de control aleatoria (Tabla S1) y se clonaron en el vector pLKO. El ADNc de CASP (NM_001913.5), amplificado a partir de células de cáncer de colon, se clonó en los vectores de expresión pCDH-EF1-Puro o pcDNA3.1-3×FLAG.

Los plásmidos de sobreexpresión de CASP, los plásmidos de shRNA de CASP y los plásmidos de control se cotransfectaron con los plásmidos psPAX2 y PMD2.G en células 293T. Después de 48 horas, se recogió el sobrenadante y se filtró a través de un filtro de 0,45 μm para las infecciones posteriores. Para la transducción viral, se sembraron 5 × 104 células en placas de 12 pocillos e se incubaron con 1 ml de solución de lentivirus que contenía 8-12 μg/ml de polibreno. Después de 48-72 horas de transducción, las células se seleccionaron con 2 μg/ml de puromicina hasta la eliminación completa de las células no infectadas.

Western blot

Las proteínas se extrajeron utilizando el tampón RIPA (AR0102, Boster), se separaron en geles SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: ?-actina (1:5000, M1210-2, Huabio), GAPDH (1:50000, 60004-1-Ig, Proteintech), CASP (1:2000, 11733-1-AP, Proteintech), c-Myc (1:5000, 67447-1-Ig, Proteintech), Cyclin D1 (1:1000, 55506, Cell Signaling Technology), p21 (1:1000, 2947, Cell Signaling Technology), N-cadherin (1:5000, 22018-1-AP, Proteintech), Vimentin (1:5000, 10366-1-AP, Proteintech), MMP-9 (1:1000, 10375-2-AP, Proteintech) y ?-catenina (1:1000, EM0306, Huabio). Los inmunoblots se sondearon con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (1:5000, HA1001, HA1006, Huabio) y se visualizaron utilizando un reactivo de detección de quimioluminiscencia mejorada (ECL, AR1172, Boster).

Inmunofluorescencia

Las células de CRC se sembraron en placas de microscopía confocal y se cultivaron durante 24 horas. Las células se fijaron con formaldehído al 4% a 4 °C durante 15 minutos a temperatura ambiente (TA) y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% durante 10 minutos. Se realizó el bloqueo utilizando el tampón de bloqueo (P0260, Beyotime) suplementado con Triton X-100 al 0,1% durante 60 minutos. A continuación, las células se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra CASP (1:200, 11733-1-AP, Proteintech) o ?-catenina (1:200, EM0306, Huabio). Después del lavado, las células se incubaron con IgG anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 488 (1:300, ab150073, Abcam) durante 2 horas a TA. Después de los lavados con PBS, las células se incubaron con Alexa Fluor® 647 Anti-GM130 (1:1000, ab195303, Abcam) durante 2 horas a TA y se lavaron con PBS y se contratiñeron con DAPI (P0131, Beyotime) durante 10 minutos. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal LSM900 (Zeiss, Alemania).

Aislamiento de ARN y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa inversa (qRT-PCR)

Se extrajo ARN total de células de CRC utilizando el kit de purificación RNA-Quick (RN001, ES science, Shanghái, China) siguiendo el protocolo del fabricante. Se utilizó el 5×PrimeScript RT Master Mix (RR036Q, Takara) para la transcripción inversa. Se aplicó el kit SYBR Green qPCR (AG11701, Accurate Biotechnology, Hunan, China) para RT-qPCR mediante el sistema Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR. ?-ACTINA se utilizó como control de carga. Se utilizó el método 2-ΔΔCt para los cálculos de expresión relativa. Las secuencias de los primers específicos para cada gen fueron las siguientes:

CASP forward: 5'-GGAGGTGCTGTTGCTGGAGAAG-3',

CASP reverse: 5'-CCGCTGGATGGACTGAATGATGCT-3',

p200 CUX1 forward: 5'-CCAGAGCCTGAACAGACTATTT-3',

p200 CUX1 reverse: 5'-CTTTAAGGCAGGGTCGAGGGCA-3',

?-ACTINA forward: 5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3',

?-ACTINA reverse: 5'-TCCCTGGAGAAGAGCTACG-3'.

Evaluación de la viabilidad celular y ensayo del ciclo celular

Se evaluó la capacidad proliferativa de las células de CRC utilizando el kit Cell Counting Kit-8 (CCK-8, K1018, APExBIO). Se sembraron células de CRC (1-1,5 × 103 por pocillo) en placas de 96 pocillos. Después de permitir que las células se adhirieran y se recuperaran, se añadieron 10 µL de reactivo CCK-8 a 100 µL de medio de cultivo diariamente durante 7 días consecutivos. Las placas se incubaron en la oscuridad a 37 °C durante 90 minutos y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de ELISA.

Para el análisis del ciclo celular, se utilizó el kit Cell Cycle Staining Kit (CCS012, Multi Sciences Biotech) siguiendo el protocolo del fabricante. Las células teñidas se analizaron utilizando un citómetro de flujo DxFLEX (Beckman) y los resultados se procesaron con el software CytExpert.

Ensayo de formación de colonias

Se sembraron un total de 500-800 células de CRC en una placa de 6 pocillos. Después de 10 días, se formaron colonias celulares, que se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 15-30 minutos y se lavaron con PBS. A continuación, se añadió solución de tinción con cristal violeta a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 15-30 minutos. Las células se lavaron con PBS varias veces hasta que el fondo de la placa estuviera limpio. Una vez secas, se fotografiaron las colonias.

Ensayos de migración e invasión celular

Se utilizó un ensayo Transwell con cámaras de poro de 8 µm (3422, Corning) para evaluar el potencial metastásico de las células de CRC. Las cámaras se pre-recubrieron con Matrigel (356234, Corning) para imitar la matriz extracelular. Se añadió 200 µL de suspensión libre de FBS que contenía 6 × 104 (migratorias) o 8 × 104 (invasivas) células DLD-1, o 1 × 105 células LoVo/HCT116, a la cámara superior, mientras que se añadieron 800 µL de medio de cultivo con 20% de FBS a la cámara inferior. Después de 24 horas (DLD-1) o 48 horas (LoVo, HCT116), se lavó la cámara superior con PBS, se fijó con 4% de paraformaldehído durante 15 minutos a temperatura ambiente y se tiñó con cristal violeta durante 15-30 minutos. Las células no migradas de la superficie de la membrana superior se eliminaron con un hisopo de algodón. Las células migrantes e invasivas se visualizaron utilizando un microscopio óptico invertido (Axio Observer 3, Zeiss) y se cuantificaron con el software ImageJ.

Ensayo de co-inmunoprecipitación (Co-IP)

Tras una transfección de 48 horas con los plásmidos indicados, las células se lisaron utilizando el tampón de lisis IP (87787, Thermo Fisher Scientific). Los lisados se sometieron a inmunoprecipitación con las cuentas magnéticas FLAG M2 (M8823, Sigma Aldrich), las cuentas Anti-His (L-1015, Biolinkedin) o las cuentas de agarosa magnética Ni-NTA (HY-K0241, MedChemExpress), siguiendo estrictamente los protocolos de los respectivos fabricantes.

Para la co-inmunoprecipitación (Co-IP) endógena, se recogieron y lisaron las células DLD-1 o LoVo. Los lisados celulares se incubaron durante la noche a 4 °C con cuentas de proteína A/G (HY-K0202, MedChemExpress) que se habían pre-acoplado con un anticuerpo CASP o un anticuerpo IgG de control durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las proteínas unidas a las cuentas se lavaron con tampón de elución de IgG (21028, Thermo Fisher Scientific) y se neutralizaron con Tris-HCl (pH 8,8). Las proteínas eluidas se analizaron finalmente mediante inmunotransferencia (WB).

La identificación de las proteínas interactuantes se llevó a cabo mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) en Oebiotech (Shanghái, China).

Eliminación de genes mediante siRNA

Se sembraron células DLD-1 en placas de 12 pocillos. Cuando las células alcanzaron una confluencia del 50-60%, se transfectó siRNA (GenePharma, Shanghái, China) en las células utilizando Lipofectamine 3000 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de 48 horas de incubación, se recogieron las células para los experimentos posteriores. Las secuencias del siRNA de TRIM21 fueron las siguientes: sentido: 5'-GCAUGGUCUCCUUCUACAATT-3' y antisenso: 5'-UUGUAGAAGGAGACCAUGCTT-3'.

Ensayo de renovación

Se sembraron células CASP-KD DLD-1 y las células de control correspondientes en placas de 12 pocillos. Tras una incubación de 24 horas, se reemplazó el medio de cultivo por uno que contenía CHX, 60 (µg/ml) para inhibir la síntesis de proteínas. Las células se lisaron en los puntos de tiempo indicados tras la exposición a CHX. Los extractos proteicos resultantes se sometieron a análisis de WB para determinar la abundancia de la proteína diana a lo largo del tiempo.

Ensayo de ubiquitinación

Se co-transfectaron células 293T con plásmidos que codificaban CASP-shRNA o control negativo, TRIM21-His y plásmidos HA-Ub durante 72 horas. Seis horas antes de la recolección, las células se trataron con 20 µM de MG132 para inhibir la degradación proteasómica. Los lisados celulares se incubaron con agarosa Ni-NTA para extraer las proteínas marcadas con His. Tras un lavado exhaustivo, las proteínas unidas se eluyeron hirviéndolas en tampón de carga SDS 2× durante 5 minutos. Los niveles de ubiquitinación se analizaron posteriormente mediante WB utilizando los anticuerpos indicados.

Experimentos con animales

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica China de Zhejiang y se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices de Estudio Animal de la institución (Número ético: 20230123-05) y la normativa aplicable. Para el modelo de tumor subcutáneo, se inyectaron un total de 5 × 106 células de CRC en 100 µL en el flanco derecho de ratones nude. Los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos: Scramble (n=5) y shCASP-1 (n=5). El tamaño de los tumores se midió cada 4 días y se calculó el volumen tumoral utilizando la fórmula: Volumen = ½ × longitud × anchura². Después de 45 días (DLD-1) o 53 días (LoVo), se sacrificaron los ratones y se extirparon y pesaron los tumores.

Para el modelo de tumor metastásico, se inyectaron un total de 2 × 106 células LoVo en 200 µL en la vena caudal de ratones NSG. Los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos: Scramble (n=5) y shCASP-1 (n=5). Se realizó una imagen de bioluminiscencia in vivo el día de la inyección y cada 5-12 días después para controlar la formación de tumores metastásicos. El día 34, se sacrificaron los ratones y se disecaron sus pulmones e hígados, se visualizaron ex vivo y se fijaron en 4% de paraformaldehído.

Cuantificación y análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos y las representaciones gráficas se realizaron utilizando GraphPad Prism v9.0. Los datos cuantitativos se presentaron como medias ± DE. Para las comparaciones entre dos grupos, se utilizaron pruebas t de Student no pareadas o pareadas, según el diseño experimental. Se realizó una prueba de Chi-cuadrado para examinar la asociación entre las variables categóricas. Se calculó el coeficiente de correlación de Pearson para determinar la fuerza de las asociaciones. La significación estadística se definió como un valor de P bilateral < 0,05 (P < 0,05, * P < 0,01, P < 0,001, * P < 0,0001, ns = no hay diferencia significativa).

Modelo experimental y detalles de los participantes del estudio

Muestras clínicas

Se obtuvieron seis pares de tejidos de CRC congelados y tejidos de márgenes quirúrgicos normales correspondientes del Biobanco del Instituto del Cáncer de la Universidad de Zhejiang para la inmunotransferencia. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes o sus representantes legales antes de la recolección de muestras. El uso de materiales biológicos humanos fue aprobado por el Comité de Ética del Segundo Hospital Afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang (Número de aprobación: 2020-666) y se llevó a cabo de acuerdo con las normas institucionales y nacionales aplicables. Las características clínicas de los pacientes se resumen en la Tabla S1.

Se compraron microarreglos de tejidos de cáncer de colon (TMA) a Shanghai OUTDO BIOTECH CO., LTD para IHC. Se utilizaron dos TMA: HCol-Ade060CS-01 (cuatro tejidos de colon normales y 28 pares de tejidos de cáncer de colon/tejidos adyacentes) y HColA160CS01 (80 pares de tejidos de cáncer de colon/tejidos adyacentes). Tras la exclusión de los casos con núcleos de tejido faltantes, se retuvieron 28 muestras de CRC (27 con tejido adyacente correspondiente) de HCol-Ade060CS-01 y 79 muestras de CRC (70 con tejido adyacente correspondiente) de HColA160CS01 para todos los análisis posteriores. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes o sus representantes legales. El uso de estos TMA fue aprobado por el comité de ética del proveedor (Números de aprobación: SHYJS-CP-1410002 y SHYJS-CP-1701008) y se llevó a cabo de acuerdo con las normas aplicables. Las características clínicas de los pacientes se proporcionan en las Tablas S2 y S3.

Cultivo celular y líneas celulares

Las líneas celulares DLD-1, LoVo, HCT116, HT-29 y 293T se cultivaron con medio RPMI 1640 o DMEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific) que contenía 10% de suero fetal bovino (FBS, BI Industry). Las células se incubaron a 37 °C con 5% de CO2.

Modelos animales

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica China de Zhejiang y se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices de Estudio Animal de la institución (Número ético: 20230123-05) y la normativa aplicable. Para el modelo de xenoinjerto subcutáneo, se utilizaron ratones nude BALB/c de 4 a 6 semanas de edad. Para el modelo metastásico, se utilizaron ratones NSG de 6 a 8 semanas de edad.

Detalles del método

Análisis bioinformático

Se recuperaron todos los perfiles de expresión de ARNm de nivel 3 de CRC RNASeqV2 y los datos clínicos de pacientes con CRC de TCGA. Se excluyeron los genes con niveles de expresión inferiores a 1 en más del 50% de las muestras. Se descargaron los archivos CEL sin procesar para GSE41258, GSE14333 y GSE39582 del Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

Las diferencias en la supervivencia entre los grupos con alta o baja expresión de CASP se evaluaron mediante el método de Kaplan-Meier y se analizaron con la prueba de log-rank utilizando las funciones survfit y survdiff del paquete survival de R.^[34]

Los datos de expresión masiva se reanalizaron con una versión actualizada del software DIA-NN. Las proteínas diferencialmente expresadas (PDE) entre los subgrupos se seleccionaron según un valor de P < 0,05 y un cambio de expresión > 2, basándose en la prueba t de Student.

Los niveles de infiltración de células inmunitarias en las muestras de CRC se evaluaron utilizando los algoritmos CIBERSORT y xCELL. Se obtuvieron datos de expresión génica estandarizados de los conjuntos de datos GEO. El algoritmo CIBERSORT, que emplea una regresión de vectores de soporte lineal para deconvolucionar los datos de transcriptómica, se aplicó para estimar las proporciones relativas de 22 fenotipos de células inmunitarias humanas.^[35] Concurrentemente, se utilizó el algoritmo xCELL para calcular las puntuaciones de enriquecimiento para 64 tipos de células inmunitarias y estromales basándose en el análisis de enriquecimiento de firmas génicas.^[36]

Inmunohistoquímica (IHC)

Se utilizó un anticuerpo anti-CASP de conejo (1:3000, 11733-1-AP, Proteintech) para la tinción de IHC. La expresión de CASP se evaluó mediante la puntuación de reactividad inmune (IRS), calculada como IRS = intensidad de la tinción × porcentaje de células positivas. El porcentaje de células positivas se clasificó de la siguiente manera: 0 (negativo), 1 (80%). La intensidad se clasificó de la siguiente manera: 0 (sin tinción), 1 (débilmente positivo, amarillo claro), 2 (moderadamente positivo, marrón-amarillo) y 3 (fuertemente positivo, marrón) (Figura S2C). La expresión de CASP se clasificó como baja (IRS ≤ 4) o alta (IRS ≥ 9).

Construcción de líneas celulares estables con sobreexpresión y silenciamiento de CASP

Se diseñaron shRNAs específicos dirigidos a CASP y una secuencia de control aleatoria (Tabla S1) y se clonaron en el vector pLKO. El cDNA de CASP (NM_001913.5), amplificado a partir de células de cáncer de colon, se clonó en los vectores de expresión pCDH-EF1-Puro o pcDNA3.1-3×FLAG.

Los plásmidos de sobreexpresión de CASP, shRNA de CASP y control se cotransfectaron con los plásmidos psPAX2 y PMD2.G en células 293T. Después de 48 horas, el sobrenadante se recogió y se filtró a través de un filtro de 0,45 μm para las infecciones posteriores. Para la transducción viral, se sembraron 5 × 104 células en placas de 12 pocillos e se incubaron con 1 mL de solución lentiviral que contenía 8-12 μg/mL de polibreno. Después de 48-72 horas de transducción, las células se seleccionaron con 2 μg/mL de puromicina hasta la eliminación completa de las células no infectadas.

Western blot

Las proteínas se extrajeron utilizando el tampón RIPA (AR0102, Boster), se separaron en geles SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: ?-actina (1:5000, M1210-2, Huabio), GAPDH (1:50000, 60004-1-Ig, Proteintech), CASP (1:2000, 11733-1-AP, Proteintech), c-Myc (1:5000, 67447-1-Ig, Proteintech), Cyclin D1 (1:1000, 55506, Cell Signaling Technology), p21 (1:1000, 2947, Cell Signaling Technology), N-cadherin (1:5000, 22018-1-AP, Proteintech), Vimentin (1:5000, 10366-1-AP, Proteintech), MMP-9 (1:1000, 10375-2-AP, Proteintech) y ?-catenina (1:1000, EM0306, Huabio). Los inmunoblot se sondearon con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (1:5000, HA1001, HA1006, Huabio) y se visualizaron utilizando un reactivo de detección de quimioluminiscencia mejorada (ECL, AR1172, Boster).

Inmunofluorescencia

Las células de CRC se sembraron en placas de microscopía confocal y se cultivaron durante 24 horas. A continuación, las células se fijaron con formaldehído al 4% frío durante 15 minutos a temperatura ambiente (TA) y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% durante 10 minutos. El bloqueo se realizó utilizando el tampón de bloqueo (P0260, Beyotime) suplementado con Triton X-100 al 0,1% durante 60 minutos. A continuación, las células se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra CASP (1:200, 11733-1-AP, Proteintech) o ?-catenina (1:200, EM0306, Huabio). Después del lavado, las células se incubaron con IgG anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 488 (1:300, ab150073, Abcam) durante 2 horas a TA. Después de los lavados con PBS, las células se incubaron con Alexa Fluor® 647 Anti-GM130 (1:1000, ab195303, Abcam) durante 2 horas a TA y se lavaron con PBS y se contrateñeron con DAPI (P0131, Beyotime) durante 10 minutos. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal LSM900 (Zeiss, Alemania).

Aislamiento de ARN y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR)

Se extrajo el ARN total de las células de CRC utilizando el kit de purificación de ARN-Quick (RN001, ES science, Shanghái, China) siguiendo el protocolo del fabricante. Se utilizó el 5×PrimeScript RT Master Mix (RR036Q, Takara) para la transcripción inversa. Se aplicó el kit SYBR Green qPCR (AG11701, Accurate Biotechnology, Hunan, China) para la RT-qPCR mediante el sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7500 Fast. Se utilizó ?-ACTINA como control de carga. Se utilizó el método 2-ΔΔCt para los cálculos de expresión relativa. Las secuencias de los cebadores específicas para cada gen son las siguientes:

CASP sentido: 5'-GGAGGTGCTGTTGCTGGAGAAG-3',

CASP reverso: 5'-CCGCTGGATGGACTGAATGATGCT-3',

p200 CUX1 sentido: 5'-CCAGAGCCTGAACAGACTATTT-3',

p200 CUX1 reverso: 5'-CTTTAAGGCAGGGTCGAGGGCA-3',

?-ACTINA sentido: 5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3',

?-ACTINA reverso: 5'-TCCCTGGAGAAGAGCTACG-3'.

Evaluación de la viabilidad celular y ensayo del ciclo celular

La capacidad proliferativa de las células de CRC se evaluó utilizando el kit de recuento de células-8 (CCK-8, K1018, APExBIO). Se sembraron células de CRC (1-1,5 × 103 por pocillo) en placas de 96 pocillos. Después de permitir que las células se adhirieran y se recuperaran, se añadieron 10 μL de reactivo CCK-8 a 100 μL de medio de cultivo diariamente durante 7 días consecutivos. Las placas se incubaron en la oscuridad a 37 °C durante 90 minutos y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de ELISA.

Para el análisis del ciclo celular, se utilizó el kit de tinción del ciclo celular (CCS012, Multi Sciences Biotech) siguiendo el protocolo del fabricante. Las células teñidas se analizaron utilizando un citómetro de flujo DxFLEX (Beckman) y los resultados se procesaron con el software CytExpert.

Ensayo de formación de colonias

Se sembraron un total de 500-800 células de CRC en una placa de 6 pocillos. Después de 10 días, se formaron colonias de células, que se fijaron con formaldehído al 4% durante 15-30 minutos y se lavaron con PBS. A continuación, se añadió solución de tinción de cristal violeta a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 15-30 minutos. Las células se lavaron con PBS varias veces hasta que el fondo de la placa estuviera limpio. Una vez secas, se fotografiaron las colonias.

Ensayos de migración e invasión celular

Se utilizó un ensayo Transwell con cámaras de poro de 8 μm (3422, Corning) para evaluar el potencial metastásico de las células de CRC. Las cámaras se pre-recubrieron con Matrigel (356234, Corning) para imitar la matriz extracelular. Se añadió una suspensión libre de FBS de 200 μL que contenía 6 × 104 (migratorias) u 8 × 104 (invasivas) células DLD-1, o 1 × 105 células LoVo/HCT116, a la cámara superior, mientras que se añadieron 800 μL de medio de cultivo con 20% de FBS a la cámara inferior. Después de 24 horas (DLD-1) o 48 horas (LoVo, HCT116), la cámara superior se lavó con PBS, se fijó con formaldehído al 4% durante 15 minutos a TA y se tiñó con cristal violeta durante 15-30 minutos. Las células no migradas de la superficie de la membrana superior se eliminaron con un hisopo de algodón. Las células migrantes e invasivas se visualizaron utilizando un microscopio óptico invertido (Axio Observer 3, Zeiss) y se cuantificaron con el software ImageJ.

Ensayo de co-inmunoprecipitación (Co-IP)

Después de 48 horas de transfección con los plásmidos indicados, las células se lisaron utilizando el tampón de lisis IP (87787, Thermo Fisher Scientific). Los lisados se sometieron a inmunoprecipitación con cuentas magnéticas FLAG M2 (M8823, Sigma Aldrich), cuentas Anti-His (L-1015, Biolinkedin) o cuentas de agarosa Ni-NTA (HY-K0241, MedChemExpress), siguiendo estrictamente los protocolos de los respectivos fabricantes.

Para la co-inmunoprecipitación (Co-IP) endógena, se recogieron y lisaron las células DLD-1 o LoVo. Los lisados celulares se incubaron durante la noche a 4 °C con cuentas de proteína A/G (HY-K0202, MedChemExpress) que se habían pre-acoplado con un anticuerpo anti-CASP o un anticuerpo IgG de control durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las proteínas unidas a las cuentas se lavaron con tampón de elución de IgG (21028, Thermo Fisher Scientific) y se neutralizaron con Tris-HCl (pH 8,8). Las proteínas eluidas se analizaron finalmente mediante Western blot (WB).

La identificación de las proteínas interactuantes se llevó a cabo mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) en Oebiotech (Shanghái, China).

Silenciamiento mediante siRNA

Se sembraron células DLD-1 en placas de 12 pocillos. Cuando las células alcanzaron una confluencia del 50-60%, se transfectó siRNA (GenePharma, Shanghái, China) en las células utilizando Lipofectamine 3000 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de 48 horas de incubación, las células se recogieron para los experimentos posteriores. Las secuencias del siRNA de TRIM21 son las siguientes: sentido: 5'-GCAUGGUCUCCUUCUACAATT-3' y antisentido: 5'-UUGUAGAAGGAGACCAUGCTT-3'.

Ensayo de renovación

Las células DLD-1 con silenciamiento de CASP y las células de control respectivas se sembraron en placas de 12 pocillos. Después de una incubación de 24 horas, se reemplazó el medio de cultivo por uno que contenía CHX, 60 (μg/ml) para inhibir la síntesis de proteínas. Las células se lisaron en los puntos de tiempo indicados después de la exposición a CHX. Los extractos de proteínas resultantes se sometieron a análisis de WB para determinar la abundancia de la proteína diana a lo largo del tiempo.

Ensayo de ubiquitinación

Las células 293T se cotransfectaron con plásmidos que codificaban shRNA de CASP o control negativo, TRIM21-His y plásmidos HA-Ub durante 72 horas. Seis horas antes de la recolección, las células se trataron con 20 μM de MG132 para inhibir la degradación proteasómica. Los lisados celulares se incubaron con agarosa Ni-NTA para extraer las proteínas marcadas con His. Después de lavados exhaustivos, las proteínas unidas se eluyeron hirviéndolas en tampón de carga SDS 2× durante 5 minutos. Los niveles de ubiquitinación se analizaron posteriormente mediante WB utilizando los anticuerpos indicados.

Experimentos con animales

Para el modelo de tumor subcutáneo, se inyectaron un total de 5 × 106 células de CRC en 100 μL en el flanco derecho de ratones nude. Los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos: Scramble (n=5) y shCASP-1 (n=5). El tamaño de los tumores se midió cada 4 días y el volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula: Volumen = ½ × longitud × anchura2. Después de 45 días (DLD-1) o 53 días (LoVo), se sacrificaron los ratones y se extirparon los tumores y se pesaron.

Para el modelo de tumor metastásico, se inyectaron un total de 2 × 106 células LoVo en 200 μL en la vena de la cola de ratones NSG. Los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos: Scramble (n=5) y shCASP-1 (n=5). Se realizó una imagen de bioluminiscencia in vivo el día de la inyección y cada 5-12 días después para controlar la formación de tumores metastásicos. El día 34, se sacrificaron los ratones y se disecaron sus pulmones e hígados, se visualizaron ex vivo y se fijaron en formaldehído al 4%.

Análisis bioinformático

Todos los perfiles de expresión de ARNm de CRC de nivel 3 y los datos clínicos de los pacientes con CRC se obtuvieron de TCGA. Se excluyeron los genes con niveles de expresión inferiores a 1 en más del 50% de las muestras. Los archivos CEL sin procesar para GSE41258, GSE14333 y GSE39582 se descargaron del Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

Las diferencias en la supervivencia entre los grupos con alta o baja expresión de CASP se evaluaron mediante el método de Kaplan-Meier y se analizaron con la prueba de log-rank utilizando las funciones survfit y survdiff del paquete survival de R.^[34]

Los datos de expresión masiva se reanalizaron con una versión actualizada del software DIA-NN. Las proteínas diferencialmente expresadas (PDE) entre los subgrupos se seleccionaron según un valor de P < 0,05 y un cambio de expresión > 2, basándose en la prueba t de Student.

Los niveles de infiltración de células inmunitarias en las muestras de CRC se evaluaron utilizando los algoritmos CIBERSORT y xCELL. Se obtuvieron datos de expresión génica estandarizados de los conjuntos de datos GEO. El algoritmo CIBERSORT, que emplea una regresión de vectores de soporte lineal para deconvolucionar los datos de transcriptómica, se aplicó para estimar las proporciones relativas de 22 fenotipos de células inmunitarias humanas.^[35] Concurrentemente, se utilizó el algoritmo xCELL para calcular las puntuaciones de enriquecimiento para 64 tipos de células inmunitarias y estromales basándose en el análisis de enriquecimiento de firmas génicas.^[36]

Inmunohistoquímica (IHQ)

Se utilizó un anticuerpo anti-CASP de conejo (1:3000, 11733-1-AP, Proteintech) para la tinción por IHQ. La expresión de CASP se evaluó mediante el índice de reactividad inmune (IRS), calculado como IRS = intensidad de la tinción × porcentaje de células positivas. El porcentaje de células positivas se clasificó de la siguiente manera: 0 (negativo), 1 (80%). La intensidad se clasificó de la siguiente manera: 0 (sin tinción), 1 (débilmente positivo, amarillo claro), 2 (moderadamente positivo, marrón-amarillo) y 3 (fuertemente positivo, marrón) (Figura S2C). La expresión de CASP se clasificó como baja (IRS ≤ 4) o alta (IRS ≥ 9).

Construcción de líneas celulares estables con sobreexpresión y silenciamiento de CASP

Se diseñaron shRNAs específicos dirigidos a CASP y una secuencia de control aleatoria (Tabla S1) y se clonaron en el vector pLKO. El cDNA de CASP (NM_001913.5), amplificado a partir de células de cáncer de colon, se clonó en los vectores de expresión pCDH-EF1-Puro o pcDNA3.1-3×FLAG.

Los plásmidos de sobreexpresión de CASP, shRNA de CASP y control se cotransfectaron con los plásmidos psPAX2 y PMD2.G en células 293T. Después de 48 horas, se recogió el sobrenadante y se filtró a través de un filtro de 0,45 μm para las infecciones posteriores. Para la transducción viral, se sembraron 5 × 104 células en placas de 12 pocillos e se incubaron con 1 mL de solución lentiviral que contenía 8-12 μg/mL de polibreno. Después de 48-72 horas de transducción, se seleccionaron las células con 2 μg/mL de puromicina hasta la eliminación completa de las células no infectadas.

Western blot

Las proteínas se extrajeron utilizando el tampón RIPA (AR0102, Boster), se separaron en geles SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: ?-actina (1:5000, M1210-2, Huabio), GAPDH (1:50000, 60004-1-Ig, Proteintech), CASP (1:2000, 11733-1-AP, Proteintech), c-Myc (1:5000, 67447-1-Ig, Proteintech), Cyclin D1 (1:1000, 55506, Cell Signaling Technology), p21 (1:1000, 2947, Cell Signaling Technology), N-caderina (1:5000, 22018-1-AP, Proteintech), Vimentina (1:5000, 10366-1-AP, Proteintech), MMP-9 (1:1000, 10375-2-AP, Proteintech) y ?-catenina (1:1000, EM0306, Huabio). Los inmunoblots se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (1:5000, HA1001, HA1006, Huabio) y se visualizaron utilizando un reactivo de detección de quimioluminiscencia mejorada (ECL, AR1172, Boster).

Inmunofluorescencia

Las células de CRC se sembraron en placas de microscopía confocal y se cultivaron durante 24 horas. Luego, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% frío durante 15 minutos a temperatura ambiente (TA) y se permeabilizaron con 0,1% de Triton X-100 durante 10 minutos. El bloqueo se realizó utilizando el tampón de bloqueo (P0260, Beyotime) suplementado con 0,1% de Triton X-100 durante 60 minutos. Luego, las células se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra CASP (1:200, 11733-1-AP, Proteintech) o ?-catenina (1:200, EM0306, Huabio). Después del lavado, las células se incubaron con IgG anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 488 (1:300, ab150073, Abcam) durante 2 horas a TA. Después de los lavados con PBS, las células se incubaron con Alexa Fluor® 647 Anti-GM130 (1:1000, ab195303, Abcam) durante 2 horas a TA y se lavaron con PBS y se contrateñeron con DAPI (P0131, Beyotime) durante 10 minutos. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal LSM900 (Zeiss, Alemania).

Aislamiento de ARN y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR)

Se extrajo el ARN total de las células de CRC utilizando el kit de purificación de ARN (RN001, ES science, Shanghái, China) siguiendo el protocolo del fabricante. Se utilizó el 5× PrimeScript RT Master Mix (RR036Q, Takara) para la transcripción inversa. Se aplicó el kit SYBR Green qPCR (AG11701, Accurate Biotechnology, Hunan, China) para la RT-qPCR mediante el sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7500 Fast. Se utilizó ?-ACTINA como control de carga. Se utilizó el método 2-ΔΔCt para los cálculos de expresión relativa. Las secuencias de los primers específicos para cada gen fueron las siguientes:

CASP sentido: 5'-GGAGGTGCTGTTGCTGGAGAAG-3',

CASP reverso: 5'-CCGCTGGATGGACTGAATGATGCT-3',

p200 CUX1 sentido: 5'-CCAGAGCCTGAACAGACTATTT-3',

p200 CUX1 reverso: 5'-CTTTAAGGCAGGGTCGAGGGCA-3',

?-ACTINA sentido: 5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG3',

?-ACTINA reverso: 5'-TCCCTGGAGAAGAGCTACG.

Evaluación de la viabilidad celular y ensayo del ciclo celular

Se evaluó la capacidad proliferativa de las células de CRC utilizando el kit de conteo de células (CCK-8, K1018, APExBIO). Se sembraron células de CRC (1-1,5 × 103 por pocillo) en placas de 96 pocillos. Después de permitir que las células se adhirieran y se recuperaran, se añadieron 10 μL de reactivo CCK-8 a 100 μL de medio de cultivo diariamente durante 7 días consecutivos. Las placas se incubaron en la oscuridad a 37 °C durante 90 minutos y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de ELISA.

Para el análisis del ciclo celular, se utilizó el kit de tinción del ciclo celular (CCS012, Multi Sciences Biotech) siguiendo el protocolo del fabricante. Las células teñidas se analizaron utilizando un citómetro de flujo DxFLEX (Beckman) y los resultados se procesaron con el software CytExpert.

Ensayo de formación de colonias

Se sembraron un total de 500-800 células de CRC en una placa de 6 pocillos. Después de 10 días, se formaron colonias celulares, se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15-30 minutos y se lavaron con PBS. Luego, se añadió solución de tinción con cristal violeta a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 15-30 minutos. Las células se lavaron con PBS varias veces hasta que el fondo de la placa estuviera limpio. Una vez secas, se fotografiaron las colonias.

Ensayos de migración e invasión celular

Se utilizó un ensayo Transwell con cámaras de poro de 8 μm (3422, Corning) para evaluar el potencial metastásico de las células de CRC. Las cámaras se pre-recubrieron con Matrigel (356234, Corning) para imitar la matriz extracelular. Se añadió una suspensión libre de FBS de 200 μL que contenía 6 × 104 (migratorias) u 8 × 104 (invasivas) células DLD-1, o 1 × 105 células LoVo/HCT116, a la cámara superior, mientras que se añadieron 800 μL de medio de cultivo con 20% de FBS a la cámara inferior. Después de 24 horas (DLD-1) o 48 horas (LoVo, HCT116), la cámara superior se lavó con PBS, se fijó con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a TA y se tiñó con cristal violeta durante 15-30 minutos. Las células no migradas en la superficie de la membrana superior se eliminaron con un hisopo de algodón. Las células migrantes e invasivas se visualizaron utilizando un microscopio óptico invertido (Axio Observer 3, Zeiss) y se cuantificaron con el software ImageJ.

Ensayo de co-inmunoprecipitación (Co-IP)

Después de 48 horas de transfección con los plásmidos indicados, las células se lisaron utilizando el tampón de lisis IP (87787, Thermo Fisher Scientific). Los lisados se sometieron a inmunoprecipitación con perlas magnéticas FLAG M2 (M8823, Sigma Aldrich), perlas Anti-His (L-1015, Biolinkedin) o perlas de agarosa Ni-NTA (HY-K0241, MedChemExpress), siguiendo estrictamente los protocolos de los respectivos fabricantes.

Para la co-inmunoprecipitación (Co-IP) endógena, se recogieron y lisaron las células DLD-1 o LoVo. Los lisados celulares se incubaron durante la noche a 4 °C con perlas de proteína A/G (HY-K0202, MedChemExpress) que se habían pre-acoplado con un anticuerpo anti-CASP o un anticuerpo IgG de control durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las proteínas unidas a las perlas se lavaron con tampón de elución de IgG (21028, Thermo Fisher Scientific) y se neutralizaron con Tris-HCl (pH 8,8). Las proteínas eluidas se analizaron finalmente mediante Western blot (WB).

La identificación de las proteínas interactuantes se llevó a cabo mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) en Oebiotech (Shanghái, China).

Silenciamiento mediante siRNA

Se sembraron células DLD-1 en placas de 12 pocillos. Cuando las células alcanzaron una confluencia del 50-60%, se transfectó siRNA (GenePharma, Shanghái, China) en las células utilizando Lipofectamine 3000 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de 48 horas de incubación, se recogieron las células para los experimentos posteriores. Las secuencias del siRNA de TRIM21 fueron las siguientes: sentido: 5'-GCAUGGUCUCCUUCUACAATT-3' y antisentido: 5'-UUGUAGAAGGAGACCAUGCTT-3'.

Ensayo de renovación

Las células DLD-1 con silenciamiento de CASP y las células de control respectivas se sembraron en placas de 12 pocillos. Después de una incubación de 24 horas, se reemplazó el medio de cultivo por uno que contenía CHX, 60 (μg/ml) para inhibir la síntesis de proteínas. Las células se lisaron en los puntos de tiempo indicados después de la exposición a CHX. Los extractos proteicos resultantes se sometieron a análisis de WB para determinar la abundancia de la proteína diana a lo largo del tiempo.

Ensayo de ubiquitinación

Las células 293T se cotransfectaron con plásmidos que codificaban shRNA de CASP o control negativo, TRIM21-His y plásmidos HA-Ub durante 72 horas. Seis horas antes de la recolección, las células se trataron con 20 μM de MG132 para inhibir la degradación proteasómica. Los lisados celulares se incubaron con agarosa Ni-NTA para extraer las proteínas marcadas con His. Después de lavados exhaustivos, las proteínas unidas se eluyeron hirviéndolas en tampón de carga SDS 2× durante 5 minutos. Los niveles de ubiquitinación se analizaron posteriormente mediante WB utilizando los anticuerpos indicados.

Experimentos con animales

Para el modelo de tumor subcutáneo, se inyectaron un total de 5 × 106 células de CRC en 100 μL en el flanco derecho de ratones nude. Los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos: Scramble (n=5) y shCASP-1 (n=5). El tamaño de los tumores se midió cada 4 días y se calculó el volumen tumoral utilizando la fórmula: Volumen = ½ × longitud × ancho2. Después de 45 días (DLD-1) o 53 días (LoVo), se sacrificaron los ratones y se extirparon los tumores y se pesaron.

Para el modelo de tumor metastásico, se inyectaron un total de 2 × 106 células LoVo en 200 μL en la vena de la cola de ratones NSG. Los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos: Scramble (n=5) y shCASP-1 (n=5). Se realizó una imagen de bioluminiscencia in vivo el día de la inyección y cada 5-12 días después para controlar la formación de tumores metastásicos. El día 34, se sacrificaron los ratones y se disecaron sus pulmones e hígados, se visualizaron ex vivo y se fijaron en paraformaldehído al 4%.

Cuantificación y análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos y las representaciones gráficas se realizaron utilizando GraphPad Prism v9.0. Los datos cuantitativos se presentaron como medias ± DE. Para las comparaciones entre dos grupos, se utilizaron pruebas t de Student no pareadas o pareadas, según el diseño experimental. Se realizó una prueba de Chi-cuadrado para examinar la asociación entre las variables categóricas. Se calculó el coeficiente de correlación de Pearson para determinar la fuerza de las asociaciones. La significación estadística se definió como un valor de P bilateral < 0,05 (P < 0,05, * P < 0,01, P < 0,001, * P < 0,0001, ns = sin diferencia significativa).