SMCO: un modelo de aprendizaje profundo que integra el ecosistema del entorno microambiental celular a nivel de resolución unicelular y la omicología múltiple para la predicción de supervivencia en pacientes con CRC.

Según las estadísticas globales de cáncer de 2020 de la Organización Mundial de la Salud, el cáncer colorrectal (CCR) ocupa el tercer lugar en incidencia y el segundo en mortalidad entre todos los cánceres [^[1]]. Una evaluación precisa del pronóstico de supervivencia desempeña un papel fundamental en la toma de decisiones terapéuticas y sigue siendo una de las tareas clínicas más desafiantes [^[2]]. El sistema de estadificación tumor-nodo-metástasis (TNM), publicado por el Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer, se utiliza habitualmente para evaluar la etapa del tumor, predecir la supervivencia y guiar las estrategias de tratamiento. Sin embargo, la considerable heterogeneidad tumoral conduce a una variación sustancial en la supervivencia entre pacientes con etapas idénticas [^[3]]. Con el creciente énfasis en la medicina de precisión y los avances en los marcadores moleculares relacionados con el tumor, depender únicamente de la estadificación TNM es insuficiente para satisfacer las necesidades clínicas actuales [^[4]]. Por lo tanto, deben desarrollarse sistemas de evaluación pronóstica sólidos para ayudar a los clínicos en el diseño de regímenes de tratamiento personalizados.

En 2015, el Consorcio de Subtipos de CCR estableció cuatro subtipos moleculares de consenso (CMS) basados en características transcriptómicas: inmunológico (CMS1), canónico (CMS2), metabólico (CMS3) y mesenquimal (CMS4) [^[5]]. Entre estos subtipos, el CMS4 se define por una prominente transición epitelio-mesenquimal (TEM) y se asocia con la peor supervivencia general. Aunque la clasificación CMS sigue siendo el sistema más autorizado para el CCR hasta la fecha, se deriva de perfiles de expresión génica promedio a nivel de tejido basados en transcriptomas globales que incluyen tanto células epiteliales malignas como componentes microambientales (por ejemplo, células inmunitarias y células del estroma). Este método enmascara inherentemente la dinámica de la expresión génica a nivel de célula única, lo que puede conducir a una clasificación errónea. Estudios previos han demostrado que los datos de resolución a nivel de célula única pueden revelar nuevos estados celulares, y la integración de estas características promete refinar el sistema de clasificación CMS [^[6]]. El microambiente tumoral (MET) es un ecosistema altamente estructurado compuesto por diversas poblaciones celulares, incluidas las células tumorales, las células del estroma y las células inmunitarias, así como complejas interacciones intercelulares. Estas características hacen del MET un recurso valioso para mejorar aún más la estratificación de pacientes basada en la secuenciación de ARN global [^[7]].

La secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) permite una caracterización exhaustiva del MET a nivel celular. Sin embargo, la aplicación de scRNA-seq a grandes cohortes de pacientes sigue siendo difícil debido a los altos costos y los estrictos requisitos de las muestras [^[8]]. Hasta donde sabemos, aún no se ha establecido una cohorte a gran escala de scRNA-seq con un seguimiento de la supervivencia que supere los 5 años para estudios de tumores. En contraste, la secuenciación de ARN global convencional ha producido conjuntos de datos extensos con información de supervivencia bien anotada, aunque este enfoque carece inherentemente de resolución celular. El algoritmo EcoTyper propuesto por Luca et al. permite la deconvolución de la secuenciación de ARN global en características del MET a resolución celular, incluidos los estados celulares y los ecosistemas multicelulares, utilizando scRNA-seq como referencia [^[9]]. Este enfoque integra eficazmente la secuenciación de célula única y la secuenciación global, superando la brecha de resolución al tiempo que aprovecha las fortalezas complementarias de ambas tecnologías. En particular, EcoTyper facilita el análisis del MET a resolución celular en grandes cohortes de secuenciación de ARN global con datos de seguimiento clínico completos.

Los datos multiómicos desempeñan un papel fundamental en el avance de la investigación del cáncer y la oncología de precisión, particularmente en aplicaciones como la subtipificación del cáncer, la predicción de la supervivencia y el descubrimiento de biomarcadores [^[10]]. Por ejemplo, Song et al. realizaron un análisis integrado de datos genómicos, transcriptómicos y proteómicos e identificaron cinco subtipos distintos de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM). El subtipo 4 se caracterizó por un alto potencial metastásico y una mala supervivencia, lo que representa un subgrupo no distinguido por la clasificación histopatológica convencional. Este descubrimiento tiene importantes implicaciones para el desarrollo de estrategias de tratamiento personalizadas en el CPNM [^[11]]. En el CCR, Roelands et al. integraron datos transcriptómicos y del microbioma (MIC) del tejido tumoral de pacientes con CCR primario para caracterizar el MET del CCR y construir un modelo de predicción de la supervivencia. Este modelo refinó la estratificación dentro de los pacientes con CMS4 y reveló que un subconjunto de pacientes con CMS4 exhibió una supervivencia más prolongada a pesar de los resultados generalmente desfavorables asociados con este subtipo [^[12]]. De manera similar, Luís Nunes et al. analizaron datos genómicos y transcriptómicos de una gran cohorte de CCR y propusieron cinco subtipos pronósticos de CCR (CRPS). Entre ellos, CRPS2 y CRPS4 se clasificaron como CMS4, pero los pacientes con CRPS2 experimentaron una supervivencia significativamente más prolongada que aquellos con CRPS4, lo que destaca aún más las limitaciones del sistema de clasificación CMS [^[13]]. En conjunto, estos estudios demuestran que la integración multiómica fortalece la estratificación del riesgo al tiempo que proporciona información multidimensional sobre la biología del tumor, ofreciendo una base para el refinamiento del sistema de clasificación CMS.

En resumen, los avances en los algoritmos para el perfilado del ecosistema tumoral y la creciente disponibilidad de datos multiómicos han creado nuevas oportunidades para establecer modelos de pronóstico tumoral precisos y refinar el sistema de clasificación CMS. Basándonos en estos recursos, desarrollamos un nuevo modelo de aprendizaje profundo que integra características del ecosistema MET a resolución de célula única con datos multiómicos (SCMO) para la predicción de la supervivencia. El modelo utiliza una arquitectura de red neuronal de auto-normalización (SNN) y demuestra un rendimiento superior en comparación con los enfoques existentes. Para mejorar la interpretabilidad, incorporamos el algoritmo de Gradientes Integrados, que identificó la proteína asociada al receptor del factor de necrosis tumoral 1 (TRAP1) como una característica crítica y guio la posterior validación experimental de la actividad anticancerígena de la saikosaponina A in vitro.

Materiales y métodos

Recopilación y procesamiento de datos de scRNA-seq de CCR

Recopilamos datos de scRNA-seq de 213 muestras de CCR sin tratamiento previo, que cubren toda la región de la resección quirúrgica radical (Tabla S1). La matriz de expresión se procesó con Seurat (v5) utilizando los siguientes umbrales de control de calidad: se excluyeron las células que expresaban menos de 500 genes o que contenían menos de 500 identificadores moleculares únicos, así como las células con > 15% de contenido de genes mitocondriales. Los dobletes se identificaron y eliminaron con scDblFinder [^[14]]. Después del control de calidad, la expresión génica se normalizó con la función NormalizeData y se identificaron los 2000 genes más variables utilizando la función FindVariableFeatures (método = “vst”). Los efectos de lote se corrigieron con Harmony [^[15]]. La reducción de la dimensionalidad se realizó seleccionando los 30 principales componentes para la visualización y el análisis de agrupamiento mediante la aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP). Los grupos de células se identificaron con la función FindClusters; los genes expresados diferencialmente (DEG) entre los grupos se determinaron con FindAllMarkers. La anotación del tipo de célula se realizó utilizando genes marcadores establecidos. Este flujo de trabajo generó un atlas de célula única completo del MET específico del CCR.

Descubrimiento de características específicas del MET del CCR mediante el algoritmo EcoTyper

La matriz de expresión derivada del atlas de célula única del MET específico del CCR se analizó con la canalización EcoTyper para identificar características del MET de novo, incluidos tanto los estados celulares como los ecosistemas multicelulares. Los estados celulares representan programas funcionales distintos dentro de un tipo de célula, mientras que los ecosistemas multicelulares consisten en comunidades coordinadas de estos estados. El control de calidad de los datos se realizó de acuerdo con los requisitos de EcoTyper, y todos los análisis se adhirieron a su flujo de trabajo estandarizado. Las redes de ecosistemas se visualizaron en Cytoscape [^[16]]; los pesos de los bordes correspondieron a los coeficientes de similitud de Jaccard entre los estados celulares que interactúan.

Recuperación del MET específico del CCR a partir de datos de secuenciación de ARN global y exploración de características relacionadas con la supervivencia

Se adquirieron conjuntos de datos de secuenciación de ARN global de cuatro cohortes independientes: Del et al. [^[17]] (n = 124), Yue et al. [^[18]] (n = 585), Roelands et al. [^[19]] (n = 348) y la cohorte del Proyecto Genoma del Cáncer (TCGA)-CCR (adenocarcinoma de colon [COAD] y adenocarcinoma de recto [READ]) [^[20]] (n = 619). Considerando las características del MET específico del CCR derivadas de la secuenciación de ARN de célula única como firmas de referencia, utilizamos la canalización EcoTyper para deconvolucionar los datos de secuenciación de ARN global y cuantificar las abundancias de los estados celulares y los ecosistemas. Luego, se realizó una regresión de riesgos proporcionales de Cox univariada para identificar los estados celulares y los ecosistemas que estaban significativamente asociados con la supervivencia general (p < 0,05), que se retuvieron para el modelado pronóstico. Para la evaluación comparativa del rendimiento predictivo, aplicamos tres algoritmos de deconvolución adicionales: CIBERSORTx [^[21]], Bisque [^[22]] y MuSiC [^[23]], para reconstruir las características del MET en la cohorte TCGA-CRC utilizando el mismo atlas específico del CCR, y luego evaluamos su rendimiento en relación con EcoTyper.

Desarrollo y evaluación del modelo de predicción de supervivencia SCMO

Como se describió anteriormente, extrajimos características del MET, incluidos los estados celulares y las abundancias de los ecosistemas, de 619 pacientes en la cohorte TCGA-CRC a resolución de célula única. Además, se recuperaron los datos de supervivencia, los perfiles de expresión de ARN y los datos de mutación de ADN de la cohorte TCGA-CRC de la plataforma Xena [^[24]], que estandariza los datos brutos de TCGA en un formato uniforme para mejorar la usabilidad. Los datos de abundancia del MIC se obtuvieron de la base de datos BIC [^[25]], que alinea las lecturas humanas no mapeadas en la base de datos TCGA con referencias bacterianas para cuantificar la abundancia bacteriana intratumoral en diferentes tipos de cáncer. Para la selección de características pronósticas, la regresión de riesgos proporcionales de Cox univariada identificó 12 estados celulares, un ecosistema, 2018 características de ARN, 2876 alteraciones genómicas (493 variantes de un solo nucleótido y 2383 variaciones del número de copias) y 116 características microbianas que estaban significativamente asociadas con los resultados de supervivencia (p < 0,05; Tabla S2).

El modelo pronóstico se implementó utilizando una arquitectura SNN con cuatro capas totalmente conectadas. La capa de entrada recibió características integradas a través de una estrategia de fusión temprana [^[4]], combinando los datos del MET y los datos multiómicos en una matriz de características de 474 × 5023 para capturar los efectos sinérgicos entre los diferentes tipos de datos. Dos capas ocultas utilizaron funciones de activación de unidad lineal exponencial escalada (SELU), lo que permitió la auto-normalización mediante la preservación de las distribuciones de entrada-salida en las capas. Este mecanismo intrínseco estabilizó la propagación de la señal sin requerir técnicas de normalización externas, como la normalización por lotes [^[26]]. La función de activación SELU se define como:

La propiedad de auto-normalización se mantuvo mediante la configuración predeterminada de los parámetros para ? y ?, lo que aseguró que las salidas de la capa convergieran hacia una media de cero y una varianza unitaria al tiempo que incorporaban la regularización de abandono. La capa de salida final generó puntuaciones de riesgo específicas del paciente a través de una transformación totalmente conectada. El flujo de trabajo completo de optimización de parámetros se ilustra en la Figura S1 complementaria.

Los pacientes se estratificaron aleatoriamente en conjuntos de entrenamiento (80%) y prueba (20%). La optimización de hiperparámetros se realizó mediante una validación cruzada de cinco pliegues dentro del conjunto de entrenamiento; el índice de concordancia (C-índice) sirvió como la métrica de evaluación principal. La arquitectura óptima consistió en capas con 512, 512, 1024 y 256 neuronas (tasa de abandono = 0,15). Luego, se evaluó el rendimiento del modelo en el conjunto de prueba independiente. El análisis de la curva de características operativas del receptor (ROC) dependiente del tiempo cuantificó la precisión predictiva a los 1, 3 y 5 años. Se realizaron análisis comparativos con cinco métodos establecidos: bosque de supervivencia aleatorio (RSF) [^[27]], máquina de vectores de soporte de supervivencia (SVM) [^[28]], máquina de impulso de gradiente (GBM) [^[29]], CoxBoost [^[30]], DeepHit [^[31]] y DeepOmix [^[32]]. Se realizaron comparaciones adicionales para evaluar las mejoras en el rendimiento obtenidas mediante la integración multiómica en relación con los enfoques de un solo tipo de datos.

Para evaluar más a fondo la generalizabilidad de SCMO, recopilamos conjuntos de datos multiómicos de cinco tipos de cáncer adicionales: carcinoma de células escamosas del cuello uterino (CESC), carcinoma invasivo de mama (BRCA), carcinoma urotelial de vejiga (BLCA), carcinoma esofágico (ESCA) y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSC). Cada cohorte se procesó utilizando una canalización estandarizada de integración y preprocesamiento de datos para garantizar la coherencia en el desarrollo del modelo. A diferencia del desarrollo del modelo de CRC, que utilizó un atlas específico de CRC de novo para recuperar las características del microambiente tumoral (MET), los modelos para otros tipos de cáncer se construyeron utilizando el atlas pan-cáncer proporcionado por EcoTyper, ya que generar atlas específicos para cada tipo de cáncer sería prohibitivamente costoso en términos de recursos. Las características detalladas de la cohorte y el número de características incorporadas en cada modelo se resumen en la Tabla S3.

Identificación de características pronósticas críticas basadas en gradientes integrados y bioinformática

El modelo SCMO se interpretó mediante Gradientes Integrados [^[33]] para identificar las características con un valor pronóstico significativo; los resultados se visualizaron en formato de Explicaciones Aditivas de Shapley (SHAP) [^[34]]. Para dilucidar las funciones biológicas asociadas a los microbios, se analizaron las 100 características microbianas principales mediante OmicsNet [^[35]] para reconstruir una red de interacción microbio-metabolito-proteína de múltiples capas. Las interacciones microbio-metabolito se obtuvieron de la base de datos Atlas of Gene Regulation and Expression Analysis (AGORA) [^[36]], y las interacciones metabolito-proteína se obtuvieron de la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) [^[37]]. A continuación, se realizó un análisis de enriquecimiento de vías para los nodos de metabolitos y proteínas con el fin de caracterizar los procesos biológicos mediados por los microbios. El análisis de la topología de la red identificó los nodos centrales en función de la centralidad de grado, lo que permitió el reconocimiento sistemático de los microbios reguladores clave dentro de la red de múltiples capas.

Exploración de la función biológica y los patrones de distribución espacial de las características del MET específicas de CRC

Para investigar las funciones biológicas de las características del MET, realizamos un análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) [^[38]] en los genes marcadores específicos del estado celular utilizando la prueba exacta de Fisher. Además, se analizaron las redes de comunicación célula-célula dentro de los ecosistemas mediante CellChat [^[39]] para caracterizar las interacciones ligando-receptor clave. Se obtuvieron perfiles de transcriptómica espacial (TE) de la plataforma 10X Visium, que comprenden 12 muestras, incluidas siete tumores de grado 1 (G1) y cinco tumores de grado 3 (G3) (Tabla S4) [^[40]]. Estos datos facilitaron la investigación de los patrones de distribución espacial de los estados celulares y los ecosistemas en las etapas temprana y tardía del CRC. El atlas unicelular del MET específico de CRC sirvió como referencia para la deconvolución espacial; las abundancias de los tipos celulares dentro de cada punto se estimaron utilizando la descomposición robusta de tipos celulares (RCTD) [^[41]]. Las matrices de abundancia de tipos celulares resultantes se procesaron posteriormente mediante la canalización EcoTyper para reconstruir las distribuciones del estado celular y el ecosistema a nivel espacial. A continuación, se caracterizaron los patrones de organización espacial en dos niveles: (1) las correlaciones espaciales entre los estados celulares dentro de los ecosistemas se cuantificaron con coeficientes de correlación de Spearman, y (2) la agregación espacial del ecosistema se evaluó utilizando la estadística de Moran [^[42]], que mide las tendencias de agrupamiento local en las diferentes etapas del tumor.

Análisis de estratificación de riesgo del SCMO

Los pacientes se estratificaron en grupos de alto y bajo riesgo en función de las puntuaciones de riesgo medianas derivadas del modelo SCMO. Se generaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier con el paquete R survminer para visualizar las diferencias pronósticas entre los grupos. Para evaluar la relevancia clínica, se analizaron las puntuaciones de riesgo en relación con los parámetros clínicos clave, incluido el edad, el sexo, la etapa TNM y la clasificación CMS. La clasificación CMS se asignó con el paquete R CMSclassifier para evaluar la coherencia con los subtipos moleculares.

Cribado de compuestos terapéuticos y análisis de acoplamiento molecular

Se identificaron los genes diferencialmente expresados (GDE) entre las muestras tumorales y normales de los pacientes de alto riesgo utilizando el paquete R limma [^[43]]. Se realizó un cribado de una biblioteca de 562 compuestos naturales de la base de datos de medicina tradicional china HERB [^[44]] con el algoritmo CMap [^[45]], utilizando los GDE relevantes para la enfermedad como entrada. Se seleccionaron para un análisis posterior los compuestos con puntuaciones CMap < –75, lo que indica un posible efecto de reversión de las firmas de expresión génica asociadas a la enfermedad.

A continuación, predijimos los modos de unión de estos compuestos naturales a las proteínas codificadas por TRAP1 mediante el acoplamiento molecular. Se utilizó AutoDock [^[46]] para el acoplamiento con ajuste inducido. La estructura cristalina de la proteína TRAP1 (código PDB: 7U8X, resolución = 1,6 Å) se obtuvo de la Protein Data Bank. La proteína se preprocesó con las herramientas de AutoDock para conservar el ligando original de la estructura de co-cristal, que se utilizó para etiquetar las coordenadas espaciales del sitio de acoplamiento. Se consideraron flexibles los residuos dentro de los 6 Å del ligando de co-cristal. Las estructuras de los compuestos y las proteínas se hidrogenaron, protonaron y minimizaron energéticamente utilizando los componentes de AutoDock. Se seleccionó la mejor conformación de unión en función de la alineación espacial entre el compuesto y la proteína receptora, así como de las puntuaciones de acoplamiento. Los resultados del acoplamiento molecular se visualizaron con el software PyMOL.

Análisis de inmunohistoquímica

Se recogieron muestras de tumor y de tejido normal adyacente de tres pacientes con CRC tratados en el Hospital No. 2 de Ningbo: un caso en etapa I y dos casos en etapa IV. Tras la fijación con formalina y la inclusión en parafina, las secciones de tejido se procesaron para el análisis de inmunohistoquímica de la expresión de TRAP1. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo primario anti-TRAP1 de conejo (1:800, ABclonal A25919), seguido de una incubación durante 2 horas a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:200, ABclonal RK50015). La reactividad de TRAP1 se visualizó utilizando el cromógeno diaminobencidina, produciendo precipitados marrones en los sitios de los antígenos. La contratinción con hematoxilina proporcionó contraste nuclear antes del montaje. Las secciones teñidas con inmunohistoquímica se examinaron mediante microscopía óptica.

Cultivo celular

Las células HT29 y HCT116 se cultivaron en medio McCoy’s 5A, y las células SW480 se cultivaron en medio DMEM, cada uno suplementado con un 10% de suero fetal bovino, 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina (todos de Pricella Life Science & Technology Co., Ltd.). Las células se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2.

Análisis de Western blot

Las células se lisaron en tampón RIPA que contenía inhibidores de proteasas (TOPSCIENCE). Se utilizaron los siguientes anticuerpos para el análisis de Western blot: anticuerpo monoclonal de conejo contra la subunidad principal S de la NADH:ubiquinona oxidorreductasa (NDUFS)1 (1:10,00; ABclonal, A21192), anticuerpo primario anti-TRAP1 (1:10,00; ABclonal, A25919), anticuerpo monoclonal de conejo recombinante contra la sirtuina 3 (Sirt3) (1:1000; HUABIO, HA722251), anticuerpo monoclonal de conejo recombinante contra la glutaminasa (1:1000; HUABIO, HA722251) y anticuerpo monoclonal de conejo recombinante contra la actina de músculo liso alfa (1:10,000; HUABIO, HA722251). Se compraron geles de proteínas prefundidos Bis-Tris a Life-ilab (China). Las membranas se bloquearon con un 5% de leche en tampón fosfato salino que contenía Tween-20 para minimizar la unión inespecífica. Se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (ABclonal; 1:5000) para la detección. Se aplicaron reactivos de quimioluminiscencia mejorada a las membranas y las señales se detectaron con el sistema Azure Biosystems C280.

Medición de la generación de especies reactivas de oxígeno (ERO)

Para evaluar la generación de ERO, se trataron las células HT29, HCT116 y SW480 de adenocarcinoma de colon humano con TRAP1-IN-1 (40 µM) o saikosaponina A (20 µM) durante 24 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2. Los niveles intracelulares de ERO se cuantificaron mediante citometría de flujo (BD FACS Canto II) después de 30 minutos de incubación con la sonda fluorescente 2,7-diclorodihidrofluoresceína diacetato (H2DCFDA; 10 µM; Beyotime). Se recopilaron y analizaron los datos de intensidad de fluorescencia con el software FlowJo.

Ensayo de viabilidad celular

La viabilidad celular se analizó sembrando células de carcinoma de colon humano a una densidad de 8 × 103 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Después de una noche de adherencia en una incubadora humidificada (37 °C, 5% de CO2), las células se trataron con TRAP1-IN-1 (40 µM) o saikosaponina A (20 µM) durante 24 horas. La actividad metabólica se evaluó utilizando el kit de recuento celular-8 (CCK-8, TOPSCIENCE), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se añadió la solución CCK-8 a cada pocillo a una dilución de 1:10 en medio de cultivo y se incubó durante 4 horas a 37 °C. La absorbancia se midió a 450 nm con un espectrofotómetro de microplacas Infinite F50 Plus.

Ensayo de apoptosis

La apoptosis se evaluó utilizando la tinción dual con anexina V-fluoresceína isotiocianato/yoduro de propidio en células de carcinoma de colon humano. Las células se sembraron en placas de seis pocillos (5 × 104 células/pocillo) y se dejaron adherir durante la noche en una atmósfera humidificada (37 °C, 5% de CO2). A continuación, se trataron con TRAP1-IN-1 (40 µM) o saikosaponina A (20 µM) durante 24 horas. Después del tratamiento, las células se recogieron con tripsina libre de etilendiaminotetraacético, se lavaron una vez con tampón fosfato salino helado y se resuspendieron en tampón de unión. La suspensión se incubó con anexina V-fluoresceína isotiocianato (5 µL) e yoduro de propidio (5 µL) (Elabscience) durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Las poblaciones de apoptosis temprana y tardía se cuantificaron mediante citometría de flujo (BD FACS Canto II).

Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron con réplicas biológicas (n ≥ 2). Los datos se presentan como media ± error estándar de la media y se analizaron utilizando pruebas t de Student de dos colas no pareadas para las comparaciones entre grupos. La significación estadística se definió como p < 0,05; los niveles de significación se indican como *p < 0,05, p < 0,01 y *p < 0,001.

Recopilación y procesamiento de datos de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) de CRC

Recopilamos datos de scRNA-seq de 213 muestras de CRC sin tratamiento previo, que abarcan toda la región de la resección quirúrgica radical (Tabla S1). La matriz de expresión se procesó con Seurat (v5) utilizando los siguientes umbrales de control de calidad: se excluyeron las células que expresaban menos de 500 genes o que contenían menos de 500 identificadores moleculares únicos, así como las células con > 15% de contenido de genes mitocondriales. Los dobletes se identificaron y se eliminaron con scDblFinder [^[14]]. Después del control de calidad, la expresión génica se normalizó con la función NormalizeData y se identificaron los 2000 genes altamente variables con la función FindVariableFeatures (método = “vst”). Los efectos de lote se corrigieron con Harmony [^[15]]. La reducción de la dimensionalidad se realizó seleccionando los 30 principales componentes principales para la visualización UMAP y el análisis de agrupamiento. Los grupos de células se identificaron con la función FindClusters; los genes diferencialmente expresados (GDE) entre los grupos se determinaron con FindAllMarkers. La anotación del tipo celular se realizó utilizando genes marcadores establecidos. Este flujo de trabajo generó un atlas unicelular completo del MET específico de CRC.

Descubrimiento de características del MET específicas de CRC mediante el algoritmo EcoTyper

La matriz de expresión derivada del atlas unicelular del MET específico de CRC se analizó con la canalización EcoTyper para identificar de novo las características del MET, incluidos tanto los estados celulares como los ecosistemas multicelulares. Los estados celulares representan programas funcionales distintos dentro de un tipo celular, mientras que los ecosistemas multicelulares consisten en comunidades coordinadas de estos estados. Se realizó el control de calidad de los datos de acuerdo con los requisitos de EcoTyper, y todos los análisis se adhirieron a su flujo de trabajo estandarizado. Las redes de ecosistemas se visualizaron en Cytoscape [^[16]]; los pesos de los bordes correspondían a los coeficientes de similitud de Jaccard entre los estados celulares que interactúan.

Recuperación del MET específico de CRC a partir de datos de secuenciación de ARN masiva y exploración de las características relacionadas con la supervivencia

Se obtuvieron conjuntos de datos de RNA-seq masivo de cuatro cohortes independientes: Del et al. [^[17]] (n = 124), Yue et al. [^[18]] (n = 585), Roelands et al. [^[19]] (n = 348) y la cohorte The Cancer Genome Atlas (TCGA)-CRC (adenocarcinoma de colon [COAD] y adenocarcinoma de recto [READ]) [^[20]] (n = 619). Considerando las características del microambiente tumoral (TME) específicas de CRC derivadas de scRNA-seq como firmas de referencia, utilizamos el pipeline EcoTyper para deconvolucionar los datos de RNA-seq masivo y cuantificar las abundancias de estados celulares y ecosistemas. A continuación, se realizó una regresión de riesgos proporcionales de Cox univariante para identificar los estados celulares y ecosistemas significativamente asociados con la supervivencia global (p < 0,05), que se conservaron para el modelado pronóstico. Para una evaluación comparativa del rendimiento predictivo, aplicamos tres algoritmos de deconvolución adicionales: CIBERSORTx [^[21]], Bisque [^[22]] y MuSiC [^[23]], para reconstruir las características del TME en la cohorte TCGA-CRC utilizando el mismo atlas específico de CRC, y luego evaluamos su rendimiento en relación con EcoTyper.

Desarrollo y evaluación del modelo de predicción de supervivencia SCMO

Como se describió anteriormente, extrajimos las características del TME, incluidas las abundancias de estados celulares y ecosistemas, de 619 pacientes en la cohorte TCGA-CRC a nivel de célula única. Además, se recuperaron los datos de supervivencia, los perfiles de expresión de RNA y los datos de mutación de ADN para la cohorte TCGA-CRC de la plataforma Xena [^[24]], que estandariza los datos brutos de TCGA en un formato uniforme para mejorar la usabilidad. Los datos de abundancia de MIC se obtuvieron de la base de datos BIC [^[25]], que alinea las lecturas humanas no mapeadas en la base de datos TCGA con referencias bacterianas para cuantificar la abundancia bacteriana intratumoral en diferentes tipos de cáncer. Para la selección de características pronósticas, la regresión de riesgos proporcionales de Cox univariante identificó 12 estados celulares, un ecosistema, 2018 características de RNA, 2876 alteraciones genómicas (493 variantes de un solo nucleótido y 2383 variaciones en el número de copias) y 116 características microbianas que estaban significativamente asociadas con los resultados de supervivencia (p < 0,05; Tabla S2).

El modelo pronóstico se implementó utilizando una arquitectura de red neuronal convolucional (SNN) con cuatro capas totalmente conectadas. La capa de entrada recibió características integradas a través de una estrategia de fusión temprana [^[4]], combinando los datos del TME y multiómicos en una matriz de características de 474 × 5023 dimensiones para capturar los efectos sinérgicos entre diferentes niveles de datos. Dos capas ocultas utilizaron funciones de activación de unidad lineal exponencial escalada (SELU), lo que permitió la auto-normalización mediante la preservación de las distribuciones de entrada-salida en las capas. Este mecanismo intrínseco estabilizó la propagación de la señal sin requerir técnicas de normalización externas, como la normalización por lotes [^[26]]. La función de activación SELU se define como:

La propiedad de auto-normalización se mantuvo mediante la configuración de los parámetros predeterminados para ? y ?, lo que aseguró que las salidas de la capa convergieran hacia una media de cero y una varianza unitaria, al tiempo que se incorporaba la regularización de dropout. La capa de salida final generó puntuaciones de riesgo específicas del paciente a través de una transformación totalmente conectada. El flujo de trabajo completo de optimización de parámetros se ilustra en la Figura S1 del material suplementario.

Los pacientes se estratificaron aleatoriamente en conjuntos de entrenamiento (80%) y prueba (20%). La optimización de hiperparámetros se realizó mediante una validación cruzada de cinco pliegues dentro del conjunto de entrenamiento; el índice de concordancia (C-índice) sirvió como la métrica de evaluación principal. La arquitectura óptima consistió en capas con 512, 512, 1024 y 256 neuronas (tasa de dropout = 0,15). Luego, se evaluó el rendimiento del modelo en el conjunto de prueba independiente. El análisis de la curva ROC dependiente del tiempo cuantificó la precisión predictiva a 1, 3 y 5 años. Se realizaron análisis comparativos con cinco métodos establecidos: bosque de supervivencia aleatorio (RSF) [^[27]], máquina de vectores de soporte de supervivencia (SVM) [^[28]], máquina de boosting de gradiente (GBM) [^[29]], CoxBoost [^[30]], DeepHit [^[31]] y DeepOmix [^[32]]. Se realizaron comparaciones adicionales para evaluar las mejoras en el rendimiento obtenidas mediante la integración multiómica en relación con los enfoques monoómicos.

Para evaluar aún más la generalizabilidad de SCMO, ensamblamos conjuntos de datos multiómicos de cinco tipos de cáncer adicionales: carcinoma de células escamosas del cuello uterino (CESC), carcinoma invasivo de mama (BRCA), carcinoma de células transicionales de la vejiga (BLCA), carcinoma esofágico (ESCA) y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSC). Cada cohorte se procesó utilizando un pipeline estandarizado de integración y preprocesamiento de datos para garantizar la coherencia en el desarrollo del modelo. A diferencia del desarrollo del modelo de CRC, que utilizó un atlas específico de CRC de novo para recuperar las características del TME, los modelos para otros tipos de cáncer se construyeron utilizando el atlas pancanceroso proporcionado por EcoTyper, ya que la generación de atlas específicos para cada tipo de cáncer sería prohibitivamente costosa en términos de recursos. Las características detalladas de la cohorte y el número de características incorporadas en cada modelo se resumen en la Tabla S3.

Identificación de características pronósticas críticas basadas en gradientes integrados y bioinformática

El modelo SCMO se interpretó mediante Gradientes Integrados [^[33]] para identificar las características con un valor pronóstico significativo; los resultados se visualizaron en formato de Explicaciones Aditivas de Shapley (SHAP) [^[34]]. Para dilucidar las funciones biológicas asociadas con los microbios, se analizaron las 100 características microbianas principales mediante OmicsNet [^[35]] para reconstruir una red de interacción microbio-metabolito-proteína de múltiples capas. Las interacciones microbio-metabolito se obtuvieron de la base de datos Atlas of Gene Regulation and Expression Analysis (AGORA) [^[36]], y las interacciones metabolito-proteína se obtuvieron de la base de datos Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) [^[37]]. Luego, se realizó un análisis de enriquecimiento de vías para los nodos de metabolitos y proteínas para caracterizar los procesos biológicos mediados por los MIC. El análisis de la topología de la red identificó los nodos centrales en función de la centralidad de grado, lo que permitió el reconocimiento sistemático de los microbios reguladores clave dentro de la red de múltiples capas.

Exploración de la función biológica y los patrones de distribución espacial de las características del TME específicas de CRC

Para investigar las funciones biológicas de las características del TME, realizamos un análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) [^[38]] en los genes marcadores específicos de cada estado celular utilizando la prueba exacta de Fisher. Además, se analizaron las redes de comunicación célula-célula dentro de los ecosistemas mediante CellChat [^[39]] para caracterizar las interacciones ligando-receptor clave. Se obtuvieron perfiles de transcriptómica espacial (ST) de la plataforma 10X Visium, que comprenden 12 especímenes, incluidos siete tumores de grado 1 (G1) y cinco tumores de grado 3 (G3) (Tabla S4) [^[40]]. Estos datos facilitaron la investigación de los patrones de distribución espacial de los estados celulares y los ecosistemas en las etapas temprana y tardía del CRC. El atlas de célula única del TME específico de CRC sirvió como referencia para la deconvolución espacial; las abundancias de los tipos de células dentro de cada punto se estimaron utilizando la descomposición robusta de tipos de células (RCTD) [^[41]]. Las matrices de abundancia de tipos de células resultantes se procesaron posteriormente mediante el pipeline EcoTyper para reconstruir las distribuciones de estados celulares y ecosistemas a nivel espacial. Los patrones de organización espacial se caracterizaron luego en dos niveles: (1) las correlaciones espaciales entre los estados celulares dentro de los ecosistemas se cuantificaron con coeficientes de correlación de Spearman, y (2) la agregación espacial del ecosistema se evaluó utilizando la estadística de Moran I [^[42]], que mide las tendencias de agrupamiento local en las diferentes etapas del tumor.

Análisis de estratificación de riesgo del SCMO

Los pacientes se estratificaron en grupos de alto y bajo riesgo en función de las puntuaciones de riesgo medianas derivadas del modelo SCMO. Se generaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier con el paquete R survminer para visualizar las diferencias pronósticas entre los grupos. Para evaluar la relevancia clínica, se analizaron las puntuaciones de riesgo en relación con los parámetros clínicos clave, incluido el edad, el sexo, la etapa TNM y la clasificación CMS. La clasificación CMS se asignó con el paquete R CMSclassifier para evaluar la consistencia con los subtipos moleculares.

Cribado de compuestos terapéuticos y análisis de acoplamiento molecular

Se identificaron los genes diferencialmente expresados (DEG) entre las muestras tumorales y normales de los pacientes de alto riesgo utilizando el paquete R limma [^[43]]. Se realizó un cribado de una biblioteca de 562 compuestos naturales de la base de datos de medicina tradicional china HERB [^[44]] con el algoritmo CMap [^[45]], utilizando los DEG relevantes para la enfermedad como entrada. Se seleccionaron para un análisis posterior los compuestos con puntuaciones CMap < –75, lo que indica un posible efecto de reversión de las firmas de expresión génica asociadas con la enfermedad.

A continuación, predijimos los modos de unión de estos compuestos naturales a las proteínas codificadas por TRAP1 mediante el acoplamiento molecular. Se utilizó AutoDock [^[46]] para el acoplamiento de ajuste inducido. La estructura cristalina de la proteína TRAP1 (código PDB: 7U8X, resolución = 1,6 Å) se obtuvo de la Protein Data Bank. La proteína se preprocesó con las herramientas de AutoDock para conservar el ligando original de la estructura de co-cristal, que se utilizó para etiquetar las coordenadas espaciales del sitio de acoplamiento. Los residuos dentro de los 6 Å del ligando de co-cristal se consideraron flexibles. Las estructuras de los compuestos y las proteínas se hidrogenaron, protonaron y minimizaron energéticamente utilizando los componentes de AutoDock. Se seleccionó la mejor conformación de unión en función de la alineación espacial entre el compuesto y la proteína receptora, así como de las puntuaciones de acoplamiento. Los resultados del acoplamiento molecular se visualizaron con el software PyMOL.

Análisis de inmunohistoquímica

Se recolectaron muestras de tumor y tejido normal adyacente pareadas de tres pacientes con CRC tratados en el Hospital No. 2 de Ningbo: un caso en etapa I y dos casos en etapa IV. Después de la fijación con formalina y el procesamiento con parafina, las secciones de tejido se procesaron para el análisis de inmunohistoquímica de la expresión de TRAP1. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo primario anti-TRAP1 de conejo (1:800, ABclonal A25919), seguido de la incubación durante 2 horas a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:200, ABclonal RK50015). La reactividad de TRAP1 se visualizó utilizando el cromógeno diaminobencidina, produciendo precipitados marrones en los sitios de antígeno. La contratinción con hematoxilina proporcionó contraste nuclear antes del montaje. Las secciones teñidas con inmunohistoquímica se examinaron mediante microscopía óptica.

Cultivo celular

Las células HT29 y HCT116 se cultivaron en medio McCoy's 5A, y las células SW480 se cultivaron en medio DMEM, cada uno suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina (todos de Pricella Life Science & Technology Co., Ltd.). Las células se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2.

Análisis de Western blot

Las células se lisaron en tampón RIPA que contenía inhibidores de proteasas (TOPSCIENCE). Se utilizaron los siguientes anticuerpos para el análisis de Western blot: anticuerpo monoclonal de conejo contra la subunidad principal S de la NADH:ubiquinona oxidorreductasa (NDUFS)1 (1:10,00; ABclonal, A21192), anticuerpo primario anti-TRAP1 (1:10,00; ABclonal, A25919), anticuerpo monoclonal de conejo recombinante contra la sirtuina 3 (Sirt3) (1:1000; HUABIO, HA722251), anticuerpo monoclonal de conejo recombinante contra la glutaminasa (1:1000; HUABIO, HA722251) y anticuerpo monoclonal de conejo recombinante contra la actina de músculo liso alfa (1:10,000; HUABIO, HA722251). Los geles de proteínas prefundidas Bis-Tris se compraron a Life-ilab (China). Las membranas se bloquearon con 5% de leche en tampón fosfato salino que contenía Tween-20 para minimizar la unión inespecífica. Se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (ABclonal; 1:5000) para la detección. Se aplicaron reactivos de quimioluminiscencia mejorada a las membranas y las señales se detectaron utilizando el sistema Azure Biosystems C280.

Medición de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS)

Para evaluar la generación de ROS, se trataron células de adenocarcinoma colorrectal humano HT29, HCT116 y SW480 con TRAP1-IN-1 (40 μM) o saikosaponina A (20 μM) durante 24 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2. Los niveles intracelulares de ROS se cuantificaron mediante citometría de flujo (BD FACS Canto II) después de 30 minutos de incubación con la sonda fluorescente 2,7-diclorodihidrofluoresceína diacetato (H2DCFDA; 10 μM; Beyotime). Los datos de intensidad de fluorescencia se recopilaron y analizaron con el software FlowJo.

Ensayo de viabilidad celular

La viabilidad celular se analizó sembrando células de carcinoma colorrectal humano a una densidad de 8 × 103 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Después de una incubación nocturna en un incubador humidificado (37 °C, 5% CO2), las células se trataron con TRAP1-IN-1 (40 μM) o saikosaponina A (20 μM) durante 24 horas. La actividad metabólica se evaluó utilizando el kit de recuento celular-8 (CCK-8, TOPSCIENCE), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se añadió la solución CCK-8 a cada pocillo a una dilución de 1:10 en medio de cultivo y se incubó durante 4 horas a 37 °C. La absorbancia se midió a 450 nm con un espectrofotómetro de microplacas Infinite F50 Plus.

Ensayo de apoptosis

La apoptosis se evaluó utilizando la tinción dual con anexina V-isotiocianato de fluoresceína/yoduro de propidio en células de carcinoma colorrectal humano. Las células se sembraron en placas de seis pocillos (5 × 104 células/pocillo) y se dejaron adherir durante la noche en una atmósfera humidificada (37 °C, 5% CO2). Luego, se trataron con TRAP1-IN-1 (40 μM) o saikosaponina A (20 μM) durante 24 horas. Después del tratamiento, las células se recogieron con tripsina libre de ácido etilendiaminotetraacético, se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato a temperatura ambiente y se resuspendieron en tampón de unión. La suspensión se incubó con anexina V-isotiocianato de fluoresceína (5 μL) e yoduro de propidio (5 μL) (Elabscience) durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Las poblaciones apoptóticas tempranas y tardías se cuantificaron mediante citometría de flujo (BD FACS Canto II).

Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron con réplicas biológicas (n ≥ 2). Los datos se presentan como media ± error estándar de la media y se analizaron utilizando pruebas t de Student de dos colas no pareadas para las comparaciones entre grupos. La significación estadística se definió como p < 0,05; los niveles de significación se denotan como *p < 0,05, p < 0,01 y *p < 0,001.

Resultados

Descripción general

Este estudio presenta el desarrollo, la evaluación y la aplicación del marco computacional SCMO (Fig. 1). Primero, caracterizamos las características específicas del microambiente tumoral (MET) del CRC (Fig. 1A). Recopilamos datos de secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) de 213 muestras de CRC y realizamos la anotación celular para obtener ocho tipos de células principales que abarcan 339.060 células. Utilizando el algoritmo EcoTyper, identificamos las características específicas del MET del CRC que incluyeron 195 estados celulares y 17 ecosistemas multicelulares. El análisis de Cox univariado reveló 12 estados celulares y un ecosistema multicelular asociados significativamente con la supervivencia, que posteriormente se retuvieron para el desarrollo del modelo pronóstico. Estas características del MET se recuperaron a nivel de resolución de célula única del grupo TCGA-CRC mediante deconvolución y se incorporaron en los modelos de predicción de supervivencia junto con datos multiómicos. A continuación, construimos el modelo de predicción de supervivencia SCMO (Fig. 1B) basado en una arquitectura SNN que integró las características del MET con datos de ADN, ARN y MIC. El modelo se entrenó en un conjunto de datos de entrenamiento interno (80%) utilizando una validación cruzada de cinco pliegues y se evaluó en un conjunto de datos de prueba externo (20%) con el índice C y el área bajo la curva (AUC) como métricas de rendimiento. Para mejorar la interpretabilidad biológica de SCMO (Fig. 1C), identificamos las características ómicas críticas utilizando el algoritmo de atribución de gradiente y examinamos los patrones de distribución espacial de las características del MET mediante datos de secuenciación espacial (ST). La puntuación de riesgo mediana generada por SCMO estratificó claramente a los pacientes en grupos de alto y bajo riesgo; también mejoró la resolución pronóstica del sistema de clasificación CMS existente (Fig. 1D). Finalmente, realizamos una selección de fármacos con la característica crítica TRAP1 como un posible objetivo terapéutico. Este análisis indicó que el compuesto natural saikosaponina A demuestra efectos anticancerígenos in vitro (Fig. 1E).

Descubrimiento de estados celulares y ecosistemas relacionados con la supervivencia basados en el atlas de célula única del MET específico del CRC

Construimos un atlas del MET específico del CRC que comprende 339.060 células de 213 muestras de tumores utilizando datos de scRNA-seq (Fig. 2A). La anotación del tipo de célula se realizó en base a los genes marcadores establecidos (Fig. 2B), lo que dio como resultado ocho tipos de células principales, incluidos los linfocitos T/NK, las células mieloides y las células epiteliales. El análisis posterior identificó 11 subtipos de células NK/T y seis subtipos mieloides; se proporcionan los patrones de expresión de los genes marcadores detallados en la Figura S2 complementaria.

Utilizando el atlas del MET específico del CRC como referencia, aplicamos el algoritmo EcoTyper para identificar las características del MET, lo que dio como resultado 195 estados celulares y 17 ecosistemas (Fig. 2C). Estas características se recuperaron en cuatro cohortes de ARN masivo mediante deconvolución, que estimó las abundancias de los estados celulares y los ecosistemas en las muestras de tejido a nivel de resolución de tejido. En particular, más del 98% de las características se recuperaron con éxito (Fig. 2D), lo que demuestra la robustez de las características del MET identificadas a partir del atlas de célula única específico del CRC.

Entre estas cohortes, la cohorte TCGA-CRC proporcionó información de seguimiento bien anotada. Realizamos un análisis de Cox univariado basado en la abundancia de las características del MET en esta cohorte en relación con la supervivencia del paciente e identificamos 13 características asociadas significativamente con el pronóstico (Fig. 2E). De estas características, nueve estados celulares se vincularon con un mal pronóstico (Figura S3A complementaria), mientras que tres estados celulares se asociaron con un pronóstico favorable (Figura S3B complementaria). El ecosistema 15 (E15), compuesto por macrófagos, fibroblastos y otros tipos de células (Fig. 2F), se asoció con un mal pronóstico; su abundancia permitió una estratificación eficaz del riesgo del paciente (Fig. 2G). Estas características se investigaron más a fondo para sus funciones biológicas y se incorporaron al desarrollo del modelo SCMO.

Evaluación del rendimiento del modelo SCMO

Comparamos el rendimiento pronóstico de las características del MET derivadas de los algoritmos EcoTyper, CIBERSORTx, Bisque y MuSiC. Como se muestra en la Figura 3A y la Tabla S5, EcoTyper logró el índice C más alto (0,584) en la validación cruzada de cinco pliegues. Este rendimiento superior probablemente refleja su capacidad para capturar no solo las abundancias de los tipos de células, sino también los ecosistemas multicelulares, que representan con mayor precisión la organización altamente estructurada del MET. En contraste, los otros algoritmos se basaron únicamente en las estimaciones de la abundancia de los tipos de células. Con base en estos hallazgos, seleccionamos las 13 características del MET reconstruidas por EcoTyper para el desarrollo posterior del modelo.

Al integrar estas características del MET con los datos transcriptómicos, genómicos y MIC del grupo TCGA-CRC, construimos modelos de predicción de supervivencia SCMO. Después de la exclusión de las muestras con datos ómicos incompletos, se retuvieron 474 muestras para el desarrollo del modelo (Fig. 3B). Utilizando el marco SNN, realizamos una validación cruzada de cinco pliegues dentro del conjunto de datos de entrenamiento interno. El modelo multiómico que incorporó las características del MET logró un índice C de 0,762, superando constantemente a los modelos basados en combinaciones arbitrarias de otros datos ómicos (Fig. 3C). Estos hallazgos indican que las características del MET derivadas de los datos de scRNA-seq tienen valor pronóstico y pueden mejorar el rendimiento de los modelos de supervivencia basados en datos multiómicos. La evaluación sistemática confirmó que SCMO mantuvo una precisión predictiva superior en comparación con los métodos existentes, como lo demuestra el índice C más alto (Tabla S6). La capa biofuncional predefinida en DeepOmix limitó su capacidad para incorporar eficazmente los datos de MIC y MET. Además, la comparación de nuestro modelo específico del CRC basado en las características del MET (SCMO) con el modelo de características del MET pancanceroso (SCMO*) de EcoTyper reveló un rendimiento significativamente mejor de SCMO. Estos resultados resaltan la importancia de desarrollar firmas del MET específicas del tipo de cáncer, en lugar de depender de características pancancerosas generalizadas para el modelado pronóstico en el CRC. SCMO logró un índice C de 0,680 en el conjunto de datos de prueba externo. Además, SCMO produjo valores de AUC de 0,752, 0,772 y 0,869 en el conjunto de entrenamiento, y de 0,639, 0,756 y 0,772 en el conjunto de prueba, para las predicciones de supervivencia de 1, 3 y 5 años, respectivamente (Fig. 3D, E). Aunque la predicción de 1 año mostró un AUC ligeramente más bajo en el conjunto de prueba, el rendimiento constantemente alto a los 3 y 5 años destaca la sólida capacidad pronóstica a largo plazo del modelo.

Para evaluar la aplicabilidad multicáncer, aplicamos el marco SCMO para desarrollar modelos pronósticos en cinco tipos de cáncer adicionales: CESC, BRCA, BLCA, ESCA y HNSC. Los modelos SCMO integrados superaron constantemente a los modelos basados en características multiómicas o características del MET solas en todos los tipos de cáncer (Fig. 3F; Tabla S7). La mayoría de los modelos lograron un índice C superior a 0,7, y el modelo ESCA alcanzó el valor más alto de 0,77. Además, la estratificación por la puntuación de riesgo mediana distinguió significativamente a los pacientes de alto y bajo riesgo en cada tipo de cáncer (Fig. 3G). En conjunto, estos resultados demuestran la solidez, la precisión y la extensibilidad de SCMO como una herramienta pronóstica en múltiples tipos de cáncer.

Elucidación de la función biológica y la distribución espacial de las características del MET relacionadas con la supervivencia

Para interpretar aún más el modelo, evaluamos la contribución de las características del MET y las características ómicas individuales a SCMO utilizando el algoritmo de gradientes integrados [^[33]] (Fig. 4A). La contribución promedio de las características del MET (1,39) superó a las de ARN (0,89), ADN (0,17) y MIC (0,36), lo que explica por qué la inclusión de las características del MET mejoró aún más el índice C. Realizamos un enriquecimiento funcional GO para los genes expresados específicamente en los estados celulares asociados con la supervivencia del paciente (Fig. 4B; Tabla S8). En el estado celular endotelial S10, la regulación de la angiogénesis se enriqueció, lo que es consistente con la angiogénesis tumoral, que proporciona nutrientes al MET y acelera el crecimiento tumoral [^[47]]. También se enriqueció la adhesión célula-sustrato, lo que respalda la unión y la migración de las células tumorales [^[48]]. En el estado celular de fibroblastos S03, se observó un enriquecimiento de los procesos del sistema muscular. Los fibroblastos promueven la invasión y la metástasis tumoral a través de la secreción de citocinas, de manera análoga a las interacciones intercelulares dentro del sistema muscular, lo que impulsa la progresión maligna [^[49]]. En el estado celular de macrófagos S05, se enriqueció la regulación del metabolismo de los lípidos; este proceso está estrechamente relacionado con la modulación del microambiente inmunitario y la reprogramación metabólica en los tumores [^[50]]. El CRC del lado derecho presenta un peor pronóstico que el CRC del lado izquierdo [^[51]]. El análisis comparativo reveló que los tumores del lado izquierdo se enriquecieron en el estado celular epitelial S01, que se correlacionó con resultados favorables; los tumores del lado derecho se caracterizaron por el estado celular de fibroblastos S11, asociado con una progresión adversa (Fig. 4C). Estos patrones espaciales de las características del MET están fuertemente alineados con las diferencias pronósticas conocidas.

E15 representa una comunidad multicelular compleja, que se caracteriza no solo por la diversidad de sus estados celulares constituyentes, sino también por las intrincadas interacciones entre ellos. Para explorar las funciones biológicas de E15, realizamos un análisis de comunicación celular (Fig. 4D) e identificamos una activación pronunciada de la señalización de la vía del COLÁGENO dentro de los ecosistemas E15 (Fig. 4E). Se ha demostrado que la vía del COLÁGENO promueve la migración y la invasión de las células tumorales a través de la inducción de la EMT [^[52]]. Un análisis más profundo reveló que esta vía está regulada principalmente por el estado celular de fibroblastos S10, que contribuye al remodelado estructural del MET [^[53]], y el estado celular de macrófagos S05, que está implicado en la EMT [^[54]]. Estos resultados sugieren que los fibroblastos S10 y los macrófagos S05 representan factores clave que impulsan la asociación de E15 con un mal pronóstico.

Para examinar la distribución espacial de los ecosistemas, utilizamos el atlas del microambiente tumoral (TME) específico para el CRC como referencia y aplicamos el algoritmo EcoTyper para recuperar los datos de los subtipos celulares del CRC, estimando la abundancia de cada estado celular y ecosistema dentro de cada punto con codificación espacial. Se observaron correlaciones espaciales más fuertes entre los estados celulares dentro del mismo ecosistema (Fig. 4F; Fig. S4A en el material suplementario), lo que sugiere que cada ecosistema representa una unidad funcional distinta. El análisis de las láminas de histopatología teñidas con hematoxilina y eosina de siete pacientes con CRC G1 y cinco pacientes con CRC G3 reveló que E15 era más abundante en los tumores G3 (Fig. 4G; Fig. S5 en el material suplementario). Además, la agregación de E15 fue significativamente mayor en los pacientes G3 que en los pacientes G1 (Fig. 4H). Estos hallazgos demuestran aún más que la formación de E15 es perjudicial para el pronóstico y que E15 está más densamente distribuido en el CRC en etapas avanzadas. Para demostrar la generalizabilidad de estos hallazgos en diferentes plataformas de secuenciación espacial, analizamos cinco muestras de CRC perfiladas mediante Stereo-seq [^[55]]. Las correlaciones espaciales de las distribuciones de los estados celulares fueron consistentes con las observadas en los datos de 10X Visium (Fig. S4B en el material suplementario). Además, E15 también exhibió agregación espacial en estas muestras (Tabla S4), lo que refuerza la validez entre plataformas de nuestras conclusiones.

Gradientes integrados para identificar características multiómicas críticas en SCMO

Las 10 características clave de cada capa ómica se muestran en la Fig. 5A, y las 100 características principales se enumeran en la Tabla S9. Entre las características de ARN, ORC1 se expresa a niveles más altos en la mayoría de los tejidos tumorales que en los tejidos normales; regula el número de copias de las mitocondrias y los centrosomas en las células humanas, lo que destaca su potencial terapéutico en el cáncer [^[56]]. Entre las variaciones del número de copias, TCF7L2 es un factor de transcripción clave aguas abajo de la vía de señalización canónica de Wnt/β-catenina; su activación constitutiva en el CRC subraya su papel central en la tumorigénesis [^[57]]. Entre las mutaciones, CSMD2 se ha identificado como un oncogén en el CRC y sirve como predictor de la progresión del CRC [^[58]]. Para evaluar aún más el impacto de los microbios en el pronóstico, construimos una red multicapa de microbios, metabolitos y proteínas que comprende 582 nodos y 1824 aristas (Fig. 5B). Fusobacterium ocupó el quinto lugar en la centralidad de grado dentro de esta red (Tabla S10) y se ha relacionado con un factor patógeno crítico en el CRC; su abundancia está fuertemente asociada con la progresión de la enfermedad [^[59]]. El análisis de enriquecimiento KEGG de los nodos de proteínas y metabolitos identificó 10 vías compartidas (Fig. 5C), que involucran principalmente el metabolismo de los aminoácidos, el metabolismo de la glucosa y el metabolismo energético. Por lo tanto, las alteraciones en la abundancia de los microbios pueden contribuir a la desregulación metabólica dentro del TME [^[60]]. Además, se realizó una revisión sistemática de la literatura para evaluar las asociaciones entre estas características clave y la progresión del cáncer. La evidencia de respaldo se resume en la Tabla S11, lo que subraya su valor pronóstico.

Estratificación de riesgo de pacientes con CRC guiada por SCMO

Los pacientes con CRC se estratificaron en grupos de alto y bajo riesgo en función de las puntuaciones de riesgo medianas derivadas de los resultados de SCMO. La estratificación de riesgo se logró tanto en el conjunto de entrenamiento (Fig. 6A) como en el conjunto de prueba (Fig. 6B). El análisis de las características clínicas entre los grupos (Fig. 6C) reveló una mortalidad significativamente mayor y una mayor proporción de casos en etapa avanzada en el grupo de alto riesgo en comparación con el grupo de bajo riesgo. La distribución de los pacientes con CMS4 también difería significativamente entre los dos grupos. Además, las puntuaciones de riesgo de SCMO estratificaron a los pacientes con CMS4, identificando un subconjunto con un mejor pronóstico (Fig. 6D). Este hallazgo demuestra la capacidad de SCMO para refinar el sistema de clasificación CMS.

A continuación, evaluamos la relevancia inmunoterapéutica examinando la expresión de los puntos de control inmunitario en los grupos de alto y bajo riesgo (Fig. 6E). Cuatro puntos de control inmunitario, incluido HHLA2, mostraron diferencias significativas entre los grupos. Los niveles de expresión de estos puntos de control fueron más bajos en el grupo de alto riesgo, lo que sugiere que las células tumorales en estos pacientes dependen menos de las vías de los puntos de control inmunitario para evadir la vigilancia inmunitaria. Esta característica puede contribuir a una peor respuesta inmunoterapéutica en relación con el grupo de bajo riesgo. Finalmente, predijimos la sensibilidad de los fármacos del CRC de uso común, incluido el 5-fluorouracilo, en los dos grupos (Fig. 6F). El grupo de alto riesgo exhibió una sensibilidad reducida a estos agentes en comparación con el grupo de bajo riesgo. Estos resultados destacan la urgente necesidad de nuevas estrategias terapéuticas para mejorar los resultados en los pacientes con CRC de alto riesgo.

SCMO-Lite exhibe un sólido potencial de traslación clínica

Aunque SCMO demostró un fuerte rendimiento en la predicción de la supervivencia, su aplicabilidad clínica se vio obstaculizada por la necesidad de datos de secuenciación multiómica integrales. Para abordar esta limitación, desarrollamos SCMO-Lite, un modelo simplificado. Se realizó una revisión sistemática de la literatura para evaluar la relevancia biológica de las cinco características principales de cada modalidad ómica en relación con la progresión tumoral (Tabla S11). Doce características mostraron asociaciones directas con la progresión del CRC (Fig. 7A), que incluyen cuatro características de ARN (DNAJB8, ORC1, OR1L8 y LINC02516), cinco características de ADN (TTN, CSMD2, TCF7L2, NDN y PLXDC1) y tres características microbianas (Oribacterium, Methylobacterium y Tannerella) (Fig. 7B). Estas características se incorporaron en un modelo de regresión de Cox multivariante ligero (SCMO-Lite) para la estratificación de riesgos. El conjunto de datos TCGA-CRC se dividió aleatoriamente en un conjunto de entrenamiento (80%) y un conjunto de prueba (20%) para el desarrollo del modelo y la validación interna. SCMO-Lite distinguió eficazmente entre pacientes de alto y bajo riesgo tanto en el conjunto de entrenamiento (Fig. 7C) como en el conjunto de prueba interno (Fig. 7D). Además, SCMO-Lite mantuvo una sólida estratificación de riesgos en dos cohortes independientes de CRC multiómicas de Roelands et al. [^[19]] y Nunes et al. [^[13]], que se utilizaron para la validación externa (Fig. 7E, F).

El análisis de Cox univariante confirmó que tanto las puntuaciones de riesgo de SCMO como las de SCMO-Lite fueron factores pronósticos independientes (Fig. 7G). El análisis multivariante validó aún más su valor predictivo independiente después del ajuste por posibles factores de confusión (SCMO: razón de riesgos = 1,72, p < 0,05; SCMO-Lite: razón de riesgos = 4,82, p < 0,05) (Fig. 7H, I). Para mejorar la aplicabilidad clínica, desarrollamos un nomograma pronóstico que integra las puntuaciones de riesgo con los parámetros clínicos clave para predecir las probabilidades de supervivencia a 1, 3 y 5 años (Fig. 7J). SCMO-Lite representa un modelo pronóstico optimizado que logra una estratificación de riesgos eficaz utilizando un conjunto mínimo de 12 características biológicamente validadas, equilibrando la simplicidad con la precisión predictiva. Este marco simplificado demuestra un fuerte potencial para la evaluación pronóstica personalizada y la guía del tratamiento de precisión en el manejo del CRC.

Compuestos naturales como nuevas estrategias de tratamiento para pacientes con CRC de alto riesgo

Aproximadamente el 75% de los fármacos anticancerígenos se derivan de o se inspiran en compuestos naturales [^[61]]. Para identificar posibles opciones terapéuticas para pacientes con CRC de alto riesgo, examinamos compuestos naturales utilizando enfoques de bioinformática y biología estructural (Fig. 8A). El análisis de expresión diferencial entre las muestras tumorales y normales en el grupo de alto riesgo (Tabla S12) reveló 781 genes sobreexpresados y 1092 genes subexpresados. De la base de datos de compuestos naturales HERB, se identificaron 49 compuestos con el potencial de revertir la expresión génica aberrante mediante el algoritmo CMap (Tabla S13). Entre estos, TRAP1 se identificó como un gen clave (por el algoritmo de atribución de gradiente) y un gen sobreexpresado de forma anormal. TRAP1, un miembro de la familia de proteínas de choque térmico (Hsp90) de 90 kDa, se sobreexpresa en las mitocondrias de las células tumorales. Su producto proteico contribuye al metabolismo energético anormal en las células tumorales al unirse a la adenosina trifosfato (ATP), participando así en múltiples vías que promueven el crecimiento de las células tumorales. En consecuencia, TRAP1 puede representar un objetivo terapéutico para pacientes de alto riesgo [^[62]]. Los inhibidores actuales de TRAP1 actúan uniéndose competitivamente al sitio de unión al ATP de TRAP1 (Fig. 8B). Esta interacción desestabiliza la estructura de la proteína TRAP1 e induce en última instancia la muerte de las células tumorales [^[63]].

A continuación, exploramos el potencial de los 49 compuestos para actuar como inhibidores de TRAP1 mediante el acoplamiento molecular; los resultados se resumen en la Tabla 1. Utilizando un inhibidor de TRAP1 de molécula pequeña conocido (compuesto 27 de la literatura [^[63]]) como referencia, identificamos ocho compuestos naturales que obtuvieron puntuaciones de acoplamiento más altas en el sitio de unión al ATP de TRAP1, con puntuaciones más bajas que indican una unión más estable. Entre estos, la hidroxisaflorina A y la saikosaponina A demostraron interacciones de enlace de hidrógeno más ricas con el sitio de unión al ATP en relación con el inhibidor de referencia. Como se muestra en la Fig. 8C, la hidroxisaflorina A formó un total de siete enlaces de hidrógeno con TRAP1, incluidos cinco enlaces mediados por la cadena lateral y dos enlaces mediados por la cadena principal. El enlace de hidrógeno más corto (1,9 Å) se formó con el residuo de la cadena principal F201. Como se muestra en la Fig. 8D, la saikosaponina A formó cuatro enlaces de hidrógeno: tres mediados por la cadena lateral y uno mediado por la cadena principal. En particular, la saikosaponina A estableció enlaces de hidrógeno de 2,1 Å con el residuo de la cadena principal F201 y el residuo de la cadena lateral N119. Los resultados adicionales del acoplamiento molecular se presentan en la Fig. S6 en el material suplementario. Estos hallazgos sugieren que la hidroxisaflorina A y la saikosaponina A no solo revierten la expresión génica aberrante en pacientes de alto riesgo a nivel transcripcional, sino que también se unen a TRAP1 a nivel de la proteína para inhibir la desregulación metabólica mitocondrial mediada por TRAP1. Este mecanismo dual destaca su potencial como candidatos terapéuticos para pacientes con CRC de alto riesgo.

La saikosaponina A exhibe actividad anticancerígena en ensayos in vitro

TRAP1 funciona como un oncogén o un supresor tumoral, según el tipo de tumor. La inmunohistoquímica de pares de tejidos tumorales y tejidos normales adyacentes de tres pacientes con CRC en el Hospital No. 2 de Ningbo reveló un fuerte tinción citoplasmática de TRAP1 en las células tumorales, pero una expresión mínima en el tejido del colon normal (Fig. 9A, B). Las investigaciones previas han demostrado que la inhibición de TRAP1 eleva los niveles de ROS en las células cancerosas [^[64]]. El análisis de citometría de flujo demostró que la hidroxisaflorina A no indujo significativamente la apoptosis en comparación con el control (Fig. S7 en el material suplementario); por lo tanto, los análisis posteriores se centraron en la saikosaponina A. En comparación con el inhibidor de TRAP1 establecido, TRAP1-IN-1, investigamos el efecto de la saikosaponina A sobre la generación de ROS en las células de CRC HT29, HCT116 y SW480. El tratamiento con 20 μM de saikosaponina A durante 24 horas aumentó significativamente la producción de ROS (Fig. 9C, H, M). Estos resultados indican que la focalización farmacológica de TRAP1 mejora el estrés oxidativo en las células de CRC, lo que podría explicar su mecanismo anticancerígeno. Para determinar el efecto de la inhibición de TRAP1 sobre el crecimiento y la supervivencia celular, realizamos un ensayo CCK-8 que comparó los efectos citotóxicos de la saikosaponina A con los de TRAP1-IN-1 (Fig. 9D, I, N). Después de 24 horas de tratamiento, la viabilidad de las células HT29, HCT116 y SW480 se redujo significativamente con la saikosaponina A, con una potencia inhibidora comparable a la de TRAP1-IN-1. Ambos tratamientos produjeron una citotoxicidad sustancial en relación con el grupo de control de dimetilsulfóxido. Estos hallazgos sugieren que la saikosaponina A ejerce actividad antitumoral a través de la inhibición de TRAP1.

Para dilucidar el mecanismo molecular subyacente a la citotoxicidad de la saikosaponina A en el CRC, realizamos un análisis de citometría de flujo. La saikosaponina A indujo significativamente la apoptosis en las células HT29, HCT116 y SW480, como lo demostró el aumento de las poblaciones positivas para anexina V (Fig. 9E, J, O). La cuantificación confirmó tasas apoptóticas sustancialmente más altas en las células tratadas en comparación con los controles (Fig. 9F, K, P), lo que indica que la inducción de la apoptosis es un mecanismo principal de la actividad anticancerígena de la saikosaponina A. El análisis de Western blot aclaró aún más el efecto de la saikosaponina A sobre TRAP1 en las células de CRC. El compuesto indujo la degradación selectiva de proteínas clave dependientes de TRAP1, incluyendo NDUFS1, glutaminasa-1 y Sirt3 (Fig. 9G, L, Q) [^[65]]. Este patrón de degradación se asemejó al de los inhibidores establecidos de TRAP1, lo que confirmó que la saikosaponina A interrumpe específicamente la función de chaperona de TRAP1. En consonancia con los hallazgos previos de que la inhibición farmacológica de TRAP1 desestabiliza las proteínas cliente mitocondriales, estos resultados identifican a TRAP1 como el objetivo molecular a través del cual la saikosaponina A ejerce su actividad anticancerígena.

Resumen

Este estudio presenta el desarrollo, la evaluación y la aplicación del marco computacional SCMO (Fig. 1). Primero, caracterizamos las características específicas del microambiente tumoral (MET) del CRC (Fig. 1A). Recopilamos datos de secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq) de 213 muestras de CRC y realizamos una anotación celular para obtener ocho tipos de células principales que abarcan 339.060 células. Utilizando el algoritmo EcoTyper, identificamos características específicas del MET del CRC que incluyeron 195 estados celulares y 17 ecosistemas multicelulares. El análisis univariado de Cox reveló 12 estados celulares y un ecosistema multicelular significativamente asociados con la supervivencia, que se retuvieron posteriormente para el desarrollo del modelo pronóstico. Estas características del MET se recuperaron a nivel de resolución de célula única del grupo TCGA-CRC mediante deconvolución y se incorporaron a los modelos de predicción de supervivencia junto con datos multiómicos. A continuación, construimos el modelo de predicción de supervivencia SCMO (Fig. 1B) basado en una arquitectura SNN que integró las características del MET con datos de ADN, ARN y MIC. El modelo se entrenó en un conjunto de datos de entrenamiento interno (80%) utilizando una validación cruzada de cinco pliegues y se evaluó en un conjunto de datos de prueba externo (20%) con el índice C y el área bajo la curva (AUC) como métricas de rendimiento. Para mejorar la interpretabilidad biológica de SCMO (Fig. 1C), identificamos características ómicas críticas utilizando el algoritmo de atribución de gradiente y examinamos los patrones de distribución espacial de las características del MET a través de datos ST. La puntuación de riesgo mediana generada por SCMO estratificó claramente a los pacientes en grupos de alto y bajo riesgo; también mejoró la resolución pronóstica del sistema de clasificación CMS existente (Fig. 1D). Finalmente, realizamos una selección de fármacos con la característica crítica TRAP1 como un posible objetivo terapéutico. Este análisis indicó que el compuesto natural saikosaponina A demuestra efectos anticancerígenos in vitro (Fig. 1E).

Descubrimiento de estados celulares y ecosistemas relacionados con la supervivencia basados en el atlas de células individuales del MET específico del CRC

Construimos un atlas del MET específico del CRC que comprende 339.060 células de 213 muestras de tumores utilizando datos de scRNA-seq (Fig. 2A). La anotación del tipo de célula se realizó basándose en genes marcadores establecidos (Fig. 2B), lo que dio como resultado ocho tipos de células principales, incluidos las células T/NK, las células mieloides y las células epiteliales. El análisis posterior identificó 11 subtipos de células NK/T y seis subtipos mieloides; los patrones detallados de expresión de los genes marcadores se proporcionan en la Fig. S2 complementaria.

Utilizando el atlas del MET específico del CRC como referencia, aplicamos el algoritmo EcoTyper para identificar las características del MET, lo que dio como resultado 195 estados celulares y 17 ecosistemas (Fig. 2C). Estas características se recuperaron luego en cuatro cohortes de ARN masivo mediante deconvolución, lo que estimó las abundancias de los estados celulares y los ecosistemas en las muestras de tejido a nivel de resolución de tejido. En particular, más del 98% de las características se recuperaron con éxito (Fig. 2D), lo que demuestra la robustez de las características del MET identificadas a partir del atlas de células individuales específico del CRC.

Entre estas cohortes, la cohorte TCGA-CRC proporcionó información de seguimiento bien anotada. Realizamos un análisis univariado de Cox basado en la abundancia de las características del MET en esta cohorte en relación con la supervivencia del paciente e identificamos 13 características significativamente asociadas con el pronóstico (Fig. 2E). De estas características, nueve estados celulares se vincularon con un mal pronóstico (Fig. S3A complementaria), mientras que tres estados celulares se asociaron con un pronóstico favorable (Fig. S3B complementaria). El ecosistema 15 (E15), compuesto por macrófagos, fibroblastos y otros tipos de células (Fig. 2F), se asoció con un mal pronóstico; su abundancia permitió una estratificación eficaz del riesgo del paciente (Fig. 2G). Estas características se investigaron más a fondo para sus funciones biológicas y se incorporaron al desarrollo del modelo SCMO.

Evaluación del rendimiento del modelo SCMO

Comparamos el rendimiento pronóstico de las características del MET derivadas de los algoritmos EcoTyper, CIBERSORTx, Bisque y MuSiC. Como se muestra en la Figura 3A y la Tabla S5, EcoTyper logró el índice C más alto (0,584) en una validación cruzada de cinco pliegues. Este rendimiento superior probablemente refleje su capacidad para capturar no solo las abundancias de los tipos de células, sino también los ecosistemas multicelulares, lo que representa con mayor precisión la organización altamente estructurada del MET. En contraste, los otros algoritmos se basaron únicamente en las estimaciones de la abundancia de los tipos de células. Con base en estos hallazgos, seleccionamos las 13 características del MET reconstruidas por EcoTyper para el desarrollo posterior del modelo.

Al integrar estas características del MET con datos transcriptómicos, genómicos y MIC del grupo TCGA-CRC, construimos modelos de predicción de supervivencia SCMO. Después de la exclusión de las muestras con datos ómicos incompletos, se retuvieron 474 muestras para el desarrollo del modelo (Fig. 3B). Utilizando el marco SNN, realizamos una validación cruzada de cinco pliegues dentro del conjunto de datos de entrenamiento interno. El modelo multiómico que incorporó las características del MET logró un índice C de 0,762, superando constantemente a los modelos basados en combinaciones arbitrarias de otros datos ómicos (Fig. 3C). Estos hallazgos indican que las características del MET derivadas de los datos de scRNA-seq tienen valor pronóstico y pueden mejorar el rendimiento de los modelos de supervivencia basados en datos multiómicos. La evaluación sistemática confirmó que SCMO mantuvo una precisión predictiva superior en comparación con los métodos existentes, como lo demuestra el índice C más alto (Tabla S6). La capa biofuncional predefinida en DeepOmix limitó su capacidad para incorporar eficazmente los datos de MIC y MET. Además, la comparación de nuestro modelo específico del CRC basado en características del MET (SCMO) con el modelo de características del MET pancanceroso (SCMO*) de EcoTyper reveló un rendimiento significativamente mejor de SCMO. Estos resultados resaltan la importancia de desarrollar firmas del MET específicas del tipo de cáncer, en lugar de depender de características pancancerosas generalizadas para el modelado pronóstico en el CRC. SCMO logró un índice C de 0,680 en el conjunto de datos de prueba externo. Además, SCMO produjo valores de AUC de 0,752, 0,772 y 0,869 en el conjunto de entrenamiento, y de 0,639, 0,756 y 0,772 en el conjunto de prueba, para las predicciones de supervivencia de 1, 3 y 5 años, respectivamente (Fig. 3D, E). Aunque la predicción de 1 año mostró un AUC ligeramente más bajo en el conjunto de prueba, el rendimiento constantemente alto a los 3 y 5 años destaca la sólida capacidad pronóstica a largo plazo del modelo.

Para evaluar la aplicabilidad multicanceroso, aplicamos el marco SCMO para desarrollar modelos pronósticos en cinco tipos de cáncer adicionales: CESC, BRCA, BLCA, ESCA y HNSC. Los modelos SCMO integrados superaron constantemente a los modelos basados en características multiómicas o características del MET solas en todos los tipos de cáncer (Fig. 3F; Tabla S7). La mayoría de los modelos lograron un índice C superior a 0,7, y el modelo ESCA alcanzó el valor más alto de 0,77. Además, la estratificación por la puntuación de riesgo mediana distinguió significativamente a los pacientes de alto riesgo de los pacientes de bajo riesgo en cada tipo de cáncer (Fig. 3G). En conjunto, estos resultados demuestran la robustez, la precisión y la extensibilidad de SCMO como una herramienta pronóstica en múltiples tipos de cáncer.

Dilucidación de la función biológica y la distribución espacial de las características del MET relacionadas con la supervivencia

Para interpretar aún más el modelo, evaluamos la contribución de las características del MET y las características ómicas individuales a SCMO utilizando el algoritmo de gradientes integrados [^[33]] (Fig. 4A). La contribución promedio de las características del MET (1,39) superó a las de ARN (0,89), ADN (0,17) y MIC (0,36), lo que explica por qué la inclusión de las características del MET mejoró aún más el índice C. Realizamos un enriquecimiento funcional GO para los genes expresados específicamente en los estados celulares asociados con la supervivencia del paciente (Fig. 4B; Tabla S8). En el estado celular endotelial S10, se enriqueció la regulación de la angiogénesis, lo que es consistente con la angiogénesis tumoral, que proporciona nutrientes al MET y acelera el crecimiento tumoral [^[47]]. También se enriqueció la adhesión célula-sustrato, lo que respalda la unión y la migración de las células tumorales [^[48]]. En el estado celular fibroblástico S03, se observó un enriquecimiento de los procesos del sistema muscular. Los fibroblastos promueven la invasión y la metástasis tumoral a través de la secreción de citocinas, de manera similar a las interacciones intercelulares dentro del sistema muscular, lo que impulsa la progresión maligna [^[49]]. En el estado celular de macrófagos S05, se enriqueció la regulación del metabolismo de los lípidos; este proceso está estrechamente relacionado con la modulación del microambiente inmunitario y la reprogramación metabólica en los tumores [^[50]]. El CRC del lado derecho exhibe un peor pronóstico que el CRC del lado izquierdo [^[51]]. El análisis comparativo reveló que los tumores del lado izquierdo se enriquecieron en el estado celular epitelial S01, que se correlacionó con resultados favorables; los tumores del lado derecho se caracterizaron por el estado celular fibroblástico S11, asociado con una progresión adversa (Fig. 4C). Estos patrones espaciales de las características del MET están fuertemente alineados con las diferencias pronósticas conocidas.

E15 representa una comunidad multicelular compleja, caracterizada no solo por la diversidad de sus estados celulares constituyentes, sino también por las intrincadas interacciones entre ellos. Para explorar las funciones biológicas de E15, realizamos un análisis de comunicación celular (Fig. 4D) e identificamos una activación pronunciada de la señalización de la vía del COLÁGENO dentro de los ecosistemas E15 (Fig. 4E). Se ha demostrado que la vía del COLÁGENO promueve la migración y la invasión de las células tumorales a través de la inducción de la EMT [^[52]]. Un análisis más profundo reveló que esta vía está regulada principalmente por el estado celular fibroblástico S10, que contribuye al remodelado estructural del MET [^[53]], y el estado celular de macrófagos S05, que está implicado en la EMT [^[54]]. Estos resultados sugieren que el fibroblasto S10 y el macrófago S05 representan factores clave que impulsan la asociación de E15 con un mal pronóstico.

Para examinar la distribución espacial de los ecosistemas, utilizamos el atlas del MET específico del CRC como referencia y aplicamos el algoritmo EcoTyper para recuperar los datos ST del CRC, estimando la abundancia de cada estado celular y ecosistema dentro de cada punto con código de barras espacial. Se observaron correlaciones espaciales más fuertes entre los estados celulares dentro del mismo ecosistema (Fig. 4F; Fig. S4 complementaria), lo que sugiere que cada ecosistema representa una unidad funcional distinta. El análisis de las diapositivas de histología con tinción de hematoxilina y eosina de siete pacientes con CRC G1 y cinco pacientes con CRC G3 reveló que E15 era más abundante en los tumores G3 (Fig. 4G; Fig. S5 complementaria). Además, la agregación de E15 fue significativamente mayor en los pacientes con G3 que en los pacientes con G1 (Fig. 4H). Estos hallazgos demuestran aún más que la formación de E15 es perjudicial para el pronóstico y que E15 está más densamente distribuido en el CRC en etapa tardía. Para demostrar la generalizabilidad de estos hallazgos en las plataformas ST, analizamos cinco muestras de CRC perfiladas por Stereo-seq [^[55]]. Las correlaciones espaciales de las distribuciones de los estados celulares fueron consistentes con las observadas en los datos de 10X Visium (Fig. S4B complementaria). Además, E15 también exhibió agregación espacial en estas muestras (Tabla S4), lo que refuerza la validez entre plataformas de nuestras conclusiones.

Gradientes integrados para identificar características multiómicas críticas en SCMO

Las 10 características clave principales de cada capa ómica se muestran en la Fig. 5A, y las 100 características principales se enumeran en la Tabla S9. Entre las características del ARN, ORC1 se expresa a niveles más altos en la mayoría de los tejidos tumorales que en los tejidos normales; regula el número de copias de las mitocondrias y los centrosomas en las células humanas, lo que destaca su potencial terapéutico en el cáncer [^[56]]. Entre las variaciones del número de copias, TCF7L2 es un factor de transcripción clave aguas abajo de la vía de señalización canónica de Wnt/β-catenina; su activación constitutiva en el CRC subraya su papel central en la tumorigénesis [^[57]]. Entre las mutaciones, CSMD2 se ha identificado como un oncogén en el CRC y sirve como predictor de la progresión del CRC [^[58]]. Para evaluar aún más el impacto de los microbios en el pronóstico, construimos una red multicapa de microbios, metabolitos y proteínas que comprende 582 nodos y 1824 aristas (Fig. 5B). Fusobacterium ocupó el quinto lugar en la centralidad de grado dentro de esta red (Tabla S10) y se ha relacionado con un factor patógeno crítico en el CRC; su abundancia está fuertemente asociada con la progresión de la enfermedad [^[59]]. El análisis de enriquecimiento KEGG de los nodos de proteínas y metabolitos identificó 10 vías compartidas (Fig. 5C), que involucran principalmente el metabolismo de los aminoácidos, el metabolismo de la glucosa y el metabolismo energético. Por lo tanto, las alteraciones en la abundancia microbiana pueden contribuir a la desregulación metabólica dentro del microambiente tumoral (TME) [^[60]]. Además, se realizó una revisión sistemática de la literatura para evaluar las asociaciones entre estas características clave y la progresión del cáncer. La evidencia de respaldo se resume en la Tabla S11, lo que subraya su valor pronóstico.

Estratificación de riesgo de pacientes con CRC guiada por SCMO

Los pacientes con CRC se estratificaron en grupos de alto y bajo riesgo en función de las puntuaciones de riesgo medianas derivadas de los resultados de SCMO. La estratificación de riesgo se logró tanto en el conjunto de entrenamiento (Fig. 6A) como en el conjunto de prueba (Fig. 6B). El análisis de las características clínicas entre los grupos (Fig. 6C) reveló una mortalidad significativamente mayor y una mayor proporción de casos en etapa avanzada en el grupo de alto riesgo en comparación con el grupo de bajo riesgo. La distribución de los pacientes CMS4 también difería significativamente entre los dos grupos. Además, las puntuaciones de riesgo de SCMO estratificaron a los pacientes CMS4, identificando un subconjunto con un mejor pronóstico (Fig. 6D). Este hallazgo demuestra la capacidad de SCMO para refinar el sistema de clasificación CMS.

A continuación, evaluamos la relevancia inmunoterapéutica examinando la expresión de los puntos de control inmunitarios en los grupos de alto y bajo riesgo (Fig. 6E). Cuatro puntos de control inmunitarios, incluido HHLA2, mostraron diferencias significativas entre los grupos. Los niveles de expresión de estos puntos de control fueron más bajos en el grupo de alto riesgo, lo que sugiere que las células tumorales en estos pacientes dependen menos de las vías de los puntos de control inmunitarios para evadir la vigilancia inmunitaria. Esta característica puede contribuir a una peor respuesta inmunoterapéutica en relación con el grupo de bajo riesgo. Finalmente, predijimos la sensibilidad de los fármacos del CRC de uso común, incluido el 5-fluorouracilo, en los dos grupos (Fig. 6F). El grupo de alto riesgo exhibió una sensibilidad reducida a estos agentes en comparación con el grupo de bajo riesgo. Estos resultados destacan la urgente necesidad de nuevas estrategias terapéuticas para mejorar los resultados en los pacientes con CRC de alto riesgo.

SCMO-Lite exhibe un sólido potencial de traslación clínica

Aunque SCMO demostró un fuerte rendimiento en la predicción de la supervivencia, su aplicabilidad clínica se vio obstaculizada por la necesidad de datos de secuenciación multiómica integrales. Para abordar esta limitación, desarrollamos SCMO-Lite, un modelo simplificado. Se realizó una revisión sistemática de la literatura para evaluar la relevancia biológica de las cinco características principales de cada modalidad ómica en relación con la progresión tumoral (Tabla S11). Doce características mostraron asociaciones directas con la progresión del CRC (Fig. 7A), que incluyen cuatro características de ARN (DNAJB8, ORC1, OR1L8 y LINC02516), cinco características de ADN (TTN, CSMD2, TCF7L2, NDN y PLXDC1) y tres características microbianas (Oribacterium, Methylobacterium y Tannerella) (Fig. 7B). Estas características se incorporaron en un modelo de regresión de Cox multivariada ligero (SCMO-Lite) para la estratificación de riesgos. El conjunto de datos TCGA-CRC se dividió aleatoriamente en un conjunto de entrenamiento (80%) y un conjunto de prueba (20%) para el desarrollo del modelo y la validación interna. SCMO-Lite distinguió eficazmente entre pacientes de alto y bajo riesgo tanto en el conjunto de entrenamiento (Fig. 7C) como en el conjunto de prueba interno (Fig. 7D). Además, SCMO-Lite mantuvo una sólida estratificación de riesgos en dos cohortes independientes de CRC multiómicas de Roelands et al. [^[19]] y Nunes et al. [^[13]], que se utilizaron para la validación externa (Fig. 7E, F).

El análisis de Cox univariado confirmó que tanto las puntuaciones de riesgo de SCMO como las de SCMO-Lite fueron factores pronósticos independientes (Fig. 7G). El análisis multivariado validó aún más su valor predictivo independiente después del ajuste por posibles factores de confusión (SCMO: razón de riesgos = 1,72, p < 0,05; SCMO-Lite: razón de riesgos = 4,82, p < 0,05) (Fig. 7H, I). Para mejorar la aplicabilidad clínica, desarrollamos un nomograma pronóstico que integra las puntuaciones de riesgo con los parámetros clínicos clave para predecir las probabilidades de supervivencia a 1, 3 y 5 años (Fig. 7J). SCMO-Lite representa un modelo pronóstico optimizado que logra una estratificación de riesgos eficaz utilizando un conjunto mínimo de 12 características biológicamente validadas, equilibrando la simplicidad con la precisión predictiva. Este marco simplificado demuestra un fuerte potencial para la evaluación pronóstica personalizada y la guía del tratamiento de precisión en el manejo del CRC.

Compuestos naturales como nuevas estrategias de tratamiento para pacientes con CRC de alto riesgo

Aproximadamente el 75% de los fármacos anticancerígenos se derivan o se inspiran en compuestos naturales [^[61]]. Para identificar posibles opciones terapéuticas para pacientes con CRC de alto riesgo, examinamos compuestos naturales utilizando enfoques de bioinformática y biología estructural (Fig. 8A). El análisis de expresión diferencial entre las muestras tumorales y normales en el grupo de alto riesgo (Tabla S12) reveló 781 genes sobreexpresados y 1092 genes subexpresados. De la base de datos de compuestos naturales HERB, se identificaron 49 compuestos con el potencial de revertir la expresión génica aberrante mediante el algoritmo CMap (Tabla S13). Entre estos, TRAP1 se identificó como un gen clave (por el algoritmo de atribución de gradiente) y un gen sobreexpresado de forma anormal. TRAP1, un miembro de la familia de proteínas de choque térmico (Hsp90) de 90 kDa de chaperonas moleculares, se sobreexpresa en las mitocondrias de las células tumorales. Su producto proteico contribuye al metabolismo energético anormal en las células tumorales al unirse al trifosfato de adenosina (ATP), participando así en múltiples vías que promueven el crecimiento de las células tumorales. En consecuencia, TRAP1 puede representar un objetivo terapéutico para pacientes de alto riesgo [^[62]]. Los inhibidores actuales de TRAP1 actúan uniéndose competitivamente al sitio de unión al ATP de TRAP1 (Fig. 8B). Esta interacción desestabiliza la estructura de la proteína TRAP1 e induce en última instancia la muerte de las células tumorales [^[63]].

A continuación, exploramos el potencial de los 49 compuestos para actuar como inhibidores de TRAP1 mediante el acoplamiento molecular; los resultados se resumen en la Tabla 1. Utilizando un inhibidor de TRAP1 de molécula pequeña conocido (compuesto 27 de la literatura [^[63]]) como referencia, identificamos ocho compuestos naturales que obtuvieron puntuaciones de acoplamiento más altas en el sitio de unión al ATP de TRAP1, con puntuaciones más bajas que indican una unión más estable. Entre estos, la hidroxisaflorina A y la saikosaponina A demostraron interacciones de enlace de hidrógeno más ricas con el sitio de unión al ATP en relación con el inhibidor de referencia. Como se muestra en la Fig. 8C, la hidroxisaflorina A formó un total de siete enlaces de hidrógeno con TRAP1, incluidos cinco enlaces mediados por la cadena lateral y dos enlaces mediados por la cadena principal. El enlace de hidrógeno más corto (1,9 Å) se formó con el residuo de la cadena principal F201. Como se muestra en la Fig. 8D, la saikosaponina A formó cuatro enlaces de hidrógeno: tres enlaces mediados por la cadena lateral y uno mediado por la cadena principal. En particular, la saikosaponina A estableció enlaces de hidrógeno de 2,1 Å tanto con el residuo de la cadena principal F201 como con el residuo de la cadena lateral N119. Los resultados adicionales del acoplamiento molecular se presentan en la Figura S6 complementaria. Estos hallazgos sugieren que la hidroxisaflorina A y la saikosaponina A no solo revierten la expresión génica aberrante en pacientes de alto riesgo a nivel transcripcional, sino que también se unen a TRAP1 a nivel de la proteína para inhibir la desregulación metabólica mitocondrial mediada por TRAP1. Este mecanismo dual destaca su potencial como candidatos terapéuticos para pacientes con CRC de alto riesgo.

La saikosaponina A exhibe actividad anticancerígena en ensayos in vitro

TRAP1 funciona como un oncogén o un supresor tumoral, según el tipo de tumor. La inmunohistoquímica de pares de tejidos tumorales y adyacentes normales de tres pacientes con CRC en el Hospital No. 2 de Ningbo reveló una fuerte tinción citoplasmática de TRAP1 en las células tumorales, pero una expresión mínima en el tejido del colon normal (Fig. 9A, B). Las investigaciones previas han demostrado que la inhibición de TRAP1 eleva los niveles de ROS en las células cancerosas [^[64]]. El análisis de citometría de flujo demostró que la hidroxisaflorina A no indujo significativamente la apoptosis en comparación con el control (Figura S7 complementaria); por lo tanto, los análisis posteriores se centraron en la saikosaponina A. En comparación con el inhibidor de TRAP1 establecido, TRAP1-IN-1, investigamos el efecto de la saikosaponina A sobre la generación de ROS en las células de CRC HT29, HCT116 y SW480. El tratamiento con 20 μM de saikosaponina A durante 24 horas aumentó significativamente la producción de ROS (Fig. 9C, H, M). Estos resultados indican que la focalización farmacológica de TRAP1 mejora el estrés oxidativo en las células de CRC, lo que explica potencialmente su mecanismo anticancerígeno. Para determinar el efecto de la inhibición de TRAP1 sobre el crecimiento y la supervivencia celular, realizamos un ensayo CCK-8 que comparó los efectos citotóxicos de la saikosaponina A con los de TRAP1-IN-1 (Fig. 9D, I, N). Después de 24 horas de tratamiento, la viabilidad de las células HT29, HCT116 y SW480 se redujo significativamente con la saikosaponina A, con una potencia inhibidora comparable a la de TRAP1-IN-1. Ambos tratamientos produjeron una citotoxicidad sustancial en relación con el grupo de control de dimetilsulfóxido. Estos hallazgos sugieren que la saikosaponina A ejerce actividad antitumoral a través de la inhibición de TRAP1.

Para dilucidar el mecanismo molecular subyacente a la citotoxicidad de la saikosaponina A en el CRC, realizamos un análisis de citometría de flujo. La saikosaponina A indujo significativamente la apoptosis en las células HT29, HCT116 y SW480, como lo demostró el aumento de las poblaciones positivas para la anexina V (Fig. 9E, J, O). La cuantificación confirmó tasas de apoptosis sustancialmente más altas en las células tratadas en comparación con los controles (Fig. 9F, K, P), lo que indica que la inducción de la apoptosis es un mecanismo principal de la actividad anticancerígena de la saikosaponina A. El análisis de Western blot aclaró aún más el efecto de la saikosaponina A sobre TRAP1 en las células de CRC. El compuesto indujo la degradación selectiva de las proteínas dependientes de TRAP1 clave, que incluyen NDUFS1, glutaminasa-1 y Sirt3 (Fig. 9G, L, Q) [^[65]]. Este patrón de degradación se asemejó al de los inhibidores de TRAP1 establecidos, lo que confirmó que la saikosaponina A interrumpe específicamente la función de la chaperona de TRAP1. Coherente con los hallazgos previos de que la inhibición farmacológica de TRAP1 desestabiliza las proteínas cliente mitocondriales, estos resultados identifican a TRAP1 como el objetivo molecular a través del cual la saikosaponina A ejerce su actividad anticancerígena.

Discusión

Desarrollo del modelo

En este estudio, desarrollamos SCMO, un nuevo marco computacional para la predicción del tiempo de supervivencia en cáncer. SCMO utiliza el algoritmo EcoTyper para reconstruir las características del microambiente tumoral (TME) a nivel de resolución unicelular a partir de datos de secuenciación de ARN masiva (bulk RNA-seq). Al integrar estas características con datos multiómicos en un modelo de aprendizaje profundo, SCMO mejoró significativamente la precisión de la predicción tanto en los conjuntos de entrenamiento como de prueba en comparación con los métodos existentes. Aunque la aplicación clínica de los modelos pronósticos basados en datos multiómicos se ve limitada por el desafío de obtener perfiles multiómicos completos para pacientes individuales, abordamos esta limitación diseñando SCMO-Lite, una alternativa optimizada. Utilizando algoritmos de atribución basados en gradientes, identificamos 12 características ómicas clave fuertemente asociadas con las características del TME. SCMO-Lite mantuvo un rendimiento predictivo robusto al tiempo que redujo la dependencia de datos multiómicos completos, centrándose en este conjunto de características mínimo pero biológicamente informativo. Esta mejora aumenta la viabilidad para la traslación clínica.

Interpretación del modelo

Para garantizar la interpretabilidad, realizamos una caracterización biológica exhaustiva de las características del TME específicas del cáncer colorrectal (CRC). Nuestro atlas del TME a nivel unicelular reveló distintos estados celulares y ecosistemas multicelulares. En particular, el análisis de la comunicación celular identificó interacciones patógenas entre macrófagos y fibroblastos dentro de E15. Esta observación es consistente con informes previos sobre la interacción macrófago-fibroblasto que promueve el tumor en el CRC [^[66]]. Los análisis ST revelaron además aumentos progresivos en la abundancia de E15 y una agregación espacial más densa a medida que avanza el tumor, estableciendo E15 como una unidad del TME distinta y un factor pronóstico independiente.

El análisis de atribución de gradientes identificó las características clave de cada capa ómica que contribuyeron al rendimiento del modelo. Por ejemplo, Fusobacterium, que se ha relacionado previamente con la progresión del CRC [^[59]], surgió como una característica crítica en el MIC. La puntuación de riesgo de SCMO identificó con éxito un subconjunto de pacientes con un pronóstico favorable en el grupo CMS4, que de otro modo tiene un mal pronóstico, complementando así el sistema de clasificación CMS existente y ofreciendo nuevas perspectivas sobre la evaluación pronóstica de los pacientes con CMS4.

Implicaciones clínicas

Los pacientes con CRC de alto riesgo mostraron una expresión reducida de los puntos de control inmunitario, lo que indica un fenotipo "inmune-frío" caracterizado por una actividad disminuida de los linfocitos T citotóxicos y una señalización de interferón atenuada. Este microambiente inmunosupresor perjudica el reconocimiento tumoral y favorece la resistencia a la quimioterapia a través de vías de señalización alteradas. En contraste, los tumores inmunológicamente activos responden de manera más eficaz a la quimioterapia debido a una mayor respuesta a los daños en el ADN; los tumores inmune-fríos exhiben activación de la EMT y características de células madre, lo que conduce a la resistencia [^[67]]. Nuestros hallazgos indican que el microambiente inmunosupresor en los pacientes de alto riesgo contribuye a la resistencia intrínseca a la quimioterapia, lo que sugiere que las estrategias combinadas de inmunoterapia y quimioterapia pueden mejorar los resultados clínicos.

Para abordar los desafíos terapéuticos en los pacientes de alto riesgo, realizamos una selección de fármacos dirigida a TRAP1, una característica clave identificada por el análisis de atribución de gradientes como un posible objetivo terapéutico. El acoplamiento molecular reveló que la saikosaponina A se une a TRAP1 a través de interacciones extensas de enlaces de hidrógeno, lo que respalda su potencial como un nuevo inhibidor de TRAP1. La validación in vitro posterior demostró que la saikosaponina A ejerce efectos antitumorales al modular el metabolismo de las especies reactivas de oxígeno (ROS) mitocondriales en las células tumorales, lo que induce la muerte celular por apoptosis.

TRAP1 puede servir como un objetivo terapéutico complementario, que podría proporcionar nuevas intervenciones personalizadas para subgrupos de pacientes con opciones de tratamiento limitadas. Además, el enfoque de descubrimiento de características integrado en el marco SCMO establece un nuevo paradigma para aplicar el aprendizaje profundo con el fin de identificar objetivos terapéuticos a partir de datos multiómicos. Esta estrategia tiene el potencial de facilitar la identificación de objetivos previamente no reconocidos y avanzar en el desarrollo de la oncología de precisión.

Limitaciones

Aunque el marco SCMO propuesto en este estudio ofrece un nuevo enfoque para la predicción de la supervivencia, persisten varias limitaciones. En términos de aplicabilidad, el modelo demostró un fuerte rendimiento para la predicción de la supervivencia a largo plazo (más de 3 años), pero su precisión disminuyó para la predicción a corto plazo (1 año), lo que destaca los mayores desafíos en la predicción de los resultados a corto plazo para los pacientes con CRC. En cuanto a la interpretabilidad biológica, aunque la agregación espacial de E15 se observó en dos plataformas de transcriptómica espacial distintas, esta observación se validó solo en un número limitado de conjuntos de datos de transcriptómica espacial. La generalizabilidad y la relevancia clínica de este patrón requieren confirmación en cohortes de transcriptómica espacial más grandes.

Direcciones futuras

El desarrollo futuro de modelos pronósticos debería incorporar una gama cada vez mayor de características con potencial predictivo a medida que avance la comprensión biológica. Por ejemplo, el ADN celular libre circulante ha surgido como un biomarcador crítico para la progresión de la enfermedad en las neoplasias hematológicas, lo que se ve respaldado por los avances en las tecnologías de biopsia líquida [^[68]]. En comparación con la elaboración de perfiles multiómicos de tejidos tumorales sólidos, el ADN celular libre circulante reduce la necesidad de procedimientos invasivos y permite el seguimiento dinámico de las señales derivadas del tumor. Las características genómicas representan una capa fundamental en los estudios multiómicos; el modelo actual incorpora tanto mutaciones como variaciones en el número de copias. Sin embargo, estas solo capturan alteraciones genómicas localizadas, mientras que la duplicación del genoma completo proporciona una medida a escala cromosómica de la inestabilidad genómica. Cada vez hay más evidencia de que la duplicación del genoma completo desempeña un papel complejo y dependiente del contexto en la biología tumoral, mostrando efectos tanto oncogénicos como supresores de tumores, y representa un factor fundamental en la progresión del cáncer [^[69], ^[70]]. La incorporación de ADN celular libre circulante y duplicación del genoma completo en futuros modelos pronósticos puede mejorar sustancialmente el poder predictivo y la relevancia clínica.

Conclusión

Este estudio establece SCMO, un nuevo marco de referencia para el desarrollo de modelos pronósticos, que al mismo tiempo mejora la comprensión del microambiente tumoral (TME) y optimiza la precisión de la predicción multiómica. Utilizando el cáncer colorrectal (CRC) como prueba de concepto, desarrollamos un modelo pronóstico, refinamos el sistema de clasificación CMS e identificamos posibles compuestos naturales anticancerígenos para poblaciones de alto riesgo con bajas tasas de respuesta a la inmunoterapia y una escasa sensibilidad a los fármacos. El marco SCMO demuestra una amplia aplicabilidad en diferentes tipos de cáncer y proporciona un equilibrio clínicamente relevante entre la precisión predictiva y la interpretabilidad biológica.

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