Papeles distintos y cooperativos de la Osteopontina del huésped y del tumor en la metástasis hepática del cáncer colorrectal

El cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa más común de muerte por cáncer en los Estados Unidos^[1]. Aunque una minoría de los CCR (10-15%) presenta inestabilidad de microsatélites alta (MSI-H) y responde bien al bloqueo de PD-(L)1, la mayoría de los casos (85-90%) son microsatélites estables y tienen reparación de errores de apareamiento funcional (MSS), un subtipo que responde mal a la inhibición de los puntos de control inmunitario (ICI)^[2],^[3]. Además, la gestión del CCR MSS presenta desafíos clínicos, ya que hasta el 50% de los pacientes con CCR desarrollan metástasis hepáticas (CRHLM), que son difíciles de resecar y representan aproximadamente el 70% de la diseminación metastásica en el CCR debido a la diseminación hematógena a través del sistema portal^[4],^[5],^[6]. Las metástasis hepáticas son un predictor independiente de mal pronóstico en el CCR y se asocian con una reducción sustancial de la respuesta al bloqueo de PD-(L)1 en comparación con las metástasis en otros sitios^[7]-^[9].

A pesar de estos malos resultados clínicos, tanto el CCR MSS como el MSI-H contienen con frecuencia abundantes linfocitos T citotóxicos (CTL), lo que sugiere que la exclusión inmune por sí sola no explica completamente la resistencia terapéutica^[10]-^[12]. En particular, la expresión de PD-L1 suele ser débil o ausente en las células epiteliales tumorales del CCR MSS, lo que indica que el fracaso de la terapia con ICI puede deberse a mecanismos independientes de PD-L1^[13],^[14]. La evidencia emergente sugiere que el microambiente metastásico hepático impone limitaciones únicas a la inmunidad antitumoral^[15]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de comprender los mecanismos que promueven las metástasis hepáticas e identificar nuevas vías de tratamiento, especialmente en la enfermedad MSS.

Entre los biomarcadores de la progresión del CCR, la osteopontina se ha convertido en un objetivo importante de investigación reciente^[16]-^[18]. La osteopontina (OPN), codificada por SPP1, es una fosfoproteína secretada que es expresada por las células tumorales y diversas células huésped e inmunitarias. La OPN se une a CD44 y a múltiples heterodímeros de integrinas, modulando las interacciones con la matriz extracelular, la adhesión celular y la señalización intracelular^[19]. Hemos demostrado, junto con otros, que la OPN suprime la función de las células T a través de CD44 y promueve el reclutamiento de macrófagos a través de la señalización de CD44 e integrinas^[20]-^[23]. En múltiples cánceres, incluido el CCR, la OPN promueve la progresión y la metástasis^[24]-^[33]. En particular, los tumores de CRHLM están enriquecidos con macrófagos asociados al tumor (MAT) de tipo M2 y con alta expresión de SPP1, una población que se asocia de forma recurrente con malos resultados clínicos^[34]-^[36]. También se ha demostrado que esta población de macrófagos SPP1-hi media la resistencia a la ICI en el cáncer de próstata resistente a la castración^[37]. La OPN también es expresada por las células tumorales y recientemente se ha demostrado que mantiene el destino de las células mesenquimales en el cáncer de páncreas, lo que subraya su amplio papel en la regulación del destino de las células tumorales^[38],^[39]. Se ha propuesto la OPN como un objetivo terapéutico; sin embargo, los enfoques sistémicos que neutralizan globalmente la OPN probablemente afectarán tanto a los reservorios derivados del huésped como a los derivados del tumor^[40],^[41],^[42]. Las contribuciones relativas de la OPN derivada del tumor frente a la OPN derivada del huésped en el CRHLM no se han investigado directamente hasta el momento.

Los recientes avances en la transcriptómica espacial permiten la resolución a nivel de célula única y el mapeo de la expresión génica dentro de los tumores. Aquí, aprovechamos la transcriptómica espacial CosMx y modelos de ratón con eliminación genética para investigar las funciones específicas de compartimento de la OPN en las metástasis hepáticas, revelando distintos roles derivados del tumor y del huésped en la configuración del microambiente tumoral en el CRHLM. El direccionamiento de la OPN puede desbloquear un nicho inmunitario antitumoral asociado con la respuesta al bloqueo de PD-(L)1.

Resultados

La OPN derivada del tumor y del huésped promueve la metástasis del cáncer de colon en el hígado

El análisis de conjuntos de datos de cáncer colorrectal (CCR) del Proyecto Genoma del Cáncer (TCGA; COAD/READ) reveló que la alta expresión de OPN se asocia con una reducción del tiempo de supervivencia general en pacientes con cáncer de colon (Fig. 1A). Coherente con esta observación, el nivel de expresión de OPN aumenta con la progresión de la enfermedad y fue más alto en pacientes con CCR en estadio IV (Fig. 1B). Para definir las fuentes celulares de la OPN en el CCR, analizamos a continuación conjuntos de datos de secuenciación de ARN de célula única (scRNAseq) disponibles públicamente de pacientes con cáncer de colon humano. La expresión de OPN fue más alta en los macrófagos en las metástasis hepáticas (CRHLM) (Fig. 1C). En particular, también se detectó OPN en las células tumorales, con una expresión significativamente mayor en las células tumorales metastásicas hepáticas en comparación con las células tumorales primarias (Fig. 1D).

Estos hallazgos indican que la OPN se enriquece preferentemente en las células tumorales y los macrófagos asociados al tumor (MAT) en el CRHLM, lo que sugiere que la OPN puede promover la enfermedad metastásica hepática. Para probar esta hipótesis, eliminamos Spp1 en la línea celular de tumor de colon murino, MC38-met (Fig. 1E). Las células tumorales de tipo salvaje (WT) y deficientes en OPN (KO) se trasplantaron a ratones C57BL/6J (WT) y B6.129S6(Cg)-Spp1tm1Blh/J (en adelante, OPN-KO; KO) utilizando un modelo experimental de metástasis hepática que implica la inyección intrasplénica seguida de esplenectomía^[43], lo que imita la vía portal de la metástasis (Fig. 1F). La pérdida de OPN en las células tumorales, el tejido del huésped o ambos, resultó en una reducción significativa de la carga de metástasis hepáticas, medida por el peso bruto del hígado (Fig. 1G y H). El análisis histológico confirmó significativamente menos nódulos tumorales microscópicos cuando se implantaron células tumorales KO de OPN en ratones KO de Spp1 (KO-KO) en comparación con todos los demás grupos (Fig. 1I-K).

Para validar estas observaciones en un modelo independiente, Spp1 se eliminó a continuación en una segunda línea celular de tumor de colon murino, CT26 (Fig. 1L). Las células tumorales CT26 de tipo salvaje o KO de OPN se trasplantaron quirúrgicamente en ratones BALB/c sin relación para establecer metástasis hepáticas. Como se observó en el modelo MC38-met, la eliminación de OPN redujo significativamente la carga de metástasis hepáticas (Fig. 1M y N). En conjunto, estos estudios de pérdida de función genética demuestran que tanto la OPN derivada del tumor como la del huésped contribuyen al CRHLM. Sin embargo, estos experimentos no resuelven cómo la OPN de distintos compartimentos moldea los estados de las células tumorales, los fenotipos inmunitarios o las interacciones entre células dentro del microambiente metastásico. Dado que la OPN es un ligando secretado cuya señalización depende de la proximidad espacial entre las células que lo producen o responden a él, recurrimos a la transcriptómica espacial para resolver sus funciones específicas de la fuente.

La transcriptómica espacial revela que la OPN específica de la fuente altera los fenotipos celulares y los microambientes locales en la metástasis del tumor de colon en el hígado

Empleamos la transcriptómica espacial para caracterizar cómo la OPN modula espacialmente los fenotipos y las interacciones celulares dentro del CRHLM. Utilizando muestras de metástasis hepáticas del experimento de eliminación de OPN 2x2 (Fig. 1F), aplicamos el panel de caracterización universal de ratón CosMx en la plataforma Spatial Molecular Imager (SMI) (Fig. 2A). El panel detectó simultáneamente 1000 transcripciones de ARNm seleccionadas, tres proteínas de superficie celular y una tinción nuclear a resolución de célula única en portaobjetos de parafina. Se seleccionaron un total de 544 campos de visión (FOV) en las áreas de los nódulos tumorales en los cuatro grupos experimentales. Se realizó una segmentación exhaustiva de células únicas (Fig. S1A), lo que arrojó un total de 1.168.484 células únicas.

La agrupación no supervisada identificó 21 poblaciones celulares (Fig. 2C, 2D y S1B). La tipificación celular anotó las células no cancerosas en 15 subpoblaciones, incluidas 8 poblaciones de células inmunitarias y 7 poblaciones de células estromales y parenquimatosas (Fig. 2D y E). Se utilizaron firmas de subpoblaciones de células tumorales de colon publicadas para realizar el mapeo de referencia para anotar las cinco subpoblaciones de células tumorales: células de alta división, células de baja división, células similares a tallo Ogn+dcnhiCD34hi, células con respuesta a IFN y células cancerosas con hipoxia (Fig. 2D)^[44]. Para cuantificar la frecuencia de los tipos de células en los tumores, creamos gráficos de barras de células ubicadas solo dentro de los nódulos, excluyendo el parénquima hepático normal que rodea los tumores (Fig. 2E y 3A).

La ubicación espacial proporcionada por la transcriptómica espacial permite el análisis de vecindad/nicho que agrupa microambientes localizados en función de grupos de células que están colocalizadas. Realizamos un análisis de nicho e identificamos ocho nichos tumorales (T1-T8) y dos nichos hepáticos (L1 y L2) (Fig. 3C). Trazamos FOV representativos que se componen esencialmente de un solo nicho (Fig. 3F, S2C) y observamos que distintos tipos de células definen cada nicho (Fig. 3E). Los nichos T1 y T2 están dominados por células tumorales de alta división y una baja infiltración de células inmunitarias. El nicho T3 exhibe una alta proporción de células tumorales con hipoxia, mientras que T4 contiene muchas células cancerosas similares a tallo. Las células de baja división predominan en el nicho T5. Los nichos T6 y T7 representan los dos nichos de respuesta inmune: en T6, hay altos monocitos, células dendríticas (DC) y células T, mientras que T7 se caracteriza por macrófagos similares a M1, DC y la mayor proporción de células T en cualquier nicho. Finalmente, el nicho T8 representa las pseudocápsulas que rodean los nódulos tumorales (Fig. 3B). En particular, observamos un enriquecimiento heterogéneo de nichos en diferentes muestras (Fig. 3C y D). Los nichos de alta división T1 y T2 fueron más altos en la muestra WT-WT, mientras que en el grupo globalmente deficiente en OPN KO-KO, el nicho de baja división T5 fue el más abundante, lo que sugiere el papel de la OPN en el impulso de la proliferación de las células tumorales. Los nichos inmunitarios activos T6 y T7 estuvieron esencialmente ausentes en el tejido WT-WT. T6 se enriqueció en huéspedes deficientes en OPN (WT-KO y KO-KO), mientras que la pérdida de OPN tumoral condujo a un aumento en T7 (KO-WT) (Fig. 3C y D).

El perfilado de la transcriptómica espacial reveló amplios efectos de la OPN derivada del tumor y del huésped en los compartimentos tumoral e inmunitario. Nos centramos en los análisis posteriores en cuatro programas mecanicistas que son biológicamente y terapéuticamente relevantes en el CRHLM. Estos incluyen: (i) la señalización autócrina de OPN en las células tumorales impulsa la proliferación, (ii) la OPN derivada del huésped y del tumor regula diferencialmente la diferenciación y la polarización de los monocitos, (iii) la OPN suprime las células T en el microambiente tumoral y (iv) los programas de respuesta a IFN dominan en los tumores de los huéspedes deficientes en OPN.

La OPN derivada del tumor impulsa la proliferación tumoral a través de la señalización de MAPK

Basándonos en la observación de que los nichos tumorales de alta división T1 y T2 fueron más abundantes en el grupo WT-WT, mientras que el nicho de baja división T5 se enriqueció en el grupo KO-KO, investigamos cómo la OPN influye en la proliferación tumoral. Más del 50% de las células en T1 son células tumorales de alta división (Fig. 4A). Para identificar las señales que impulsan la proliferación en estas células, aplicamos el análisis CellChat a un FOV representativo de T1 y encontramos que las interacciones receptor-ligando más fuertes fueron las interacciones autócrinas entre las células tumorales de alta división (Fig. 4B y C, S3A-D). El examen de redes específicas reveló que la red SPP1 (OPN) fue un contribuyente significativo a estas interacciones autócrinas (Fig. 4E y F, y S3C-D).

Los gráficos de características de la expresión de Spp1 en las cuatro muestras mostraron que la OPN es expresada por las células tumorales, las células mieloides y los colangiocitos parenquimatosos hepáticos (Fig. 4D). Los gráficos de imagen de un FOV representativo de T1, compuesto principalmente por el nicho T1 (Fig. 4I), confirmaron visualmente la expresión de Spp1 y Cd44, un receptor de OPN, en este nicho (Fig. 4J, y S4A-D). Aunque la OPN es expresada por las células tumorales, es aún mayor en las células mieloides, particularmente en los macrófagos en los pacientes con CRHLM (Fig. 1C). La cuantificación de los transcritos de Spp1 reveló que, en el nicho T1, casi el 90% del ARNm de Spp1 proviene de las células tumorales (Fig. 4G), lo que sugiere que la señalización autócrina de OPN predomina sobre la OPN derivada de los mieloides en el impulso de la proliferación tumoral en este modelo. Coherente con esto, la proporción de células tumorales de baja división fue mayor en el grupo KO-WT que en el grupo WT-KO (Fig. 4H). Un FOV representativo de bajo ciclo T5 del grupo KO-KO ilustra la ablación global de OPN (Fig. 4K y L). Además, el grupo KO-KO mostró un aumento en las células tumorales de bajo ciclo en relación con el grupo KO-WT (Fig. 4H), lo que sugiere que la OPN del huésped también contribuye a la proliferación tumoral.

Validamos de forma independiente la reducción en la proliferación de las células tumorales mediante inmunohistoquímica (IHC) de Ki67 (Fig. 4M y N). Como se esperaba, las muestras WTt-WTm contenían más células Ki67+ por campo de visión que los grupos de knockout. Para evaluar directamente el papel de OPN en la proliferación de las células tumorales, realizamos ensayos de proliferación in vitro. Las células CT26 y MC38-met con knockout de OPN mostraron una disminución significativa en la proliferación en comparación con los controles scramble (Fig. 4O). El tratamiento de las células CT26 y MC38-met parentales con anticuerpo anti-OPN reprodujo el efecto del knockout, lo que confirmó que la proliferación depende de OPN (Fig. 4P). Para explorar el mecanismo subyacente de la proliferación de las células tumorales impulsada por OPN, calculamos una puntuación de señalización de MAPK a partir de una firma génica relevante^[45] utilizando los genes de nuestro conjunto de datos, lo que reveló una disminución en la actividad de MAPK en todos los grupos de knockout en relación con WTt-WTm (Fig. 4Q). El análisis de Western blot mostró una disminución significativa en la actividad de la quinasa MAPK, según lo determinado por la fosforilación de MEK y ERK en las líneas celulares con knockout de OPN en comparación con los controles scramble, lo que es consistente con las vías de señalización de OPN conocidas (Fig. 4R-T)^[46]. Además, OPN promueve la proliferación de células mieloides (Fig. SA-C), pero a través de una vía de señalización independiente de MAPK (Fig. S5A-F). Cabe destacar que se ha informado que la actividad de MAPK activa la producción de PGE2 en las células cancerosas, lo que puede suprimir los monocitos y las células T; sin embargo, en nuestro modelo, el knockout de OPN en las células tumorales MC38met no aumentó la producción de PGE2 (Fig. S5G y H)^[47],^[48]. En conjunto, estos resultados demuestran que la señalización autocrina de OPN en las células tumorales impulsa la proliferación a través de la vía MEK/ERK.

OPN de origen tumoral y del huésped regula la diferenciación de monocitos y la polarización de macrófagos

Una de las diferencias más notables en la composición de los tipos de células entre los cuatro grupos experimentales fue un aumento relativo de los monocitos en los huéspedes deficientes en OPN (WTt-KOm y KOt-KOm; Fig. 2E). La comparación de las proporciones de monocitos y macrófagos reveló que los macrófagos similares a M2 predominaban en los tumores WTt-WTm (Fig. 5A), mientras que los tumores KOt-WTm estaban enriquecidos con macrófagos similares a M1. En los huéspedes deficientes en OPN (WTt-KOm y KOt-KOm), los monocitos comprendían la mayor parte de este compartimento mieloide (Fig. 5A-C). El análisis de expresión diferencial destacó distintos programas transcripcionales en los tres grupos. Los macrófagos similares a M1 expresaron altos niveles de transcritos de presentación de antígenos (H2-Eb1, H2-Ab1, H2-Aa, Cd74 y H2-Dmb1) (Fig. 5B). Los macrófagos similares a M2 expresaron componentes del complemento (C1qa, C1qc, C1qb) junto con Pf4 y Mrc1 (CD206) (Fig. 5B), lo que sugiere una superposición sustancial con los TAM SPP1hi descritos previamente que promueven la metástasis hepática. Los monocitos se caracterizaron por una alta expresión de Plac8, Mx1, Ifit3/b, Cxcl10 y Srgn, lo que indica un estado activo y sensible a los interferones (Fig. 5B)^[47].

La proyección UMAP de estos grupos y el análisis de pseudotiempo, con los monocitos como grupo raíz, revelaron un continuo transcripcional desde los monocitos hasta los macrófagos (Fig. 5C-E). La mayoría de los monocitos se ubicaron en las primeras etapas del pseudotiempo, los macrófagos similares a M2 ocuparon estados intermedios y los macrófagos similares a M1 residieron en el extremo distal, lo que refleja una divergencia transcripcional sustancial (Fig. 5E). En consonancia con esto, Cxcl10, una quimiocina maestra para el reclutamiento de células T y NK CXCR3+, fue más alta en las primeras etapas del pseudotiempo (Fig. 5F), y los grupos WTt-KOm y KOt-KOm contenían la mayor cantidad de células en esta región (Fig. 5G). Estos datos sugieren que en los huéspedes deficientes en OPN, los monocitos con potencial de reclutamiento inmunitario dominan el compartimento mieloide, lo que se ajusta al contexto más amplio de estudios recientes que muestran poblaciones de monocitos capaces de presentar antígenos tumorales a las células T y facilitar la inmunidad antitumoral^[47].

Para examinar directamente el papel de OPN en la polarización de los macrófagos, eliminamos Spp1 en los macrófagos RAW264.7. Estas células ya diferenciadas modelan el comportamiento de los macrófagos maduros en el microambiente tumoral (TME) en lugar de la dinámica de diferenciación de los monocitos. La citometría de flujo reveló que las células RAW264.7 deficientes en OPN exhibieron una disminución de CD204 (receptor de carroñeros de macrófagos 1) en comparación con los controles scramble (Fig. 5H e I, S5J), lo que es consistente con una reducción en el fenotipo similar a M2 y pro-tumoral, y con informes previos^[49],^[50]. Estos resultados destacan que OPN actúa en el TME de forma paracrina y autocrina para mantener la activación alternativa de los macrófagos.

La expansión de los monocitos en los tumores de los huéspedes deficientes en OPN, pero no en los tumores KOt-WTm, sugirió que el OPN del huésped regula la diferenciación de monocitos a macrófagos antes de la entrada en el TME. Para probar esto, analizamos las células del exudado peritoneal de ratones WT y KO de OPN sin tumores, donde el reclutamiento de monocitos está en curso (Fig. 5L)^[51]. La citometría de flujo reveló un aumento de las poblaciones Ly6Chi, F4/80hi y Ly6C-hi, F4/80-lo en los ratones KO de OPN en relación con WT (Fig. 5J y K), lo que indica una diferenciación alterada y, por lo tanto, una acumulación de monocitos en ausencia de OPN del huésped. Estos datos respaldan un modelo en el que el OPN derivado del huésped autoriza la diferenciación de monocitos en macrófagos, mientras que el OPN derivado del tumor en el TME activa alternativamente a los macrófagos hacia un estado similar a M2 y pro-tumoral (Fig. 5L).

OPN suprime las células T en el microambiente tumoral

Las células T se encuentran en el centro de la inmunidad antitumoral. Previamente demostramos que OPN suprime la proliferación y la activación de las células T en los tumores de colon in vivo, centrándonos en los mecanismos mieloides dependientes de IRF8 y el bloqueo mediado por anticuerpos de OPN^[20],^[22],^[52]. Aquí, ampliamos estos hallazgos para analizar los roles específicos de cada compartimento de OPN en la regulación de la inmunidad de las células T. Los tres grupos de knockout (WTt-KOm, KOt-WTm y KOt-KOm) exhibieron un aumento de la infiltración de células T en comparación con los tumores WTt-WTm (Fig. 6A). Recientemente se informó que la deficiencia de SPP1 en las células mieloides aumenta la expresión de CXCL9 y CXCL10 a través de la vía cGAS-STING, lo que puede explicar la escasa infiltración de células T en los TME competentes en OPN^[53]. El aumento de las células T en los grupos de knockout se debió al enriquecimiento específico del nicho de las células T. Los nichos antitumorales T6 y T7, identificados previamente en los huéspedes deficientes en OPN y en los tumores KOt-WTm, respectivamente, contenían las mayores proporciones de células T entre todos los nichos (Fig. 6B). La inspección visual de los campos de visión representativos confirmó que T6 estaba enriquecido con células T, monocitos y células dendríticas (DCs), mientras que T7 estaba enriquecido con células T, macrófagos similares a M1 y DCs (Fig. 6C y D). El análisis de colocalización reveló una estrecha asociación espacial entre las células T y las DCs en T7 (Fig. 6E).

Dado que la mayor supresión tumoral se produjo en el grupo KOt-KOm (Fig. 1K), que se enriqueció preferentemente con el nicho T6 en lugar de T7, buscamos determinar si el estado funcional de las células T era diferente entre estos dos nichos. Las células T en el nicho T6 expresaron niveles más altos de genes relacionados con la citotoxicidad (Gzmb, Tnf, Lamp2 y Prf1), mientras que las células T en el nicho T7 exhibieron una expresión elevada de marcadores asociados con el agotamiento (Lag3, Tigit, Pdcd1, Tox) (Fig. 6F). Validamos el aumento de la infiltración de células T en los tumores deficientes en OPN mediante citometría de flujo e IHC. En consonancia con los datos de transcriptómica, los tres grupos de knockout exhibieron un aumento de la abundancia de células T en relación con los tumores WTt-WTm (Fig. 6G-J).

Dado que la firma de células T citotóxicas más pronunciada se encuentra en T6, a continuación, examinamos si las células tumorales en los huéspedes deficientes en OPN exhibían evidencia de una mayor susceptibilidad a la muerte mediada por el sistema inmunitario. Aunque el panel CosMx no analizó la apoptosis activa, los tumores de los grupos WTt-KOm y KOt-KOm mostraron una mayor expresión de genes relacionados con la apoptosis (Bax, Bcl2, Casp3, Casp8 y Fas), particularmente Casp8 (Fig. 6K). Si bien la expresión elevada de estos genes no indica directamente la apoptosis, sugiere estrés celular y un estado preparado para el ataque citotóxico. En consonancia con esta interpretación, el tinte TUNEL reveló un aumento significativo de la apoptosis en los tumores de los huéspedes deficientes en OPN en comparación con los tumores WTt-WTm y KOt-WTm (Fig. 6L).

Apoyando la muerte mediada por células T activas, identificamos regiones dentro del nicho T6 con células T Gzmb-hi cerca de células tumorales que expresan transcritos asociados con la apoptosis, lo que proporciona evidencia espacial de interacciones citotóxicas activas (Fig. 6N). Para probar directamente si OPN suprime la función citotóxica de las células T, realizamos experimentos de cocultivo utilizando CTLs específicas de gp70 2/20 y células tumorales CT26 que expresan gp70^[54],^[55]. Las CTLs fueron más eficaces para matar las células CT26-OPN KO en comparación con los controles scramble (Fig. 6O, carriles 1-2). El pretratamiento de las CTLs con OPN recombinante redujo significativamente su capacidad para matar las células CT26-Scramble (Fig. 6O, carriles 1 y 3). Es importante destacar que la eliminación de la supresión mediada por OPN mediante el cultivo de CTLs estimuladas con OPN con células CT26-OPN KO restauró rápidamente la actividad citotóxica (Fig. 6O, carril 4).

En conjunto, estos datos demuestran que los huéspedes deficientes en OPN están enriquecidos con un nicho tumoral que contiene células T altamente citotóxicas y no agotadas capaces de suprimir eficazmente la progresión tumoral. Si bien la pérdida de OPN derivado del tumor aumenta la infiltración de células T, estas células exhiben un fenotipo más agotado. Por lo tanto, el OPN del huésped y el OPN derivado del tumor cooperan para suprimir la infiltración, la función y la citotoxicidad de las células T en el TME.

La deficiencia de OPN del huésped libera un nicho de respuesta de interferón que impulsa la inmunidad antitumoral

Después de observar que las células T en el nicho T6 mostraban un estado activado, buscamos caracterizar el panorama inmunitario más amplio del nicho T6. El nicho T6 se enriqueció predominantemente en tumores deficientes en OPN del huésped (WTt-KOm y KOt-KOm), mientras que T7 se observó de manera significativa solo en el grupo KOt-WTm (Fig. 7A). El nicho T6 se caracterizó por una alta abundancia de monocitos y células tumorales con respuesta a los interferones, mientras que T7 se enriqueció con macrófagos similares a M1 (Fig. 7B). El análisis de expresión diferencial reveló que T6 se enriqueció con genes involucrados en el reclutamiento inmunitario y la señalización del interferón de tipo I (Cxcl10, Plac8, Ifit3b, Ifit1, Oas3) (Fig. 7C). En contraste, T7 se definió por programas de presentación de antígenos (H2-Ab1, Cd74, H2-Aa, H2-Eb1), lo que es consistente con informes previos que vinculan el fenotipo de IFN y la expresión de CD74 con la respuesta a la inmunoterapia en el CRC^[56].

Dado que el microambiente tumoral (TME) con deficiencia global de OPN (KOt-KOm) modela con mayor precisión el probable efecto de la inmunoterapia de bloqueo de OPN, investigamos si la deficiencia de OPN en el huésped promueve un nicho antitumoral distinto que no se observa en otros contextos. Descubrimos que los monocitos y las células cancerosas con respuesta a IFN fueron los principales contribuyentes al programa de respuesta a IFN en T6 (Fig. 7D), lo que sugiere que el reclutamiento de monocitos y la señalización local de IFN son características clave de este nicho. Los monocitos representaron una fracción significativa de T6, lo que es consistente con un reclutamiento activo. El análisis de CellChat de la red de señalización CCL indicó que las células cancerosas con respuesta a IFN, las células cancerosas con alta tasa de división y los monocitos señalaron colectivamente para reclutar monocitos (Fig. 7E), lo que se corroboró con la alta expresión de Ccl2 y Ccl5 en estos tipos de células (Fig. 7F). El análisis espacial confirmó además la colocalización de monocitos y células tumorales con respuesta a IFN dentro de T6, lo que verificamos mediante la inspección visual de un campo de visión (FOV) representativo de T6 (Fig. 7G-I, S&). Al volver a colorear el mismo FOV para las células inmunitarias adaptativas, se observó que las células T entraban en contacto con frecuencia tanto con las células dendríticas (DCs) como con los monocitos, lo que sugiere que estas poblaciones innatas pueden modular la actividad de las células T dentro del nicho T6. Para evaluar más a fondo si los programas transcripcionales reflejaban la organización espacial de las células, realizamos un análisis de módulos génicos colocalizados espacialmente (SCGM) utilizando los centroides de las células como ubicaciones de los transcritos. Identificamos 37 módulos génicos con alta colocalización espacial, incluido un módulo de 25 genes que representa un programa de respuesta al interferón de tipo I (Fig. 7K, S8A). Coherente con nuestros otros análisis, los monocitos y las células tumorales con respuesta a IFN fueron los principales contribuyentes a este módulo (Fig. 7K), lo que apoya la conclusión de que T6 es un nicho impulsado por monocitos y con respuesta a IFN.

La inmunoterapia de bloqueo de OPN suprime la metástasis hepática del CRC y mejora la infiltración de células T

Guiados por nuestros hallazgos de los experimentos de eliminación genética, evaluamos el potencial terapéutico de la neutralización de OPN in vivo. Se trató a ratones Balb/c con metástasis hepáticas de CT26 con un anticuerpo monoclonal anti-OPN (100D3). La inmunoterapia de bloqueo de OPN redujo significativamente la carga tumoral en este modelo sinérgico (Fig. 8A). La citometría de flujo y la inmunohistoquímica (IHC) revelaron un aumento correspondiente en la infiltración de células T después del tratamiento (Fig. 8B-E). Para determinar si estos efectos se traducían en metástasis hepáticas de CRC humanas, utilizamos un modelo de xenoinjerto derivado de metástasis hepáticas de pacientes con cáncer de colon humano (PDX) en ratones humanizados. Primero confirmamos que nuestro clon 100D3 se une a la proteína OPN humana in vitro (Fig. 8F) e intracelularmente en células mieloides (Fig. 8G). Se trató a ratones con tumores PDX subcutáneos con anti-OPN o IgG cada tres días durante 15 ciclos (Fig. 8H). Los tumores del grupo de tratamiento fueron significativamente más pequeños, incluido un caso de remisión completa (Fig. 8I). El análisis por citometría de flujo e IHC demostró nuevamente una mayor infiltración de células T en el grupo de tratamiento (Fig. 8J-L). En conjunto, estos resultados indican que el bloqueo terapéutico de OPN suprime el crecimiento tumoral y promueve la infiltración de células T tanto en modelos sinérgicos como humanizados de metástasis hepáticas de CRC, lo que es consistente con nuestros estudios genéticos.

OPN derivado del tumor y del huésped promueve la metástasis hepática del cáncer de colon

El análisis de conjuntos de datos de cáncer colorrectal (CRC) de The Cancer Genome Atlas (TCGA; COAD/READ) reveló que la alta expresión de OPN se asocia con una reducción del tiempo de supervivencia general en pacientes con cáncer de colon (Fig. 1A). Coherente con esta observación, el nivel de expresión de OPN aumenta con la progresión de la enfermedad y fue más alto en pacientes con CRC en estadio IV (Fig. 1B). Para definir las fuentes celulares de OPN en el CRC, analizamos a continuación conjuntos de datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq) disponibles públicamente de pacientes con cáncer de colon humano. La expresión de OPN fue más alta en los macrófagos en las metástasis hepáticas (CRCLM) (Fig. 1C). Cabe destacar que también se detectó OPN en las células tumorales, con una expresión significativamente mayor en las células tumorales metastásicas hepáticas en comparación con las células tumorales primarias (Fig. 1D).

Estos hallazgos indican que OPN está enriquecido preferentemente en las células tumorales y los macrófagos asociados al tumor (TAM) en CRCLM, lo que sugiere que OPN puede promover la enfermedad metastásica hepática. Para probar esta hipótesis, eliminamos Spp1 en la línea celular de tumor de colon murino, MC38-met (Fig. 1E). Se trasplantaron células tumorales WT (WTt) y deficientes en OPN (KOt) a ratones C57BL/6J (WTm) y ratones B6.129S6(Cg)-Spp1tm1Blh/J (en adelante, OPN-KO; KOm) utilizando un modelo experimental de metástasis hepática que implica la inyección intrasplénica seguida de esplenectomía ^[43], lo que imita la vía de metástasis venosa portal (Fig. 1F). La pérdida de OPN en las células tumorales, el tejido del huésped o ambos resultó en una reducción significativa de la carga de metástasis hepáticas, según lo midió el peso bruto del hígado (Fig. 1G y H). El análisis histológico confirmó significativamente menos nódulos tumorales microscópicos cuando se implantaron células tumorales KO de OPN en ratones KO de Spp1 (KOt-KOm) en comparación con todos los demás grupos (Fig. 1I-K).

Para validar estas observaciones en un modelo independiente, se eliminó Spp1 en una segunda línea celular de tumor de colon murino, CT26 (Fig. 1L). Se trasplantaron quirúrgicamente células tumorales WT o KO de OPN de CT26 en ratones BALB/c sinérgicos para establecer metástasis hepáticas. Como se observó en el modelo MC38-met, la eliminación de OPN redujo significativamente la carga de metástasis hepáticas (Fig. 1M y N). En conjunto, estos estudios de pérdida de función genética demuestran que tanto el OPN derivado del tumor como del huésped contribuyen a CRCLM. Sin embargo, estos experimentos no resuelven cómo el OPN de diferentes compartimentos moldea los estados de las células tumorales, los fenotipos inmunitarios o las interacciones entre células dentro del microambiente metastásico. Dado que OPN es una ligando secretado cuya señalización depende de la proximidad espacial entre las células que lo producen o responden a él, recurrimos a la transcriptómica espacial para resolver sus funciones específicas de la fuente.

La transcriptómica espacial revela que el OPN específico de la fuente altera los fenotipos celulares y los microambientes locales en la metástasis hepática del tumor de colon

Empleamos la transcriptómica espacial para caracterizar cómo OPN modula espacialmente los fenotipos celulares y las interacciones dentro de CRCLM. Utilizando muestras de metástasis hepática del experimento de eliminación de OPN 2x2 (Fig. 1F), aplicamos el panel de caracterización universal de ratón CosMx en la plataforma Spatial Molecular Imager (SMI) (Fig. 2A). El panel detectó simultáneamente 1000 transcritos de ARNm seleccionados, tres proteínas de superficie celular y una tinción nuclear a nivel subcelular en portaobjetos de parafina (FFPE). Se seleccionaron un total de 544 campos de visión (FOV) en las áreas de los nódulos tumorales en los cuatro grupos experimentales. Se realizó una segmentación exhaustiva de una sola célula (Fig. S1A), lo que arrojó un total de 1.168.484 células individuales.

La agrupación no supervisada identificó 21 poblaciones celulares (Fig. 2C, 2D y S1B). La tipificación celular anotó las células no cancerosas en 15 subpoblaciones, incluidas 8 poblaciones de células inmunitarias y 7 poblaciones de células estromales y parenquimatosas (Fig. 2D y E). Se utilizaron firmas de subpoblaciones de células tumorales de colon publicadas para realizar el mapeo de referencia para anotar las cinco subpoblaciones de células tumorales: células de alta división, células de baja división, Ogn+dcnhiCD34hi (tipo madre), células con respuesta a IFN y células cancerosas con hipoxia (Fig. 2D) ^[44]. Para cuantificar la frecuencia de los tipos de células en los tumores, creamos gráficos de barras de células ubicadas solo dentro de los nódulos, excluyendo el parénquima hepático normal que rodea los tumores (Fig. 2E y 3A).

La ubicación espacial proporcionada por la transcriptómica espacial permite el análisis de nichos que agrupa microambientes localizados en función de grupos de células que están colocalizadas. Realizamos un análisis de nichos e identificamos ocho nichos tumorales (T1-T8) y dos nichos hepáticos (L1 y L2) (Fig. 3C). Trazamos FOV representativos que se componían esencialmente de un solo nicho (Fig. 3F, S2C) y observamos que diferentes tipos de células definían cada nicho (Fig. 3E). Los nichos T1 y T2 estaban dominados por células tumorales de alta división y una baja infiltración de células inmunitarias. El nicho T3 exhibió una alta proporción de células tumorales con hipoxia, mientras que T4 contenía muchas células cancerosas tipo madre. Las células de baja división predominan en el nicho T5. Los nichos T6 y T7 representan los dos nichos de respuesta inmunitaria: en T6, hay muchos monocitos, células dendríticas (DCs) y células T, mientras que T7 se caracteriza por macrófagos tipo M1, DCs y la mayor proporción de células T en cualquier nicho. Finalmente, el nicho T8 representó las pseudocápsulas que rodean los nódulos tumorales (Fig. 3B). Cabe destacar que observamos un enriquecimiento heterogéneo de nichos en diferentes muestras (Fig. 3C y D). Los nichos de alta división T1 y T2 fueron más altos en la muestra WTt-WTm, mientras que en el grupo con deficiencia global de OPN KOt-KOm, el nicho de baja división T5 fue el más abundante, lo que sugiere el papel de OPN en el impulso de la proliferación de las células tumorales. Los nichos inmunitarios activos T6 y T7 estaban esencialmente ausentes en el tejido WTt-WTm. T6 se enriqueció en huéspedes deficientes en OPN (WTt-KOm y KOt-KOm), mientras que la pérdida de OPN tumoral condujo a un aumento en T7 (KOt-WTm) (Fig. 3C y D).

El perfilado de la transcriptómica espacial reveló efectos generalizados de OPN derivado del tumor y del huésped en los compartimentos tumoral e inmunitario. Nos centramos en los análisis posteriores en cuatro programas mecanicistas que son biológicamente y terapéuticamente relevantes en CRCLM. Estos incluyen: (i) la señalización autócrina de OPN en las células tumorales impulsa la proliferación, (ii) el OPN derivado del huésped y del tumor regula diferencialmente la diferenciación y la polarización de los monocitos, (iii) el OPN suprime las células T en el TME y (iv) los programas de respuesta a IFN dominan en los tumores de los huéspedes deficientes en OPN.

El OPN derivado del tumor impulsa la proliferación tumoral a través de la señalización de MAPK

Basándonos en la observación de que los nichos tumorales de alta división T1 y T2 eran más abundantes en el grupo WTt-WTm, mientras que el nicho de baja división T5 se enriqueció en el grupo KOt-KOm, investigamos cómo OPN influye en la proliferación tumoral. Más del 50 % de las células en T1 son células tumorales de alta división (Fig. 4A). Para identificar las señales que impulsan la proliferación en estas células, aplicamos el análisis de CellChat a un FOV representativo de T1 y encontramos que las interacciones receptor-ligando más fuertes fueron las interacciones autócrinas entre las células tumorales de alta división (Fig. 4B y C, S3A-D). El examen de redes específicas reveló que la red SPP1 (OPN) fue un contribuyente significativo a estas interacciones autócrinas (Fig. 4E y F, y S3C-D).

Los gráficos de características de la expresión de Spp1 en las cuatro muestras mostraron que OPN es expresado por las células tumorales, las células mieloides y los colangiocitos parenquimatosos del hígado (Fig. 4D). Los gráficos de imágenes de un FOV representativo de T1, compuesto principalmente por el nicho T1 (Fig. 4I), confirmaron visualmente la expresión de Spp1 y Cd44, un receptor para OPN, en este nicho (Fig. 4J, y S4A-D). Aunque OPN es expresado por las células tumorales, es aún mayor en las células mieloides, particularmente en los macrófagos en los pacientes con CRCLM (Fig. 1C). La cuantificación de los transcritos de Spp1 reveló que, en el nicho T1, casi el 90 % del ARNm de Spp1 proviene de las células tumorales (Fig. 4G), lo que sugiere que la señalización autócrina de OPN predomina sobre el OPN derivado de las células mieloides en el impulso de la proliferación tumoral en este modelo. Coherente con esto, la proporción de células tumorales de baja división fue mayor en el grupo KOt-WTm que en el grupo WTt-KOm (Fig. 4H). Un FOV representativo de baja división T5 del grupo KOt-KOm ilustra la ablación global de OPN (Fig. 4K y L). Además, el grupo KOt-KOm mostró un aumento en las células tumorales de baja división en relación con el grupo KOt-WTm (Fig. 4H), lo que sugiere que el OPN del huésped también contribuye a la proliferación tumoral.

Validamos de forma independiente la reducción en la proliferación de las células tumorales mediante inmunohistoquímica de Ki67 (IHC) (Fig. 4M y N). Como se esperaba, las muestras WTt-WTm contenían más células Ki67+ por campo de visión que los grupos de knockout. Para probar directamente el papel de OPN en la proliferación de las células tumorales, realizamos ensayos de proliferación in vitro. Las células CT26 y MC38-met con knockout de OPN mostraron una disminución significativa en la proliferación en comparación con los controles de scramble (Fig. 4O). El tratamiento de las células CT26 y MC38-met parentales con anticuerpo anti-OPN reprodujo el efecto del knockout, lo que confirmó que la proliferación depende de OPN (Fig. 4P). Para explorar el mecanismo subyacente de la proliferación de las células tumorales impulsada por OPN, calculamos una puntuación de señalización de MAPK a partir de una firma génica relevante^[45] utilizando los genes de nuestro conjunto de datos, lo que reveló una disminución en la actividad de MAPK en todos los grupos de knockout en relación con WTt-WTm (Fig. 4Q). El análisis de Western blot mostró una disminución significativa en la actividad de la quinasa MAPK, según lo determinado por la fosforilación de MEK y ERK en las líneas celulares con knockout de OPN en comparación con los controles de scramble, lo que es consistente con las vías de señalización de OPN conocidas (Fig. 4R-T)^[46]. Además, OPN promueve la proliferación de células mieloides (Fig. SA-C), pero a través de una vía de señalización independiente de MAPK (Fig. S5A-F). Cabe destacar que se ha informado que la actividad de MAPK activa la producción de PGE2 en las células cancerosas, lo que puede suprimir los monocitos y las células T; sin embargo, en nuestro modelo, el knockout de OPN en las células tumorales MC38met no aumentó la producción de PGE2 (Fig. S5G y H)^[47],^[48]. En conjunto, estos resultados demuestran que la señalización autocrina de OPN en las células tumorales impulsa la proliferación a través de la vía MEK/ERK.

OPN de origen tumoral y del huésped regula la diferenciación de monocitos y la polarización de macrófagos

Una de las diferencias más llamativas en la composición de los tipos de células entre los cuatro grupos experimentales fue un aumento relativo de los monocitos en los huéspedes deficientes en OPN (WTt-KOm y KOt-KOm; Fig. 2E). La comparación de las proporciones de monocitos y macrófagos reveló que los macrófagos similares a M2 dominaban en los tumores WTt-WTm (Fig. 5A), mientras que los tumores KOt-WTm estaban enriquecidos con macrófagos similares a M1. En los huéspedes deficientes en OPN (WTt-KOm y KOt-KOm), los monocitos comprendían la mayor parte de este compartimento mieloide (Fig. 5A-C). El análisis de la expresión diferencial destacó distintos programas transcripcionales en los tres grupos. Los macrófagos similares a M1 expresaron altos niveles de transcritos de presentación de antígenos (H2-Eb1, H2-Ab1, H2-Aa, Cd74 y H2-Dmb1) (Fig. 5B). Los macrófagos similares a M2 expresaron componentes del complemento (C1qa, C1qc, C1qb) junto con Pf4 y Mrc1 (CD206) (Fig. 5B), lo que sugiere una superposición sustancial con los TAM SPP1hi descritos previamente que promueven la metástasis hepática. Los monocitos se caracterizaron por una alta expresión de Plac8, Mx1, Ifit3/b, Cxcl10 y Srgn, lo que indica un estado activo y sensible a los interferones (Fig. 5B)^[47].

La proyección UMAP de estos grupos y el análisis de pseudotiempo, con los monocitos como grupo raíz, revelaron un continuo transcripcional desde los monocitos hasta los macrófagos (Fig. 5C-E). La mayoría de los monocitos se ubicaron en las primeras etapas del pseudotiempo, los macrófagos similares a M2 ocuparon estados intermedios y los macrófagos similares a M1 residieron en el extremo distal, lo que refleja una divergencia transcripcional sustancial (Fig. 5E). En consonancia con esto, Cxcl10, una quimiocina maestra para el reclutamiento de células T y células NK CXCR3+, fue más alta en las primeras etapas del pseudotiempo (Fig. 5F), y los grupos WTt-KOm y KOt-KOm contenían la mayor cantidad de células en esta región (Fig. 5G). Estos datos sugieren que en los huéspedes deficientes en OPN, los monocitos con potencial de reclutamiento inmunitario dominan el compartimento mieloide, lo que se ajusta al contexto más amplio de estudios recientes que muestran poblaciones de monocitos capaces de presentar antígenos tumorales a las células T y facilitar la inmunidad antitumoral^[47].

Para examinar directamente el papel de OPN en la polarización de los macrófagos, eliminamos Spp1 en los macrófagos RAW264.7. Estas células ya diferenciadas modelan el comportamiento de los macrófagos maduros en el microambiente tumoral (TME) en lugar de la dinámica de diferenciación de los monocitos. La citometría de flujo reveló que las células RAW264.7 deficientes en OPN exhibieron una disminución de CD204 (receptor de carroñero de macrófagos 1) en comparación con los controles de scramble (Fig. 5H e I, S5J), lo que es consistente con una reducción del fenotipo similar a M2 y pro-tumoral, y con informes previos^[49],^[50]. Estos resultados destacan que OPN actúa en el TME de forma paracrina y autocrina para mantener la activación alternativa de los macrófagos.

La expansión de los monocitos en los tumores de los huéspedes deficientes en OPN, pero no en los tumores KOt-WTm, sugirió que el OPN del huésped regula la diferenciación de monocitos a macrófagos antes de entrar en el TME. Para probar esto, analizamos las células del exudado peritoneal de ratones WT y KO de OPN sin tumores, donde el reclutamiento de monocitos está en curso (Fig. 5L) ^[51]. La citometría de flujo reveló un aumento de las poblaciones Ly6Chi, F4/80hi y Ly6C-hi, F4/80-lo en los ratones KO de OPN en relación con WT (Fig. 5J y K), lo que indica una diferenciación alterada y, por lo tanto, una acumulación de monocitos en ausencia de OPN del huésped. Estos datos respaldan un modelo en el que el OPN derivado del huésped autoriza la diferenciación de monocitos en macrófagos, mientras que el OPN derivado del tumor en el TME activa alternativamente a los macrófagos hacia un estado similar a M2 y pro-tumoral (Fig. 5L).

OPN suprime las células T en el microambiente tumoral

Las células T se encuentran en el centro de la inmunidad antitumoral. Previamente demostramos que OPN suprime la proliferación y la activación de las células T en los tumores de colon in vivo, centrándonos en los mecanismos mieloides dependientes de IRF8 y el bloqueo mediado por anticuerpos de OPN^[20],^[22],^[52]. Aquí, ampliamos estos hallazgos para analizar los papeles específicos de los compartimentos de OPN en la regulación de la inmunidad de las células T. Los tres grupos de knockout (WTt-KOm, KOt-WTm y KOt-KOm) exhibieron un aumento de la infiltración de células T en comparación con los tumores WTt-WTm (Fig. 6A). Recientemente se informó que la deficiencia de SPP1 en las células mieloides aumentaba la expresión de CXCL9 y CXCL10 a través de la vía cGAS-STING, lo que puede explicar la escasa infiltración de células T en los TME competentes en OPN^[53]. El aumento de las células T en los grupos de knockout se debió al enriquecimiento específico del nicho de las células T. Los nichos antitumorales T6 y T7, identificados previamente en los huéspedes deficientes en OPN y en los tumores KOt-WTm, respectivamente, contenían las mayores proporciones de células T entre todos los nichos (Fig. 6B). La inspección visual de los campos de visión representativos confirmó que T6 estaba enriquecido con células T, monocitos y células dendríticas (DCs), mientras que T7 estaba enriquecido con células T, macrófagos similares a M1 y DCs (Fig. 6C y D). El análisis de colocalización reveló una estrecha asociación espacial entre las células T y las DCs en T7 (Fig. 6E).

Dado que la mayor supresión tumoral se produjo en el grupo KOt-KOm (Fig. 1K), que se enriqueció preferentemente con el nicho T6 en lugar de T7, buscamos determinar si el estado funcional de las células T era diferente entre estos dos nichos. Las células T en el nicho T6 expresaron niveles más altos de genes relacionados con la citotoxicidad (Gzmb, Tnf, Lamp2 y Prf1), mientras que las células T en el nicho T7 exhibieron una expresión elevada de marcadores asociados con el agotamiento (Lag3, Tigit, Pdcd1, Tox) (Fig. 6F). Validamos el aumento de la infiltración de células T en los tumores deficientes en OPN mediante citometría de flujo e inmunohistoquímica. En consonancia con los datos de la transcriptómica, los tres grupos de knockout exhibieron un aumento de la abundancia de células T en relación con los tumores WTt-WTm (Fig. 6G-J).

Dado que la firma de las células T citotóxicas se intensificó en T6, examinamos a continuación si las células tumorales en los huéspedes deficientes en OPN mostraron evidencia de una mayor susceptibilidad a la muerte mediada por el sistema inmunitario. Aunque el panel CosMx no analizó la apoptosis activa, los tumores de los grupos WTt-KOm y KOt-KOm mostraron un aumento de la expresión de los genes relacionados con la apoptosis (Bax, Bcl2, Casp3, Casp8 y Fas), en particular Casp8 (Fig. 6K). Si bien la expresión elevada de estos genes no indica directamente la apoptosis, sugiere estrés celular y un estado preparado para el ataque citotóxico. En consonancia con esta interpretación, el tinte TUNEL reveló un aumento significativo de la apoptosis en los tumores de los huéspedes deficientes en OPN en comparación con los tumores WTt-WTm y KOt-WTm (Fig. 6L).

En apoyo de la muerte mediada por las células T activas, identificamos regiones dentro del nicho T6 con células T Gzmb-hi cerca de las células tumorales que expresan transcritos asociados con la apoptosis, lo que proporciona evidencia espacial de interacciones citotóxicas activas (Fig. 6N). Para probar directamente si OPN suprime la función citotóxica de las células T, realizamos experimentos de cocultivo utilizando CTLs específicas de gp70 2/20 y células tumorales CT26 que expresan gp70^[54],^[55]. Las CTLs fueron más eficaces para matar las células CT26-OPN KO en comparación con los controles de scramble (Fig. 6O, carriles 1-2). El pretratamiento de las CTLs con OPN recombinante redujo significativamente su capacidad para matar las células CT26-Scramble (Fig. 6O, carriles 1 y 3). Es importante destacar que la eliminación de la supresión mediada por OPN mediante el cultivo de las CTLs estimuladas con OPN con las células CT26-OPN KO restauró rápidamente la actividad citotóxica (Fig. 6O, carril 4).

En conjunto, estos datos demuestran que los huéspedes deficientes en OPN están enriquecidos con un nicho tumoral que contiene células T altamente citotóxicas y no agotadas capaces de suprimir eficazmente la progresión tumoral. Si bien la pérdida de OPN derivado del tumor aumenta la infiltración de células T, estas células exhiben un fenotipo más agotado. Por lo tanto, el OPN del huésped y el OPN derivado del tumor cooperan para suprimir la infiltración, la función y la citotoxicidad de las células T en el TME.

La deficiencia de OPN del huésped libera un nicho de respuesta de interferón que impulsa la inmunidad antitumoral

Después de observar que las células T en el nicho T6 mostraban un estado activado, buscamos caracterizar el panorama inmunitario más amplio del nicho T6. El nicho T6 se enriqueció predominantemente en tumores deficientes en OPN del huésped (WTt-KOm y KOt-KOm), mientras que T7 se observó significativamente solo en el grupo KOt-WTm (Fig. 7A). El nicho T6 se caracterizó por una alta abundancia de monocitos y células tumorales con respuesta a los interferones, mientras que T7 se enriqueció con macrófagos similares a M1 (Fig. 7B). El análisis de la expresión diferencial reveló que T6 se enriqueció con genes involucrados en el reclutamiento inmunitario y la señalización del interferón de tipo I (Cxcl10, Plac8, Ifit3b, Ifit1, Oas3) (Fig. 7C). En contraste, T7 se definió por programas de presentación de antígenos (H2-Ab1, Cd74, H2-Aa, H2-Eb1), lo que es consistente con informes previos que vinculan el fenotipo de IFN y la expresión de CD74 con la respuesta a la inmunoterapia en el CRC^[56].

Dado que el TME globalmente deficiente en OPN (KOt-KOm) modela más estrechamente el probable efecto de la inmunoterapia de bloqueo de OPN, investigamos si la deficiencia de OPN del huésped promueve un nicho antitumoral distinto que no se observa en otros lugares. Descubrimos que los monocitos y las células cancerosas con respuesta a los interferones fueron los principales contribuyentes al programa de respuesta a los interferones en T6 (Fig. 7D), lo que sugiere que el reclutamiento de monocitos y la señalización local de los interferones son características clave de este nicho. Los monocitos comprendieron una fracción significativa de T6, lo que es consistente con el reclutamiento activo. El análisis de CellChat de la red de señalización CCL indicó que las células cancerosas con respuesta a los interferones, las células cancerosas con alta tasa de división y los monocitos señalaron colectivamente para reclutar monocitos (Fig. 7E), lo que se corroboró con la alta expresión de Ccl2 y Ccl5 en estos tipos de células (Fig. 7F). El análisis espacial confirmó además la colocalización de monocitos y células tumorales con respuesta a los interferones dentro de T6, lo que verificamos mediante la inspección visual de un campo de visión representativo de T6 (Fig. 7G-I, S&). Volver a colorear el mismo campo de visión para las células inmunitarias adaptativas mostró que las células T entraban en contacto con frecuencia tanto con las DCs como con los monocitos, lo que sugiere que estas poblaciones innatas pueden moldear la actividad de las células T dentro del nicho T6. Para evaluar aún más si los programas transcripcionales reflejaban la organización espacial de las células, realizamos un análisis de módulo génico colocalizado espacialmente (SCGM) utilizando los centroides de las células como ubicaciones de los transcritos. Identificamos 37 módulos génicos con alta colocalización espacial, incluido un módulo de 25 genes que representa un programa de respuesta al interferón de tipo I (Fig. 7K, S8A). En consonancia con nuestros otros análisis, los monocitos y las células tumorales con respuesta a los interferones fueron los principales contribuyentes a este módulo (Fig. 7K), lo que apoya la conclusión de que T6 es un nicho impulsado por monocitos y con respuesta a los interferones.

La inmunoterapia basada en el bloqueo de OPN suprime la metástasis de CRC en el hígado y mejora la infiltración de células T

Guiados por nuestros hallazgos obtenidos a partir de experimentos de eliminación genética, evaluamos el potencial terapéutico de la neutralización de OPN in vivo. Se trató a ratones Balb/c con metástasis hepáticas de CT26 con un anticuerpo monoclonal anti-OPN (100D3). La inmunoterapia basada en el bloqueo de OPN redujo significativamente la carga tumoral en este modelo sinérgico (Fig. 8A). La citometría de flujo y la inmunohistoquímica revelaron un aumento correspondiente en la infiltración de células T después del tratamiento (Fig. 8B-E). Para determinar si estos efectos se traducían en CRCLM humano, empleamos un modelo de xenoinjerto derivado de metástasis hepáticas de un paciente con cáncer de colon humano en ratones humanizados. Primero confirmamos que nuestro clon 100D3 se une a la proteína OPN humana in vitro (Fig. 8F) e intracelularmente en células mieloides (Fig. 8G). Se trató a ratones con tumores PDX subcutáneos con anti-OPN o IgG cada tres días durante 15 ciclos (Fig. 8H). Los tumores del grupo de tratamiento fueron significativamente más pequeños, incluido un caso de remisión completa (Fig. 8I). El análisis por citometría de flujo e inmunohistoquímica demostró nuevamente una mayor infiltración de células T en el grupo de tratamiento (Fig. 8J-L). En conjunto, estos resultados indican que el bloqueo terapéutico de OPN suprime el crecimiento tumoral y promueve la infiltración de células T tanto en modelos sinérgicos como humanizados de CRCLM, lo que es consistente con nuestros estudios genéticos.

Discusión

En este estudio, demostramos que la osteopontina (OPN) promueve la metástasis hepática del cáncer colorrectal a través de mecanismos específicos de cada compartimento. En nuestros modelos, la OPN derivada del tumor impulsa la proliferación tumoral a través de la vía MEK/ERK. La OPN del huésped facilita la diferenciación de monocitos en macrófagos, mientras que la OPN en el microambiente tumoral (TME) promueve la polarización hacia un fenotipo similar a M2 y pro-tumoral. Tanto la OPN derivada del tumor como la del huésped contribuyen a la supresión de las células T en el TME. En huéspedes deficientes en OPN, las células T eran más citotóxicas y menos exhaustas que en tumores deficientes en OPN, lo que contribuye a un nicho impulsado por un programa de respuesta IFN que promueve la inmunidad antitumoral.

Nuestros hallazgos unifican varias observaciones de estudios anteriores al tiempo que añaden un análisis crítico a nivel de célula única y resolución espacial. El trabajo previo que implicaba a SPP1 en el CRC a menudo se basaba en análisis de expresión masiva, que no puede resolver los roles específicos de cada compartimento. A nivel de célula única, un estudio reciente mostró que el bloqueo de SPP1 redujo los macrófagos F4/80+ en los tumores, un fenómeno que también observamos, pero también encontramos que esta reducción se acompaña de un aumento de los monocitos, lo que destaca un cambio previamente poco apreciado en el compartimento mieloide ^[42].

Los estudios en melanoma han demostrado que los monocitos inflamatorios dominan los tumores sensibles al tratamiento, mientras que los macrófagos predominan en los tumores resistentes ^[47]. Dado que estos monocitos inflamatorios están enriquecidos con genes del programa de respuesta IFN, los monocitos observados en el nicho T6 en nuestros huéspedes deficientes en OPN pueden desempeñar una función antitumoral análoga, lo que sugiere que la focalización de SPP1 puede revertir la desviación de los macrófagos que contribuye a la resistencia al tratamiento. El panel limitado de 1000 genes utilizado en CosMx SMI impide el mapeo directo de las firmas de monocitos inflamatorios descritas anteriormente, pero nuestros hallazgos son consistentes con su función. En cuanto a la diferenciación de monocitos en macrófagos facilitada por OPN, aún queda por estudiar si esto se debe a la expresión intracelular de OPN en las células mieloides o al resultado de la OPN extracelular que se une a los receptores de la superficie celular.

El trabajo reciente ha identificado un inmunofenotipo de alta expresión de interferón como un predictor de respuesta a la inhibición del punto de control inmunitario (ICI) en el CRC ^[56]. Los pacientes con este inmunofenotipo en la línea de base exhiben una mayor capacidad de respuesta al bloqueo de PD-1. En nuestro estudio, el grupo KOt-KOm, que modela el bloqueo global de OPN, muestra un enriquecimiento para un nicho impulsado por la respuesta IFN (T6), lo que sugiere que el bloqueo de OPN puede desbloquear estados inmunes similares, lo que se ha demostrado en modelos de ratón que mejora la capacidad de respuesta a la ICI ^[42].

Informes anteriores describen la prostaglandina E2 (PGE2) derivada del tumor como un mediador de la supresión de las células T en el melanoma y otros cánceres [47, 48]. Descubrimos que las células MC38met-OPN_KO exhiben una mayor expresión de PGE2 in vitro, lo que indica que los efectos inmunes en nuestro modelo son independientes de la PGE2 y son específicamente atribuibles a la OPN. Investigar la focalización dual de la PGE2 y la OPN para reactivar las células T en el TME sigue siendo un área interesante para futuros estudios.

Nuestros resultados delinean aún más cómo la OPN derivada del tumor y del huésped cooperan para suprimir las células T de una manera dependiente del nicho. Anteriormente identificamos un punto de control inmunitario OPN-CD44 que controla la activación de las células T CD8, y nuestro trabajo actual es consistente con mecanismos adicionales de supresión mediados por macrófagos ^[20]. La literatura muestra que los macrófagos derivados de monocitos SPP1+ o FasL+CD11b+F4/80+ causan el agotamiento o la apoptosis de las células T específicas del antígeno tumoral, lo que conduce a la progresión tumoral [34, 35]. Aquí, mostramos que la focalización de la OPN derivada del huésped altera la diferenciación de monocitos en macrófagos, lo que limita la aparición de estas poblaciones pro-tumorales. Si ocurre la diferenciación en macrófagos, la OPN en el TME promueve la polarización similar a M2. El trabajo reciente identifica la señalización de CSF1 mediada por PI3K/AKT como una vía dominante para esta polarización ^[57]. Aunque CosMx SMI proporciona información espacial crítica, produce una menor profundidad transcriptómica por célula que las tecnologías de secuenciación de ARN de célula única (scRNAseq) actuales. Para comprender cómo la OPN derivada del huésped y del tumor afecta la diferenciación y los estados de agotamiento de las células T en el CRCLM, los estudios futuros pueden considerar el uso de scRNAseq.

La seguridad de los posibles objetivos terapéuticos es un aspecto crítico del desarrollo de fármacos preclínicos y clínicos. Un ensayo clínico ha evaluado los anticuerpos monoclonales que bloquean la OPN en humanos para el tratamiento de la artritis reumatoide (AR) ^[58]. Si bien el bloqueo de OPN no fue eficaz en la AR, el perfil de seguridad favorable observado en el ensayo sugiere que la OPN puede representar un objetivo terapéutico viable en el CRCLM.

En conjunto, nuestro estudio proporciona evidencia mecánica de que la OPN coopera de manera específica de cada compartimento para apoyar la metástasis hepática. Estos resultados respaldan la justificación de la focalización global de OPN como una estrategia terapéutica para reducir la proliferación tumoral y aliviar múltiples capas de supresión inmunitaria impulsada por la OPN del huésped que conduce a la progresión metastásica en el cáncer colorrectal.

Métodos

Líneas celulares tumorales.

La línea celular de tumor de colon de ratón CT26, la línea celular de leucemia de ratón RAW264.7 y las líneas celulares de leucemia humana K562 y U937 se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). MC38-met es una sublínea de tumor de colon de ratón metastásico derivada de la línea celular parental MC38 ^[59]. La sublínea J774M se derivó de la línea celular parental J774A.1 de ATCC ^[60]. ATCC caracterizó estas células por morfología, inmunología, huella digital de ADN y citogenética. Las células eran negativas para el micoplasma en el momento de los experimentos.

Ratones.

Los ratones BALB/c y C57BL/6 se obtuvieron de Charles River NCI Frederick (Frederick, MD). Los ratones NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) se obtuvieron del laboratorio Jackson (Bar Habor ME).

Generación de líneas celulares con eliminación de OPN.

Para generar líneas celulares con eliminación de Spp1, las células HEK293FT se cotransfectaron con psPAX2 (Cat#12260, Addgene, Watertown, MA, USA), pCMV-VSV-G (Cat#8454, Addgene) y los plásmidos que codifican Spp1-sgRNA o scramble mediante Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Las secuencias de sgRNA Spp1 y scramble son 5'-AAGGTGAAAGTGACTGATTC-3' y 5'-CTCGTATCTTTTCCCACGGC-3'. Después de 48-72 horas, se recolectaron las partículas virales para transducir las células CT26, MC38-met, RAW264.7 y J774M. Las células transducidas se cultivaron luego en presencia de puromicina (5 μg/mL) para seleccionar las células transducidas de manera estable. El fenotipo celular se confirmó mediante el análisis del nivel de proteína OPN en el sobrenadante del cultivo celular.

Modelo sinérgico de metástasis hepática de tumor de colon en ratones.

El modelo sinérgico de metástasis hepática de tumor de colon en ratones se estableció de acuerdo con los procedimientos publicados ^[43]. Brevemente, las células MC38-met o CT26 (3x105 células en 50 μl de PBS) se inyectaron quirúrgicamente en el bazo de los ratones, seguido de una esplenectomía. El uso de ratones está aprobado por el IACU de la Universidad de Augusta (protocolo # 2008-0162).

Modelo humanizado de xenoinjerto PDX derivado de metástasis hepáticas de cáncer de colon humano.

El xenoinjerto PDX derivado de metástasis hepáticas de cáncer de colon humano (TM00170) se estableció a partir de una mujer con cáncer de colon y se obtuvo del laboratorio Jackson. Los ratones humanizados NSG se generaron según lo descrito anteriormente ^[61]. Brevemente, se recolectaron PBMCs de donantes femeninos sanos que dieron su consentimiento en el Augusta Shepeard Community Blood Center. Se inyectaron PBMCs (3x106 células/ratón) por vía intravenosa en ratones NSG hembra. Se determinó que este modelo de ratón humanizado PDX no es una investigación con sujetos humanos y fue aprobado para su uso por el IRB de la Universidad de Augusta (Protocolo # 1314554-18).

Preparación de la muestra para el imager espacial molecular CosMx™ (SMI).

Los tejidos hepáticos se fijaron en formaldehído tamponado al 10% y se incluyeron en parafina. El tejido se cortó en secciones de 4 μm en portaobjetos Leica BOND Plus, se incubó a 37 °C durante la noche y se almacenó a 4 °C hasta que estuviera listo para la preparación de CosMx SMI. Para mejorar la adherencia, los portaobjetos se incubaron durante la noche a 60 °C. Después de la incubación, las muestras se prepararon de acuerdo con el protocolo proporcionado por Bruker Spatial. Brevemente, los portaobjetos se desparafinizaron y se prepararon para la recuperación del antígeno. Inmediatamente después de la recuperación del antígeno, las muestras se enjuagaron en agua tratada con DEPC y se lavaron durante 3 minutos en etanol al 100%. Las muestras se sometieron a una digestión suave con proteinasa K. Después del enjuague, las muestras se incubaron con una solución de fiducial al 0,001% y se fijaron con NBF al 10%. Después de la fijación, las muestras se apagaron y luego se bloquearon utilizando 100 mM de NHS-acetato en el tampón NHS-acetato de CosMx.

Las sondas del panel de caracterización celular universal de ratón se desnaturalizaron a 95 °C durante 2 minutos y luego se enfriaron rápidamente sobre hielo. La mezcla de trabajo de la sonda ISH se preparó utilizando 1 nM de sondas ISH en agua tratada con DEPC con el tampón R y el inhibidor de la RNasa proporcionado por Bruker Spatial. Las muestras se incubaron con la mezcla de sondas a 37 °C durante la noche utilizando cubreobjetos y un horno de hibridación durante 16 horas.

Luego, los portaobjetos se lavaron e incubaron con la tinción nuclear DAPI diluida en el tampón de bloqueo. Después de los lavados apropiados, las muestras se incubaron durante 1 hora con anticuerpos de morfología contra CD298/B2M, PanCK y CD45. Después de tres lavados en PBS 1X, se aplicó la celda de flujo de vidrio al portaobjetos y las muestras se cargaron en el instrumento. Una vez completado el escaneo de vista previa, se seleccionaron campos de visión de tamaño fijo que miden 0,5 mm × 0,5 mm para definir las regiones que se van a analizar para la detección de transcritos. Se adquirieron ocho imágenes de pila Z (paso de 0,8 μm) por campo de visión. Los enlaces foto-cleivables en los fluoróforos de las sondas reporteras se liberaron mediante la iluminación UV y se lavaron con el tampón de lavado. Los procedimientos de fluidos e imágenes se repitieron para los 16 grupos de sondas reporteras. Cada ronda de hibridación e imágenes de sondas reporteras se repitió varias veces para aumentar la sensibilidad de la detección de ARN. La morfología celular se analizó en el instrumento antes de la lectura de ARN agregando fluoróforos unidos a las sondas reporteras a la celda de flujo y capturando ocho imágenes de pila Z en los siguientes canales: 488 nm (CD298/B2M), 532 nm (PanCK), 594 nm (CD45), 647 nm y 385 nm (DAPI).

Segmentación de células únicas.

Los datos se transfirieron en tiempo real al software AtoMx SIP. Se realizaron controles de calidad posteriores a la ejecución para garantizar que cada FOV (campo de visión) tuviera una alta tasa de hibridación y una segmentación celular precisa, lo que resultó en una cuantificación fiable de transcritos por célula. La segmentación celular se mejoró aún más utilizando la configuración avanzada de AtoMx SMI, optimizada para reflejar la composición del tejido. La diapositiva 1, con 331 FOV, muestra una media de 277 genes por transcrito por célula, con un total de 740.902 células no vacías. La diapositiva 2, con 213 FOV, muestra una media de 348 genes por transcrito por célula, con un total de 438.449 células no vacías.

Análisis bioinformático de los datos de transcriptómica espacial CosMx:

El objeto Seurat exportado del análisis de AtoMx SIP se utilizó para el análisis posterior. Las células que no superaron el control de calidad en AtoMx, y las células con menos de 50 recuentos, se eliminaron del análisis posterior. Después de la primera fase del análisis, como se describe a continuación, se utilizó el paquete FastReseg para evaluar la calidad de la segmentación. Se eliminó un pequeño número de células (menos del 0,02% del total de células) si el algoritmo FastReseg realizó acciones significativas. La matriz de recuentos actualizada se utilizó entonces para la segunda ronda de análisis. La matriz de recuentos actualizada se normalizó utilizando SCTransform. Se realizó la corrección de lotes utilizando el algoritmo Harmony. La anotación del tipo celular se realizó utilizando el método de mapeo de referencia o transferencia de etiquetas de Seurat. Se generó un conjunto de datos de referencia artificial integrando un conjunto de datos de scRNA-seq de células MC38 implantadas subcutáneamente en ratones sinérgicos (ref) y el conjunto de datos del atlas de células individuales del hígado (ref). Se realizó el análisis de expresión diferencial utilizando la función FindMarker de Seurat. Se calcularon las puntuaciones de la firma del conjunto de genes utilizando la función AddModuleScore de Seurat. Los conjuntos de genes se descargaron de la base de datos MSigDB. El análisis del nicho se realizó en AtoMx y las etiquetas del nicho se incluyeron en la exportación de AtoMx y se utilizaron para generar gráficos. Todos los gráficos de visualización se generaron utilizando las funciones de graficación integradas en Seurat. Para los análisis computacionales, los transcritos de Spp1 se conservaron en las muestras de Spp1 knockout para preservar la integridad del agrupamiento de tipos celulares y evitar la división artificial debido a la ausencia de transcritos de Spp1. Para mayor claridad en las imágenes representativas, los transcritos de Spp1 se eliminaron de las células tumorales KO y/o de las células huésped para resaltar la ausencia de proteína OPN funcional.

Análisis de colocalización celular:

Analizamos cómo se posicionan los diferentes tipos celulares anotados en relación entre sí en los datos de transcriptómica espacial CosMx, utilizando un gráfico de vecindad basado en la distancia construido a partir de las coordenadas del centroide celular (en micrómetros). Para cada muestra (y, si es necesario, para cada campo de visión [FOV]), definimos las células vecinas como aquellas que se encuentran dentro de un radio fijo (por ejemplo, 40 μm). Convertimos estas relaciones en una matriz de adyacencia binaria que indica el contacto espacial. Para un determinado tipo celular "índice" A, contamos las células vecinas del tipo B sumando las conexiones de adyacencia de las células A a las células B. Para probar si esta proximidad es mayor de lo esperado por azar, al tiempo que se preserva la estructura del tejido, creamos una distribución nula barajando las etiquetas de los tipos celulares entre las células no índice, ya sea en toda la muestra o dentro de los FOV para mantener la densidad local y la organización espacial. A partir de esta distribución nula, obtuvimos los recuentos de vecinos esperados, las desviaciones estándar y los puntajes z para cada par de tipos celulares, y los utilizamos para calcular valores p de dos colas con corrección para pruebas múltiples. Para el análisis regional, aplicamos este método a cada FOV, calculando las puntuaciones de enriquecimiento (por ejemplo, el logaritmo de los vecinos observados/esperados). Esto resaltó los "puntos calientes" espaciales en los que interacciones específicas, como las células T y las células dendríticas o los monocitos y la proximidad de las células de respuesta a IFN, están particularmente enriquecidas.

Ensayos ELISA.

Se recogió el sobrenadante del cultivo celular, se aclaró mediante centrifugación y se midió la concentración de proteína OPN utilizando el kit ELISA para OPN de ratón (R and D System, Minneapolis, MN) según las instrucciones del fabricante. Para el ensayo de afinidad de unión de anticuerpos, la proteína OPN recombinante se recubrió en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos a 1 μg/mL durante la noche. Los pocillos se lavaron, se bloquearon y luego se añadió el anticuerpo anti-OPN a los pocillos recubiertos a varias diluciones. Se añadió Peroxidase-AffiniPure goat anti-mouse IgG como anticuerpo secundario para capturar el anticuerpo anti-OPN. Los ensayos se realizaron utilizando el kit ELISA (Biolegend, San Diego, CA, USA) según las instrucciones del fabricante.

Ensayo de proliferación celular.

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se midió la proliferación celular utilizando el kit de ensayo de proliferación celular CellTiter 96A Queous One Solution (Cat# G3582, Promega Corp, Madison, WI).

Generación de anticuerpos monoclonales OPN.

Para generar anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-OPN humano, se inmunizaron cinco ratones BALB/c con 50 μg de proteína OPN humana recombinante (R and D System), seguido de un refuerzo con 25 μg de proteína OPN humana cada 2 semanas, durante 3 veces. Los sueros de ratón se analizaron mediante ELISA indirecto utilizando proteína OPN humana recombinante y una proteína irrelevante marcada con His como antígenos. Basándose en un valor de OD >1,0 mientras que la dilución es >1:8.000, se seleccionó el ratón M6766 para la fusión celular. Las células B del bazo se fusionaron con células de mieloma SP2/0. Los clones de hibridoma parentales se seleccionaron en base al cribado de ELISA y se seleccionaron para el subclonado. Se analizaron veinte clones mediante ELISA para la afinidad de unión y para suprimir la proliferación de las líneas celulares de leucemia humana K562 y U937 in vitro. Los clones 13D11, 16B3, 16G2, 22B3 y 24C-3 se seleccionaron como los productos finales. El clon 100D3 se generó como se describió previamente^[22].

Análisis de Western blotting.

Las células se lisaron en un tampón de lisis de proteínas totales (20 mM de HEPES, pH 7,4, 20 mM de NaCl, 10% de glicerol, 1% de TritonX100, cócteles de inhibidores de proteasas), se centrifugaron para eliminar los residuos y se separaron en un gel de SDS-poliacrilamida desnaturalizante de gradiente del 4 al 20% (Biorad, Hercules, CA, USA), se transfirieron a una membrana PXDF, se bloquearon en un 5% de leche en PBST, se incubaron con anticuerpos primarios (anti-pMek1/2, Cat#562457 y anti-pErk1/2, cat#612359, BD Biosciences) durante la noche a 4 °C, seguido de un segundo anticuerpo y detección utilizando el sistema ECL. La membrana se eliminó y se reprobó con el anticuerpo anti-actina (Sigma-Aldrich, Cat# 9026) como se describió previamente^[62].

Conjuntos de datos de scRNA-seq de cáncer de colon humano.

Los conjuntos de datos de scRNA-seq de metástasis hepáticas de pacientes con cáncer de colon humano publicados se extrajeron de la base de datos GEO (número de acceso # GSE164522)^[63]. Los conjuntos de datos de scRNA-seq de tumores de colon humano se extrajeron de la base de datos GEO (número de acceso # GSE178341)^[64]. Los conjuntos de datos de scRNA-seq de cáncer de colon humano de pacientes tratados con pembrolizumab se extrajeron de la base de datos GEO (número de acceso # GSE236581)^[65]. Los conjuntos de datos se analizaron utilizando Seurat v4.9.9 en R v4.4.3.

Análisis de supervivencia y progresión del cáncer de colon humano.

El conjunto de datos TCGA Pan-Cancer (PANCAN) se accedió a través del programa Xena Browser, y se seleccionaron las columnas para el ID de muestra, la expresión de SPP1, el tipo de cáncer, el tipo de muestra, la supervivencia general (OS), el tiempo de supervivencia general y la etapa AJCC. Se excluyeron las muestras que carecían de los valores necesarios, conservando solo los tumores primarios de COAD y READ. Los datos se analizaron en R v4.4.3 utilizando los paquetes tidyverse, survival y survminer. Las muestras se clasificaron como SPP1-altas o SPP1-bajas (50% de corte) y se compararon utilizando el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. Las subetapas tumorales se combinaron en etapas parentales (I-IV) para el análisis ANOVA de una vía de la expresión de SPP1 en las diferentes etapas.

Inmunohistoquímica.

Los tejidos tumorales se fijaron en formaldehído al 10% y se incluyeron en parafina. Las secciones tumorales se procesaron y se trataron con el reactivo de recuperación de antígenos HIER (Abcam, Cat# ab208572), se lavaron, se bloquearon con suero y se incubaron con el anticuerpo anti-CD8 de ratón (Cat# Ab209775, Abcam) para los tejidos tumorales de ratón y con el anti-CD8 humano (Dako) para los tejidos tumorales humanos. Las secciones tumorales teñidas se contrateñieron con hematoxilina (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI) y luego se incubaron con el kit de detección de polímeros IHC de ratón (número de catálogo ab209101, Abcam) para detectar la proteína diana.

Análisis de citometría de flujo.

Se recogieron los tejidos tumorales de los ratones y se digirieron con una solución de colagenasa [1 mg/ml de colagenasa (Sigma-Aldrich), 0,1 mg/ml de hialuronidasa (Sigma-Aldrich) y DNasa I a 30 U/ml]. El tejido tumoral digerido se pasó a través de un tamiz celular de 100 μm (Corning, Corning, NY), se trató con un tampón de lisis de células rojas y se lavó con PBS al 1% de FBS. Los digestos tumorales de ratón se tiñeron con un colorante fluorescente conjugado con los anticuerpos anti-CD45, CD4, CD8, CD11b, F4-80, Ly6C y Ly6G de ratón (Biolegend, San Diego, CA). Los digestos de xenoinjertos de cáncer de colon humano se tiñeron con un colorante fluorescente conjugado con el anticuerpo anti-CD8 humano (Biolegend). Para la tinción intracelular, las células se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron con el anticuerpo anti-OPN, seguido de la tinción con el anticuerpo anti-IgG-FITC de ratón. Las células teñidas se analizaron en un analizador celular BD LSRFortessa con BD Diva 8.01 (BD Biosciences) o un citómetro de flujo BD FACSCalibur con Cell Quest Pro. Todos los datos de citometría de flujo se analizaron con FlowJo v10.6.0 (BD Biosciences).

Análisis estadístico.

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 10. Se utilizaron ANOVA y la prueba t de Student pareada para determinar la significación estadística. Se considera que un valor de p 1,0 mientras que la dilución es >1:8.000, se seleccionó el ratón M6766 para la fusión celular. Las células B del bazo se fusionaron con células de mieloma SP2/0. Se seleccionaron los clones de hibridoma parentales basándose en el cribado de ELISA y se seleccionaron para la subclonación. Se analizaron veinte clones mediante ELISA para la afinidad de unión y para suprimir la proliferación de las líneas celulares de leucemia humana K562 y U937 in vitro. Los clones 13D11, 16B3, 16G2, 22B3 y 24C-3 se seleccionaron como los productos finales. El clon 100D3 se generó como se describió previamente^[22].

Análisis de Western blotting.

Se lisaron las células en un tampón de lisis de proteína total (20 mM de HEPES, pH 7,4, 20 mM de NaCl, 10% de glicerol, 1% de TritonX100, cócteles de inhibidores de proteasas), se centrifugaron para eliminar los residuos y se separaron en un gel de SDS-poliacrilamida desnaturalizante de gradiente del 4 al 20% (Biorad, Hercules, CA, EE. UU.), se transfirieron a una membrana PXDF, se bloquearon en leche al 5% en PBST y se incubaron con anticuerpos primarios (anti-pMek1/2, Cat#562457 y anti-pErk1/2, cat#612359, BD Biosciences) durante la noche a 4 °C, seguido de un segundo anticuerpo y detección utilizando el sistema ECL. La membrana se eliminó y se volvió a sondear con el anticuerpo anti-actina (Sigma-Aldrich, Cat# 9026) como se describió previamente^[62].

Conjuntos de datos de scRNA-seq de cáncer de colon humano.

Los conjuntos de datos de scRNA-seq de metástasis hepáticas de pacientes con cáncer de colon humano publicados se extrajeron de la base de datos GEO (número de acceso # GSE164522)^[63]. Los conjuntos de datos de scRNA-seq de tumores de colon humano se extrajeron de la base de datos GEO (número de acceso # GSE178341)^[64]. Los conjuntos de datos de scRNA-seq de pacientes con cáncer de colon humano tratados con pembrolizumab se extrajeron de la base de datos GEO (número de acceso # GSE236581)^[65]. Los conjuntos de datos se analizaron utilizando Seurat v4.9.9 en R v4.4.3.

Análisis de supervivencia y progresión del cáncer de colon humano.

El conjunto de datos TCGA Pan-Cancer (PANCAN) se accedió a través del programa Xena Browser y se seleccionaron las columnas para el ID de muestra, la expresión de SPP1, el tipo de cáncer, el tipo de muestra, la supervivencia general (OS), el tiempo de supervivencia general y la etapa AJCC. Se excluyeron las muestras que carecían de los valores necesarios, conservando solo los tumores primarios de COAD y READ. Los datos se analizaron en R v4.4.3 utilizando los paquetes tidyverse, survival y survminer. Las muestras se clasificaron como SPP1-altas o SPP1-bajas (50% de corte) y se compararon utilizando el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. Las subetapas tumorales se combinaron en etapas principales (I-IV) para el análisis de varianza de una vía de la expresión de SPP1 en las etapas.

Inmunohistoquímica.

Los tejidos tumorales se fijaron en formaldehído al 10% y se incluyeron en parafina. Las secciones tumorales se procesaron y se trataron con el reactivo de recuperación de antígenos HIER (Abcam, Cat# ab208572), se lavaron, se bloquearon con suero y se incubaron con el anticuerpo anti-ratón CD8 (Cat# Ab209775, Abcam) para los tejidos tumorales de ratón y con el anti-CD8 humano (Dako) para los tejidos tumorales humanos. Las secciones tumorales teñidas se contrateñieron con hematoxilina (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI) y luego se incubaron con el kit de detección de polímero IHC de ratón (número de catálogo ab209101, Abcam) para detectar la proteína diana.

Análisis de citometría de flujo.

Se recogieron los tejidos tumorales de los ratones y se digirieron con una solución de colagenasa [1 mg/ml de colagenasa (Sigma-Aldrich), 0,1 mg/ml de hialuronidasa (Sigma-Aldrich) y DNasa I a 30 U/ml]. El tejido tumoral digerido se pasó a través de un tamiz celular de 100 μm (Corning, Corning, NY), se trató con un tampón de lisis de células rojas y se lavó con PBS con 1% de FBS. Los digestos tumorales de ratón se tiñeron con un tinte fluorescente conjugado con los anticuerpos anti-ratón CD45, CD4, CD8, CD11b, F4-80, Ly6C, Ly6G (Biolegend, San Diego, CA). Los digestos de xenoinjertos de cáncer de colon humano se tiñeron con un tinte fluorescente conjugado con el anticuerpo anti-humano CD8 (Biolegend). Para la tinción intracelular, se fijaron las células, se permeabilizaron y se tiñeron con el anticuerpo anti-OPN, seguido de la tinción con el anti-IgG de ratón-FITC. Las células teñidas se analizaron en un analizador de células BD LSRFortessa con BD Diva 8.01 (BD Biosciences) o un citómetro de flujo BD FACSCalibur con Cell Quest Pro. Todos los datos de citometría de flujo se analizaron con FlowJo v10.6.0 (BD Biosciences).

Análisis estadístico.

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 10. Se utilizaron ANOVA y la prueba t de Student pareada para determinar la significación estadística. Se considera que un valor de p