El tratamiento con cóctel de anticuerpos específicos del tumor inhibe el crecimiento de tumores colorrectales en ratones.

A pesar de su importancia como el tercer cáncer más común a nivel mundial y su creciente prevalencia entre individuos más jóvenes, las opciones de tratamiento para el cáncer colorrectal (CCR) siguen siendo limitadas, sin opciones curativas para pacientes con enfermedad avanzada [^[1], ^[2]]. Incluso cuando los pacientes con CCR avanzado experimentan respuestas iniciales prometedoras al tratamiento, la recurrencia es común, lo que contribuye al fracaso y la muerte del tratamiento [^[3], ^[4]]. La resistencia terapéutica y la recurrencia tumoral se ven impulsadas en gran medida por la tendencia de las células tumorales a acumular mutaciones y la consecuente heterogeneidad de las poblaciones de células malignas [^[5]], lo que permite que un subconjunto de células persista incluso cuando las terapias reducen significativamente la carga tumoral general. A pesar de una respuesta clínica aparente, finalmente surgen tumores resistentes al tratamiento, lo que hace necesario buscar intervenciones alternativas. Las terapias convencionales tienden a ser en gran medida no específicas (por ejemplo, quimioterapia y radioterapia) o a dirigirse a objetivos específicos (por ejemplo, inhibidores de la tirosina quinasa y anticuerpos monoclonales [AcM]), y ofrecen beneficios solo a un subconjunto de pacientes debido a esta inherente heterogeneidad intra e interpaciente, incluso cuando se utilizan en combinación. Para aumentar el número de pacientes que logren una respuesta terapéutica duradera y prolongar la duración de esta respuesta, se necesitan nuevas terapias que aprovechen esta heterogeneidad tumoral específica como un recurso, en lugar de sufrirla como una limitación.

Los anticuerpos han revolucionado el campo de la oncología en las últimas décadas, con importantes avances terapéuticos derivados de la producción de anticuerpos terapéuticos específicos para antígenos tumorales e inhibidores de puntos de control inmunitario (ICPI) [^[2], ^[6]]. Si bien los esfuerzos para tratar el CCR con ICPI y AcM específicos para factores de crecimiento han mostrado ser prometedores [^[7]], los resultados curativos son escasos y solo un subconjunto de pacientes responde favorablemente [^[2], ^[8]]. Debido a su biogénesis estocástica, los anticuerpos ofrecen un potencial incomparable como un medio para adaptar las soluciones terapéuticas a una enfermedad heterogénea, con estimaciones de hasta un cuatrillón (1015) de miembros en el repertorio de anticuerpos humanos naïve [^[9]]. Una línea de productos terapéuticos que aplique la especificidad y diversidad de los anticuerpos para dirigirse simultáneamente a múltiples proteínas mutadas distintas en poblaciones heterogéneas de células tumorales puede permitir un mejor control del tumor. Dirigirse a múltiples objetivos mutados diferentes aumenta la unión general de los anticuerpos a las células cancerosas sin aumentar la unión a las células normales. Anteriormente, hemos demostrado la viabilidad de producir cócteles de anticuerpos policlonales (AcP) específicos para tumores en cáncer de mama triple negativo, melanoma y otros tumores, junto con la capacidad de estos anticuerpos para controlar el crecimiento tumoral en modelos de ratón [^[10]–^[12]]. A pesar del creciente interés en el tratamiento personalizado del CCR [^[13], ^[14]], aún no se ha publicado un enfoque similar en este tipo de cáncer, lo que destaca una nueva oportunidad para el desarrollo terapéutico con el potencial de prolongar la supervivencia del paciente y mejorar la calidad de vida.

En este estudio, utilizando el modelo murino CT26 de CCR, describimos una línea de productos terapéuticos en la que se identifican proteínas mutadas específicas del tumor (PMT) en la superficie celular utilizando un enfoque bioinformático. Luego, generamos AcP que se dirigen a un subconjunto de estas PMT y demostramos su unión específica al tumor y su capacidad para prolongar la supervivencia de ratones con tumores cuando se administran como un cóctel de anticuerpos oligoclonales. Además, destacamos la prevalencia de las PMT en pacientes con CCR. En conjunto, nuestros resultados enfatizan la promesa del tratamiento con anticuerpos personalizados como un medio para aprovechar la heterogeneidad inherente presente en el CCR para controlar de manera más efectiva esta devastadora enfermedad.

Resultados

Producción de AcP dirigidos a 10 péptidos mutados expresados por las células CT26

Para seleccionar las PMT candidatas como objetivos, comenzamos comparando los datos de secuenciación del exoma completo de la línea celular de tumor de colon CT26 con el genoma de referencia del ratón BALB/c de tipo salvaje. Este modelo de células tumorales se seleccionó porque es un modelo sinérgico, lo que permite la evaluación de la eficacia del tratamiento con AcP en el contexto de un sistema inmunitario huésped intacto. De las 1354 mutaciones no sinónimas identificadas en las regiones traducidas en estas células, 153 (11,2%) se encontraron en proteínas de la membrana plasmática, 76 (5,6%) en proteínas de las uniones celulares y 35 (2,6%) en proteínas de la matriz extracelular. Luego, seleccionamos 10 proteínas mutadas asociadas a la superficie distintas como objetivos para el tratamiento basado en anticuerpos sin tener en cuenta sus funciones. Generamos péptidos cortos de 11 aminoácidos que contienen las mutaciones identificadas para cada una de estas 10 PMT (Tabla 1), y estos péptidos se utilizaron para vacunar conejos con el fin de generar AcP dirigidos a estas PMT. Se prepararon preparaciones de anticuerpos con una pureza > 80%, y los ensayos ELISA confirmaron que todas las 10 preparaciones de AcP se unieron a sus antígenos diana correspondientes con valores de CE50 que oscilaron entre 1,75 × 10-11 y 5,36 × 10-11 M (Fig. 1). Su capacidad para unirse a las células tumorales CT26 se confirmó además mediante la tinción de inmunofluorescencia utilizando secciones de tejido preparadas a partir de ratones BALB/c con tumores CT26 (Fig. 2A), y mediante citometría de flujo, que demostró una unión específica no observada para los anticuerpos de control isotípicos (Fig. 2B). En conjunto, estos datos confirman la localización superficial prevista de las 10 PMT elegidas en las células tumorales CT26 y subrayan la viabilidad de generar una serie de AcP capaces de unirse a proteínas mutadas específicas del tumor.

Los AcP anti-PMT se unen específicamente a los tumores CT26 de forma aditiva

Antes de probar el rendimiento de estos AcP en un contexto terapéutico, primero buscamos confirmar que su unión acumulativa es específica de las células tumorales, dado que cualquier unión de alta afinidad a los tejidos sanos contribuiría al potencial de resultados terapéuticos no deseados. Con ese fin, se generó un cóctel que contenía concentraciones iguales de todas las 10 preparaciones de AcP y se utilizó para la tinción de inmunofluorescencia de una variedad de órganos y tejidos principales de ratones BALB/c. Solo se observó una unión débil en cualquiera de estos tejidos sanos, en marcado contraste con la fuerte unión a las secciones de tumores CT26 (Fig. 3). Sorprendentemente, estos anticuerpos exhibieron una unión aditiva a los tumores CT26 de modo que la intensidad de la señal de inmunofluorescencia cuando se sondearon con un anticuerpo secundario aumentó con la adición secuencial de cada anticuerpo anti-PMT adicional al cóctel utilizado para sondear estas secciones (Fig. 4). También se observaron dinámicas de unión aditiva similares mediante citometría de flujo cuando se utilizaron para sondear células CT26 cultivadas (Fig. 5, Fig. S1). Estos resultados son consistentes con el hecho de que estos AcP se dirigen a 10 antígenos tumorales diferentes, lo que podría permitir que los 10 se unan a células tumorales específicas o a poblaciones heterogéneas de células que expresan solo un subconjunto de estos antígenos.

Los AcP anti-PMT suprimen el crecimiento tumoral de CT26 y prolongan la supervivencia

Para probar la utilidad terapéutica de un cóctel de anticuerpos oligoclonales que consiste en estos 10 AcP, se establecieron ratones BALB/c con tumores CT26. A partir de 3 días después de la implantación, se administraron diariamente inyecciones subcutáneas del cóctel de 10 AcP (o control de IgG) solos o en combinación con anti-PD-1 (inyectado por vía intraperitoneal cada dos días), lo que se aplicó para potenciar la inmunidad antitumoral. El tratamiento con ICPI anti-PD-1 se incluyó en este diseño experimental a la luz de las sólidas pruebas que respaldan la capacidad del tratamiento combinado con ICPI para contribuir a mejores resultados de inmunoterapia [^[15]–^[17]]. Si bien la inhibición de PD-1 (iPD1) sola no tuvo ningún impacto en el crecimiento tumoral, el cóctel de 10 AcP ralentizó significativamente el crecimiento de los tumores diana, y la combinación del tratamiento con 10 AcP + iPD1 condujo a la cesación casi total del crecimiento tumoral durante el período de tratamiento (Fig. 6A, Tabla S1), sin ningún cambio en el peso corporal (Fig. S2). Incluso después de que se había interrumpido el tratamiento, este régimen combinado se asoció con beneficios profundos, prolongando la mediana de supervivencia de los ratones tratados a 86 días en comparación con 15,5 a 19 días en los grupos de control sin el cóctel de 10 Ac. (Fig. 6B, Tabla S2). Por lo tanto, la aplicación de este cóctel de anticuerpos anti-PMT junto con el bloqueo de los puntos de control inmunitario promete ser una nueva modalidad terapéutica para prolongar la supervivencia de las personas con cáncer de colon.

El cáncer de colon humano es un objetivo factible para la generación de anticuerpos anti-PMT terapéuticos

Dada la prometedora eficacia del tratamiento con anticuerpos dirigidos a PMT en ratones con tumores de colon y la urgente necesidad insatisfecha en el tratamiento del cáncer de colon avanzado en humanos, buscamos determinar el potencial de aplicabilidad de esta estrategia terapéutica a pacientes con cáncer de colon. Con ese fin, aprovechamos The Cancer Genome Atlas, analizando los datos genómicos disponibles de 100 pacientes con cáncer de colon incluidos en este conjunto de datos. Las comparaciones de los datos de secuenciación del genoma completo disponibles de los tumores de estos pacientes y los tejidos normales correspondientes revelaron una mediana de 76,5 (Rango intercuartílico: 5958, Mín: 12; Máx: 5970) mutaciones sinónimas por paciente y una mediana de 24,75 (Rango intercuartílico: 1712, Mín: 2,5; Máx: 1714) PMT por paciente (Fig. 7A, B). Según estos resultados, el 96% de los pacientes con cáncer de colon tienen al menos 10 PMT, lo que destaca el potencial de viabilidad de desarrollar cócteles de anticuerpos oligoclonales dirigidos a al menos 10 PMT por paciente. Sorprendentemente, a pesar del gran número de mutaciones sinónimas totales identificadas en esta cohorte de pacientes, muy pocas de estas mutaciones se compartieron entre los pacientes. De hecho, solo 12 PMT (0,088%; 12/13488 mutaciones únicas totales) fueron compartidas por 3 o más pacientes, y ninguna fue compartida por más de 8 de estos 100 pacientes (Fig. 7C).

Antes de evaluar el rendimiento de estos pAbs en un contexto terapéutico, primero buscamos confirmar que su unión acumulativa es específica de las células tumorales, dado que cualquier unión de alta afinidad a tejidos sanos contribuiría al potencial de resultados terapéuticos no deseados. Con este fin, se generó un cóctel que contenía concentraciones iguales de las 10 preparaciones de pAbs y se utilizó para la tinción inmunofluorescente de una variedad de órganos y tejidos principales de ratones BALB/c. Solo se observó una unión débil en cualquiera de estos tejidos sanos, en marcado contraste con la fuerte unión a las secciones tumorales CT26 (Fig. 3). Sorprendentemente, estos anticuerpos exhibieron una unión aditiva a los tumores CT26, de modo que la intensidad de la señal inmunofluorescente al sondear con un anticuerpo secundario aumentó con la adición secuencial de cada anticuerpo anti-MSP adicional al cóctel utilizado para sondear estas secciones (Fig. 4). También se observaron dinámicas de unión aditiva similares mediante citometría de flujo al utilizarse para sondear células CT26 cultivadas (Fig. 5, Fig. S1). Estos resultados son consistentes con el hecho de que estos pAbs se dirigen a 10 antígenos tumorales diferentes, lo que podría permitir que los 10 se unan a células tumorales específicas o a poblaciones heterogéneas de células que expresan solo un subconjunto de estos antígenos.

Los pAbs anti-MSP suprimen el crecimiento tumoral de CT26 y prolongan la supervivencia

Para probar la utilidad terapéutica de un cóctel de anticuerpos oligoclonales que consiste en estos 10 pAbs, se establecieron ratones BALB/c con tumores CT26. A partir de 3 días después de la implantación, se administraron a los animales inyecciones subcutáneas diarias del cóctel de 10 pAbs (o control de IgG) solo o en combinación con anti-PD-1 (inyectado intraperitonealmente cada dos días), lo que se aplicó para potenciar la inmunidad antitumoral. El tratamiento con ICI anti-PD-1 se incluyó en este diseño experimental a la luz de las sólidas pruebas que respaldan la capacidad del tratamiento combinado con ICI para contribuir a mejores resultados inmunoterapéuticos [^[15]–^[17]]. Si bien la inhibición de PD-1 (PD1i) por sí sola no logró afectar el crecimiento tumoral, el cóctel de 10 pAbs redujo significativamente el crecimiento de los tumores diana, y la combinación del tratamiento con 10 pAbs + PD1i condujo a la casi total cesación del crecimiento tumoral durante el período de tratamiento (Fig. 6A, Tabla S1), sin ningún cambio en el peso corporal (Fig. S2). Incluso después de que se había interrumpido el tratamiento, este régimen combinado se asoció con beneficios profundos, prolongando la mediana de supervivencia de los ratones tratados a 86 días en comparación con 15,5 a 19 días en los grupos de control sin el cóctel de 10 anticuerpos (Fig. 6B, Tabla S2). Por lo tanto, la aplicación de este cóctel de anticuerpos anti-MSP junto con el bloqueo de los puntos de control inmunitario promete ser una nueva modalidad terapéutica para prolongar la supervivencia de las personas con cáncer de colon.

El cáncer de colon humano es un objetivo factible para la generación terapéutica de anticuerpos anti-MSP

Dado la prometedora eficacia del tratamiento con anticuerpos dirigidos a MSP en ratones con tumores de colon y la urgente necesidad insatisfecha en el tratamiento del cáncer de colon avanzado en humanos, buscamos determinar la posible aplicabilidad de esta estrategia terapéutica a pacientes con cáncer de colon. Con este fin, aprovechamos The Cancer Genome Atlas, analizando los datos genómicos disponibles de 100 pacientes con cáncer de colon incluidos en este conjunto de datos. Las comparaciones de los datos de secuenciación genómica disponibles de los tumores de estos pacientes y los tejidos normales correspondientes revelaron una mediana de 76,5 (Rango intercuartílico: 5,958, Mín: 12; Máx: 5,970) mutaciones sinónimas por paciente y una mediana de 24,75 (Rango intercuartílico: 1,712, Mín: 2,5; Máx: 1,714) MSP por paciente (Fig. 7A, B). Con base en estos resultados, el 96% de los pacientes con cáncer de colon tienen al menos 10 MSP, lo que destaca la posible viabilidad de desarrollar cócteles de anticuerpos oligoclonales dirigidos a al menos 10 MSP por paciente. Sorprendentemente, a pesar del gran número de mutaciones sinónimas totales identificadas en esta cohorte de pacientes, muy pocas de estas mutaciones se compartieron entre los pacientes. De hecho, solo 12 MSP (0,088%; 12/13.488 mutaciones únicas totales) fueron compartidas por 3 o más pacientes, y ninguna fue compartida por más de 8 de estos 100 pacientes (Fig. 7C).

Discusión

El presente estudio introduce una nueva estrategia inmunoterapéutica personalizada que se dirige a los MSP específicos del tumor en el CRC, demostrando su viabilidad y potencial terapéutico en un modelo murino. Al aprovechar la heterogeneidad inherente de las mutaciones específicas del tumor, nuestro enfoque de cóctel de anticuerpos oligoclonales busca transformar el desafío clínico de larga data que plantea la diversidad mutacional inter e intratumoral en una ventaja terapéutica. Este enfoque, en el que se generan múltiples anticuerpos contra mutaciones expresadas en la superficie específicas del paciente, no solo supera las limitaciones de las terapias convencionales con anticuerpos monoclonales que carecen de especificidad para el paciente, sino que también abre una nueva vía para el tratamiento individualizado del cáncer.

Seleccionamos 10 MSP en el modelo murino de CRC CT26 utilizando la secuenciación del exoma completo y una cadena de herramientas bioinformáticas personalizada. La generación posterior de pAbs contra péptidos cortos que contienen cada una de estas secuencias mutadas resultó en preparaciones de anticuerpos altamente específicos y de alta afinidad. Los 10 pAbs demostraron una unión robusta y específica a las células tumorales CT26 con un reconocimiento mínimo fuera del objetivo de los tejidos sanos del ratón. En particular, su uso combinado en un cóctel oligoclonal produjo un patrón de unión aditiva, tanto en las secciones de tejido tumoral como en los análisis citométricos de flujo de células cultivadas. Esto sugiere que estos anticuerpos reconocen epítopos distintos en las superficies de las subpoblaciones heterogéneas de células tumorales, lo que respalda la hipótesis central de que dirigirse a múltiples MSP con anticuerpos puede proporcionar una cobertura tumoral más amplia que la terapia monoclonal tradicional. Además, estas estrategias de tratamiento basadas en anticuerpos oligoclonales ofrecen un diseño específico del paciente y la capacidad de evitar la naturaleza restringida por el HLA de las respuestas de los pacientes que limitan el uso de vacunas peptídicas [^[13]].

Terapéuticamente, la administración de este cóctel de anticuerpos oligoclonales inhibió significativamente el crecimiento tumoral in vivo y confirió un beneficio marcado en la supervivencia a los animales tratados. Cuando se combinó con el bloqueo del punto de control inmunitario PD-1, el efecto fue aún más pronunciado, lo que resultó en una detención casi completa de la progresión tumoral durante el período de tratamiento y una prolongación de la supervivencia después del tratamiento. Estos datos destacan el potencial sinérgico de combinar anticuerpos dirigidos al tumor con ICI, lo que es consistente con estudios previos que demuestran el valor de combinar terapias dirigidas a antígenos con agentes inmunomoduladores y otros agentes para mejorar la inmunidad antitumoral [^[15]–^[17]].

Uno de los aspectos más interesantes de este estudio es la demostración de que el concepto terapéutico no se limita al modelo murino. Si bien los 10 MSP dirigidos en el modelo CT26 no son relevantes para la enfermedad humana, ya que las mutaciones subyacentes son aleatorias y, por lo tanto, específicas del tumor y de la especie, el análisis bioinformático de los datos de TCGA de 100 pacientes humanos con CRC reveló que la mayoría tienen un número suficiente de MSP específicos del paciente para justificar el diseño individualizado de cócteles de anticuerpos. Si bien el número medio de MSP por paciente fue sustancial, el solapamiento entre pacientes fue mínimo, de modo que solo aproximadamente el 0,1% de los MSP fueron compartidos por más de tres individuos, y ninguno fue compartido por más de ocho. Como tal, si bien los tumores de colon tienden a albergar un gran número de mutaciones en la superficie, estas mutaciones son altamente específicas del paciente, lo que enfatiza la falta de objetivos adecuados para los anticuerpos terapéuticos producidos en masa más tradicionales. Estos hallazgos, por lo tanto, subrayan la promesa y la necesidad de cócteles de anticuerpos dirigidos a MSP personalizados preparados individualmente para cada paciente como un medio para eliminar más eficazmente estos tumores y mejorar los resultados de los pacientes (Fig. 8). Dado que estas mutaciones individuales son extremadamente raras y es poco probable que contribuyan al crecimiento del cáncer, explorar la relación entre los epítopos mutados asociados a MSP individuales y los resultados de supervivencia de los pacientes con CRC no es factible, ni es probable que tenga algún impacto directo en la eficacia de este enfoque de tratamiento con anticuerpos exógenos.

La estrategia terapéutica presentada aquí contrasta con los enfoques convencionales que durante mucho tiempo han buscado "antígenos tumorales universales" como objetivos terapéuticos [^[18]] y que, en última instancia, se han centrado en dirigirse a algunos de los antígenos tumorales más comunes. Si bien las proteínas objetivo importantes identificadas hasta la fecha ofrecen ventajas de fabricación y regulatorias para la producción de anticuerpos, su utilidad clínica se ve inherentemente limitada por la heterogeneidad tumoral [^[5], ^[19]]. En contraste, los anticuerpos específicos de MSP personalizados abordan este desafío directamente al adaptar la terapia al paisaje mutacional único de cada tumor. Este enfoque también se alinea con las tendencias más amplias en la oncología de precisión, incluido el uso de vacunas de neoantígenos tumorales y terapias de células T adoptivas, que se basan en la elaboración de perfiles tumorales específicos del paciente [^[13], ^[14]]. En particular, a diferencia de las estrategias basadas en células T, los anticuerpos se pueden producir rápidamente, escalar según sea necesario y administrar sin las complejidades de la recolección de células, la expansión ex vivo o la reinfusión.

Sin embargo, existen limitaciones y desafíos importantes que deben reconocerse. Primero, aunque el modelo murino CT26 proporciona una evidencia útil como prueba de concepto como un sistema de modelo sinérgico adecuado, se necesitarán más estudios para validar la eficacia y la seguridad del tratamiento con cócteles de anticuerpos oligoclonales personalizados de manera más amplia en el CRC. Nuestro equipo ha implementado con éxito esta estrategia de tratamiento basada en cócteles de pAbs en otros tipos de tumores [^[10]–^[12], ^[20]], lo que sugiere que este enfoque es flexible y que su eficacia no se limita a un tipo de cáncer o línea celular en particular, aunque es importante tener en cuenta que, dado que los MSP son específicos del tipo de tumor, se deben generar nuevos pAbs para cada modelo experimental. En segundo lugar, la generación de anticuerpos de alta afinidad y específicos para el conjunto único de MSP de cada paciente sigue siendo un proceso complejo, particularmente dentro de los estrictos plazos que normalmente se requieren para la toma de decisiones terapéuticas en oncología. Actualmente estamos trabajando para optimizar una cadena de herramientas terapéutica que comprende estrategias de secuenciación, síntesis de péptidos y producción de anticuerpos recombinantes para ayudar a abordar estos desafíos a medida que comenzamos un ensayo clínico de fase 1 que prueba la viabilidad de este enfoque en humanos.

Otra consideración importante es el contexto inmunitario del huésped. Nuestro estudio demuestra un mayor control tumoral cuando el cóctel de pAbs anti-MSP se combina con el bloqueo de PD-1, lo que sugiere que la eficacia del tratamiento con anticuerpos depende al menos parcialmente de las respuestas inmunitarias del huésped. Esto es consistente con un mecanismo de acción mediado por Fc, como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) [^[16], ^[21]]. Se necesitará trabajo futuro para dilucidar los mecanismos inmunitarios específicos a través de los cuales estos anticuerpos dirigidos a MSP ejercen sus efectos antitumorales, incluidas sus interacciones con las células asesinas naturales (NK), los macrófagos y las vías del complemento. La ingeniería de las regiones Fc para mejorar la ADCC o la activación del complemento podría aumentar aún más la eficacia terapéutica [^[16], ^[22]]. Sin embargo, dada la inherente complejidad del microambiente inmunitario tumoral que se encuentra dentro de los tumores sólidos [^[23]], pueden ser esenciales análisis sistemáticos para aclarar las contribuciones de las células inmunitarias específicas a la eficacia de esta estrategia terapéutica y para guiar la selección adecuada de ICI u otras terapias de combinación.

Por último, aunque nos hemos centrado aquí en los MSP, esta estrategia podría extenderse para incluir otras clases de antígenos específicos del tumor, como variantes de empalme, proteínas de fusión o péptidos modificados postraduccionalmente que se expresan de forma exclusiva en las células cancerosas. Ampliar el repertorio antigénico de esta manera podría aumentar aún más la cobertura tumoral y reducir la probabilidad de escape inmunitario, siempre y cuando los objetivos sean accesibles para el direccionamiento basado en anticuerpos. Es importante señalar que los MSP seleccionados para el direccionamiento basado en anticuerpos en este estudio se eligieron para evitar cualquier proteína oncogénica conocida. Si bien estos objetivos serán relevantes en futuros estudios clínicos, los excluimos aquí para minimizar cualquier posible impacto funcional del tratamiento con anticuerpos sobre las proteínas objetivo más allá de su capacidad para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), lo que destaca una vía importante para futuros estudios.

En conclusión, este estudio presenta una sólida prueba de concepto preclínica para una estrategia personalizada basada en un cóctel oligoclonal de anticuerpos que se dirige a los MSP específicos del tumor en el CCRC. Al aprovechar la heterogeneidad que socava las terapias actuales, demostramos que es posible montar un ataque inmunitario potente y específico contra diversas poblaciones de células tumorales. Para explorar la viabilidad clínica y la seguridad de este enfoque, hemos iniciado un ensayo clínico de fase I que incluye a pacientes en estadio IV con CCRC y otros cánceres (NCT06674538). A través de este ensayo y los conocimientos adquiridos en este estudio, esperamos ampliar las nuevas opciones de tratamiento individualizadas para prolongar significativamente la supervivencia y, al mismo tiempo, impulsar un cambio de paradigma mediante la introducción de una alternativa viable a los enfoques de tratamiento convencionales.

Materiales y métodos

Productos químicos y reactivos

La IgG normal de conejo (pH 7,4, purificada con proteína A, sin conservantes, en PBS) se obtuvo de Sino Biological, Inc. (Wayne, PA). El anticuerpo anti-PD-1 de rata (clon RMP1-14, InVivoMAb anti-PD-1 de ratón) y su control isotípico (IgG2a de rata, clon 2A3, control isotípico InVivoMAb IgG2a) se compraron a Bio X Cell (West Lebanon, NH). Estos anticuerpos se suministraron en PBS (pH 7,0) y eran adecuados para tratamientos in vivo en ratones. La IgG anti-conejo conjugada con Alexa FluorTM 568 y la IgG anti-ratón (H + L) conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) se obtuvieron de Life Technologies (Carlsbad, CA). Todos los demás reactivos utilizados eran de grado de biología molecular o de alta pureza.

Cultivo de células tumorales

Las células de carcinoma colorrectal murino CT26 (ATCC CRL-2638) se adquirieron del American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Las células se cultivaron en RPMI-1640 (ACC 30-2001) que contenía un 10 % de suero bovino fetal (ATCC 30-2020) y se mantuvieron hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente el 70 %. Se confirmó que las células estaban libres de contaminación por micoplasma. Las células se desprendieron utilizando tripsina-EDTA (ATCC), se lavaron y se resuspendieron en PBS a las concentraciones deseadas para la inoculación en ratones, siguiendo los protocolos de ATCC.

Selección de péptidos mutados de CT26 y producción de anticuerpos policlonales de conejo (pAbs)

Los datos de secuenciación del exoma completo de las células CT26 [^[24]] se analizaron para identificar mutaciones sin sentido en las proteínas expresadas en la superficie. Se seleccionaron diez MSP en función de la ubicación extracelular de los residuos mutados, según lo determinado utilizando UniProt [^[25]]. No se consideraron los roles funcionales de las proteínas durante la selección. Para cada mutación, se sintetizó un péptido inmunogénico de 11 aminoácidos que contenía el residuo mutado, con una cisteína en el extremo C-terminal para facilitar la conjugación con la hemocianina de caracol de llave (KLH). GenScript (Piscataway, NJ) produjo y purificó por afinidad los anticuerpos policlonales de conejo (pAbs) específicos para estos péptidos. Los anticuerpos se suministraron en PBS sin conservantes. La selección de los anticuerpos que se incluirían en la mezcla de cócteles oligoclonales se basó en su unión a las células CT26 y al tejido tumoral.

Titulación de anticuerpos contra péptidos mutados

Los anticuerpos policlonales de conejo purificados por afinidad se titularon utilizando ensayos ELISA para estimar los valores de CE50, como se describió anteriormente [^[20]]. Las placas MaxiSorpTM de 96 pocillos (Nunc, NY, EE. UU.) se recubrieron con péptidos mutantes individuales en un tampón de carbonato (pH 9,6). Después de bloquear con un 1 % de caseína en TBS (Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.), se añadieron diluciones seriadas de cada pAb. Después de la incubación y el lavado con TBS que contenía un 0,1 % de Tween 20, se aplicó HRP conjugada con anti-IgG de conejo (GenScript). La unión se visualizó utilizando el sustrato TMB (GenScript) y se registró la absorbancia a 450 nm cada 2 minutos durante 10 minutos utilizando un lector de placas Synergy HT (BioTek Instruments). Los valores de CE50 se calcularon utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software, CA, EE. UU.).

Microscopía de inmunofluorescencia

Los estudios de inmunofluorescencia se realizaron como se describió anteriormente [^[11]]. Las células CT26 cultivadas recientemente y los cortes de tejido congelados de tumores CT26 y órganos de ratón normales se fijaron con paraformaldehído. Las muestras se bloquearon con Image-iTTM FX Signal Enhancer (Thermo Fisher Scientific) y luego se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con pAbs específicos de MSP individuales, un cóctel de 10 pAbs o IgG de conejo de control. Se utilizó IgG anti-conejo conjugada con Alexa FluorTM 568 para la detección. Las láminas se montaron con Dako Fluorescent Mounting Medium (Agilent, CA, EE. UU.) y se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia invertido Nikon TE2000-U (Nikon Corp., Kanagawa, Japón) con longitudes de onda de excitación/emisión de 579/603 nm.

Preparación del cóctel de pAbs

Las concentraciones de IgG de los pAbs purificados por afinidad se midieron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Los 10 pAbs demostraron una unión específica al tejido tumoral CT26, sin una unión detectable a los tejidos normales del ratón. Estos pAbs se combinaron en proporciones de masa iguales para generar una concentración final de cóctel de 2 mg/mL en PBS de grado de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP).

Citometría de flujo

Se realizó citometría de flujo para evaluar la unión de los pAbs anti-péptidos mutados a la superficie de las células CT26, siguiendo un método publicado anteriormente [^[26]]. Las células CT26 se incubaron en PBS que contenía un 1 % de BSA con pAbs individuales, el cóctel de 10 anticuerpos o IgG de conejo de control. Después de bloquear con suero de burro, las células se tiñeron utilizando IgG anti-conejo conjugada con PE (BioLegend, San Diego, CA). Se utilizó un tinte de viabilidad Live/Dead (azul) (Thermo Fisher Scientific) para excluir las células muertas. Las células se fijaron con paraformaldehído y se analizaron en un citómetro de flujo BD LSR II utilizando el software BD FACSDivaTM v8. Los datos se procesaron y se clasificaron utilizando FlowJoTM v10.1 (FlowJo LLC, Ashland, OR), con controles isotípicos y controles sin tinción adecuados.

Modelo tumoral animal

Se estableció un modelo de carcinoma colorrectal sinérgico CT26 en ratones BALB/c inmunocompetentes. CT26 es una línea celular de carcinoma colorrectal indiferenciada derivada de ratones BALB/c y se conoce por sus características de crecimiento agresivo. Se compraron ratones BALB/c hembra de 6 a 7 semanas de edad (± 3 días) de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE. UU.). Los ratones se aclimataron durante una semana en el establo de animales antes de la experimentación. Los animales se alojaron en jaulas ventiladas individualmente que suministraban aire filtrado y se mantuvieron en condiciones estándar, incluido un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Se proporcionó comida y agua ad libitum.

Tratamientos animales

Experimento 1: Este experimento tuvo como objetivo identificar el número óptimo de células CT26 necesarias para producir tumores que alcanzaran aproximadamente los 2000 mm3 en un plazo de 15 a 20 días después de la inoculación. Los ratones se asignaron aleatoriamente a tres grupos (n = 6/grupo) y se inyectaron por vía subcutánea en el flanco izquierdo afeitado con 5 × 105, 1 × 106 o 1,5 × 106 células CT26 suspendidas en solución salina tamponada con fosfato (PBS). El crecimiento tumoral se controló midiendo las dimensiones del tumor en intervalos de tiempo designados.

Experimento 2: Este experimento evaluó los efectos de un cóctel de pAbs que se dirige a los MSP de conejo, administrado solo o en combinación con un inhibidor de PD-1 (PD1i), sobre el crecimiento tumoral y la supervivencia de los ratones. Todos los ratones se inocularon por vía subcutánea con 1 × 106 células CT26. Luego, los animales se asignaron aleatoriamente a seis grupos de tratamiento (n = 6/grupo): Grupo 1: control no tratado: no se administró tratamiento; Grupo 2: solo PD1i: inyecciones intraperitoneales (i.p.) de 0,2 mg de PD1i por ratón en los días 3, 5, 7, 9 y 11 posteriores a la inoculación (DPI); Grupo 3: control isotípico de PD1i: inyecciones i.p. de 0,2 mg de anticuerpo de control isotípico en el mismo programa que el Grupo 2; Grupo 4: IgG normal de conejo + PD1i: inyecciones subcutáneas (s.c.) de 0,2 mg de IgG normal de conejo en la base del tumor en los DPI 3-9, más inyecciones i.p. de 0,2 mg de PD1i en los DPI 3, 5, 7, 9 y 11; Grupo 5: solo cóctel de anticuerpos: inyecciones s.c. de 0,2 mg de un cóctel que contiene 10 anticuerpos policlonales de conejo contra péptidos mutados en la base del tumor en los DPI 3-9; y Grupo 6: cóctel de anticuerpos + PD1i: tratamiento combinado con el cóctel de anticuerpos (inyecciones s.c. como en el Grupo 5) y PD1i (inyecciones i.p. como en el Grupo 2).

Análisis de datos animales

Se controlaron los ratones durante todo el estudio para detectar signos de efectos adversos relacionados con el tratamiento. Se registraron los pesos corporales dos veces por semana. Las observaciones adicionales incluyeron la ingesta de alimentos y agua, el comportamiento general y la apariencia para evaluar el bienestar animal.

El crecimiento tumoral se realizó un seguimiento a partir del día 7 después de la inoculación utilizando calibradores electrónicos. El volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula: V = (w2 × l)/2, donde w = ancho del tumor y l = longitud del tumor. El tiempo de supervivencia se determinó en función de la muerte natural o la eutanasia debido a que la carga tumoral alcanzó los 2000 mm3 o signos de angustia (por ejemplo, deshidratación, movilidad deteriorada y caquexia), de acuerdo con las directrices del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC).

Análisis de mutaciones sin sentido en pacientes con CCRC

La información de mutaciones somáticas humanas y las llamadas de variantes se obtuvieron de la colección de acceso abierto del Proyecto del Genoma del Cáncer (TCGA; https://www.cancer.gov/tcga) con datos de tumor y sangre normal coincidentes disponibles. Para identificar la localización subcelular de cada mutación sin sentido, se utilizó el servicio de mapeo UniProtID [^[25], ^[27]]. Primero, se identificó el UniProtID correcto para cada gen para garantizar que se considerara el isoforma correcto. Las entradas sin UniProtID se eliminaron, ya que no se pudieron obtener datos sobre la localización subcelular. Para cada UniProtID, se obtuvieron datos de localización subcelular anotados de Uniprot con el paquete uniprotR (https://cran.r-project.org/web/packages/UniprotR/citation.html). Dada la posición de la variante en el gen, se identificó la localización subcelular exacta de la variante, incluido si la variante se encontraba en el dominio extracelular o ubicada en una proteína secretada. La programación se realizó utilizando R [^[28]], y se generaron informes utilizando RStudio [^[29]].

Análisis estadísticos

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) y Microsoft Excel. Las diferencias en el crecimiento tumoral entre los grupos se evaluaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías, seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Los datos de supervivencia se presentaron como curvas de Kaplan-Meier. Las diferencias entre las curvas de supervivencia se analizaron utilizando la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox), y se informaron los tiempos de supervivencia medianos. Se calcularon los intervalos de confianza (IC) para la supervivencia mediana y las razones de riesgo (Mantel-Haenszel) al nivel de confianza del 95 %. Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo.

Productos químicos y reactivos

La IgG normal de conejo (pH 7,4, purificada con proteína A, sin conservantes, en PBS) se obtuvo de Sino Biological, Inc. (Wayne, PA). El anticuerpo anti-PD-1 de rata (clon RMP1-14, InVivoMAb anti-PD-1 de ratón) y su control isotípico (IgG2a de rata, clon 2A3, control isotípico InVivoMAb IgG2a) se compraron a Bio X Cell (West Lebanon, NH). Estos anticuerpos se suministraron en PBS (pH 7,0) y eran adecuados para tratamientos in vivo en ratones. La IgG anti-conejo conjugada con Alexa FluorTM 568 y la IgG anti-ratón (H + L) conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) se obtuvieron de Life Technologies (Carlsbad, CA). Todos los demás reactivos utilizados eran de grado de biología molecular o de alta pureza.

Cultivo de células tumorales

Las células de carcinoma colorrectal murino CT26 (ATCC CRL-2638) se adquirieron del Banco de Cultivos Celulares Americano (ATCC, Manassas, VA). Las células se cultivaron en RPMI-1640 (ACC 30–2001) que contenía un 10% de suero bovino fetal (ATCC 30–2020) y se mantuvieron hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente el 70%. Se confirmó que las células estaban libres de contaminación por micoplasma. Las células se separaron utilizando tripsina-EDTA (ATCC), se lavaron y se resuspendieron en PBS a las concentraciones deseadas para la inoculación en ratones, siguiendo los protocolos de ATCC.

Selección de péptidos mutados de CT26 y producción de anticuerpos policlonales de conejo (pAbs)

Se analizaron los datos de secuenciación del exoma completo de las células CT26 [^[24]] para identificar mutaciones con cambio de sentido en las proteínas expresadas en la superficie celular. Se seleccionaron diez péptidos mutados (MSPs) basándose en la ubicación extracelular de los residuos mutados, según lo determinado utilizando UniProt [^[25]]. No se consideraron los roles funcionales de las proteínas durante la selección. Para cada mutación, se sintetizó un péptido inmunogénico de 11 aminoácidos que contenía el residuo mutado, con una cisteína en el extremo C-terminal para facilitar la conjugación con la hemocianina de caracol de llave (KLH). GenScript (Piscataway, NJ) produjo y purificó por afinidad anticuerpos policlonales de conejo (pAbs) específicos para estos péptidos. Los anticuerpos se suministraron en PBS sin conservantes. La selección de los anticuerpos que se incluirían en la mezcla de cóctel policlonal se basó en su capacidad de unirse a las células CT26 y al tejido tumoral.

Titulación de anticuerpos contra péptidos mutados

Se titularon los anticuerpos policlonales de conejo purificados por afinidad utilizando ensayos ELISA para estimar los valores de CE50, como se describió anteriormente [^[20]]. Se recubrieron placas de pocillos de 96 pocillos MaxiSorpTM (Nunc, NY, EE. UU.) con péptidos mutantes individuales en tampón de carbonato (pH 9,6). Después de bloquear con un 1% de caseína en TBS (Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.), se añadieron diluciones seriadas dobles de cada pAb. Tras la incubación y el lavado con TBS que contenía un 0,1% de Tween 20, se aplicó IgG anti-conejo conjugada con HRP (GenScript). La unión se visualizó utilizando el sustrato TMB (GenScript) y se registró la absorbancia a 450 nm cada 2 minutos durante 10 minutos utilizando un lector de placas Synergy HT (BioTek Instruments). Los valores de CE50 se calcularon utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software, CA, EE. UU.).

Microscopía de inmunofluorescencia

Se realizaron estudios de inmunofluorescencia como se describió anteriormente [^[11]]. Las células CT26 cultivadas recientemente y las secciones de tejido congelado de tumores CT26 y órganos de ratón normales se fijaron con paraformaldehído. Las muestras se bloquearon con Image-iTTM FX Signal Enhancer (Thermo Fisher Scientific) y luego se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con pAbs específicos para MSP individuales, un cóctel de 10 pAbs o IgG de conejo de control. Se utilizó IgG anti-conejo conjugada con Alexa FluorTM 568 para la detección. Las láminas se montaron con Dako Fluorescent Mounting Medium (Agilent, CA, EE. UU.) y se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia invertido Nikon TE2000-U (Nikon Corp., Kanagawa, Japón) con longitudes de onda de excitación/emisión de 579/603 nm.

Preparación del cóctel de pAbs

Se midieron las concentraciones de IgG de los pAbs purificados por afinidad utilizando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Los 10 pAbs mostraron una unión específica al tejido tumoral CT26, sin una unión detectable a los tejidos normales del ratón. Estos pAbs se combinaron en proporciones de masa iguales para generar una concentración final de cóctel de 2 mg/mL en PBS de grado de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP).

Citometría de flujo

Se realizó citometría de flujo para evaluar la unión de los pAbs anti-péptido mutado a la superficie de las células CT26, siguiendo un método publicado anteriormente [^[26]]. Las células CT26 se incubaron en PBS que contenía un 1% de BSA con pAbs individuales, el cóctel de 10 anticuerpos o IgG de conejo de control. Después de bloquear con suero de burro, las células se tiñeron utilizando IgG anti-conejo conjugada con PE (BioLegend, San Diego, CA). Se utilizó un tinte de viabilidad (azul) Live/Dead (Thermo Fisher Scientific) para excluir las células muertas. Las células se fijaron con paraformaldehído y se analizaron en un citómetro de flujo BD LSR II utilizando el software BD FACSDivaTM v8. Los datos se procesaron y se clasificaron utilizando FlowJoTM v10.1 (FlowJo LLC, Ashland, OR), con controles de isotipo y controles sin teñir adecuados.

Modelo tumoral animal

Se estableció un modelo de carcinoma de colon CT26 sinérgico en ratones BALB/c inmunocompetentes. CT26 es una línea celular de carcinoma de colon indiferenciado derivada de ratones BALB/c y se conoce por sus características de crecimiento agresivo. Se compraron ratones BALB/c hembra de 6 a 7 semanas de edad (± 3 días) de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE. UU.). Los ratones se aclimataron durante una semana en el establo de animales antes de la experimentación. Los animales se alojaron en jaulas con ventilación individual que suministraban aire filtrado y se mantuvieron en condiciones estándar, incluido un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Se proporcionó comida y agua ad libitum.

Tratamientos animales

Experimento 1: Este experimento tuvo como objetivo identificar el número óptimo de células CT26 necesarias para producir tumores que alcanzaran aproximadamente los 2000 mm3 en un plazo de 15 a 20 días después de la inoculación. Los ratones se asignaron aleatoriamente a tres grupos (n = 6/grupo) y se inyectaron subcutáneamente en el flanco izquierdo afeitado con 5 × 105, 1 × 106 o 1,5 × 106 células CT26 suspendidas en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se controló el crecimiento tumoral midiendo las dimensiones del tumor en intervalos de tiempo designados.

Experimento 2: Este experimento evaluó los efectos de un cóctel de pAbs que se dirige a MSP de conejo, administrado solo o en combinación con un inhibidor de PD-1 (PD1i), sobre el crecimiento tumoral de CT26 y la supervivencia del ratón. A todos los ratones se les inyectó subcutáneamente 1 × 106 células CT26. Luego, los animales se asignaron aleatoriamente a seis grupos de tratamiento (n = 6/grupo): Grupo 1: control no tratado: no se administró ningún tratamiento; Grupo 2: solo PD1i: inyecciones intraperitoneales (i.p.) de 0,2 mg de PD1i por ratón en los días 3, 5, 7, 9 y 11 posteriores a la inoculación (DPI); Grupo 3: control de isotipo de PD1i: inyecciones i.p. de 0,2 mg de anticuerpo de control de isotipo con el mismo programa que el Grupo 2; Grupo 4: IgG de conejo normal + PD1i: inyecciones subcutáneas (s.c.) de 0,2 mg de IgG de conejo normal en la base del tumor en los DPI 3-9, más inyecciones i.p. de 0,2 mg de PD1i en los DPI 3, 5, 7, 9 y 11; Grupo 5: solo cóctel de anticuerpos: inyecciones s.c. de 0,2 mg de un cóctel que contiene 10 anticuerpos policlonales de conejo contra péptidos mutados en la base del tumor en los DPI 3-9; y Grupo 6: cóctel de anticuerpos + PD1i: tratamiento combinado con el cóctel de anticuerpos (inyecciones s.c. como en el Grupo 5) y PD1i (inyecciones i.p. como en el Grupo 2).

Análisis de datos animales

Se controlaron los ratones durante todo el estudio para detectar signos de efectos adversos relacionados con el tratamiento. Se registraron los pesos corporales dos veces por semana. Otras observaciones incluyeron la ingesta de alimentos y agua, el comportamiento general y la apariencia para evaluar el bienestar animal.

Se realizó un seguimiento del crecimiento tumoral a partir del DPI 7 utilizando calibradores electrónicos. El volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula: V = (w2 × l)/2, donde w = ancho del tumor y l = longitud del tumor. El tiempo de supervivencia se determinó en función de la muerte natural o la eutanasia debido a que la carga tumoral alcanzó los 2000 mm3 o signos de angustia (por ejemplo, deshidratación, movilidad deteriorada y caquexia), de acuerdo con las directrices del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC).

Análisis de mutaciones con cambio de sentido en pacientes con CRC

La información de mutaciones somáticas de pacientes humanos y las llamadas de variantes se obtuvieron de la colección de acceso abierto del Proyecto del Genoma del Cáncer (TCGA; https://www.cancer.gov/tcga) con datos de tumor y sangre normal coincidentes disponibles. Para identificar la localización subcelular de cada mutación con cambio de sentido, se utilizó el servicio de mapeo UniProtID [^[25], ^[27]]. Primero, se identificó el UniProtID correcto para cada gen para garantizar que se considerara el isoforma correcto. Se eliminaron las entradas sin UniProtID, ya que no se pudieron obtener datos sobre la localización subcelular. Para cada UniProtID, se obtuvo información de localización subcelular anotada de Uniprot con el paquete uniprotR (https://cran.r-project.org/web/packages/UniprotR/citation.html). Dada la posición de la variante en el gen, se identificó la localización subcelular exacta de la variante, incluido si la variante se encontraba en el dominio extracelular o se encontraba en una proteína secretada. La programación se realizó utilizando R [^[28]], y se generaron informes utilizando RStudio [^[29]].

Análisis estadísticos

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) y Microsoft Excel. Las diferencias en el crecimiento tumoral entre los grupos se evaluaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías, seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Los datos de supervivencia se presentaron como curvas de Kaplan-Meier. Las diferencias entre las curvas de supervivencia se analizaron utilizando la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox), y se informaron los tiempos de supervivencia medianos. Se calcularon los intervalos de confianza (IC) para la supervivencia mediana y las razones de riesgo (Mantel-Haenszel) con un nivel de confianza del 95%. Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo.

Información complementaria

A continuación, se muestra el enlace al material complementario electrónico.