Subconjuntos de células inmunitarias del sangre periférica como marcadores bioquímicos no invasivos del estado de la enfermedad colo-rectal, lateralidad, metástasis y supervivencia.

El cáncer colorrectal (CCR) constituye una importante carga de salud a nivel mundial, y se sitúa como la segunda causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo [^[1]]. En 2020, el CCR fue responsable de aproximadamente el 9,4% de todas las muertes por cáncer, lo que equivale a unos 900.000 casos [^[2], ^[3]]. Preocupantemente, se prevé que su incidencia mundial se duplique para 2040, lo que subraya la urgente necesidad de mejorar las estrategias de detección precoz y la identificación de biomarcadores pronósticos robustos [^[4], ^[5]].

A pesar de los avances en los programas de cribado, especialmente en los países de ingresos altos, aproximadamente el 20% de los pacientes con CCR son diagnosticados en estadio IV, y un 25% adicional de aquellos que inicialmente son diagnosticados con enfermedad en estadio temprano, desarrollarán metástasis. El pronóstico sigue estando estrechamente relacionado con el estadio de la enfermedad, con tasas de supervivencia a cinco años que disminuyen del 90% en tumores localizados a solo el 10% en casos metastásicos [^[6]–^[8]].

Cada vez se reconoce más que el CCR no es una enfermedad uniforme, sino más bien un grupo heterogéneo de tumores, cuyo comportamiento biológico y patogénesis difieren notablemente según la ubicación anatómica. Se han descrito diferencias significativas a nivel molecular, histológico y clínico entre los cánceres de colon derecho (proximal) e izquierdo (distal), así como entre los tumores de colon y recto [^[9], ^[10]]. Estas diferencias, arraigadas en las variaciones en el origen embriológico, la anatomía, la función, la carga mutacional y la respuesta al tratamiento, justifican la necesidad de estrategias de manejo clínico distintas [^[11], ^[12]]. Tradicionalmente, la clasificación del CCR se ha basado en características clinicopatológicas como la estadificación TNM y la histología [^[13]]. Sin embargo, estos parámetros a menudo no logran predecir con precisión los resultados del paciente o las respuestas a la terapia. Como tal, los marcadores moleculares, incluyendo la inestabilidad de microsatélites y el estado mutacional de BRAF/KRAS, se utilizan cada vez más para mejorar la precisión pronóstica [^[14], ^[15]].

El papel del sistema inmunitario en el desarrollo y la progresión del cáncer ha recibido cada vez más atención, dado su doble capacidad para suprimir o promover la progresión tumoral, influyendo en procesos que van desde la tumorigénesis hasta la metástasis [^[16]]. En el CCR, la infiltración inmune asociada al tumor dentro del microambiente tumoral (MAT) se ha relacionado fuertemente tanto con la progresión de la enfermedad como con el pronóstico clínico [^[17]–^[19]]. Esto ha estimulado un renovado interés no solo como herramienta pronóstica, sino también como base para la intervención terapéutica [^[20]]. En particular, el sistema inmunitario periférico ha surgido como una valiosa ventana a las alteraciones inmunológicas sistémicas en pacientes con cáncer, lo que permite la detección de subconjuntos inmunitarios innatos y adaptativos desregulados [^[21], ^[22]]. En paralelo, el estudio de los puntos de control inmunitarios (PCI) circulantes está ganando interés como un enfoque prometedor para el diagnóstico precoz, la predicción del pronóstico y la predicción de la respuesta a la inmunoterapia en varios tipos de cáncer, incluido el CCR [^[23], ^[24]]. Sin embargo, la caracterización exhaustiva de los fenotipos inmunitarios circulantes y los patrones de expresión de los PCI en pacientes con CCR sigue siendo limitada.

En el presente estudio, aplicamos dos paneles de citometría espectral de alta dimensión para analizar la frecuencia, el fenotipo y el estado funcional de las células inmunitarias innatas y adaptativas circulantes en muestras de sangre periférica de pacientes con CCR. El primer panel permitió una caracterización en profundidad de las subpoblaciones inmunitarias, mientras que el segundo se centró en la expresión de 21 marcadores, incluidos los PCI y los receptores tipo V similares a la inmunoglobulina (Ig), dentro de las poblaciones inmunitarias predominantes. En conjunto, nuestros hallazgos mejoran la comprensión de la heterogeneidad del CCR y la progresión de la enfermedad, y subrayan el valor de la inmunofenotipificación periférica como una herramienta no invasiva para la estratificación de pacientes y la guía de la toma de decisiones clínicas.

Material y métodos

Muestras clínicas humanas y criterios de elegibilidad

Se obtuvieron muestras de sangre periférica de 16 pacientes diagnosticados con cáncer colorrectal (CCR) antes de la cirugía en el Departamento de Cirugía Colorrectal del Hospital Universitario La Paz (Madrid, España), tras obtener el consentimiento informado por escrito de acuerdo con las directrices éticas institucionales (HULP-PI-1958). Todos los participantes tenían un diagnóstico confirmado de CCR antes de su inclusión y fueron evaluados en la consulta externa antes de su inclusión. Cada caso fue posteriormente revisado por el Comité de Tumores Colorrectales del hospital. Los datos clínicos se utilizaron para estratificar a los pacientes en grupos distintos para el análisis comparativo en función del estadio tumoral (temprano: estadio I; estadio localmente avanzado: estadio II-III), la ubicación anatómica (colon frente a recto), la lateralidad del tumor (derecho frente a izquierdo), la presencia o ausencia de metástasis a distancia en un período de seguimiento de tres años (metastásico frente a no metastásico) y el estado de supervivencia a tres años (supervivientes frente a no supervivientes). Detalles en la Tabla Suplementaria 1.

Muestras clínicas humanas y criterios de elegibilidad

Se obtuvieron muestras de sangre periférica de 16 pacientes diagnosticados con cáncer colorrectal (CCR) antes de la cirugía en el Departamento de Cirugía Colorrectal del Hospital Universitario La Paz (Madrid, España), tras obtener el consentimiento informado por escrito de acuerdo con las directrices éticas institucionales (HULP-PI-1958). Todos los participantes tenían un diagnóstico confirmado de CCR antes de su inclusión y fueron evaluados en la consulta externa antes de su inclusión. Cada caso fue posteriormente revisado por el Comité de Tumores Colorrectales del hospital. Los datos clínicos se utilizaron para estratificar a los pacientes en grupos distintos para el análisis comparativo en función del estadio tumoral (temprano: estadio I; estadio localmente avanzado: estadio II-III), la ubicación anatómica (colon frente a recto), la lateralidad del tumor (derecho frente a izquierdo), la presencia o ausencia de metástasis a distancia en un período de seguimiento de tres años (metastásico frente a no metastásico) y el estado de supervivencia a tres años (supervivientes frente a no supervivientes). Detalles en la Tabla Suplementaria 1.

Procesamiento de muestras y citometría de flujo de espectro completo

Las muestras de sangre total se recogieron en tubos con anticoagulante EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) (Vacuette®, Greiner Bio One, Kremsmünster, Austria). La lisis de los glóbulos rojos se realizó utilizando el tampón de lisis BD PharmLyse™ (BD Biosciences), obteniendo una suspensión de células leucocitarias, que se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). La viabilidad celular se evaluó utilizando el tinte fijable azul LIVE/DEAD™ (Invitrogen). Posteriormente, las células se incubaron con la solución True-Stain Monocyte Blocker (BioLegend) y luego se dividieron en dos alícuotas para la tinción con dos paneles de anticuerpos distintos. Las células se tiñeron durante 25 minutos a temperatura ambiente (TA) en la oscuridad con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos. Los paneles de tinción, basados en un panel de citometría de flujo espectral estandarizado establecido previamente en nuestro laboratorio [^[25], ^[26]], se diseñaron para caracterizar las poblaciones de células inmunitarias y la expresión de los PCI, respectivamente (detallado en las Tablas Suplementarias 2 y 3). La adquisición de datos se realizó utilizando un citómetro de flujo de espectro completo Aurora (Cytek Biosciences), que se calibró diariamente utilizando cuentas de control de calidad del citómetro SpectroFlo® (Cytek Biosciences).

Análisis de datos, estadística y procesamiento bioinformático

Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando FlowJo v10.6.2 (TreeStar). Utilizando una plantilla de análisis predefinida, generamos descriptores que incluían el porcentaje de células dentro de las compuertas parentales, la proporción de células CD45+ y, para subconjuntos específicos, los porcentajes de las principales poblaciones celulares. Para la visualización UMAP de datos y la agrupación jerárquica, utilizamos el software Graphext (Madrid, España), que aplica la distancia euclidiana para cuantificar la similitud entre los puntos de datos en el espacio multidimensional. Los parámetros se establecieron de la siguiente manera: nneighbours = 30, definiendo el número de vecinos más cercanos considerados para cada punto; ncomponents = 10, especificando el número de dimensiones utilizadas para la incrustación; y min_dist = 0,01, que controla la distancia mínima entre los puntos en la representación de baja dimensión, influyendo así en la compacidad del clúster. Para la visualización de gráficos de radar, utilizamos el software RAWGraphs (Milán, Italia) [^[27]].

Los análisis estadísticos y las representaciones gráficas se realizaron utilizando GraphPad Prism 9 (GraphPad Software Inc.). La distribución normal de las muestras de datos se determinó con la prueba de Shapiro-Wilk. Para las comparaciones entre grupos dentro de cada condición clínica, se aplicaron múltiples pruebas t no pareadas, utilizando la prueba no paramétrica de Mann-Whitney U cuando los datos no siguieron una distribución gaussiana. Esta prueba también se aplicó para evaluar las diferencias individuales en los subconjuntos resaltados por los gráficos de volcanes, donde las poblaciones celulares que muestran significación estadística se delimitan con líneas discontinuas basadas en log10 (p-valor) en el eje Y, mientras que la magnitud del cambio se representa como log2 (cambio de pliegue) en el eje X. Los valores de p se indican con asteriscos, tenga en cuenta que p > 0,05 se consideró que no es significativo (ns).

Se realizaron múltiples pruebas t no pareadas como un enfoque exploratorio para identificar y priorizar las poblaciones de células inmunitarias que exhiben las diferencias más relevantes entre los grupos clínicos. Los valores de p obtenidos de estos análisis se visualizaron en gráficos de volcanes, incluyendo todas las 918 poblaciones de células inmunitarias, facilitando así las variables más significativas para el modelado posterior. No se aplicó ninguna corrección formal para las pruebas múltiples (por ejemplo, FDR o Benjamini-Hochberg), ya que el análisis es por naturaleza una evaluación exploratoria y tiene como objetivo identificar poblaciones candidatas para una evaluación posterior.

Se realizaron análisis de regresión logística binaria utilizando el método de eliminación paso a paso de Wald en IBM SPSS Statistics v0.23 (Armonk, NY). Las variables de resultado se definieron explícitamente como el estado de supervivencia a tres años (no supervivientes = 0, supervivientes = 1), la presencia de metástasis dentro de un período de seguimiento de tres años (no metastásico = 0, metastásico = 1), la ubicación anatómica (colon = 0, recto = 1), la lateralidad del tumor (derecho = 0, izquierdo = 1) y el estadio tumoral (estadio temprano = 0, estadio localmente avanzado = 1). El análisis incluyó las últimas cuatro poblaciones de células inmunitarias con los valores de AUC más altos en el análisis de la curva ROC. Estos números se eligieron para que coincidan con el número máximo de pacientes en el grupo de comparación más pequeño, lo que garantiza la solidez y evita el sobreajuste en los pasos de modelado posteriores. Este método comienza con todos los predictores candidatos y elimina o reintroduce progresivamente las variables en función de su relevancia estadística. Para cada variable que se retiene en el modelo final, se calcula un coeficiente de regresión (B), que indica su contribución a la separación de grupos. Las puntuaciones finales se obtuvieron utilizando la fórmula: Puntuación = ([Parámetro A] x Factor B-A) + ([Parámetro B] x Factor B-B) + ... + ([Parámetro X] x Factor B-X), como se describió anteriormente [^[28], ^[29]]. Estas puntuaciones se utilizaron luego para generar curvas ROC, de las cuales se determinó el área bajo la curva (AUC) y los umbrales óptimos utilizando el índice de Youden. La selección del modelo de regresión óptimo tuvo como objetivo incluir el menor número posible de variables, reteniendo solo aquellas con la mayor significación estadística basada en múltiples pruebas t, análisis de gráficos de volcanes y análisis de curvas ROC.

Dada la limitada cantidad de cohortes (n = 16), todos los análisis de regresión logística se realizaron como evaluaciones exploratorias y generadoras de hipótesis. Para mitigar aún más la posibilidad de sobreajuste y evaluar la estabilidad de los modelos, se aplicó un procedimiento de remuestreo no paramétrico de bootstrap con 10.000 iteraciones de forma coherente en todos los análisis de regresión logística descritos anteriormente. El remuestreo de bootstrap se realizó utilizando el paquete boot en el software R.

Resultados

Características de los pacientes y flujo de trabajo estadístico

Entre el 17 de enero de 2022 y el 14 de marzo de 2022, se reclutaron un total de 16 pacientes con CRC en el Departamento de Cirugía Colorrectal del Hospital Universitario La Paz (Madrid, España). Los pacientes se clasificaron según los principales parámetros clínicos, incluido el estadificación TNM, el sitio anatómico, la lateralidad del tumor, la presencia o ausencia de metástasis en el seguimiento a tres años y el estado de supervivencia. Todas estas características clínicas y demográficas de la cohorte de estudio están disponibles en la Tabla Suplementaria 1.

Tras el procesamiento de las muestras, se aplicó un flujo de trabajo analítico unificado en todos los subgrupos clínicos (Fig. 1). La citometría de flujo espectral permitió la elaboración de perfiles multidimensionales del entorno inmunitario periférico, incluida la composición de las células sanguíneas y la inmunofenotipificación, identificando 918 subconjuntos de células inmunitarias (Fig. 1A). Se realizó una agrupación no supervisada (Fig. 1B) y múltiples pruebas t no pareadas para detectar diferencias intergrupales significativas (Fig. 1C), y los resultados se visualizaron mediante un diagrama de dispersión (volcano plot) para priorizar las poblaciones relevantes. Específicamente, se consideraron significativas las poblaciones inmunitarias si cumplían tanto los umbrales de relevancia estadística como biológica. La significación estadística se definió como –log p (valor p) mayor que 1,30 (equivalente a p < 0,05) en el eje Y, mientras que la relevancia biológica se evaluó en función de log (cambio de pliegue) en el eje X dentro del rango de –6 a 6. Este último umbral se aplicó con el objetivo de excluir diferencias de frecuencia extremas o potencialmente atípicas, garantizando así la retención de subconjuntos inmunitarios que presenten cambios en las frecuencias de expresión biológicamente interpretables (correspondientes a una disminución de 64 veces a un aumento de 64 veces). Los cuatro subconjuntos con la mayor capacidad discriminatoria (es decir, aquellos capaces de discriminar a los pacientes según las variables clínicas), determinados por los valores de AUC de ROC, se seleccionaron para la regresión logística binaria, generando una puntuación inmunitaria (Fig. 1D) cuya capacidad predictiva se evaluó posteriormente mediante el análisis ROC (Fig. 1E). Para confirmar la robustez de esta puntuación, se repitió la agrupación utilizando únicamente la puntuación inmunitaria, lo que reveló una fuerte concordancia con el conjunto de datos completo original (Fig. 1F). Finalmente, se evaluó la significación pronóstica de la puntuación mediante el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier tanto para la supervivencia como para la metástasis (Fig. 1G).

Características de los pacientes y flujo de trabajo estadístico

Entre el 17 de enero de 2022 y el 14 de marzo de 2022, se reclutaron un total de 16 pacientes con CRC en el Departamento de Cirugía Colorrectal del Hospital Universitario La Paz (Madrid, España). Los pacientes se clasificaron según los principales parámetros clínicos, incluido el estadificación TNM, el sitio anatómico, la lateralidad del tumor, la presencia o ausencia de metástasis en el seguimiento a tres años y el estado de supervivencia. Todas estas características clínicas y demográficas de la cohorte de estudio están disponibles en la Tabla Suplementaria 1.

Tras el procesamiento de las muestras, se aplicó un flujo de trabajo analítico unificado en todos los subgrupos clínicos (Fig. 1). La citometría de flujo espectral permitió la elaboración de perfiles multidimensionales del entorno inmunitario periférico, incluida la composición de las células sanguíneas y la inmunofenotipificación, identificando 918 subconjuntos de células inmunitarias (Fig. 1A). Se realizó una agrupación no supervisada (Fig. 1B) y múltiples pruebas t no pareadas para detectar diferencias intergrupales significativas (Fig. 1C), y los resultados se visualizaron mediante un diagrama de dispersión (volcano plot) para priorizar las poblaciones relevantes. Específicamente, se consideraron significativas las poblaciones inmunitarias si cumplían tanto los umbrales de relevancia estadística como biológica. La significación estadística se definió como –log p (valor p) mayor que 1,30 (equivalente a p < 0,05) en el eje Y, mientras que la relevancia biológica se evaluó en función de log (cambio de pliegue) en el eje X dentro del rango de –6 a 6. Este último umbral se aplicó con el objetivo de excluir diferencias de frecuencia extremas o potencialmente atípicas, garantizando así la retención de subconjuntos inmunitarios que presenten cambios en las frecuencias de expresión biológicamente interpretables (correspondientes a una disminución de 64 veces a un aumento de 64 veces). Los cuatro subconjuntos con la mayor capacidad discriminatoria (es decir, aquellos capaces de discriminar a los pacientes según las variables clínicas), determinados por los valores de AUC de ROC, se seleccionaron para la regresión logística binaria, generando una puntuación inmunitaria (Fig. 1D) cuya capacidad predictiva se evaluó posteriormente mediante el análisis ROC (Fig. 1E). Para confirmar la robustez de esta puntuación, se repitió la agrupación utilizando únicamente la puntuación inmunitaria, lo que reveló una fuerte concordancia con el conjunto de datos completo original (Fig. 1F). Finalmente, se evaluó la significación pronóstica de la puntuación mediante el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier tanto para la supervivencia como para la metástasis (Fig. 1G).

Alteraciones asociadas a la etapa en el patrón celular inmunológico circulatorio en el cáncer colorrectal

Para explorar las diferencias en la composición de las células inmunitarias circulantes y la expresión de los IC entre las etapas en pacientes con CRC, se realizó un análisis de citometría de flujo espectral en muestras de sangre periférica de 15 participantes. Según el marco clínico aplicado para la clasificación de la etapa, que distingue entre la etapa temprana (etapa I) y la enfermedad localmente avanzada (etapas II-III), la etapa IV representa una categoría clínica distinta caracterizada por la diseminación metastásica. En consecuencia, el único paciente con CRC en etapa IV se excluyó de este análisis comparativo basado en la etapa para evitar introducir sesgos o una heterogeneidad desproporcionada debido a la ausencia de casos comparables. La agrupación no supervisada del conjunto de datos completo del perfil inmunológico agrupó a los pacientes en dos grupos distintos; sin embargo, esta estratificación no se correlacionó con la etapa clínica y no logró distinguir eficazmente la enfermedad en etapa temprana de la enfermedad localmente avanzada (Fig. 2A).

El análisis posterior de múltiples pruebas t reveló diferencias estadísticamente significativas en varios subconjuntos de células inmunitarias, incluidos los monocitos, las células T Natural Killer (NKT), las células T convencionales y las células Natural Killer (NK) (Tabla Suplementaria 4). Para refinar la selección de las poblaciones más relevantes, se generó un diagrama de dispersión basado en los valores p y los valores de cambio de pliegue, destacando los subconjuntos con significación estadística y diferencias biológicamente significativas (Fig. 2B). De estos, se seleccionaron las cuatro poblaciones inmunitarias con el mayor rendimiento discriminatorio, según el análisis ROC, para una evaluación adicional (Fig. 2C). Estos incluyen CD161-CD38+ (% sobre CD45RA- CCR7+CD4-CD8- células T convencionales), PD-1+CD38- (% sobre CD56lowCD16low células NK), CD134+ (% sobre CD4+ células T convencionales) y CCR6-CD161+ (% sobre CD57-CD8+ células NKT). Se descubrió que las dos primeras poblaciones estaban aumentadas en la enfermedad en etapa temprana, mientras que las dos últimas mostraron frecuencias más altas en la enfermedad localmente avanzada (Fig. 2D).

Para explorar si una firma inmunitaria podría discriminar entre la enfermedad en etapa temprana y la enfermedad localmente avanzada, las cuatro poblaciones seleccionadas se incorporaron a un modelo de regresión logística binaria utilizando la selección paso a paso inversa. Este análisis exploratorio identificó CD161-CD38+ (% sobre CD45RA-CCR7+CD4-CD8- células T convencionales) y CCR6- CD161+(% sobre CD57-CD8+ células NKT) como los discriminadores específicos de la etapa más prometedores. El análisis ROC arrojó un umbral óptimo de ≤4,48, determinado por el índice de Youden, logrando una sensibilidad y especificidad del 100% (Tabla Suplementaria 5). En particular, la aplicación de este umbral separó a los pacientes en etapa temprana de los pacientes en etapa localmente avanzada, con frecuencias más altas observadas en estos últimos (Fig. 2E).

De manera similar, la agrupación no supervisada basada únicamente en la puntuación de la firma inmunitaria pudo estratificar a los pacientes según la etapa clínica, lo que apoya aún más el poder discriminatorio del modelo (Fig. 2F). Además, se evaluaron individualmente los demás subconjuntos inmunitarios identificados a través del diagrama de dispersión (Figura Suplementaria 1). Entre ellos, solo CD57+ CD95- (% sobre CD45RA+CCR7-CD4-CD8- células T convencionales) y CD16+ (% sobre células NKT) mostraron una frecuencia aumentada en los pacientes con enfermedad localmente avanzada, mientras que las tres variables restantes compartieron el aumento de la expresión en los pacientes con enfermedad en etapa temprana.

Reconocemos que el uso de un tamaño de cohorte pequeño puede limitar la potencia estadística y aumentar el riesgo de sobreajuste, particularmente en modelos complejos como los aplicados en este estudio. Para mitigar este problema, empleamos un remuestreo bootstrap con 10.000 iteraciones para evaluar la estabilidad de nuestro modelo de regresión logística binaria, lo que demostró un rendimiento robusto (AUC = 1).

Impacto del sitio anatómico del tumor y la lateralidad del colon en el perfil inmunitario del cáncer colorrectal

Dado el bien establecido grado de heterogeneidad clínica entre los subtipos anatómicos del CRC, particularmente entre los cánceres de colon y recto, así como entre los cánceres de colon derecho e izquierdo, buscamos determinar si estas diferencias se reflejan en la composición de las células inmunitarias circulantes y la expresión de los IC. Con este fin, los pacientes con CRC se estratificaron por sitio tumoral (colon, n = 12; recto, n = 4) y, entre aquellos con cáncer de colon, se subdividieron aún más por lateralidad tumoral (derecho, n = 8; izquierdo, n = 4).

Coherente con los hallazgos del análisis basado en la etapa, la agrupación no supervisada del conjunto de datos inmunitario completo reveló un grupo asociado con la lateralidad del tumor y dos grupos asociados con el sitio tumoral; sin embargo, estos no fueron consistentes con los datos clínicos en todos los pacientes (Fig. 3A-B). Las comparaciones grupales utilizando múltiples pruebas t identificaron varios subconjuntos de células inmunitarias representados de manera diferente en las diferentes ubicaciones anatómicas, particularmente entre las células T, las células NKT, las células NK, las células inmunitarias linfoides innatas (ILC), los basófilos, las células dendríticas (DC) y las células B (Tablas Suplementarias 6 y 7). Los subconjuntos candidatos se priorizaron mediante diagramas de dispersión, destacando aquellos con alta significación estadística y un cambio de pliegue marcado (Fig. 3C-D).

Las cuatro poblaciones inmunitarias con el mayor rendimiento discriminatorio entre los cánceres de colon y recto, según el análisis ROC (Fig. 4A), fueron: PD-1? CD38+ (% sobre CD27? CD45RA+ células Treg), PD-1? CD38+ (% sobre CD27? CD45RA? células Treg), CD45RA? CCR7? (% sobre CD8+ células T convencionales) y CD38+ HLA-DR? (% sobre basófilos). Todos se observaron con frecuencias más altas en los pacientes con cáncer de recto (Fig. 4B). Un modelo de regresión logística exploratorio identificó PD-1? CD38+ (% sobre CD27? CD45RA+ células Treg) y CD38+ HLA-DR? (% sobre basófilos) como los marcadores más informativos para discriminar el sitio tumoral. Este modelo alcanzó una AUC de 1,000 (umbral = 121,1) (Tabla Suplementaria 5), lo que sugiere una gran capacidad para distinguir entre pacientes que sufren tumores de colon y tumores de recto (Fig. 4C). De manera consistente, la agrupación no supervisada basada en la puntuación inmunitaria derivada pareció estratificar a los pacientes según el sitio anatómico (Fig. 4D). También se evaluaron individualmente otros subconjuntos inmunitarios de alta especificidad (Figura Suplementaria 2).

Un análisis más exhaustivo dentro del subgrupo de cáncer de colon examinó las diferencias en los perfiles inmunitarios entre tumores de la zona derecha e izquierda del colon. El análisis ROC identificó los subconjuntos más discriminativos de la siguiente manera (Fig. 5A): CD27+ CD28+ (% sobre CD45RA? CCR7? CD4+ CD8+ células T), PD-1? CD38+ (% sobre CD27? CD45RA? células Treg), CD57? CD95+ (% sobre CD45RA+ CCR7+ CD4+ CD8+ células T) y CD27? CD28? (% sobre CD45RA? CCR7? CD4+ CD8+ células T). Los dos primeros se encontraron en mayor proporción en los tumores de la zona derecha, mientras que los dos últimos fueron más prevalentes en los tumores de la zona izquierda (Fig. 5B). Un modelo de regresión logística identificó los subconjuntos CD27+ CD28+ (% sobre CD45RA? CCR7? CD4+ CD8+ células T) y CD57? CD95+ (% sobre CD45RA+ CCR7+ CD4+ CD8+ células T) como los discriminadores más informativos. El análisis ROC determinó un umbral de 4,612, obteniendo también un AUC de 1,000 con una sensibilidad y especificidad del 100% (Tabla Suplementaria 5), lo que sugiere una gran capacidad para distinguir entre los grupos (Fig. 5C). La agrupación basada en la puntuación inmune agrupó con éxito a los pacientes según la localización del tumor (Fig. 5D). El comportamiento de los subconjuntos inmunitarios adicionales con alta especificidad también se evaluó individualmente (Figura Suplementaria 3).

Coherente con nuestro enfoque anterior, se utilizó un remuestreo bootstrap para evaluar la fiabilidad del modelo tanto en el sitio anatómico del tumor como en la lateralidad del colon, mostrando un rendimiento fiable (AUC = 1).

Diferencias en el perfil inmunitario según el estado metastásico en pacientes con cáncer colorrectal

Para explorar la asociación entre los perfiles inmunitarios y el desarrollo de metástasis tres años después de la cirugía, realizamos un análisis de agrupación no supervisado (Fig. 6A) excluyendo a los pacientes que ingresaron al estudio con metástasis preexistentes (n = 15). Este enfoque no discriminó entre pacientes con metástasis (n = 4) y pacientes sin metástasis (n = 11). Sin embargo, múltiples pruebas t no pareadas revelaron diferencias estadísticamente significativas en varios subconjuntos de células inmunitarias, incluidos monocitos, células NK, células B y células T, y células NKT, entre los dos grupos de individuos (Tabla Suplementaria 8).

Como se realizó en el análisis anterior, generamos un diagrama de dispersión (Fig. 6B) que identificó cuatro poblaciones inmunitarias con un potencial discriminatorio particularmente alto y valores de AUC robustos: CD152+ (% sobre CD14+ monocitos), CD38-CD24- (% sobre CD27+ células B IgD-), CD57-CD95+ (% sobre CD45RA+ CCR7- células T convencionales CD8+) y células NKT CD3+CD56+ (% sobre células CD45+) (Fig. 6C). La primera población mostró frecuencias más altas en pacientes con metástasis, mientras que las otras tres aumentaron en aquellos que no desarrollaron metástasis (Fig. 6D).

Un modelo de regresión logística que incorporó estos cuatro subconjuntos inmunitarios generó una puntuación inmune compuesta con un AUC de 1, logrando una sensibilidad del 100% y una especificidad del 100% (Tabla Suplementaria 5). El umbral, determinado utilizando el índice de Youden, se estableció en ≤73,32 (Fig. 6E). La agrupación basada en esta puntuación compuesta mejoró la separación entre pacientes con metástasis y pacientes sin metástasis, acercándose casi a una separación completa (Fig. 6F), en contraste con la observada en la Figura 6A. Además, el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier demostró que las puntuaciones inmunitarias más bajas se asociaron significativamente con una menor probabilidad de supervivencia libre de metástasis (Fig. 6G).

Se aplicó el mismo procedimiento de remuestreo bootstrap descrito anteriormente a este modelo para garantizar la robustez, manteniendo una alta fiabilidad del modelo (AUC = 0,993).

Diferencias asociadas a la supervivencia en el perfil celular inmunitario circulante en pacientes con cáncer colorrectal

Para investigar la relación entre la composición inmune y la supervivencia a 3 años en pacientes con CRC, aplicamos la misma estrategia analítica utilizada para los otros subgrupos clínicos. Nuevamente, la agrupación no supervisada inicial (Fig. 7A) no diferenció entre supervivientes (n = 12) y no supervivientes (n = 4).

Múltiples pruebas t no pareadas revelaron diferencias estadísticamente significativas en varias poblaciones inmunitarias, incluidas las células dendríticas, las células NK, las células B, las células T y las células NKT (Tabla Suplementaria 9). Para priorizar las poblaciones de células inmunitarias más relevantes, generamos un diagrama de dispersión (Fig. 7B). Entre las poblaciones significativamente alteradas, los cuatro subconjuntos con la mayor capacidad discriminatoria, según los valores de AUC del análisis ROC (Fig. 7C), se seleccionaron para una evaluación independiente (Fig. 7D). Este análisis identificó frecuencias significativamente más bajas de células CD141+ CD1c+ (% sobre células CD123+ CD11c+ de células dendríticas) y células T convencionales CD4- CD8- (% sobre células CD45+) en el grupo de supervivientes. Por el contrario, también exhibieron frecuencias elevadas de células CD57+ CD95+ (% sobre células CD45RA+ CCR7+ células T convencionales CD4- CD8+) y células CD4- CD62L- (% sobre células ILC).

Estos cuatro subconjuntos de poblaciones se incorporaron a un modelo de regresión logística binaria utilizando una selección paso a paso inversa, para explorar preliminarmente si una firma inmune podría estar relacionada con la supervivencia. El modelo final identificó tres poblaciones inmunitarias como los discriminadores más informativos entre supervivientes y no supervivientes: células CD57+ CD95+ (% sobre células CD45RA+ CCR7+ células T convencionales CD4- CD8+), células CD141+ CD1c+ (% sobre células CD123+ CD11c+ de células dendríticas) y células CD4- CD62L- (% sobre células ILC). Un análisis ROC posterior de la puntuación compuesta derivada de estas poblaciones produjo un umbral de ≤126, determinado utilizando el índice de Youden. Este umbral logró un AUC de 1,000 con una sensibilidad del 100% y una especificidad del 100% (Tabla Suplementaria 5). Cuando se aplicó según el estado de supervivencia, la puntuación exhibió un patrón discriminatorio notable, con valores significativamente más altos observados en los no supervivientes (Fig. 7E). La reaplicación de la agrupación no supervisada utilizando esta puntuación resultó en una separación robusta de las muestras según el estado de supervivencia (Fig. 7F). Coherente con estos hallazgos, el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier reveló que una puntuación inmune compuesta más baja se asocia con una mejor probabilidad de supervivencia (Fig. 7G).

Finalmente, se analizaron de forma independiente y se representaron gráficamente como diagramas de caja los subconjuntos inmunitarios adicionales que se identificaron como significativamente más altos en los no supervivientes (Figura Suplementaria 5) o en los supervivientes (Figura Suplementaria 6) según el diagrama de dispersión.

Para mantener la coherencia en todos los análisis, aplicamos la técnica de remuestreo bootstrap descrita para el primer modelo, lo que indica una alta precisión predictiva (AUC = 0,999).

Visualización integrativa de las poblaciones relevantes y los resultados de supervivencia en las variables clínicas en pacientes con cáncer colorrectal

Para proporcionar una síntesis completa de las alteraciones inmunitarias sistémicas identificadas en este estudio, generamos un resumen visual integrativo (Fig. 8) que abarca los subconjuntos de células inmunitarias más informativos asociados con cinco variables clínicas principales en el CRC: estadio tumoral, sitio anatómico, lateralidad del colon, metástasis y supervivencia a tres años.

La Figura 8A muestra un diagrama de radar que destaca las principales poblaciones inmunitarias con el mayor poder discriminatorio (AUC > 0,9) para cada parámetro clínico. Las poblaciones a las que se asigna una puntuación de 0 para una variable clínica específica se interpretan como que no tienen poder discriminatorio con respecto a esa variable. Una puntuación de 0,5 indica un nivel moderado de relevancia, lo que sugiere una asociación parcial pero notable. Por el contrario, una puntuación de 1 significa que la población puede discriminar eficazmente entre los subgrupos de pacientes definidos por esa variable clínica, lo que refleja un alto grado de especificidad y relevancia en la estratificación de los resultados clínicos. Esta visualización condensada permite una rápida identificación de los fenotipos inmunitarios enriquecidos en contextos clínicos específicos.

Por ejemplo, las diferencias en la abundancia de células CD161- CD38+ (% sobre células CD45RA-CCR7+ CD4- CD8- células T convencionales) y células CCR6–CD161+ (% sobre células CD57- CD8+ células NKT) se asociaron con el estadio de la enfermedad, lo que podría permitir la discriminación entre pacientes en estadio temprano y en estadio localmente avanzado. En cuanto al sitio tumoral, las células CD38+ HLA-DR+ (como proporción de basófilos circulantes) y las células PD-1+ CD38+ (dentro de las células T reguladoras CD27- CD45RA+) parecieron diferenciar entre tumores de colon y tumores rectales. Dentro de los tumores de colon, la diferencia entre la zona derecha y la izquierda se discriminó mejor mediante las células CD27+ CD28+ (entre las células CD45RA- CCR7- CD4+ CD8+ células T) y las células CD57- CD95+ (dentro de las células CD45RA+ CCR7+ CD4+ CD8+ células T). Los pacientes no metastásicos mostraron diferencias significativas en las frecuencias de células CD152+ (% sobre células CD14+ monocitos) y células CD3+ CD56+ células NKT (% sobre células CD45+) en comparación con los pacientes metastásicos. En relación con la supervivencia, las poblaciones más discriminatorias incluyeron las células CD57+ CD95+ (dentro de las células CD45RA+ CCR7+ células T convencionales CD4- CD8+), las células CD4- CD62L- (entre las células ILC) y las células CD141+ CD1c+ (dentro de las células CD123- CD11c+ de células dendríticas).

La Figura 8B proporciona una curva de supervivencia de Kaplan-Meier derivada de las puntuaciones inmunitarias compuestas calculadas en las cohortes de pacientes. La estratificación por estas puntuaciones revela asociaciones consistentes con el tiempo hasta la metástasis y la supervivencia general, lo que respalda la posible relevancia clínica de las poblaciones inmunitarias identificadas. Los pacientes con valores altos de la puntuación de supervivencia, definidos por frecuencias aumentadas de inmunofenotipos terminalmente diferenciados e innatos, muestran una supervivencia significativamente reducida, mientras que los valores altos de la puntuación de metástasis, definidos por respuestas citotóxicas rápidas, se corresponden con un menor riesgo de diseminación metastásica.

En conjunto, la Fig. 8 ofrece una síntesis gráfica de los hallazgos clave del estudio, lo que ilustra que la desregulación inmune en el CRC se extiende más allá del microambiente tumoral hasta el panorama inmunitario sistémico. Aunque estas observaciones requieren una validación adicional, pueden proporcionar una base valiosa para futuros estudios que exploren el potencial de la inmunofenotipificación periférica en la estratificación del riesgo, la toma de decisiones terapéuticas y el monitoreo de la enfermedad en tiempo real en el cáncer colorrectal.

Discusión

El papel del sistema inmunitario en el cáncer colorrectal (CRC) sigue siendo incompletamente comprendido, lo que plantea un gran desafío para la integración eficaz de la inmunoterapia en el manejo clínico. Si bien las poblaciones inmunitarias infiltrantes tumorales se han caracterizado ampliamente, se ha prestado mucha menos atención a las alteraciones inmunitarias en la sangre periférica. Para abordar esta brecha, nuestro estudio proporciona una caracterización exhaustiva de los subconjuntos de células inmunitarias circulantes y su expresión de puntos de control inmunitarios (PCI), explorando su importancia clínica y valor pronóstico.

Nuestro análisis comparativo entre enfermedad temprana y enfermedad localmente avanzada reveló una remodelación inmunológica sistémica en el CRC avanzado, con dos poblaciones inmunitarias significativamente aumentadas en cada grupo de individuos. En el caso de la enfermedad localmente avanzada, se observó una mayor prevalencia de CD134+ en las células T convencionales CD4+. CD134+, también conocido como OX-40, es un receptor coestimulador ubicado principalmente en las células T CD4+ activadas [^[30]]. Se ha demostrado que proporciona una señal de supervivencia y proliferación para, principalmente, los linfocitos CD4+, para que persistan y respondan contra las células tumorales [^[30]]. En concordancia con otros informes publicados, la expresión de OX-40 aumenta en los tumores localmente avanzados, lo que se ha asociado con un mejor pronóstico y eficacia de la inmunoterapia [^[31]]. Además, el enriquecimiento de las células NKT CD8+ CCR6? CD161+ CD57? sugiere una expansión de las células T de tipo innato que responden a la exposición sostenida a antígenos y a la inflamación inducida por el tumor. CD161, también conocido como NKR-P1A, marca los subconjuntos de células T sensibles a las citocinas, incluidas las células NKT, capaces de respuestas efectoras rápidas incluso sin la unión al TCR [^[32], ^[33]]. La ausencia de CCR6 puede indicar un comportamiento migratorio alterado hacia los tejidos epiteliales y mucosos o un fenotipo de retención sistémica en la enfermedad en etapa tardía [^[34]]. Por el contrario, la expansión de las células NK PD-1+CD38-CD56lowCD16low en la etapa temprana sugiere la presencia de un fenotipo agotado o regulador. Esto es consistente con una función citotóxica alterada y un mal pronóstico, como se ha descrito en el CRC y otros tumores sólidos [^[35]–^[38]]. Finalmente, la elevada frecuencia de células T convencionales CD4? CD8? CCR7+ CD45RA? CD161?, que fenotípicamente corresponden a las células T de memoria central (TCM), ya que carecen de la expresión de CD45RA pero expresan CCR7, apunta a una acumulación de células T de doble negatividad que han hecho la transición a un fenotipo de memoria, pero que pueden estar en un estado latente de activación [^[39]]. Se necesitan más investigaciones para establecer si estas células están haciendo la transición de un estado de memoria a otro y para determinar su función específica en el desarrollo del CRC. En conjunto, estos hallazgos resaltan una remodelación compleja de los subconjuntos de células inmunitarias periféricas durante las diferentes etapas de la enfermedad, marcada por características de activación, agotamiento y senescencia.

Un análisis comparativo similar basado en la ubicación del tumor, colon frente a recto, identificó cuatro subconjuntos inmunitarios significativamente aumentados en pacientes con cáncer de recto. En particular, dos subconjuntos de células T reguladoras (CD27? CD45RA+ y CD27? CD45RA-) exhibieron una mayor expresión de PD-1? CD38+. Estas poblaciones corresponden a células de memoria efectoras terminalmente diferenciadas (denominadas TEMRA) y, células T de memoria efectoras (TEM), respectivamente [^[39], ^[40]]. La falta de expresión de PD-1 puede reflejar una activación reciente, mientras que la expresión de CD38 indica una mayor función supresora y potencial de expansión [^[41]–^[43]]. Asimismo, el enriquecimiento de las células T convencionales CD8+ CD45RA? CCR7? (marcadores de las células TEM) [^[44], ^[45]], se ha asociado con un mejor pronóstico en pacientes con CRC, incluido un mejor tiempo de supervivencia libre de progresión y supervivencia global [^[46]]. Por último, también encontramos un aumento de los basófilos CD38+ HLA-DR? en los tumores rectales. CD38 es un marcador robusto de las células inmunitarias innatas, como los basófilos, cuya menor expresión se ha considerado un indicador de células atípicas en neoplasias mieloides y lupus eritematoso sistémico [^[47]–^[49]]. En conjunto, estos hallazgos resaltan que el sitio anatómico del tumor da forma a un perfil de firma inmune sistémica distinto, con los cánceres de recto que exhiben una regulación al alza simultánea de las señales inmunitarias efectoras y reguladoras.

Dentro del subgrupo de cáncer de colon, observamos patrones inmunitarios sistémicos distintos basados en la lateralidad del tumor. Los tumores del lado derecho mostraron frecuencias elevadas de Tregs PD-1? CD38+ (CD27? CD45RA-), un fenotipo asociado con una función altamente supresora y malos resultados, lo que probablemente contribuye a la inhibición de las respuestas antitumorales [^[50]]. Mecánicamente, la expresión de CD38 en/sobre las Tregs se ha relacionado con una mayor producción de adenosina a través de la vía enzimática CD38–CD203a–CD73. Esto conduce a una acumulación local de adenosina, que inhibe la activación y proliferación de las células T y promueve un entorno inmunosupresor [^[51], ^[52]]. Además, la evidencia reciente de estudios de mieloma múltiple ha demostrado que la focalización de CD38 con anticuerpos monoclonales anti-CD38, como daratumumab, agota las células T reguladoras CD38+, restaurando la proliferación y la citotoxicidad de las células T efectoras [^[43]]. Este fenotipo también pareció estar enriquecido en los tumores rectales, lo que refuerza su importancia clínica. Además, los tumores del lado derecho mostraron frecuencias aumentadas de células TEM de doble positividad CD27+ CD28+ (CD45RA? CCR7? CD4+ CD8+), lo que indica una mayor capacidad de procesamiento de antígenos y señalización coestimuladora, lo que es consistente con su mayor tamaño y mayor carga mutacional. Por el contrario, los tumores del lado izquierdo se enriquecieron con células TEM terminalmente diferenciadas o senescentes CD27? CD28? (CD45RA? CCR7? CD4+ CD8+), que muestran una plasticidad reducida y un potencial proliferativo limitado, probablemente como consecuencia de la activación inmunitaria crónica.

Además, los tumores del lado izquierdo exhibieron un aumento de las células T CD4+ CD8+ CD57+ CD95+ CD45RA+ CCR7+, una población descrita como células T de memoria tipo células madre (TSCM) [^[53], ^[54]]. Estas células poseen capacidad de autorrenovación, una larga vida útil y una rápida diferenciación efectora, y se han asociado con un pronóstico favorable del CRC y la detección temprana [^[55], ^[56]]. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que proporciona evidencia del enriquecimiento de TSCM en los tumores del lado izquierdo, lo que sugiere que, si bien los cánceres de colon del lado derecho albergan perfiles de memoria de células T inmunosupresoras y coestimuladoras, los tumores del lado izquierdo conservan células T de tipo multipotente con signos de agotamiento inmunitario. Dada la dicotomía bien establecida en las respuestas al tratamiento, una mayor eficacia de la inmunoterapia en los tumores del lado derecho y mejores resultados de la quimioterapia en la enfermedad del lado izquierdo [^[10], ^[11]], nuestros resultados ofrecen información inmunológica sobre esta divergencia clínica y sugieren un potencial para estrategias inmunomoduladoras específicas del sitio.

Según los pacientes metastásicos, se observa una mayor frecuencia de CD152+ (% sobre los monocitos CD14+). CD152+, también conocido como CTLA-4, se considera el principal regulador negativo de las respuestas de las células T [^[57]]. Un mecanismo plausible implica la capacidad de CTLA-4 en la superficie de los monocitos para unirse competitivamente a CD80/CD86 en las células presentadoras de antígenos (APC) con mayor afinidad que CD28. Esto da como resultado el bloqueo de la señalización coestimuladora, que es necesaria para la activación completa de las células T. Dentro del microambiente tumoral, dicha unión competitiva puede perjudicar la activación inicial de las células T efectoras y favorecer un entorno inmunosupresor, lo que en última instancia facilita la evasión inmunitaria del tumor [^[58]]. Por el contrario, CD38-CD24- (% sobre las células B CD27+ IgD-) y CD57-CD95+ (% sobre las células T convencionales CD45RA+ CCR7- CD8+) y las células NKT CD3+CD56+ (% sobre las células CD45+) se elevaron en los pacientes no metastásicos. Las células NKT CD3+CD56+, también denominadas células tipo NKT, se han identificado como desempeñando un papel fundamental en la inmunidad tumoral, funcionando como un conducto entre las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas [^[59], ^[60]]. Funcionalmente, estas células secretan IFN-γ y TNF-α al activarse, mejorando así la maduración de las células dendríticas y promoviendo la respuesta de las células T CD8+ citotóxicas [^[61]]. Por el contrario, también pueden adquirir características reguladoras, liberando IL-10 o/y TGF-β y contribuyendo a la inmunosupresión local. Dado que su perfil funcional depende del microambiente, su papel en el cáncer colorrectal sigue siendo controvertido, con evidencia que respalda tanto los efectos pro-tumorales como los anti-tumorales [^[62]–^[64]]. El presente estudio apoya la hipótesis de que una mayor presencia de células NKT en el CRC puede ser indicativo de un pronóstico más favorable. En cuanto a la población CD38-CD24- (% sobre las células B CD27+IgD-), no se han identificado ni estudiado específicamente en el cáncer colorrectal. Esta población específica, designada como células B de memoria, se ha relacionado con un estado inflamatorio elevado [^[65]]. En circunstancias específicas, un microambiente tumoral inflamatorio puede provocar respuestas inmunitarias (activando células citotóxicas, como las células asesinas naturales o las células T CD8+), que tienen la capacidad de impedir el proceso de metástasis. En paralelo, las células TEM CD57? CD95+ CD45RA+ CCR7? CD8+ también se elevaron en los pacientes no metastásicos. Estos efectores terminalmente diferenciados están asociados con la inmunosenescencia y las respuestas citotóxicas rápidas tras la exposición al antígeno [^[66]–^[68]]. Su expansión puede reflejar una presión inmunitaria eficaz que previene la diseminación metastásica, lo que las posiciona como posibles biomarcadores de inmunocompetencia en la enfermedad localizada y posibles objetivos para la inmunoterapia.

Nuestro análisis de inmunofenotipado que compara los supervivientes y los no supervivientes de CRC reveló tres poblaciones inmunitarias significativamente asociadas con la mortalidad: células CD57+ CD95+ (dentro de las células T de doble negatividad CD45RA+ CCR7+), células dendríticas mieloides CD141? CD1c+ y ILCs CD4? CD62L?. La primera podría considerarse una célula TSCM terminalmente diferenciada (CD57+), un subconjunto inmunitario con un alto potencial citotóxico pero una capacidad proliferativa limitada. Su acumulación en los supervivientes puede indicar un perfil inmunitario citotóxico sostenido, que podría ser beneficioso para controlar los antígenos o la inflamación persistentes de bajo nivel, incluso en el contexto de una capacidad proliferativa limitada [^[53], ^[54]]. De manera similar, la alta frecuencia de ILCs CD62L? en el grupo de supervivientes puede reflejar un subconjunto de ILC funcionalmente activo, que posiblemente contribuya a la integridad de la mucosa, la reparación epitelial o el control inmunitario residual a través de la producción de IL-22 o IL-17 [^[69], ^[70]]. Por el contrario, la disminución de la frecuencia de las células dendríticas mieloides CD141? CD1c+ en los supervivientes puede indicar una respuesta inmunitaria Th2 reducida, lo que favorece una inmunidad antitumoral eficaz [^[71], ^[72]]. Por el contrario, los supervivientes presentaban un enriquecimiento de células T convencionales de doble negatividad y células dendríticas CD141? CD1c+.

Además de estos hallazgos, es importante contextualizar nuestros resultados dentro del marco más amplio del perfilado inmunitario tisular en el CRC. Las células inmunitarias infiltrantes tumorales, en particular las células CD3+, CD8+ y las células T de memoria, son biomarcadores pronósticos bien establecidos, con densidades más altas que se asocian constantemente con una mejor supervivencia, una reducción de la recurrencia y una mejor respuesta al tratamiento [^[73], ^[74]]. Aunque nuestro estudio se centra en las poblaciones inmunitarias circulantes, el enriquecimiento de los subconjuntos de linfocitos activados, de tipo memoria y modulados por puntos de control en la circulación se asemeja a las características descritas dentro del tejido tumoral, lo que sugiere que las firmas inmunitarias sistémicas pueden reflejar, al menos en parte, la dinámica inmunitaria local. Por el contrario, ciertas poblaciones periféricas identificadas en nuestro estudio, como las células NK agotadas o los subconjuntos de tipo TSCM circulantes, pueden capturar aspectos de la disfunción inmunitaria o la evasión de la immunosurveglancia que están poco representados en las muestras tumorales, lo que subraya la naturaleza complementaria del inmunofenotipado basado en la sangre. En conjunto, estas observaciones respaldan el concepto de que la integración de la información inmunitaria derivada de la periferia y del tejido puede proporcionar una comprensión más completa de la inmunobiología del CRC y mejorar el desarrollo de biomarcadores clínicamente aplicables.

En resumen, nuestro estudio proporciona un panorama inmunofenotípico integrador del CCRC, lo que sugiere que las distintas firmas inmunitarias sistémicas en la sangre periférica pueden estar asociadas con el estadio tumoral, el sitio anatómico, el desarrollo de metástasis y la supervivencia del paciente. La identificación de subconjuntos inmunitarios específicos, incluidos las células NK agotadas, los Tregs activados y las células T efectoras de memoria y similares a células madre, plantea la posibilidad de que estas poblaciones puedan servir como posibles biomarcadores basados en sangre para la estratificación no invasiva de pacientes. En línea con nuestros hallazgos, se han utilizado enfoques computacionales para modelar las interacciones tumor-inmunitarias en el CCRC utilizando marcos de biología de sistemas. En particular, Li et al. propusieron un modelo cuantitativo del ciclo de inmunidad contra el cáncer (QCIC) que incorpora las poblaciones de CD8+CD4+ Th1 y Tregs, y demostraron que el equilibrio entre estos subconjuntos predice la progresión tumoral y la supervivencia general en pacientes con metástasis [^[75]].

Si bien nuestros hallazgos son alentadores, deben interpretarse teniendo en cuenta el tamaño limitado de la cohorte, lo que justifica una mayor validación en cohortes independientes más amplias. Serán necesarios estudios futuros que integren ensayos funcionales y muestreos longitudinales para determinar si estas poblaciones inmunitarias representan biomarcadores y objetivos terapéuticos sólidos. No obstante, este trabajo contribuye al creciente campo de los biomarcadores inmunitarios basados en sangre en el CCRC, lo que respalda la mejora de la estratificación de los pacientes y proporciona información para terapias inmunológicas personalizadas. También proporciona información valiosa para los enfoques computacionales que buscan modelar las interacciones tumor-inmunitarias y refuerza el concepto de que la inmunidad circulatoria refleja la biología tumoral de manera clínicamente significativa.

Material suplementario electrónico

A continuación, se muestra el enlace al material suplementario electrónico.