La señalización de Notch está implicada en la tumorigénesis, y los ARN largos no codificantes (lncRNA) asociados a Notch, como el gen anfitrión de ARN pequeño nucleolar 3 (SNHG3) y el ARN activador no codificante asociado a la leucemia 1 (LUNAR1), se expresan en gran medida en diversos tejidos malignos, incluido el cáncer colorrectal (CCR).
Sin embargo, aún se desconoce la utilidad clínica y pronóstica de estos lncRNA en la sangre de pacientes con CCR. El objetivo de este estudio fue evaluar los patrones de expresión de los lncRNA circulantes asociados a Notch, SNHG3 y LUNAR1, y explorar su relevancia para el seguimiento y la evaluación del riesgo en pacientes con CCR. Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) para cuantificar los niveles de expresión de SNHG3 y LUNAR1 en sueros de 70 pacientes egipcios con CCR y compararlos con un grupo de control de 26 voluntarios aparentemente sanos, emparejados por edad y sexo. La expresión relativa en suero de SNHG3 y LUNAR1 aumentó en los pacientes con CCR en comparación con los controles aparentemente sanos (p < 0,0001).
Los niveles de expresión relativa del lncRNA SNHG3 se correlacionaron positivamente con la etapa avanzada del CCR (III-IV) (p = 0,0175), y se relacionaron en gran medida con características clínico-patológicas más desfavorables de los pacientes con CCR, como una invasión tumoral extensa (p = 0,0046), invasión vascular (p = 0,0015) y metástasis en los ganglios linfáticos (p = 0,0175). De manera similar, el nivel de expresión relativa del lncRNA LUNAR1 se asoció significativamente y de forma positiva con un mayor tamaño tumoral (p = 0,0033) y una invasión tumoral más profunda (p = 0,042). Los dos lncRNA presentaron una mayor utilidad discriminatoria que el CEA o el CA19-9, según la curva ROC, con mayor sensibilidad y especificidad (p < 0,0001). Se observó una correlación positiva significativa entre las expresiones relativas de los lncRNA SNHG3 y LUNAR1 (r = 0,4615, p < 0,0001).
SNHG3 y LUNAR1 podrían ser biomarcadores moleculares no invasivos útiles para el seguimiento del CCR. Dado que se correlacionan con características clínicas más desfavorables de los pacientes con CCR, los lncRNA SNHG3 y LUNAR1 podrían constituir posibles objetivos terapéuticos para el CCR, según los genes o proteínas identificados en estudios in silico, lo que representa un paso hacia la medicina de precisión basada en ncRNA.
Antecedentes. El cáncer colorrectal (CCR) se ha identificado como un importante problema de salud pública, dada su alta incidencia y tasas de mortalidad[1]. En 2020, el CCR fue el tercer cáncer más prevalente después del cáncer de mama y de pulmón, representando el 10% de los nuevos casos y ocupando el segundo lugar en términos de mortalidad, con el 9,4% de las muertes[2]. Desafortunadamente, para el año 2030, se prevé que haya más de 2,2 millones de nuevos casos y 1,1 millones de fallecimientos por CCR a nivel mundial[3].
Problema. A pesar de las mejoras significativas en los enfoques de tratamiento quirúrgico o radiológico intervencionista del CCR, con terapias neoadyuvantes, el pronóstico de los pacientes sigue siendo desfavorable[4],[5]. Las metástasis y la recurrencia tumoral postquirúrgica son frecuentes, especialmente en casos de cáncer más avanzados[6], lo que puede explicar el aumento previsto en el número de casos y fallecimientos, lo que socava los esfuerzos nacionales para lograr la Visión 2030 de Egipto y la implementación de los Objetivos de Desarrollo Sostenible (ODS).
Declaración del problema. Los marcadores pronósticos del CCR que se utilizan convencionalmente para controlar la evolución del tratamiento y señalar la recurrencia del cáncer son el antígeno 19.9 (CA19.9) y/o el antígeno carcinoembrionario (CEA), que no son tan sensibles[7] en relación con la subclasificación o estratificación de los pacientes en función de las características patológicas del CCR para un pronóstico más eficiente y temprano. Por lo tanto, existe una creciente demanda de marcadores biomoleculares sensibles y precisos que se correlacionen mejor con los marcadores pronósticos del CCR y/o el resultado clínico del CCR[8], y que, de tener éxito, podrían sentar las bases para el ODS nº 3 ("Salud y bienestar") y reducir la recurrencia del cáncer y, por lo tanto, la mortalidad.
Las biopsias líquidas se utilizan para el diagnóstico o el pronóstico del cáncer, como el cáncer de mama, la leucemia, el cáncer de hígado, el cáncer de vejiga o el CCR, y otras enfermedades, mediante la medición de marcadores biomoleculares derivados del tumor, incluidos los ncRNA circulantes, incluidos los lncRNA, los microRNA, los ncRNA exosómicos, los oncogenes o los genes supresores de tumores y sus mutaciones, las citoquinas relacionadas con el tumor y las proteínas diana posteriores[9]–[22].
Después de una extensa búsqueda y análisis de la literatura, junto con análisis bioinformáticos para abordar las lagunas de investigación para mejorar la "Precisión Epigenética del Cáncer", hemos elegido dos lncRNA relacionados con Notch para estudiar su relación con el pronóstico del CCR. Un área de investigación actual es determinar el impacto de los ncRNA relacionados con Notch en el riesgo y/o la progresión del CCR.
La vía de señalización de Notch es una cascada ubicua en las especies para controlar una amplia variedad de eventos biológicos, incluida la división celular, la proliferación y la muerte celular[23],[24]. Investigaciones recientes han revelado el papel fundamental de la cascada de Notch en la evolución del CCR[25]. La renovación homeostática y la transformación promotora de tumores de las células epiteliales intestinales pueden ser gestionadas por la señalización de Notch[26]. La estimulación de la cascada de Notch puede ser desencadenada epigenéticamente por la expresión desregulada de ncRNA (ncRNA)[27].
La utilidad significativa de los lncRNA asociados a Notch expresados en el tumor como indicadores pronósticos de malignidad demuestra cómo están conectados con la carcinogénesis o la metástasis y, por lo tanto, reflejan los resultados en diferentes tipos de cáncer, incluido el CCR[28]–[31].
El gen de la pequeña RNA nucleolar 3 (SNHG3) es un lncRNA de 4950 pares de bases situado en el cromosoma 1p35.3[32]. En el cáncer de mama, la sobreexpresión de SNHG3 desencadena la activación del sistema de Notch como resultado de su unión competitiva al microRNA humano (hsa) hsa-miR-154-3p, exacerbando la proliferación y la metástasis de las células cancerosas[33]. Además, SNHG3 regula positivamente la expresión de Notch1 en el cáncer de ovario a través de la supresión de hsa-miR-139-5p, acelerando la proliferación y la migración de las células tumorales[34]. SNHG3 ejerció un papel carcinogénico en el cáncer de próstata, el osteosarcoma, el glioma, el cáncer gástrico, el cáncer de laringe, el cáncer de vejiga y el CCR[32]. Huang et al. informaron de una mayor expresión de SNHG3 en las células y tejidos del CCR, estimulando la progresión del cáncer a través de la unión a hsa-miR-182-5p[35]. Por lo tanto, se considera que SNHG3 es un potenciador de la malignidad que regula el sistema de Notch en varios tipos de cáncer.
El nc-factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1R)-Activador de la leucemia (LUNAR1) sirve como una diana posterior de la señalización de Notch, al mismo tiempo que LUNAR1 actúa a través de la estimulación de la señalización de Notch. LUNAR1 es un transcrito de un gen de 491 nucleótidos (nt) en el cromosoma 15q26.3 con cuatro exones y una cola de poli (A)[36]. Se identificó que LUNAR1 estaba elevado en los tejidos del CCR, desencadenado por la estimulación de Notch1, acelerando la progresión del CCR a través de la retención de la expresión de IGF1R[37], siendo un regulador positivo de la división celular.
Objetivo del estudio: Dado que existen pocas publicaciones de investigación sobre los dos lncRNA relacionados con Notch, SNHG3 y LUNAR1, en el pronóstico del CCR o en la evaluación del riesgo del CCR, así como en la estratificación de los pacientes en función de las características clínico-patológicas, la evaluación de la utilidad clínica de los cambios en la expresión de los lncRNA SNHG3 y LUNAR1 en la biopsia líquida de sangre periférica de los pacientes con CCR (la muestra no invasiva y fácil) es importante como un paso hacia la implementación de la precisión de los ncRNA.
Objetivos del estudio: evaluar, en primer lugar, el nivel y el patrón de expresión de los lncRNA asociados a Notch, SNHG3 y LUNAR1, en la biopsia líquida de sangre periférica, recogida de una cohorte de pacientes egipcios con CCR que no han recibido tratamiento, en comparación con sujetos voluntarios sanos con edades y sexos similares como grupo de control. En segundo lugar, evaluar la utilidad de la expresión de los lncRNA SNHG3 y LUNAR1 como un marcador biomolecular pronóstico sensible y no invasivo para el cribado del CCR. En tercer lugar, investigar la correlación entre la expresión de SNHG3 y LUNAR1 y las características clínico-patológicas del CCR. Por último, explorar la relevancia clínica de los lncRNA investigados para la evaluación de los resultados clínicos de los pacientes con CCR. Todos estos objetivos deben ser confirmados o descartados mediante análisis in silico y búsqueda en bases de datos bioinformáticas.
Sujetos y métodos
Tamaño de la muestra y poder del estudio
De acuerdo con estudios de referencia previos[36],[38], el tamaño de la muestra se estimó utilizando una calculadora de tamaño de muestra en línea https://riskcalc.org/samplesize/# para la comparación del área bajo la curva (AUC) con un valor de hipótesis nula (realizado en enero de 2021) utilizando un nivel de significación de dos colas de 0,05 y una potencia (1-beta) de 0,95 como el nivel de confianza de dos colas del 95%. AUC de SNHG3 del artículo de referencia = 0,863, relación de casos positivos/tamaño total de la muestra = 0,73. AUC de LUNAR1 del artículo de referencia = 0,942, relación de casos positivos/tamaño total de la muestra = 87/115 = 0,756. A partir de estas AUC, la potencia de la muestra es de 62 para SNHG3 y 64 para LUNAR1. Por lo tanto, para comparar las muestras de la enfermedad con el control en una proporción de 2:1, los grupos serán de 45 muestras para los pacientes con CCR y 17 controles para SNHG3 y 48 pacientes con CCR frente a 16 controles para LUNAR1.
Diseño del estudio
Estudio observacional exploratorio, piloto y prospectivo, de tipo caso-control. El estudio se llevó a cabo desde junio de 2021 hasta octubre de 2022.
Participantes del estudio
Grupo de pacientes
Se reclutaron 70 pacientes egipcios con CCR, ingresados en el Centro de Oncología de la Facultad de Medicina, Hospitales de la Universidad Ain Shams (ASUH) o en el Departamento de Cirugía Oncológica del Hospital Dar-El-Shafa, antes del tratamiento quirúrgico o del tratamiento neoadyuvante del CCR, si cumplían los requisitos y aceptaban participar (firmaron el consentimiento informado). La relación hombre-mujer fue de 30:40 con un rango de edad; mínimo-máximo 24-79 años.
Grupo de control sano
Veintiséis sujetos sanos, seleccionados aleatoriamente, con edades y sexos similares, sirvieron como grupo de control. La relación hombre-mujer fue de 9:17 y el rango de edad; mínimo-máximo 35-78 años. Los sujetos del grupo de control fueron seleccionados entre aquellos que acudieron a visitar a los trabajadores del hospital en el hospital o de los donantes de sangre en la Unidad de Donación de Sangre de la ASUH. Ninguno de los sujetos del grupo de control tomó ningún medicamento o padecía ninguna enfermedad, según el cuestionario, y se tomaron muestras de sangre para un hemograma completo.
Criterios de inclusión y exclusión
Se incluyeron en el estudio los pacientes que acudieron al Centro de Oncología de la ASUH o al Departamento de Cirugía Oncológica del Hospital Dar-El-Shafa, que presentaban una variedad de síntomas cólicos, como estreñimiento, molestias abdominales, sangrado rectal y pérdida de peso repentina, cuando el diagnóstico de CCR se confirmó clínicamente mediante radiografía abdominal, colonoscopia e histopatología.
Se excluyeron los pacientes que habían recibido quimioterapia, radioterapia o que se habían sometido a cirugía. También se excluyeron los pacientes con otros tipos de cáncer. No se incluyeron los individuos con datos faltantes.
Datos patológicos y clínicos de los pacientes
Para cada participante con CCR, se utilizaron los resultados de la colonoscopia, las imágenes radiológicas abdominales y las evaluaciones patológicas para definir la etapa del CCR. La clasificación de la etapa del tumor, los ganglios linfáticos y las metástasis (TNM) se basó en el criterio del Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer (AJCC)[39].
Se registraron los antecedentes familiares, la hipertensión (HTA) o la diabetes mellitus (DM) de los participantes en el estudio del CCR como enfermedades no transmisibles (ENT), para correlacionarlas con los lncRNA relacionados con Notch estudiados.
Las afecciones inflamatorias como la colitis ulcerosa, el tamaño del tumor, la ubicación del tumor (rectal, cólico o rectosigmoide), el tipo mucinoso o no mucinoso, la profundidad de la invasión tumoral, la metástasis en los ganglios linfáticos (LNM), la presencia o ausencia de invasión vascular, el estado de diferenciación tumoral; adenocarcinoma, adenocarcinoma moderadamente diferenciado o adenocarcinoma pobremente diferenciado, así como la presencia de las características histológicas subyacentes, células en anillo de sello o no, se recopilaron de los archivos de los pacientes con CCR que cumplían los requisitos y eran voluntarios.
Análisis in silico
LncRNA relacionados con Notch: Bioinformática de varias bases de datos (accedido en enero de 2021 y revisado en julio de 2023)
Se utilizó el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA)[40] con ClusterProfiler utilizando la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG)[41],[42] de Genome net https://www.genome.jp/ para analizar el enriquecimiento funcional de genes, enfermedades, redes, fármacos y vías relacionados con la señalización de Notch. Búsqueda en la base de datos Ensemble[43]
https://www.ensembl.org/index.html para los posibles lncRNA relacionados con Notch SNHG3 y LUNAR1. Búsqueda en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ para la caracterización de los lncRNA hsa investigados, el gen SNHG3 y los transcritos[2] y los lncRNA hsa LUNAR1 y el gen y el transcrito[1]. Comité de Nomenclatura de Genes HUGO (HGNC)[44]
https://www.genenames.org/ genes hsa lncRNA SNHG3 y LUNAR1.
LncRNADisease v3.0 expresión
Base de datos de lncRNA y enfermedades (versión 3.0)[45] para explorar la expresión de los lncRNA relacionados con Notch en el CCR, obtenida de resultados experimentales validados en publicaciones o predichos http://www.rnanut.net/lncrnadisease/index.php/home
2.2.4.3. Expresión a través de la plataforma de análisis pan-cáncer ENCORI Project[46]
https://rnasysu.com/encori/panGeneDiffExp.php de lncRNA o genes en 32 tipos de cáncer. Los valores de los gráficos de caja de expresión de los genes de los datos de RNA-seq se escalaron con log2(FPKM + 0,01), mientras que los de los datos de miRNA-seq se escalaron con log2(RPM + 0,01). Análisis de expresión diferencial para los niveles de expresión de SNHG3, LUNAR1 y sus transcritos en muestras de tumor de CCR frente a muestras de control.
Enriquecimiento funcional y vías dirigidas
Vías dirigidas de KEGG y redes de interacción proteína-proteína (PPI) STRING versión 11.5 https://string-db.org/[47],[48] (Accedido el 30 de agosto de 2023).
LncRNAWiki 2.0 LncRNA—LncRNAWiki—CNCB-NGDC https://ngdc.cncb.ac.cn/lncrnawiki/ (Accedido el 30 de agosto de 2023).
Muestras de sangre
Se recogieron cinco mililitros de líquido de biopsia de sangre periférica venosa de los pacientes con CCR y los sujetos sanos y se almacenaron en tubos vacutainer con gel polimérico activador de coágulos (Greiner Bio-One GmbH, Australia). Las muestras se centrifugaron en tubos vacutainer a una velocidad de 4000 rpm durante diez minutos a temperatura ambiente (25 °C). El suero obtenido se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C en tubos Eppendorf libres de RNA.
Extracción de RNA total
Utilizando el kit miRNeasy Mini (n.º de catálogo 217004; Qiagen, Hilden, Alemania), se aisló el ARN total de los sueros de acuerdo con las instrucciones del protocolo. Se conservaron alícuotas del ARN extraído a -80 °C después de disolverlo en 30 µl de agua libre de RNasa.
Cuantificación del ARN purificado
Utilizando un espectrofotómetro NanoDrop®-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EE. UU.), se evalúa la pureza y la concentración del ARN aislado. La cantidad de ARN se determinó en la muestra utilizando la absorbancia a 260 nm (A260 = 1, 44 ng/µl). Además, la pureza del ARN se evaluó utilizando las relaciones A260/280 nm. La relación 260/280 aceptable oscila entre 1,8 y 2,1, mientras que la relación 260/230 es superior a 1,7.
Transcriptasa inversa
La síntesis de ADN complementario (ADNc) se llevó a cabo utilizando el kit de transcriptasa inversa ADNc de alta capacidad con inhibidor de RNasa (n.º de catálogo 4374966, Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. En un volumen de reacción de 20 µl, la transcriptasa inversa se llevó a cabo a 25 °C durante 10 minutos, 37 °C durante 120 minutos y, a continuación, se sometió a inactivación por calor durante 5 minutos a 85 °C. El ADNc producido se mantuvo a -80 °C hasta que se realizaron más investigaciones.
Medición de la expresión de los lncARN mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real con transcriptasa inversa (RT-qPCR)
La RT-qPCR se llevó a cabo en una reacción de 20 µl utilizando el TaqMan® Gene Expression Master Mix (n.º de catálogo 4370048, Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, EE. UU.). Para determinar los niveles de expresión de los lncARN SNHG3 y LUNAR1, se utilizaron los ensayos de expresión génica TaqMan para el SNHG3 humano (Hs05055352s1, n.º de catálogo 4448892, ThermoFisher Scientific, EE. UU.) y el LUNAR1 humano (Hs03829521s1, n.º de catálogo 4426961, ThermoFisher Scientific, EE. UU.), y el ensayo de expresión génica TaqMan para la gliceraldehído 3-fosfatodeshidrogenasa humana (GAPDH) (n.º de catálogo 4326317E, ThermoFisher Scientific, EE. UU.) se utilizó como estándar endógeno para normalizar los valores. La reacción se llevó a cabo utilizando la técnica de RT-qPCR StepOne™ (Applied Biosystems, CA, EE. UU.). La estrategia de ciclaje térmico fue la siguiente: una etapa de incubación inicial de uracilo-N-glicosilasa (UNG) a 50 °C durante 2 minutos, seguida de una etapa de activación que duró 10 minutos a 95 °C, seguida de 40 ciclos de desnaturalización durante 15 segundos a 95 °C, y de hibridación y extensión durante 1 minuto a 60 °C.
Según el fabricante, el "límite de detección" (LD) del ensayo puede detectar plantillas de ADNc desde 1 pg hasta 100 ng en agua libre de nucleasas.
Se utilizó la técnica del umbral de ciclo (Ct) como cambio relativo (2-ΔCt) para calcular y normalizar los niveles de expresión de los lncARN, utilizando GAPDH como gen de referencia. Se obtuvo ΔCt restando los valores de Ct de GAPDH de los valores de Ct de SNHG3 o LUNAR1 [49], donde: ΔCt = Ct de las muestras de CRC – Ct de las muestras de control sanas.
Determinación de CEA y CA19-9 mediante inmunoensayo de quimioluminiscencia
Se utilizó una porción de los sueros obtenidos para determinar los marcadores tumorales CEA y CA19-9. Se utilizó un inmunoensayo de quimioluminiscencia con Cobas® e 602, desarrollado por Roche Diagnostics, GmbH, Alemania, para determinar las concentraciones séricas de CEA (n.º de catálogo 11731629 322) y CA19.9 (n.º de catálogo 11776193500), según el protocolo del fabricante.
Registro de los resultados de las pruebas bioquímicas de rutina de los archivos de los pacientes
Se recopilaron los resultados de las pruebas de la función hepática (aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT)), así como los niveles de creatinina y urea sérica, hemoglobina (Hgb), recuento de plaquetas, recuento de linfocitos y tiempo de protrombina (TP) de los archivos de los pacientes.
Relaciones e índices
Se registraron la altura de los participantes en metros y su peso en kilogramos para calcular el índice de masa corporal (IMC en kg/m2), donde los sujetos con sobrepeso tienen un IMC de 25-29,9 kg/m2, los sujetos con obesidad tienen un IMC de 30 kg/m2 o más, mientras que un IMC de 18,5-24,9 kg/m2 indica un peso normal.
https://www.nhlbi.nih.gov/health/educational/lose_wt/BMI/bmicalc.htm
El biomarcador indicador de la inflamación relacionada con la respuesta inmune, capaz de predecir la gravedad del trastorno inflamatorio asociado, es la relación plaquetas/linfocitos (RPL) [10], [50].
Análisis estadístico
Con la ayuda de GraphPad Prism® versión 9.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.), SPSS 23.0 (paquete estadístico para estudios sociales) (IBM, Armonk, NY), MedCalc Statistic Software versión 19.1 (MedCalc Software by Ostend, Bélgica) y Microsoft Office Excel 2019, se realizó el análisis estadístico.
Se utilizó la prueba de chi-cuadrado (χ2) para evaluar las asociaciones entre las características de los participantes y los grupos. Se aplicaron la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk y la prueba de Kolmogorov-Smirnov para determinar el patrón de la distribución normal de ambos grupos y subgrupos de datos. Los datos se expresaron como media ± DE cuando superaron la prueba de normalidad. Se utilizó la prueba t de Student para determinar las diferencias significativas entre dos grupos distribuidos normalmente. Además, se utilizó una prueba ANOVA de una vía (F) seguida de una prueba de comparación múltiple post hoc de Tukey, cuando fue necesario, para determinar las variaciones significativas entre múltiples grupos. Mientras tanto, los datos que no superaron la prueba de normalidad se expresaron como mediana (rango intercuartílico) (RIC) (percentil 25-percentil 75). Se utilizó la prueba de Mann-Whitney (U) para identificar los cambios significativos entre dos conjuntos de participantes. Además, se utilizaron la prueba de Kruskal-Wallis (H) y, posteriormente, la prueba de comparación múltiple de Dunn, cuando fue necesario, para determinar si existían diferencias estadísticamente significativas entre diferentes grupos.
Se implementó la curva de características operativas del receptor (ROC) y el AUC para evaluar la capacidad de los lncARN séricos SNHG3 y LUNAR1 para discriminar entre grupos y para la identificación de subgrupos. Se determinaron el mejor punto de corte, la sensibilidad (SN), la especificidad (SP) y los valores predictivos negativos (VPN) y positivos (VPP), respectivamente, utilizando la curva ROC, con un rango estimado de AUC de 0 a 1.
Los ratios de probabilidad negativos (LR) se utilizan en las pruebas médicas para evaluar la eficiencia discriminatoria del marcador. La relación, que indica la probabilidad de que una persona tenga la enfermedad o afección, confirma las SN y SP identificadas por la curva ROC. La SN y la SP proporcionan un significado diferente para el LR, con un LR negativo igual a (100-SN)/SP.
Se utilizaron modelos de regresión múltiple para evaluar la influencia de los datos demográficos de los participantes y los datos clínico-patológicos de los pacientes (como factores independientes) sobre los niveles de expresión de los lncARN SNHG3 y LUNAR1, que se consideraron como las variables dependientes (se utilizaron correcciones de Bonferroni para controlar los errores de tipo I). La correlación entre varias variables se evaluó utilizando el coeficiente de correlación de Spearman (r). Se consideran estadísticamente significativas las pruebas de análisis cuando el valor p de dos colas es < 0,05 (*).
Tamaño de la muestra y poder del estudio
De acuerdo con estudios de referencia anteriores [36], [38], el tamaño de la muestra se estimó utilizando una calculadora de tamaño de muestra en línea https://riskcalc.org/samplesize/# para la comparación del área bajo la curva (AUC) con un valor de hipótesis nula (realizado en enero de 2021) utilizando un nivel de significación de dos colas de 0,05 y una potencia (1-β) de 0,95 como nivel de confianza de dos colas del 95%. El AUC de SNHG3 del artículo de referencia = 0,863, la relación de casos positivos/tamaño total de la muestra = 0,73. El AUC de LUNAR1 del artículo de referencia = 0,942, la relación de casos positivos/tamaño total de la muestra = 87/115 = 0,756. Con estos AUC, el tamaño de la muestra es de 62 para SNHG3 y 64 para LUNAR1. Para comparar las muestras de la enfermedad con el control en una proporción de 2:1, los grupos serán de 45 muestras para los pacientes con CRC y 17 controles para SNHG3, y de 48 pacientes con CRC frente a 16 controles para LUNAR1.
Diseño del estudio
Estudio observacional exploratorio, piloto, prospectivo y de casos y controles. El estudio se llevó a cabo desde junio de 2021 hasta octubre de 2022.
Participantes del estudio
Grupo de pacientes
Se reclutaron 70 pacientes egipcios con CRC, ingresados en el Centro de Oncología de la Facultad de Medicina, Hospitales de la Universidad Ain Shams (ASUH) o en el Departamento de Cirugía Oncológica del Hospital Dar-El-Shafa, antes del tratamiento quirúrgico o del tratamiento neoadyuvante del CRC, si cumplían los requisitos y aceptaban participar (firmaron el consentimiento informado). La proporción de hombres y mujeres fue de 30:40, con un rango de edad de 24 a 79 años.
Grupo de control aparentemente sano
Se seleccionaron aleatoriamente 26 sujetos sanos, con edades y sexos similares, para que sirvieran como grupo de control. La proporción de hombres y mujeres fue de 9:17 y el rango de edad fue de 35 a 78 años. Los sujetos del grupo de control se seleccionaron entre aquellos que acudieron a visitar a los trabajadores del hospital en el hospital o entre los donantes de sangre de la Unidad de Donación de Sangre de la ASUH. Ninguno de los sujetos del grupo de control tomaba medicamentos ni padecía ninguna enfermedad, según el cuestionario, y se tomaron muestras de sangre para un hemograma completo.
Criterios de inclusión y exclusión
Se incluyeron en el estudio los pacientes que acudieron al Centro de Oncología de la ASUH o al Departamento de Cirugía Oncológica del Hospital Dar-El-Shafa, que presentaban una serie de síntomas cólicos, como estreñimiento, molestias abdominales, sangrado rectal y pérdida de peso repentina, cuando el diagnóstico de CRC se confirmó clínicamente mediante radiografía abdominal, colonoscopia e histopatología.
Los criterios de exclusión fueron los pacientes que habían recibido quimioterapia, radioterapia o que se habían sometido a cirugía. También se excluyeron los pacientes con otros tipos de cáncer. No se incluyeron los individuos con datos faltantes.
Datos patológicos y clínicos de los pacientes
Para cada participante con CRC, se utilizaron los resultados de la colonoscopia, las imágenes radiográficas abdominales y las evaluaciones patológicas para definir la etapa del CRC. La estadificación del tumor, los ganglios linfáticos y las metástasis (TNM) se basó en los criterios del Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer (AJCC) [39].
Se registraron los antecedentes familiares de los participantes con CRC, la hipertensión (HTA) o la diabetes mellitus (DM) como enfermedades no transmisibles (ENT), para correlacionarlas con los lncARN relacionados con la muesca que se estudiaron.
Se recopilaron las afecciones inflamatorias, como la colitis ulcerosa, el tamaño del tumor, la ubicación del tumor (rectal, cólico o rectosigmoide), el tipo mucinoso o no mucinoso, la profundidad de la invasión tumoral, la metástasis en los ganglios linfáticos (LNM), la presencia o ausencia de invasión vascular y el estado de diferenciación tumoral (adenocarcinoma, adenocarcinoma moderadamente diferenciado o adenocarcinoma pobremente diferenciado), así como la presencia de las características histológicas subyacentes, células en anillo de sello o no, de los archivos de los pacientes con CRC que cumplían los requisitos para participar.
Grupo de pacientes
Se reclutaron 70 pacientes egipcios con CRC, ingresados en el Centro de Oncología de la Facultad de Medicina, Hospitales de la Universidad Ain Shams (ASUH) o en el Departamento de Cirugía Oncológica del Hospital Dar-El-Shafa, antes del tratamiento quirúrgico o del tratamiento neoadyuvante del CRC, si cumplían los requisitos y aceptaban participar (firmaron el consentimiento informado). La proporción de hombres y mujeres fue de 30:40, con un rango de edad de 24 a 79 años.
Grupo de control aparentemente sano
Se seleccionaron aleatoriamente 26 sujetos sanos, con edades y sexos similares, para que sirvieran como grupo de control. La proporción de hombres y mujeres fue de 9:17 y el rango de edad fue de 35 a 78 años. Los sujetos del grupo de control se seleccionaron entre aquellos que acudieron a visitar a los trabajadores del hospital en el hospital o entre los donantes de sangre de la Unidad de Donación de Sangre de la ASUH. Ninguno de los sujetos del grupo de control tomaba medicamentos ni padecía ninguna enfermedad, según el cuestionario, y se tomaron muestras de sangre para un hemograma completo.
Criterios de inclusión y exclusión
Se incluyeron en el estudio los pacientes que acudieron al Centro de Oncología de la ASUH o al Departamento de Cirugía Oncológica del Hospital Dar-El-Shafa, que presentaban una serie de síntomas cólicos, como estreñimiento, molestias abdominales, sangrado rectal y pérdida de peso repentina, cuando el diagnóstico de CRC se confirmó clínicamente mediante radiografía abdominal, colonoscopia e histopatología.
Los criterios de exclusión fueron los pacientes que habían recibido quimioterapia, radioterapia o que se habían sometido a cirugía. También se excluyeron los pacientes con otros tipos de cáncer. No se incluyeron los individuos con datos faltantes.
Datos patológicos y clínicos de los pacientes
Para cada participante del estudio de CCRC, se utilizaron los resultados de la colonoscopia, las imágenes radiográficas abdominales y las evaluaciones patológicas para definir la estadificación del CCRC. Los criterios de estadificación del tumor, los ganglios linfáticos y las metástasis (TNM) se basaron en los criterios del Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer (AJCC) [39].
Se registraron los antecedentes familiares de los participantes en el estudio de CCRC, así como la hipertensión (HTN) o la diabetes mellitus (DM), como enfermedades no transmisibles (ENT), para correlacionarlas con los lncARN relacionados con Notch que se estudiaron.
Se recopilaron de los archivos de los pacientes con CCRC que participaron voluntariamente en el estudio las siguientes características: afecciones inflamatorias como la colitis ulcerosa, el tamaño del tumor, la ubicación del tumor (rectal, cólico o rectosigmoideo), el tipo mucinoso o no mucinoso, la profundidad de la invasión tumoral, la metástasis en los ganglios linfáticos (LNM), la presencia o ausencia de invasión vascular, el estado de diferenciación tumoral (adenocarcinoma, adenocarcinoma moderadamente diferenciado o adenocarcinoma pobremente diferenciado), así como la presencia o ausencia de las características histológicas subyacentes, como las células en anillo de sello.
Análisis in silico
Bioinformática de lncARN relacionados con Notch a partir de diversas bases de datos (acceso en enero de 2021 y revisión en julio de 2023)
Se utilizó el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) [40] con ClusterProfiler, utilizando la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) [41], [42] de Genome net https://www.genome.jp/, para analizar el enriquecimiento funcional de genes, enfermedades, redes, fármacos y vías relacionados con la señalización de Notch. Búsqueda en la base de datos Ensemble [43] https://www.ensembl.org/index.html para identificar los posibles lncARN relacionados con Notch SNHG3 y LUNAR1. Búsqueda en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ para caracterizar los lncARN hsa SNHG3 y sus transcritos [2] y los lncARN hsa LUNAR1 y sus transcritos [1]. Comité de Nomenclatura de Genes HUGO (HGNC) [44] https://www.genenames.org/ para los genes hsa lncARN SNHG3 y LUNAR1.
Expresión de LncRNADisease v3.0
Se utilizó la base de datos LncRNA and Disease (versión 3.0) [45] para explorar la expresión de los lncARN relacionados con Notch en el CCRC, obtenida a partir de resultados experimentales validados en publicaciones o predicha en http://www.rnanut.net/lncrnadisease/index.php/home.
2.2.4.3. Expresión mediante la plataforma de análisis pan-cáncer del proyecto ENCORI [46]
https://rnasysu.com/encori/panGeneDiffExp.php de lncARN o genes en 32 tipos de cáncer. Los valores de los gráficos de caja de expresión de los genes obtenidos a partir de datos de secuenciación de ARN (RNA-seq) se escalaron con log2(FPKM + 0.01), mientras que los obtenidos a partir de datos de secuenciación de microARN (miRNA-seq) se escalaron con log2(RPM + 0.01). Análisis de expresión diferencial de SNHG3, LUNAR1 y sus transcritos, niveles de expresión de IGF1R en muestras tumorales de CCRC frente a muestras de control.
Análisis de enriquecimiento funcional y vías dirigidas
Vías dirigidas de KEGG y redes de interacción proteína-proteína (PPI) de STRING versión 11.5 https://string-db.org/ [47], [48] (Acceso el 20 de julio de 2023).
LncRNAWiki 2.0 LncRNA—LncRNAWiki—CNCB-NGDC https://ngdc.cncb.ac.cn/lncrnawiki/ (Acceso el 30 de agosto de 2023).
Bioinformática de lncARN relacionados con Notch a partir de diversas bases de datos (acceso en enero de 2021 y revisión en julio de 2023)
Se utilizó el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) [40] con ClusterProfiler, utilizando la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) [41], [42] de Genome net https://www.genome.jp/, para analizar el enriquecimiento funcional de genes, enfermedades, redes, fármacos y vías relacionados con la señalización de Notch. Búsqueda en la base de datos Ensemble [43] https://www.ensembl.org/index.html para identificar los posibles lncARN relacionados con Notch SNHG3 y LUNAR1. Búsqueda en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ para caracterizar los lncARN hsa SNHG3 y sus transcritos [2] y los lncARN hsa LUNAR1 y sus transcritos [1]. Comité de Nomenclatura de Genes HUGO (HGNC) [44] https://www.genenames.org/ para los genes hsa lncARN SNHG3 y LUNAR1.
Expresión de LncRNADisease v3.0
Se utilizó la base de datos LncRNA and Disease (versión 3.0) [45] para explorar la expresión de los lncARN relacionados con Notch en el CCRC, obtenida a partir de resultados experimentales validados en publicaciones o predicha en http://www.rnanut.net/lncrnadisease/index.php/home.
2.2.4.3. Expresión mediante la plataforma de análisis pan-cáncer del proyecto ENCORI [46]
https://rnasysu.com/encori/panGeneDiffExp.php de lncARN o genes en 32 tipos de cáncer. Los valores de los gráficos de caja de expresión de los genes obtenidos a partir de datos de secuenciación de ARN (RNA-seq) se escalaron con log2(FPKM + 0.01), mientras que los obtenidos a partir de datos de secuenciación de microARN (miRNA-seq) se escalaron con log2(RPM + 0.01). Análisis de expresión diferencial de SNHG3, LUNAR1 y sus transcritos, niveles de expresión de IGF1R en muestras tumorales de CCRC frente a muestras de control.
Análisis de enriquecimiento funcional y vías dirigidas
Vías dirigidas de KEGG y redes de interacción proteína-proteína (PPI) de STRING versión 11.5 https://string-db.org/ [47], [48] (Acceso el 20 de julio de 2023).
LncRNAWiki 2.0 LncRNA—LncRNAWiki—CNCB-NGDC https://ngdc.cncb.ac.cn/lncrnawiki/ (Acceso el 30 de agosto de 2023).
Muestras de sangre
De pacientes con CCRC y voluntarios sanos, se recolectaron cinco mililitros de sangre venosa periférica y se almacenaron en tubos de vacío con gel polimérico activador de coágulos (Greiner Bio-One GmbH, Australia). Las muestras se centrifugaron en tubos de vacío a una velocidad de 4000 rpm durante diez minutos a temperatura ambiente (25 °C). El suero obtenido se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C en tubos Eppendorf libres de RNasas.
Extracción de ARN total
Utilizando el kit miRNeasy Mini (Cat. No. 217004; Qiagen, Hilden, Alemania), se aisló el ARN total del suero de acuerdo con las instrucciones del protocolo. Las alícuotas del ARN extraído se conservaron a -80 °C después de disolverse en 30 µl de agua libre de RNasas.
Cuantificación del ARN purificado
Utilizando un espectrofotómetro NanoDrop®-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA), se evaluó la pureza y la concentración del ARN aislado. La cantidad de ARN se determinó en la muestra utilizando la absorbancia a 260 nm (A260 = 1 = 44 ng/µl). Además, la pureza del ARN se evaluó utilizando las relaciones A260/280 nm. La relación 260/280 aceptable oscila entre 1.8 y 2.1, mientras que la relación 260/230 es mayor que 1.7.
Transcripción inversa
La síntesis de ADN complementario (ADNc) se llevó a cabo utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad con inhibidor de RNasa (Cat. No 4374966, Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En un volumen de reacción de 20 µl, la transcripción inversa se llevó a cabo a 25 °C durante 10 minutos, 37 °C durante 120 minutos y, a continuación, se sometió a una inactivación térmica de 5 minutos a 85 °C. El ADNc producido se mantuvo a -80 °C hasta su posterior análisis.
Medición de la expresión de lncARN mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
La qRT-PCR se llevó a cabo en una reacción de 20 µl utilizando la mezcla maestra de expresión génica TaqMan® (Cat. No 4370048, Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, USA). Para determinar los niveles de expresión de los lncARN SNHG3 y LUNAR1, se utilizaron los ensayos de expresión génica TaqMan para el gen humano SNHG3 (Hs05055352s1, Cat. No 4448892, ThermoFisher Scientific, USA) y el gen humano LUNAR1 (Hs03829521s1, Cat. No 4426961, ThermoFisher Scientific, USA), y el ensayo de expresión génica TaqMan para la gliceraldehído 3-fosfatodeshidrogenasa humana (GAPDH) (Cat. No 4326317E, ThermoFisher Scientific, USA) se utilizó como estándar endógeno para normalizar los valores. La reacción se llevó a cabo utilizando la técnica de qRT-PCR StepOne™ (Applied Biosystems, CA, USA). La estrategia de ciclaje térmico fue la siguiente: una etapa inicial de incubación de uracil-N-glicosilasa (UNG) a 50 °C durante 2 minutos, seguida de una etapa de activación que duró 10 minutos a 95 °C, seguida de 40 ciclos de desnaturalización durante 15 segundos a 95 °C, y de hibridación y extensión durante 1 minuto a 60 °C.
Según el fabricante, el "límite de detección" (LoD) del ensayo puede detectar plantillas de ADNc desde 1 pg hasta 100 ng en agua libre de nucleasas.
Se utilizó la técnica del umbral de ciclo (Ct) como cambio de pliegue (2-ΔCt) para calcular y normalizar los niveles de expresión de los lncARN, utilizando GAPDH como gen de referencia. Se obtuvo ΔCt restando los valores de Ct de GAPDH de los valores de Ct de SNHG3 o LUNAR1 [49], donde: ΔCt = Ct de las muestras de CCRC - Ct de las muestras de control sanas.
Determinación de CEA y CA19-9 mediante inmunoensayo de quimioluminiscencia
Una porción del suero obtenido se utilizó para determinar los marcadores tumorales CEA y CA19-9. Se utilizó un inmunoensayo de quimioluminiscencia con Cobas® e 602 desarrollado por Roche Diagnostics, GmbH, Alemania, para determinar las concentraciones séricas de CEA (Cat. No 11731629 322) y CA19.9 (Cat. No 11776193500), de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Resultados de las pruebas bioquímicas de rutina registrados en los archivos de los pacientes
Las pruebas de la función hepática (aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT)), así como los niveles de creatinina y urea en suero, la hemoglobina (Hgb), el recuento de plaquetas, el recuento de linfocitos y el tiempo de protrombina (TP) se recopilaron de los archivos de los pacientes.
Relaciones e índices
Se registraron la altura y el peso de los participantes en metros y kilogramos, respectivamente, para calcular el índice de masa corporal (IMC en kg/m2), donde los sujetos con sobrepeso tienen un IMC de 25-29,9 kg/m2, los obesos tienen un IMC de 30 kg/m2 o más, y los de peso normal tienen un IMC de 18,5-24,9 kg/m2.
https://www.nhlbi.nih.gov/health/educational/lose_wt/BMI/bmicalc.htm
El biomarcador de la respuesta inmune relacionado con la inflamación que puede predecir la gravedad del trastorno inflamatorio asociado es la relación plaquetas/linfocitos (PLR) [10], [50].
Extracción de ARN total
Utilizando el kit miRNeasy Mini (Cat. No. 217004; Qiagen, Hilden, Alemania), se aisló el ARN total del suero de acuerdo con las instrucciones del protocolo. Las alícuotas del ARN extraído se conservaron a -80 °C después de disolverse en 30 µl de agua libre de RNasas.
Cuantificación del ARN purificado
Utilizando un espectrofotómetro NanoDrop®-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA), se evaluó la pureza y la concentración del ARN aislado. La cantidad de ARN se determinó en la muestra utilizando la absorbancia a 260 nm (A260 = 1 = 44 ng/µl). Además, la pureza del ARN se evaluó utilizando las relaciones A260/280 nm. La relación 260/280 aceptable oscila entre 1.8 y 2.1, mientras que la relación 260/230 es mayor que 1.7.
Transcripción inversa
La síntesis de ADNc se llevó a cabo utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad con inhibidor de RNasa (Cat. No 4374966, Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En un volumen de reacción de 20 µl, la transcripción inversa se llevó a cabo a 25 °C durante 10 minutos, 37 °C durante 120 minutos y, a continuación, se sometió a una inactivación térmica de 5 minutos a 85 °C. El ADNc producido se mantuvo a -80 °C hasta su posterior análisis.
Medición de la expresión de lncARN mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
La qRT-PCR se llevó a cabo en una reacción de 20 µl utilizando la mezcla maestra de expresión génica TaqMan® (Cat. No 4370048, Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, USA). Para determinar los niveles de expresión de los lncARN SNHG3 y LUNAR1, se utilizaron los ensayos de expresión génica TaqMan para el gen humano SNHG3 (Hs05055352s1, Cat. No 4448892, ThermoFisher Scientific, USA) y el gen humano LUNAR1 (Hs03829521s1, Cat. No 4426961, ThermoFisher Scientific, USA), y el ensayo de expresión génica TaqMan para la gliceraldehído 3-fosfatodeshidrogenasa humana (GAPDH) (Cat. No 4326317E, ThermoFisher Scientific, USA) se utilizó como estándar endógeno para normalizar los valores. La reacción se llevó a cabo utilizando la técnica de qRT-PCR StepOne™ (Applied Biosystems, CA, USA). La estrategia de ciclaje térmico fue la siguiente: una etapa inicial de incubación de uracil-N-glicosilasa (UNG) a 50 °C durante 2 minutos, seguida de una etapa de activación que duró 10 minutos a 95 °C, seguida de 40 ciclos de desnaturalización durante 15 segundos a 95 °C, y de hibridación y extensión durante 1 minuto a 60 °C.
Según el fabricante, el "límite de detección" (LoD) del ensayo puede detectar plantillas de ADNc desde 1 pg hasta 100 ng en agua libre de nucleasas.
La técnica del umbral de ciclo (Ct), utilizada como un cambio de valor (2 Ct), se empleó para calcular y normalizar los niveles de expresión de los lncRNAs, utilizando GAPDH como gen de referencia. El valor ?Ct se obtuvo restando los valores de Ct de GAPDH de los valores de Ct de SNHG3 o LUNAR1[49], donde: ? Ct = Ct de las muestras de CRC – ?Ct de las muestras de control sanas.
Determinación de CEA y CA19-9 mediante inmunoensayo de quimioluminiscencia
Se utilizó una porción de los sueros obtenidos para determinar los marcadores tumorales CEA y CA19-9. Se empleó un inmunoensayo de quimioluminiscencia utilizando Cobas® e 602, desarrollado por Roche Diagnostics, GmbH, Alemania, para determinar las concentraciones séricas de CEA (N.º de catálogo 11731629 322) y CA19.9 (N.º de catálogo 11776193500), según el protocolo del fabricante.
Resultados de las pruebas bioquímicas de rutina obtenidos de los archivos de los pacientes
Se recopilaron de los archivos de los pacientes las pruebas de función hepática (transaminasa oxalacética (AST) y transaminasa alanina (ALT)), así como los niveles de creatinina y urea sérica, hemoglobina (Hgb), recuento de plaquetas, recuento de linfocitos y tiempo de protrombina (TP).
Razones e índices
Se registraron las alturas de los participantes en metros y sus pesos en kilogramos, para calcular el índice de masa corporal (IMC en kg/m2), donde los sujetos con sobrepeso tienen un IMC de 25–29,9 kg/m2, los obesos tienen un IMC de 30 kg/m2 o más, mientras que un IMC de 18,5–24,9 kg/m2 indica un peso normal.
https://www.nhlbi.nih.gov/health/educational/lose_wt/BMI/bmicalc.htm
El indicador de biomarcadores de inflamación relacionado con la respuesta inmune, capaz de predecir la gravedad del trastorno inflamatorio asociado, es la relación plaquetas/linfocitos (PLR)[10],[50].
Análisis estadístico
Con la ayuda de GraphPad Prism® versión 9.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.), SPSS 23.0 (paquete estadístico para software de estudios sociales) (IBM, Armonk, NY), MedCalc Statistic Software versión 19.1 (MedCalc Software by Ostend, Bélgica) y Microsoft Office Excel 2019, se realizó el análisis estadístico.
Se utilizó la prueba de chi-cuadrado ( 2) para evaluar las asociaciones entre las características de los participantes y los grupos. Se aplicaron la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk y la prueba de Kolmogorov-Smirnov para determinar el patrón de distribución normal para ambos grupos y subgrupos de datos. Los datos se expresaron como media ± DE cuando superaron la prueba de normalidad. Se utilizó la prueba t de Student para determinar cualquier diferencia significativa entre dos grupos con distribución normal. Además, se utilizó un ANOVA de una vía (F) seguido de la prueba de comparación múltiple post hoc de Tukey, cuando fue necesario, para determinar las variaciones significativas entre múltiples grupos. Mientras que los datos que no superaron la prueba de normalidad se expresaron como mediana (rango intercuartílico) (RIC) (percentil 25-percentil 75). Se utilizó la prueba de Mann-Whitney (U) para identificar los cambios significativos entre dos conjuntos de participantes. Además, se utilizaron la prueba de Kruskal-Wallis (H) y, posteriormente, la prueba de comparación múltiple de Dunn, cuando fue necesario, para determinar si existían diferencias estadísticamente significativas entre diferentes grupos.
Se implementaron la curva ROC (receptor operating characteristic) y el AUC para evaluar la capacidad de los lncRNAs séricos SNHG3 y LUNAR1 para discriminar entre grupos y para la identificación de subgrupos. El mejor punto de corte, la sensibilidad (SN), la especificidad (SP) y los valores predictivos negativos (VPN) y positivos (VPP), respectivamente, se determinaron utilizando la curva ROC, con un rango de AUC estimado de 0 a 1.
Los ratios de probabilidad negativos (LR) se utilizan en las pruebas médicas para evaluar la eficiencia discriminatoria del marcador. El ratio, que indica la probabilidad de que una persona tenga la enfermedad o afección, confirma las SN y SP identificadas por la curva ROC. La SN y la SP proporcionan un significado diferente para el LR, con un LR negativo igual a (100-SN)/SP.
Se utilizaron modelos de regresión múltiple para evaluar la influencia de los datos demográficos de los participantes y los datos clinicopatológicos de los pacientes (como factores independientes) sobre los niveles de expresión de los lncRNAs SNHG3 y LUNAR1, que se consideraron como las variables dependientes (se utilizaron correcciones de Bonferroni para controlar los errores de tipo I). La correlación entre numerosas variables se evaluó utilizando el coeficiente de correlación de Spearman (r). Las pruebas de análisis estadístico se consideran significativas cuando el valor p de dos colas es < 0,05 (*).
Resultados
Análisis in silico
Las regiones genómicas y la ubicación cromosómica de SNHG3 y LUNAR1, así como el producto génico (Tabla 1), se obtuvieron de HGNC; Comité de Nomenclatura Genética de la HUGO https://www.genenames.org/, NCBI; Centro Nacional de Información Biotecnológica https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ y Ensembl https://www.ensembl.org/index.html (bases de datos bioinformáticas) (Acceso en enero de 2021 y revisado en julio de 2023).
Datos de los participantes (Tabla 2)
Datos demográficos y clínicos de los participantes
La Tabla 2 muestra la diferencia en los datos demográficos y clínicos entre el grupo de pacientes con CRC y el grupo de control, donde no se detectó ninguna diferencia estadísticamente significativa en cuanto a la edad, el sexo y el IMC entre los dos grupos (estudio de casos y controles). Sin embargo, los pacientes con CRC presentaban niveles significativamente más bajos de Hgb ( 11 g/dL) en comparación con el grupo de control (P < 0,0001). Además, la PLR también estaba significativamente elevada solo en el grupo de CRC (P = 0,0048). Un TP prolongado (> 14 s) se detectó significativamente en el grupo de CRC (P = 0,024).
Datos patológicos del grupo de pacientes con CRC
Según la colonoscopia y los hallazgos radiográficos, los sitios más comunes de CRC fueron, respectivamente, el colon en 45 (64,29%), el recto en 19 (27,14%) y el rectosigmoide en 6 (8,57%) de los pacientes. Los pacientes con CRC incluidos se dividieron en dos etapas, donde 47 (67,14%) de los pacientes se encontraban en una etapa temprana (I-II). Mientras que 23 (32,86%) de los pacientes se encontraban en una etapa tardía (III-IV). La diferenciación tumoral más común fue la diferenciación moderada, que se informó en 42 (60%) de los pacientes con CRC.
Patrón de expresión de los lncRNAs investigados en la cohorte de pacientes egipcios con CRC (n = 70) (Fig. 1)
Como se muestra en la Fig. 1A, los datos de qRT-PCR revelaron que los niveles de expresión sérica del lncRNA SNHG3 en los pacientes con CRC fueron de 7,187 (3,940-9,596) y de 1,035 (0,6406-1,149) en los controles, lo que fue significativamente mayor en el grupo de pacientes con CRC (P < 0,0001). Esto coincide con el resultado de la búsqueda en la base de datos in silico a través del análisis de expresión diferencial de genes en todo el páncreas del proyecto ENCORI, que muestra los resultados de los diagramas de caja de los adenocarcinomas de colon (Fig. 1B) https://rnasysu.com/encori/panGeneDiffExp.php (Acceso revisado en junio de 2023), que fueron más altos en el grupo de casos tumorales en comparación con el grupo de control.
Como se muestra en la Fig. 1C, de manera similar, el nivel de expresión sérica del lncRNA LUNAR1 también aumentó notablemente en los pacientes con CRC, con una mediana de 3,945 (1,668-5,677) en comparación con una mediana de 0,7785 (0,500-1,206) en los participantes sanos (P < 0,0001).
El análisis de expresión diferencial en todo el páncreas (Acceso y revisión en junio de 2023) https://rnasysu.com/encori/panGeneDiffExp.php del proyecto ENCORI en tumores primarios de adenocarcinoma de colon (n = 471) frente a muestras de control (n = 41) (Fig. 1D) del lncRNA LUNAR1 y (Fig. 1E) la expresión diferencial del gen IGF1R.
Datos demográficos y clínicos de la cohorte de pacientes con CRC (n = 70) subclasificados según las etapas del CRC (Tabla 3)
La etapa tardía del CRC (III-IV) se asoció notablemente con niveles más altos de recuento de plaquetas, con una mediana (RIC) (percentil 25 a percentil 75) de 371,0 (299,0–450,0) en comparación con 302,0 (220,0–377,0) en la etapa temprana del CRC (I–II) (P = 0,0281). La PLR también se elevó notablemente en los pacientes con CRC en etapa tardía (III-IV), con una mediana de 152,0 (133,5–186,3) en contraste con 116,8 (94,08–161,6) en los pacientes con CRC en etapa temprana (I–II) (P = 0,0032). Se detectó significativamente un TP prolongado (> 14 s) en el grupo de CRC (P = 0,024).
Datos patológicos del grupo de pacientes con CRC
Según los hallazgos de la colonoscopia y la radiografía, los sitios más comunes de CRC fueron, respectivamente, el colon en 45 (64,29%), el recto en 19 (27,14%) y el rectosigmoide en 6 (8,57%) de los pacientes. Los pacientes con CRC incluidos se dividieron en dos etapas, donde 47 (67,14%) de los pacientes se encontraban en una etapa temprana (I-II). Mientras que 23 (32,86%) de los pacientes se encontraban en una etapa tardía (III-IV). La diferenciación tumoral más común fue la diferenciación moderada, que se informó en 42 (60%) de los pacientes con CRC.
Patrón de expresión de los lncRNAs investigados en la cohorte de pacientes egipcios con CRC (n = 70) (Fig. 1)
Como se muestra en la Fig. 1A, los datos de qRT-PCR revelaron que los niveles de expresión sérica del lncRNA SNHG3 en los pacientes con CRC fueron de 7,187 (3,940-9,596) y de 1,035 (0,6406-1,149) en los controles, lo que fue significativamente mayor en el grupo de pacientes con CRC (P < 0,0001). Esto coincide con el resultado de la búsqueda en la base de datos in silico a través del análisis de expresión diferencial de genes en todo el páncreas del proyecto ENCORI, que muestra los resultados de los diagramas de caja de los adenocarcinomas de colon (Fig. 1B) https://rnasysu.com/encori/panGeneDiffExp.php (Acceso revisado en junio de 2023), que fueron más altos en el grupo de casos tumorales en comparación con el grupo de control.
Como se muestra en la Fig. 1C, de manera similar, el nivel de expresión sérica del lncRNA LUNAR1 también aumentó notablemente en los pacientes con CRC, con una mediana de 3,945 (1,668-5,677) en comparación con una mediana de 0,7785 (0,500-1,206) en los participantes sanos (P < 0,0001).
El análisis de expresión diferencial en todo el páncreas (Acceso y revisión en junio de 2023) https://rnasysu.com/encori/panGeneDiffExp.php del proyecto ENCORI en tumores primarios de adenocarcinoma de colon (n = 471) frente a muestras de control (n = 41) (Fig. 1D) del lncRNA LUNAR1 y (Fig. 1E) la expresión diferencial del gen IGF1R.
Datos demográficos y clínicos de la cohorte de pacientes con CRC (n = 70) subclasificados según las etapas del CRC (Tabla 3)
La etapa tardía del CRC (III-IV) se asoció notablemente con niveles más altos de recuento de plaquetas, con una mediana (RIC) (percentil 25 a percentil 75) de 371,0 (299,0–450,0) en comparación con 302,0 (220,0–377,0) en la etapa temprana del CRC (I–II) (P = 0,0281). La PLR también se elevó notablemente en los pacientes con CRC en etapa tardía (III-IV), con una mediana de 152,0 (133,5–186,3) en contraste con 116,8 (94,08–161,6) en los pacientes con CRC en etapa temprana (I–II) (P = 0,0032). Se detectó significativamente un TP prolongado (> 14 s) en el grupo de CRC (P = 0,024).
Datos patológicos del grupo de pacientes con CRC
Según los hallazgos de la colonoscopia y la radiografía, los sitios más comunes de CRC fueron, respectivamente, el colon en 45 (64,29%), el recto en 19 (27,14%) y el rectosigmoide en 6 (8,57%) de los pacientes. Los pacientes con CRC incluidos se dividieron en dos etapas, donde 47 (67,14%) de los pacientes se encontraban en una etapa temprana (I-II). Mientras que 23 (32,86%) de los pacientes se encontraban en una etapa tardía (III-IV). La diferenciación tumoral más común fue la diferenciación moderada, que se informó en 42 (60%) de los pacientes con CRC.
Patrón de expresión de los lncRNAs investigados en la cohorte de pacientes egipcios con CRC (n = 70) (Fig. 1)
Como se muestra en la Fig. 1A, los datos de qRT-PCR revelaron que los niveles de expresión sérica del lncRNA SNHG3 en los pacientes con CRC fueron de 7,187 (3,940-9,596) y de 1,035 (0,6406-1,149) en los controles, lo que fue significativamente mayor en el grupo de pacientes con CRC (P < 0,0001). Esto coincide con el resultado de la búsqueda en la base de datos in silico a través del análisis de expresión diferencial de genes en todo el páncreas del proyecto ENCORI, que muestra los resultados de los diagramas de caja de los adenocarcinomas de colon (Fig. 1B) https://rnasysu.com/encori/panGeneDiffExp.php (Acceso revisado en junio de 2023), que fueron más altos en el grupo de casos tumorales en comparación con el grupo de control.
Como se muestra en la Fig. 1C, de manera similar, el nivel de expresión sérica del lncRNA LUNAR1 también aumentó notablemente en los pacientes con CRC, con una mediana de 3,945 (1,668-5,677) en comparación con una mediana de 0,7785 (0,500-1,206) en los participantes sanos (P < 0,0001).
El análisis de expresión diferencial en todo el páncreas (Acceso y revisión en junio de 2023) https://rnasysu.com/encori/panGeneDiffExp.php del proyecto ENCORI en tumores primarios de adenocarcinoma de colon (n = 471) frente a muestras de control (n = 41) (Fig. 1D) del lncRNA LUNAR1 y (Fig. 1E) la expresión diferencial del gen IGF1R.
Datos demográficos y clínicos de la cohorte de pacientes con CRC (n = 70) subclasificados según las etapas del CRC (Tabla 3)
La etapa tardía del CRC (III-IV) se asoció notablemente con niveles más altos de recuento de plaquetas, con una mediana (RIC) (percentil 25 a percentil 75) de 371,0 (299,0–450,0) en comparación con 302,0 (220,0–377,0) en la etapa temprana del CRC (I–II) (P = 0,0281). La PLR también se elevó notablemente en los pacientes con CRC en etapa tardía (III-IV), con una mediana de 152,0 (133,5–186,3) en contraste con 116,8 (94,08–161,6) en los pacientes con CRC en etapa temprana (I–II) (P = 0,0032). Se detectó significativamente un TP prolongado (> 14 s) en el grupo de CRC (P = 0,024).
Datos patológicos del grupo de pacientes con CRC
Según los hallazgos de la colonoscopia y la radiografía, los sitios más comunes de CRC fueron, respectivamente, el colon en 45 (64,29%), el recto en 19 (27,14%) y el rectosigmoide en 6 (8,57%) de los pacientes. Los pacientes con CRC incluidos se dividieron en dos etapas, donde 47 (67,14%) de los pacientes se encontraban en una etapa temprana (I-II). Mientras que 23 (32,86%) de los pacientes se encontraban en una etapa tardía (III-IV). La diferenciación tumoral más común fue la diferenciación moderada, que se informó en 42 (60%) de los pacientes con CRC.
Patrón de expresión de los lncRNAs investigados en la cohorte de pacientes egipcios con CRC (n = 70) (Fig. 1)
Como se muestra en la Fig. 1A, los datos de qRT-PCR revelaron que los niveles de expresión sérica del lncRNA SNHG3 en los pacientes con CRC fueron de 7,187 (3,940-9,596) y de 1,035 (0,6406-1,149) en los controles, lo que fue significativamente mayor en el grupo de pacientes con CRC (P < 0,0001). Esto coincide con el resultado de la búsqueda en la base de datos in silico a través del análisis de expresión diferencial de genes en todo el páncreas del proyecto ENCORI, que muestra los resultados de los diagramas de caja de los adenocarcinomas de colon (Fig. 1B) https://rnasysu.com/encori/panGeneDiffExp.php (Acceso revisado en junio de 2023), que fueron más altos en el grupo de casos tumorales en comparación con el grupo de control.
Como se muestra en la Fig. 1C, de manera similar, el nivel de expresión sérica del lncRNA LUNAR1 también aumentó notablemente en los pacientes con CRC, con una mediana de 3,945 (1,668-5,677) en comparación con una mediana de 0,7785 (0,500-1,206) en los participantes sanos (P < 0,0001).
El análisis de expresión diferencial en todo el páncreas (Acceso y revisión en junio de 2023) https://rnasysu.com/encori/
Para determinar la relación entre el cambio en la expresión de los lncRNAs SNHG3 y LUNAR1 en la cohorte de pacientes con CRC (n = 70), se utilizó el coeficiente de correlación de Spearman r. Además, se reveló una correlación lineal positiva considerable entre el cambio en la expresión de SNHG3 y los marcadores tumorales clásicos, CEA (r = 0.3584) (P = 0.0023) y CA19.9 (r = 0.2482) (P = 0.0383). Además, se demostró que el cambio en la expresión del lncRNA LUNAR1 se correlaciona positivamente con CEA (r = 0.3734) (P = 0.0015). Por otro lado, el cambio en la expresión de LUNAR1 no se correlacionó linealmente de manera significativa con CA19.9.
En la Fig. 4A, se demostró una correlación positiva sustancial entre el cambio en la expresión de los lncRNAs SNHG3 y LUNAR1 (r = 0.4615) (P < 0.0001), lo cual concuerda con la Fig. 4B, análisis in silico de coexpresión pan-cáncer https://rnasysu.com/encori/panGeneCoExp.php, nuevamente, en 471 muestras de CRC del proyecto ENCORI.
Análisis de regresión múltiple para determinar los factores predictivos del aumento en la expresión de los lncRNAs SNHG3 y LUNAR1 (Tabla 7)
El análisis de regresión múltiple mostró que, en línea con el diseño de un estudio de casos y controles, no hay influencia del género y la edad en ninguno de los lncRNAs. El tamaño del tumor, la presencia de invasión vascular y la expresión de LUNAR1 fueron factores independientes para la expresión de SNHG3, con un coeficiente beta estandarizado de 0.346 (P = 0.004), 0.352 (P = 0.009) y 0.279 (P = 0.009), respectivamente. Mientras que, se demostró que la expresión de SNHG3 es la única variable independiente para la expresión de LUNAR1, con un coeficiente beta estandarizado de 0.410 (P = 0.009).
Utilidad discriminativa de los lncRNAs investigados para pacientes con CRC (Tabla 8)
Se evaluó la utilidad potencial de los lncRNAs moleculares estudiados en comparación con los marcadores tumorales CEA y CA19-9, utilizando el análisis de la curva ROC con niveles de corte establecidos para cada biomarcador. Los mejores niveles de corte que identificaron a los pacientes con CRC de los controles fueron aquellos que proporcionaron una especificidad (SP) del 96.15% y una sensibilidad (SN) del 92.86% para el lncRNA SNHG3, con un AUC de 0.967 (P < 0.0001), y proporcionaron una SN del 80% y una SP del 92.31% para LUNAR1, con un AUC de 0.891 (P < 0.0001). Para los marcadores tumorales convencionales de CRC, CEA y CA19.9, las SN fueron del 47.14% y del 40%, respectivamente; sin embargo, las SP fueron del 84.62% y del 65.38%, respectivamente, como se muestra en la Tabla 8 y en las Fig. 5A–D para los marcadores individuales.
La combinación de la expresión de LUNAR1 con la expresión de SNHG3 arrojó una mejor SN del 95.71% y una SP del 96.15% que las obtenidas para cada lncRNA por separado. Cuando los marcadores tumorales clásicos CEA y CA19-9 se combinan con los lncRNAs como indicadores para los casos de CRC, se obtuvieron valores de AUC, SP y SN mejorados (Tabla 8). Este hallazgo apunta a la importancia de medir la expresión de los lncRNAs SNHG3 y LUNAR1 para el seguimiento de la recurrencia del CRC y el seguimiento posterior a la cirugía.
El LR negativo se ilustra en la Tabla 9, donde un valor de 0 a 1 denota la presencia de la enfermedad. A medida que la enfermedad se vuelve más probable, los valores de LR negativo tienen más probabilidades de disminuir, acercándose a cero, lo que indica una mayor SN del marcador. Esto revela que el lncRNA SNHG3 tuvo las mayores SN y SP calculadas, seguidas por el lncRNA LUNAR1, CEA y luego CA19-9. Esto se estableció de acuerdo con la relevancia del AUC obtenido de la curva ROC y el valor de corte óptimo obtenido para cada biomarcador, confirmando los resultados obtenidos en la Tabla 8.
Análisis de enriquecimiento funcional in silico (accedido el 31 de agosto de 2023)
Utilizando KEGG
Para analizar el enriquecimiento funcional de los genes, enfermedades, redes, fármacos y vías relacionados con la señalización de Notch, a través de la búsqueda en linkDB https://www.genome.jp/dbget-bin/get_linkdb -t+5+ko:K02599 KEGG ORTHOLOGY K02599, 2 fármacos de 1 base de datos KEGG DRUG, el objetivo es Notch, y son: Crenigacestat (hidrolasa) y Brontictuzumab (un anticuerpo monoclonal).
SNHG3 es el objetivo de tamoxifeno y sorafenib según LncRNA—LncRNAWiki – CNCB-NGDC https://ngdc.cncb.ac.cn/lncrnawiki/lncrna symbol=SNHG3, pero hasta ahora no se pudo recuperar ningún tratamiento farmacológico para LUNAR1 a través de las bases de datos, https://ngdc.cncb.ac.cn/lncrnawiki/lncrna symbol=LUNAR1.
Interacciones gen-gen, interacción de vías gen-proteína e interacción proteína-proteína (PPI)
Figura 6 de bases de datos seleccionadas y minería de texto que muestra los principales genes diana para la interacción de IGF1R (chr15:99,192,760–99,507,759) con el soporte de la base de datos de vías obtenida del proyecto UCSC Genome (Accedido en julio de 2023).
https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGeneGraph gene=IGF1R&supportLevel=pwy&hideIndirect=on&geneCount=25&geneCount=25&1=OK&geneAnnot=drugbank
Análisis in silico
Regiones genómicas y ubicación cromosómica y producto génico de SNHG3 y LUNAR1 (Tabla 1) obtenidos de HGNC; Comité de Nomenclatura Genética de la HUGO https://www.genenames.org/, NCBI; Centro Nacional de Información Biotecnológica https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ y Ensembl https://www.ensembl.org/index.html, bases de datos bioinformáticas (Accedido en enero de 2021 y revisado en julio de 2023).
Datos de los participantes (Tabla 2)
Datos demográficos y clínicos de los participantes
La Tabla 2 muestra la diferencia en los datos demográficos y clínicos entre el grupo de pacientes con CRC y el grupo de control, donde no se detectó ninguna diferencia estadística con respecto a la edad, el género y el IMC entre los dos grupos (estudio de casos y controles). Sin embargo, los pacientes con CRC presentaron niveles significativamente bajos de Hgb (≤ 11 g/dL) en comparación con el grupo de control (P < 0.0001). Además, el PLR también se elevó significativamente solo en el grupo de CRC (P = 0.0048). Se detectó un PT prolongado (> 14 s) de manera significativa en el grupo de CRC (P = 0.024).
Datos patológicos del grupo de pacientes con CRC
Según la colonoscopia y los hallazgos radiográficos, los sitios de CRC más comunes fueron, respectivamente, el colon en 45 (64.29%), el recto en 19 (27.14%) y el rectosigmoide en 6 (8.57%) de los pacientes. Los pacientes con CRC incluidos se dividieron en dos etapas, donde 47 (67.14%) de los pacientes se encontraban en una etapa temprana (I-II). Mientras que 23 (32.86%) de los pacientes se encontraban en una etapa tardía (III-IV). La diferenciación tumoral más común fue la diferenciación moderada, que se informó en 42 (60%) de los individuos con CRC.
Datos demográficos y clínicos de los participantes
La Tabla 2 muestra la diferencia en los datos demográficos y clínicos entre el grupo de pacientes con CRC y el grupo de control, donde no se detectó ninguna diferencia estadística con respecto a la edad, el género y el IMC entre los dos grupos (estudio de casos y controles). Sin embargo, los pacientes con CRC presentaron niveles significativamente bajos de Hgb (≤ 11 g/dL) en comparación con el grupo de control (P < 0.0001). Además, el PLR también se elevó significativamente solo en el grupo de CRC (P = 0.0048). Se detectó un PT prolongado (> 14 s) de manera significativa en el grupo de CRC (P = 0.024).
Datos patológicos del grupo de pacientes con CRC
Según la colonoscopia y los hallazgos radiográficos, los sitios de CRC más comunes fueron, respectivamente, el colon en 45 (64.29%), el recto en 19 (27.14%) y el rectosigmoide en 6 (8.57%) de los pacientes. Los pacientes con CRC incluidos se dividieron en dos etapas, donde 47 (67.14%) de los pacientes se encontraban en una etapa temprana (I-II). Mientras que 23 (32.86%) de los pacientes se encontraban en una etapa tardía (III-IV). La diferenciación tumoral más común fue la diferenciación moderada, que se informó en 42 (60%) de los individuos con CRC.
Patrón de expresión de los lncRNAs investigados en la cohorte de pacientes egipcios con CRC (n = 70) (Fig. 1)
Como se demuestra en la Fig. 1A, los datos de qRT-PCR revelaron que los niveles de expresión sérica del cambio en la expresión del lncRNA SNHG3 en los pacientes con CRC fueron de 7.187 (3.940-9.596) y de 1.035 (0.6406-1.149) en los controles, lo cual fue significativamente mayor en el grupo de pacientes con CRC (P < 0.0001). Esto concuerda con el resultado de la búsqueda en la base de datos in silico a través del análisis de expresión diferencial pan-cáncer de genes en muestras de adenocarcinoma de colon del proyecto ENCORI (Fig. 1B) https://rnasysu.com/encori/panGeneDiffExp.php (Acceso revisado en junio de 2023), que fue mayor en el grupo de casos tumorales en comparación con el grupo de control.
Como se presenta en la Fig. 1C, de manera similar, el nivel de expresión sérica del lncRNA LUNAR1 también aumentó significativamente en los pacientes con CRC, con una mediana de 3.945 (1.668-5.677) en comparación con los participantes sanos, con una mediana de 0.7785 (0.500-1.206) (P < 0.0001).
Análisis de expresión diferencial pan-cáncer (Accedido y revisado en junio de 2023) https://rnasysu.com/encori/panGeneDiffExp.php del proyecto ENCORI en tumores primarios de adenocarcinoma de colon (n = 471) frente a muestras de control (n = 41) (Fig. 1D) lncRNA LUNAR1 y (Fig. 1E) expresión diferencial del gen IGF1R.
Datos demográficos y clínicos de la cohorte de pacientes con CRC (n = 70) subclasificados según las etapas del CRC (Tabla 3)
El CRC en etapa tardía (III-IV) se asoció notablemente con niveles más altos de recuento de plaquetas, con una mediana (IQR) (percentil 25 a percentil 75) de 371.0 (299.0–450.0) en comparación con los de CRC en etapa temprana (I-II) 302.0 (220.0–377.0) (P = 0.0281). El PLR también se elevó significativamente en los individuos con CRC en etapa tardía (III-IV), con una mediana de 152.0 (133.5–186.3) en contraste con los de CRC en etapa temprana (I-II) 116.8 (94.08–161.6) (P = 0.0032). Se detectó un PT prolongado (> 14 s) de manera significativa en el grupo de CRC (P = 0.024).
Datos patológicos del grupo de pacientes con CRC
Según la colonoscopia y los hallazgos radiográficos, los sitios de CRC más comunes fueron, respectivamente, el colon en 45 (64.29%), el recto en 19 (27.14%) y el rectosigmoide en 6 (8.57%) de los pacientes. Los pacientes con CRC incluidos se dividieron en dos etapas, donde 47 (67.14%) de los pacientes se encontraban en una etapa temprana (I-II). Mientras que 23 (32.86%) de los pacientes se encontraban en una etapa tardía (III-IV). La diferenciación tumoral más común fue la diferenciación moderada, que se informó en 42 (60%) de los individuos con CRC.
Datos demográficos y clínicos de los participantes
La Tabla 2 muestra la diferencia en los datos demográficos y clínicos entre el grupo de pacientes con CRC y el grupo de control, donde no se detectó ninguna diferencia estadística con respecto a la edad, el género y el IMC entre los dos grupos (estudio de casos y controles). Sin embargo, los pacientes con CRC presentaron niveles significativamente bajos de Hgb (≤ 11 g/dL) en comparación con el grupo de control (P < 0.0001). Además, el PLR también se elevó significativamente solo en el grupo de CRC (P = 0.0048). Se detectó un PT prolongado (> 14 s) de manera significativa en el grupo de CRC (P = 0.024).
Datos patológicos del grupo de pacientes con CRC
Según la colonoscopia y los hallazgos radiográficos, los sitios de CRC más comunes fueron, respectivamente, el colon en 45 (64.29%), el recto en 19 (27.14%) y el rectosigmoide en 6 (8.57%) de los pacientes. Los pacientes con CRC incluidos se dividieron en dos etapas, donde 47 (67.14%) de los pacientes se encontraban en una etapa temprana (I-II). Mientras que 23 (32.86%) de los pacientes se encontraban en una etapa tardía (III-IV). La diferenciación tumoral más común fue la diferenciación moderada, que se informó en 42 (60%) de los individuos con CRC.
Patrón de expresión de los lncRNAs investigados en la cohorte de pacientes egipcios con CRC (n = 70) (Fig. 1)
Como se demuestra en la Fig. 1A, los datos de qRT-PCR revelaron que los niveles de expresión sérica del cambio en la expresión del lncRNA SNHG3 en los pacientes con CRC fueron de 7.187 (3.940-9.596) y de 1.035 (0.6406-1.149) en los controles, lo cual fue significativamente mayor en el grupo de pacientes con CRC (P < 0.0001). Esto concuerda con el resultado de la búsqueda en la base de datos in silico a través del análisis de expresión diferencial pan-cáncer de genes en muestras de adenocarcinoma de colon del proyecto ENCORI (Fig. 1B) https://rnasysu.com/encori/panGeneDiffExp.php (Acceso revisado en junio de 2023), que fue mayor en el grupo de casos tumorales en comparación con el grupo de control.
Como se presenta en la Fig. 1C, de manera similar, el nivel de expresión sérica del lncRNA LUNAR1 también aumentó significativamente en los pacientes con CRC, con una mediana de 3.945 (1.668-5.677) en comparación con los participantes sanos, con una mediana de 0.7785 (0.500-1.206) (P < 0.0001).
Análisis de expresión diferencial pan-cáncer (Accedido y revisado en junio de 2023) https://rnasysu.com/encori/panGeneDiffExp.php del proyecto ENCORI en tumores primarios de adenocarcinoma de colon (n = 471) frente a muestras de control (n = 41) (Fig. 1D) lncRNA LUNAR1 y (Fig. 1E) expresión diferencial del gen IGF1R.
Datos demográficos y clínicos de la cohorte de pacientes con CRC (n = 70) subclasificados según las etapas del CRC (Tabla 3)
El CRC en etapa tardía (III-IV) se asoció notablemente con niveles más altos de recuento de plaquetas, con una mediana (IQR) (percentil 25 a percentil 75) de 371.0 (299.0–450.0) en comparación con los de CRC en etapa temprana (I-II) 302.0 (220.0–377.0) (P = 0.0281). El PLR también se elevó significativamente en los individuos con CRC en etapa tardía (III-IV), con una mediana de 152.0 (133.5–186.3) en contraste con los de CRC en etapa temprana (I-II) 116.8 (94.08–161.6) (P = 0.0032). Se detectó un PT prolongado (> 14 s) de manera significativa en el grupo de CRC (P = 0.024).
Datos patológicos del grupo de pacientes con CRC
Según la colonoscopia y los hallazgos radiográficos, los sitios de CRC más comunes fueron, respectivamente, el colon en 45 (64.29%), el recto en 19 (27.14%) y el rectosigmoide en 6 (8.57%) de los pacientes. Los pacientes con CRC incluidos se dividieron en dos etapas, donde 47 (67.14%) de los pacientes se encontraban en una etapa temprana (I-II). Mientras que 23 (32.86%) de los pacientes se encontraban en una etapa tardía (III-IV). La diferenciación tumoral más común fue la diferenciación moderada, que se informó en 42 (60%) de los individuos con CRC.
Un aumento en el nivel de expresión de SNHG3 se relacionó significativamente con un mayor tamaño tumoral (>5 cm), con una mediana de 8,938 (6,964–11,39) en comparación con 5,242 (2,888–8,282) en tumores más pequeños (≤5 cm) (P < 0,0001). Además, una mayor profundidad de invasión tumoral (T3, T4) se asoció sustancialmente con una mayor expresión de SNHG3, con una mediana de 8,518 (5,512–11,24) en comparación con 5,521 (3,109–7,710) en tumores con una profundidad de invasión T1 o T2 (P = 0,0046). Además, una alta expresión de SNHG3 se reveló como un factor fuertemente relacionado con la presencia de invasión vascular tumoral, con un cambio de pliegue medio de 8,938 (6,063–12,91) en contraste con 6,453 (3,182–8,938) en los CRC con invasión vascular tumoral negativa (P = 0,0015). Además, los pacientes con metástasis en ganglios linfáticos (LNM) mostraron un nivel de expresión significativamente mayor de SNHG3, con una mediana de 8,938 (5,696–11,79) en comparación con aquellos que no presentaban metástasis, con una mediana de 6,498 (3,182–8,815) (P = 0,0175).
LncRNA LUNAR1 (Fig. 3)
Los pacientes con CRC que presentaban un mayor tamaño tumoral (>5 cm) mostraron un nivel de expresión significativamente mayor de LUNAR1, con una mediana (intervalo intercuartílico) (percentil 25-percentil 75) de 4,774 (3,370–6,681) en comparación con aquellos con un tamaño tumoral más pequeño (≤5 cm), con una mediana de 2,868 (1,134–4,637) (P = 0,0033). Además, una mayor expresión de LUNAR1 se correlacionó sustancialmente con una mayor profundidad de invasión tumoral (T3, T4), con una mediana de 4,317 (2,196–6,681) en comparación con 3,140 (1,063–4,675) en tumores con una profundidad de invasión T1 o T2 (P = 0,0420).
Correlación de las lncRNA SNHG3, LUNAR1, CEA y CA19.9 con las características clinico-patológicas de los pacientes con CRC (n = 70) (Tabla 5)
Como se muestra en la Tabla 5, SNHG3 se correlacionó significativamente y positivamente con el tamaño tumoral (r = 0,5469) (P < 0,0001), LNM (coeficiente de correlación punto-biserial rpb = 0,26) (P = 0,03) e invasión vascular (rpb = 0,416) (P < 0,0001). Por otro lado, la expresión de LUNAR1 se encontró correlacionada positivamente con el tamaño tumoral (r = 0,2672) (P = 0,0253). El marcador tumoral clásico, CEA, se correlacionó positivamente con el recuento de plaquetas de los pacientes con CRC (r = 0,2841) (P = 0,0172), PLR (r = 0,2502) (P = 0,0367), tamaño tumoral (r = 0,3908) (P = 0,0008), metástasis en ganglios linfáticos (rpb = 0,282) (P = 0,018) y presencia de invasión vascular (rpb = 0,238) (P = 0,047). En contraste, CEA mostró una correlación negativa con ALT (UI/L) (r = -0,3232) (P = 0,0064). Mientras que CA19.9 solo mostró una correlación positiva con metástasis en ganglios linfáticos (rpb = 0,320) (P = 0,007) y presencia de invasión vascular (rpb = 0,278) (P = 0,02). Otras características demográficas y clinico-patológicas no fueron significativas (Tabla S1 complementaria) (edad, género, hemoglobina, linfocitos, AST, urea, creatinina, DM, localización tumoral, HTA, antecedentes familiares de CRC y colitis ulcerosa).
Coeficiente de correlación entre las lncRNA SNHG3 y LUNAR1 y los marcadores tumorales clásicos convencionales de CRC (CEA y CA19.9) (Tabla 6)
Con el fin de determinar la relación entre el cambio de pliegue en la expresión de las lncRNA SNHG3 y LUNAR1 en la cohorte de pacientes con CRC (n = 70), se utilizó el coeficiente de correlación de Spearman r. Además, se reveló una correlación lineal positiva considerable entre el cambio de pliegue en la expresión de SNHG3 y los marcadores tumorales clásicos, CEA (r = 0,3584) (P = 0,0023) y CA19.9 (r = 0,2482) (P = 0,0383). Además, el cambio de pliegue en la expresión de la lncRNA LUNAR1 mostró una correlación positiva con CEA (r = 0,3734) (P = 0,0015). Por otro lado, el cambio de pliegue en la expresión de LUNAR1 no se correlacionó significativamente de forma lineal con CA19.9.
En la Fig. 4A, se demostró una correlación positiva sustancial entre el cambio de pliegue en la expresión de las lncRNA SNHG3 y LUNAR1 (r = 0,4615) (P < 0,0001), lo cual concuerda con la Fig. 4B, análisis de coexpresión in silico Pan-Cancer, https://rnasysu.com/encori/panGeneCoExp.php, nuevamente, en 471 muestras de CRC, proyecto ENCORI.
Análisis de regresión múltiple para determinar los factores predictivos del aumento de la expresión de las lncRNA SNHG3 y LUNAR1 (Tabla 7)
El análisis de regresión múltiple mostró que, en línea con el diseño de un estudio de casos y controles, no hubo influencia del género y la edad en ninguna de las lncRNA. El tamaño tumoral, la presencia de invasión vascular y la expresión de LUNAR1 fueron factores independientes para la expresión de SNHG3, con un coeficiente beta estandarizado de 0,346 (P = 0,004), 0,352 (P = 0,009) y 0,279 (P = 0,009), respectivamente. Mientras que, se demostró que la expresión de SNHG3 fue la única variable independiente para la expresión de LUNAR1, con un coeficiente beta estandarizado de 0,410 (P = 0,009).
Utilidad discriminativa de las lncRNA investigadas para los pacientes con CRC (Tabla 8)
Se evaluó la utilidad potencial de las lncRNA moleculares estudiadas en comparación con los marcadores tumorales CEA y CA19.9, utilizando el análisis de la curva ROC con niveles de corte establecidos para cada biomarcador. Los mejores niveles de corte que identificaron a los pacientes con CRC de los controles fueron aquellos que proporcionaron una especificidad (SP) del 96,15% y una sensibilidad (SN) del 92,86% para la lncRNA SNHG3, con un AUC de 0,967 (P < 0,0001), y proporcionaron una SN del 80% y una SP del 92,31% para LUNAR1, con un AUC de 0,891 (P < 0,0001). Para los marcadores tumorales clásicos de CRC, CEA y CA19.9, las SN fueron del 47,14% y del 40%, respectivamente, sin embargo, la SP fue del 84,62% y del 65,38%, respectivamente, como se revela en la Tabla 8 y en la Fig. 5A-D para los marcadores individuales.
La combinación de la expresión de LUNAR1 con la expresión de SNHG3 produjo una mejor SN del 95,71% y una SP del 96,15% en comparación con cada lncRNA por separado. Cuando los marcadores tumorales clásicos CEA y CA19.9 se emparejan con las lncRNA como indicadores para los casos de CRC, se obtuvieron valores de AUC, SP y SN mejorados (Tabla 8). Este hallazgo apunta a la importancia de la medición de la expresión de las lncRNA SNHG3 y LUNAR1 para el seguimiento y control de la recurrencia del CRC después de la cirugía.
El índice de razón negativa (LR) se ilustra en la Tabla 9, donde un valor de 0 a 1 denota la presencia de la enfermedad. A medida que la enfermedad se vuelve más probable, los valores del índice de razón negativa tienen más probabilidades de disminuir, acercándose a cero, lo que indica una mayor SN del marcador. Esto revela que la lncRNA SNHG3 tuvo las mayores SN y SP calculadas, que fueron seguidas por la lncRNA LUNAR1, CEA y luego CA19.9. Esto se estableció de acuerdo con la relevancia del AUC obtenido de la curva ROC y el valor de corte óptimo obtenido para cada biomarcador, confirmando los resultados obtenidos en la Tabla 8.
Análisis de enriquecimiento funcional in silico (accedido el 31 de agosto de 2023)
Utilizando KEGG
Para analizar el enriquecimiento funcional de los genes, enfermedades, redes, fármacos y vías relacionados con la señalización de Notch, a través de la búsqueda en linkDB https://www.genome.jp/dbget-bin/get_linkdb -t+5+ko:K02599 KEGG ORTHOLOGY K02599, 2 fármacos de 1 base de datos KEGG DRUG target Notch, y son: Crenigacestat (hidrolasa) y Brontictuzumab (un anticuerpo monoclonal).
SNHG3 es el objetivo de tamoxifeno y sorafenib según LncRNA—LncRNAWiki –
CNCB-NGDC https://ngdc.cncb.ac.cn/lncrnawiki/lncrna symbol=SNHG3
pero no se pudo recuperar ningún tratamiento farmacológico para LUNAR1 a través de las bases de datos, hasta ahora,
https://ngdc.cncb.ac.cn/lncrnawiki/lncrna symbol=LUNAR1
Interacciones gen-gen, interacciones entre genes y proteínas y interacción proteína-proteína (PPI)
Figura 6 de bases de datos seleccionadas y minería de texto que muestra los principales genes diana para IGF1R (chr15:99,192,760–99,507,759) interacción con el soporte de la base de datos de vías obtenida del proyecto del genoma UCSC (Accedido en julio de 2023).
https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGeneGraph gene=IGF1R&supportLevel=pwy&hideIndirect=on&geneCount=25&geneCount=25&1=OK&geneAnnot=drugbank
Utilizando KEGG
Para analizar el enriquecimiento funcional de los genes, enfermedades, redes, fármacos y vías relacionados con la señalización de Notch, a través de la búsqueda en linkDB https://www.genome.jp/dbget-bin/get_linkdb -t+5+ko:K02599 KEGG ORTHOLOGY K02599, 2 fármacos de 1 base de datos KEGG DRUG target Notch, y son: Crenigacestat (hidrolasa) y Brontictuzumab (un anticuerpo monoclonal).
SNHG3 es el objetivo de tamoxifeno y sorafenib según LncRNA—LncRNAWiki –
CNCB-NGDC https://ngdc.cncb.ac.cn/lncrnawiki/lncrna symbol=SNHG3
pero no se pudo recuperar ningún tratamiento farmacológico para LUNAR1 a través de las bases de datos, hasta ahora,
https://ngdc.cncb.ac.cn/lncrnawiki/lncrna symbol=LUNAR1
Interacciones gen-gen, interacciones entre genes y proteínas y interacción proteína-proteína (PPI)
Figura 6 de bases de datos seleccionadas y minería de texto que muestra los principales genes diana para IGF1R (chr15:99,192,760–99,507,759) interacción con el soporte de la base de datos de vías obtenida del proyecto del genoma UCSC (Accedido en julio de 2023).
https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGeneGraph gene=IGF1R&supportLevel=pwy&hideIndirect=on&geneCount=25&geneCount=25&1=OK&geneAnnot=drugbank
Discusión
Se pensó que la vía de señalización de Notch tenía un papel controvertido en la evolución del CRC, ya sea manteniendo las células epiteliales intestinales sanas o estando involucrada en la transformación celular en células promotoras de tumores[51],[52]. Por lo tanto, decidimos evaluar el impacto de las lncRNA asociadas a Notch, SNHG3 y LUNAR1, en la sangre, como biomarcadores moleculares potenciales involucrados tanto en la patogénesis del CRC.
Fortalezas relacionadas con el estudio. Hasta donde sabemos, esta investigación es la primera en examinar tanto SNHG3 como LUNAR1 oncogenes en la sangre periférica de pacientes con CRC, como biopsia líquida, en relación con las características clinico-patológicas del tumor. Además, este es el primer estudio que muestra la correlación entre los niveles de expresión de las lncRNA SNHG3 y LUNAR1 en sangre, así como su importancia clínica como modelo combinado expresado, para el seguimiento del CRC. Los resultados obtenidos se validaron mediante análisis in silico/bioinformáticos.
Los estudios revelaron que varios cánceres sobreexpresan la lncRNA oncogénica SNHG3, donde Zhang L et al. mostraron que SNHG3 se mejoró significativamente en los tejidos y células de cáncer de ovario, acelerando la proliferación y migración de las células a través de la estimulación de Notch1[34]. Liu et al. señaló que SNHG3 se expresó persistentemente en las muestras de suero y tejido de pacientes con cáncer de ovario, estando relacionado con LNM y un alto grado histológico[38]. Otro estudio de Ma et al. ilustró una mayor expresión de SNHG3 en los tejidos de cáncer de mama, relacionada con la agresividad tumoral, el grado histológico avanzado, el estadio TNM, LNM, el receptor de estrógeno y Her-2, todos asociados con la sobreexpresión de la lncRNA SNHG3[53]. Huang et al. reveló una mayor expresión de SNHG3 en los tejidos de CRC, relacionada con el mal pronóstico de los pacientes. Además, demostraron que SNHG3 puede funcionar como una ceRNA en CRC, mejorando la progresión del CRC a través de la regulación del eje miR-182-5p/Myc[35].
La lncRNA relacionada con NOTCH, LUNAR1, también ejerce un papel tumorigénico en el cáncer. Peng y Feng concluyeron que la expresión de LUNAR1 aumentó en los tejidos y células de linfoma difuso de células B grandes (LDCB) y que su mayor nivel se relacionó con un estadio tumoral avanzado y un mal resultado de los pacientes[36]. Nashwa et al. también señaló que los niveles de expresión de LUNAR1 y Notch 1 se regularon al alza en la leucemia linfoblástica aguda de células T pediátrica, estando relacionados con la infiltración de ganglios linfáticos, la presencia de enfermedad residual mínima y una mala respuesta clínica con un resultado desfavorable[54]. Además, Riahi et al. determinó que la sobreexpresión de LUNAR1 en los tejidos de cáncer de cuello uterino se asoció con la profundidad de invasión tumoral y LNM[55]. Finalmente, la expresión de la lncRNA LUNAR1 aumentó en los tejidos y células de CRC, estimulando la progresión del CRC a través de la modulación de la vía miR 495 3p/MYCBP[56].
Cabe mencionar que se han realizado pocos estudios para explorar la expresión de las lncRNA SNHG3 o LUNAR1 circulantes en la sangre periférica en pacientes con CRC y su relación con la presentación clínica y patológica de la enfermedad. Además, la posible participación o interacción de SNHG3 y LUNAR1, como mediadores de la señalización de Notch, durante el desarrollo o la progresión del CRC, justifica más investigación. Por lo tanto, se llevó a cabo el presente estudio para explorar sus niveles de expresión en la cohorte de pacientes egipcios con CRC, así como para establecer sus niveles de expresión de referencia, en comparación con los niveles de sujetos de control aparentemente sanos.
En nuestro estudio, los resultados revelaron que el nivel de expresión del lncRNA SNHG3 era considerablemente más alto en la sangre de pacientes con CRC que en los controles sanos. En concordancia con los estudios previos mencionados, un aumento en la expresión de SNHG3 se correlacionó estrechamente con un peor perfil clinico-patológico de nuestros pacientes con CRC. Zhang Y et al. mostraron que un aumento en el cambio de expresión de SNHG3 en los tejidos de pacientes con CRC se asoció con un estadio maligno avanzado, metástasis ganglionares positivas y una peor supervivencia general [57]. De manera similar, nuestro estudio demostró que el cambio de expresión del lncRNA SNHG3 en sangre se asoció significativamente con estadios avanzados de CRC (III, IV) y peores características clinico-patológicas de CRC; por lo tanto, SNHG3 podría utilizarse para distinguir a los pacientes con CRC en estadio avanzado de aquellos en estadio temprano, para la estratificación o subclasificación de pacientes para un seguimiento y monitorización posterior de la enfermedad y para diferentes opciones de tratamiento (utilizando ncRNAs para la medicina de precisión).
Estudios previos han demostrado una correlación positiva entre la sobreexpresión del lncRNA SNHG3 y el tamaño del tumor, las metástasis ganglionares, el estadio tumoral, la trombosis tumoral de la vena porta, la metástasis a distancia y la recurrencia en los tejidos de carcinoma hepatocelular en comparación con los tejidos normales [58], [59]. En línea con estos hallazgos, el aumento de la expresión del lncRNA SNHG3 se correlacionó con un mayor tamaño tumoral, una invasión tumoral más profunda (T3-T4), una invasión vascular positiva, así como metástasis ganglionares en la cohorte de pacientes con CRC examinada, lo que se comprobó aún más mediante los resultados del análisis de regresión múltiple, siendo estas variables dependientes. Sin embargo, no hubo una correlación significativa entre la expresión elevada de SNHG3 y la diferenciación tumoral, los tumores mucinosos o la presencia del signo histológico característico de células en anillo de sello.
De igual manera, identificamos que el nivel de expresión del lncRNA LUNAR1 estaba aumentado en la sangre de pacientes con CRC en comparación con los controles sanos. Sin embargo, en nuestro estudio, LUNAR1 no mostró diferencias en la expresión entre los estadios tempranos y avanzados de CRC. Zhang Z et al. mostraron que un aumento en el nivel de expresión de LUNAR1 en los tejidos de CRC como resultado de la estimulación de la cascada de Notch1 se asoció significativamente con el estado de diferenciación del CRC, la profundidad de la invasión tumoral y las metástasis ganglionares, pero no hubo una asociación sustancial entre LUNAR1 y el tamaño tumoral o las metástasis a distancia del CRC [37]. De manera comparable, en el presente estudio, el aumento de los niveles de expresión de LUNAR1 se asoció con una mayor profundidad de invasión tumoral, como se observa en T3-T4.
Posteriormente, con el fin de evaluar la utilidad de estos dos lncRNAs, se calcularon las curvas ROC. Previamente, SNHG3 sirvió potencialmente como un marcador molecular diagnóstico en el cáncer de ovario con un AUC altamente significativo [38]. Además, una revisión sistemática y un metaanálisis publicados afirmaron que SNHG3 serviría como un biomarcador molecular diagnóstico en diferentes tipos de cáncer [60]. Además, en DLBCL [36] y en el cáncer de cuello uterino [55], LUNAR1 sirvió como un posible marcador de detección, lo que se confirma en nuestro estudio, si la expresión de LUNAR1 se combina con CEA o SNHG3, ya que SNHG3 + LUNAR1 como modelo combinado tienen un mejor AUC, SN y SP que CEA y/o CA19.9. Además, el análisis de la curva ROC demostró que la integración de CEA y CA19.9 con estos lncRNAs produce un AUC, SN y SP mejores que los de CEA y/o CA19.9 solos. Estos hallazgos implican que SNHG3 y LUNAR1 tienen una capacidad significativamente mayor para identificar CRC que los biomarcadores tradicionales actuales, pero mejoran su rendimiento y positividad para el seguimiento de la progresión de la enfermedad, en los casos de biomarcadores tradicionales falsos negativos con casos de CRC probados por imagen, y finalmente, sientan las bases para el tratamiento de precisión.
La correlación positiva entre las expresiones de SNHG3 y LUNAR1 en la sangre de pacientes con CRC es un activo en el presente estudio, lo que coincide con el resultado de la búsqueda in silico, con sus niveles de expresión influyendo entre sí a través del tamaño tumoral y la invasión vascular como variables independientes.
Utilizando los lncRNAs SNHG3 y LUNAR1 relacionados con Notch, como posibles indicadores moleculares de la enfermedad basados en sangre periférica, útiles para la evaluación del riesgo de CRC y la subclasificación de pacientes con CRC para un mejor pronóstico y/o un seguimiento preciso de la enfermedad, un paso hacia la medicina de precisión basada en ncRNAs.
Recomendación. Para analizar los mecanismos precisos que involucran a los lncRNAs SNHG3 y LUNAR1 en relación con los posibles reguladores de la señalización de Notch en los tejidos de CRC, se extraerán datos mediante la predicción del análisis in silico, donde se medirán los niveles de expresión de las proteínas y genes IGF1R, IRS, EGF y NOTCH 1, según las interacciones de STRING, PathCards y las bases de datos bioinformáticas GenesLikeMe.
https://string-db.org/cgi/network taskId=bZ7mNRqKITtS&sessionId=bb3mRWhtNINO&forwardtonewtaskIdifnecessary=1&limit=0&additionalnetworknodes=0 y https://pathcards.genecards.org/Card/notchsignaling_pathways queryString=notch1
Y https://glm.genecards.org/#results
Mediante la identificación del análisis de enriquecimiento funcional in silico de los genes, enfermedades, redes, fármacos y vías relacionados con la señalización de Notch, se identificaron el fármaco hidrolasa Crenigacestat y el anticuerpo monoclonal Brontictuzumab como medicamentos NOTCH, así como tamoxifeno y sorafenib para atacar SNHG3, pero no se recuperó ningún tratamiento farmacológico para LUNAR1. Dado que LUNAR1 integra la actividad funcional de IGF1R, por lo tanto, atacar IGF1R sería beneficioso contra LUNAR1. La búsqueda in silico de STRING identificó carvedilol, gliclazida, dalteparina, minociclina, ácido acetilsalicílico, isoprenalina, cafeína, dasatinib, bosutinib y ponatinib como tratamientos indirectos.
En segundo lugar, identificación de los mediadores o citocinas proinflamatorias o antiinflamatorias (sistema de granzima, perforina y serpinB9) o el estado oxidativo, así como los niveles de adipocinas o adipocitoquímicos y/o su polimorfismo en relación con LUNAR1 y SNHG3 en el entorno clínico en la cohorte de pacientes con CRC con o sin DM o ECV.
Conclusiones
Nuestros hallazgos señalaron que los niveles de expresión del cambio de los lncRNAs SNHG3 y LUNAR1 relacionados con NOTCH en la sangre eran considerablemente más altos en los pacientes con CRC y exhibieron una utilidad clínica considerable para la vigilancia dinámica del CRC. Ambos lncRNAs podrían constituir biomarcadores biomoleculares no invasivos potenciales para la evaluación del riesgo de CRC y/o el seguimiento de la progresión de la enfermedad.
Dado que se correlacionan con peores características clínicas del paciente, SNHG3 y LUNAR1 podrían constituir posibles objetivos o candidatos para una futura validación, a menos que se incluyan ensayos funcionales, después de identificar sus proteínas o genes diana para bloquear, como se sugiere mediante el análisis bioinformático (limitación pendiente de verificación experimental).
Se instiga una perspectiva de sostenibilidad sobre la investigación en curso que aborda el papel de SNHG3 o LUNAR1 o su modelo combinado en una cohorte independiente, y en muestras de tejido normal y canceroso, con muestras de sangre, para una mayor validación. Las limitaciones a reconocer son un diseño de un solo centro y la falta de ensayos funcionales (recomendación futura) y la comparación de los niveles de expresión de SNHG3 y LUNAR1 según la respuesta al tratamiento en pacientes con CRC. Donde, los cambios en la expresión de estos lncRNAs durante la quimioterapia de inducción y la quimioterapia paliativa aumentarían los hallazgos del presente estudio.
Información complementaria
A continuación, se muestra el enlace al material complementario electrónico.
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