La barrera cromatínica adaptativa dependiente de EZH1-H3K27me1 limita la respuesta a los inhibidores de DNMT en el cáncer colorrectal

La hipermetilación focal del ADN en las islas CpG de los promotores, junto con la hipometilación global del ADN, son características distintivas de casi todos los cánceres (^[1]). La hipermetilación del ADN en sí misma silencia los genes supresores de tumores y otros loci implicados en casi todos los aspectos característicos del cáncer (^[2]). De manera similar, el patrón anormal de las modificaciones postraduccionales de las histonas (PTM) desregula los perfiles transcripcionales que contribuyen a la oncogénesis (^[1],^[2]). A pesar de la prevalencia de estos patrones epigenéticos anormales, existen pocos fármacos que se dirijan a la metilación del ADN o a las PTM de las histonas con éxito demostrado en los pacientes. Estos fármacos incluyen los análogos de nucleósidos azacitidina (AZA) y decitabina (DAC o 5-aza-2-desoxicitidina), que son inhibidores pan de las ADN metiltransferasas (DNMT) 1, 3A y 3B que revierten la hipermetilación del ADN. Tanto AZA como DAC cuentan con la aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para su uso en neoplasias hematológicas y cánceres (^[3]-^[5]). Para dirigirse a las PTM de las histonas anormales, varios inhibidores de la histona desacetilasa han recibido la aprobación de la FDA para tumores líquidos (^[6],^[7]). Para los tumores sólidos, el inhibidor de la metiltransferasa EZH2, tazemetostat (TAZ o EPZ6438), que bloquea la metilación de la histona 3 lisina 27 (H3K27), ha obtenido la designación de fármaco de primera clase, tanto como inhibidor de la histona/lisina metiltransferasa aprobado por la FDA como terapia epigenética en tumores sólidos raros (^[8],^[9]).

La exposición limitada a los fármacos, junto con las tasas de replicación reducidas en los tumores sólidos en comparación con los cánceres hematológicos, puede explicar los éxitos limitados de la terapia epigenética en este contexto. Esto presenta un obstáculo particular para los análogos de nucleósidos DNMTi que requieren la replicación del ADN para su incorporación, pero tienen una vida media in vivo corta, junto con daños y toxicidad del ADN dependientes de la dosis (^[10],^[11]). El ASTX727 (INQOVI), recientemente aprobado por la FDA y disponible por vía oral, ha sido diseñado para superar esta vida media corta y aumentar la exposición tumoral. Esta formulación combina DAC y el inhibidor de la citidina deaminasa, cedazuridina, que bloquea la principal vía de eliminación in vivo de DAC (^[12]). Además, los intentos de evitar la citotoxicidad asociada con la incorporación del ADN han dado como resultado el desarrollo de los inhibidores no nucleosídicos, no covalentes y específicos de DNMT1, GSK3484862 y GSK3685032 (^[13],^[14]). La aparición de estas nuevas formulaciones de DNMTi presenta nuevas oportunidades para identificar mecanismos que podrían mejorar la eficacia de los DNMTi en los tumores sólidos.

La plasticidad del epigenoma y la interacción entre la metilación del ADN y las PTM de las histonas representan una oportunidad para aumentar la terapia con DNMTi. Hemos demostrado, junto con otros investigadores, que la hipometilación del ADN puede remodelar el epigenoma del cáncer y alterar el patrón de las PTM de las histonas. En particular, la hipometilación del genoma promueve capas compensatorias de la H3K27me3 represiva, junto con la interacción entre H3K9me3 y H3K18ub, que refuerzan el silenciamiento de genes y elementos transponibles (TE) en muchos tipos de cáncer (^[15]-^[18]). En conjunto, esto sugiere que las células cancerosas remodelan el epigenoma como un mecanismo de supervivencia, y esta plasticidad puede ser el objetivo/crear una vulnerabilidad del cáncer para diseñar nuevos tratamientos combinados con DNMTi.

Para identificar los objetivos que pueden aumentar la reversión del silenciamiento de genes inducida por DNMTi en las células de cáncer de colon, realizamos tanto un cribado genético a nivel del genoma con siRNA como un cribado farmacológico exhaustivo de antagonistas del Complejo Represor Polícromico 2 (PRC2), que cataliza los tres estados de metilación de H3K27. Descubrimos que la inhibición genética de SUZ12, que mantiene la integridad de PRC2, o la inhibición química tanto de EZH2 como de EZH1, los subunidades catalíticas intercambiables de PRC2, mejora la activación transcripcional después de DNMTi, en mayor medida que la pérdida o inhibición específica de EZH2. La inhibición dual de EZH1/2 reduce los tres estados de metilación de H3K27, incluida la deposición de H3K27me1 mediada por EZH1. La pérdida de H3K27me1 y la ganancia de H3K27ac en los potenciadores y regiones reguladoras respaldan la activación génica dependiente de p300 cuando se combina con la hipometilación del ADN, mientras que la pérdida de H3K27me1 y la metilación del ADN en los cuerpos de los genes se asocia con la regulación a la baja de los programas transcripcionales oncogénicos que impulsan el crecimiento celular. En consecuencia, las células de cáncer de colon con altos niveles de EZH1 responden de manera diferente a los inhibidores duales de EZH1/2 y a los inhibidores selectivos de EZH2 cuando se combinan con DNMTi. En conjunto, este estudio revela nuevos hallazgos sobre el papel de la deposición de H3K27me1 mediada por EZH1 en el mantenimiento del silenciamiento de genes, al tiempo que proporciona una base para terapias epigenéticas combinadas eficaces en el cáncer de colon.

Resultados

La subunidad PRC2 SUZ12 ayuda a reprimir el gen supresor de tumores silenciado por la metilación del ADN

Para identificar los genes que ayudan a mantener el silenciamiento de los genes después de la hipometilación del ADN, realizamos un cribado genético de siRNA a nivel del genoma utilizando un sistema de reportero de células de cáncer de colon HCT116 previamente descrito para el gen supresor de tumores SFRP1 (Figura 1A) (^[15]). La hipermetilación de la isla CpG del promotor, flanqueada por H3K27me3, silencia fuertemente SFRP1; la actividad de la nanoluciferasa (NLuc) del casete NLuc insertado aguas abajo del promotor endógeno informa sobre la reversión del silenciamiento de SFRP1, ya sea a través de la hipometilación del ADN y el bloqueo de la deposición de H3K27me3 o mediante otro mecanismo (Figura 1A). Esta línea celular de reportero está diseñada en un derivado hipomórfico de DNMT1 de HCT116 que reduce la metilación global del ADN en aproximadamente un 20%, incluido el SFRP1, para aumentar la susceptibilidad al cribado de alto rendimiento sin la adición de DNMTi (^[19]).

Utilizando esta línea celular de reportero, transfectamos individualmente grupos de siRNA contra aproximadamente 18.000 genes durante siete días, un período de tiempo optimizado según nuestro informe anterior sobre el silenciamiento de DNMT1 que induce la actividad de NLuc en la línea celular de reportero NLuc (Figura 1A) (^[15]). Después de medir la actividad de NLuc para cada grupo de siRNA, normalizamos la señal de luminiscencia con una medida de la confluencia consistente con la viabilidad celular (Figura 1B y S1A). Se excluyeron los falsos positivos basados en la expresión génica en estado basal y el silenciamiento de los genes que inhiben la viabilidad celular en lugar de inducir la expresión de SFRP1 para aislar los efectos regulatorios en este locus silenciado (Figura S1B-C, Tabla S1). A partir de aquí, identificamos una lista limitada de genes diana cuyo silenciamiento contribuye a la reactivación de SFRP1, incluido DNMT1. El único otro factor epigenético identificado fue SUZ12, que codifica una subunidad de andamiaje indispensable para la actividad de PRC2 (Figura 1C). Nosotros y otros investigadores hemos informado previamente que la actividad de PRC2 compensa para reforzar el silenciamiento de los genes después de la inhibición de DNMT para mantener el silenciamiento de los genes en el cáncer, y esto puede superarse mediante el uso de inhibidores que se dirijan selectivamente a EZH2, la subunidad catalítica primaria de PRC2 (^[15]). Dado que el cribado sorprendentemente no identificó EZH2, comparamos SUZ12 con todos los genes representados en la biblioteca de siRNA y asociados con PRC2, el complejo represor policromático complementario 1 (PRC1) que contribuye a la compactación de la cromatina/represión génica y la maquinaria de metilación del ADN. De hecho, solo el silenciamiento de SUZ12 y DNMT1 reactivó de manera robusta SFRP1 (Figura 1D). La capacidad de la pérdida de SUZ12, pero no de EZH2, para inducir la expresión de SFRP1 y otros genes en un estado de ADN hipometilado se validó mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcriptasa inversa (qRT-PCR) en HCT116 de tipo salvaje tratadas con DAC a baja dosis (Figura 1E y S1D).

Hipótesis que, como una subunidad de andamiaje necesaria/indispensable para el PRC2 central, el silenciamiento de SUZ12 podría mostrar una mayor pérdida del producto de metilación de H3K27 más estudiado, la trimetilación de la histona 3 lisina 27 (H3K27me3), que el silenciamiento de EZH2. Sin embargo, tanto el silenciamiento de SUZ12 como el de EZH2, pero no el silenciamiento de la subunidad catalítica intercambiable EZH1, mostraron una eficacia similar en la reducción de H3K27me3 (Figura 1F). Esto indicó que los niveles de la H3K27me3 represiva no pueden explicar las diferencias entre SUZ12 y EZH2 en el mantenimiento del silenciamiento de los genes supresores de tumores después de la hipometilación del ADN.

La inhibición dual de EZH1 y EZH2 se dirige a los tres estados de metilación de H3K27 y mejora la activación transcripcional inducida por DNMTi

Dado que las medidas moleculares de la inhibición de H3K27me3 no pudieron explicar la insuficiencia del silenciamiento de EZH2 para reactivar los loci silenciados, realizamos un cribado farmacológico exhaustivo de los antagonistas de PRC2 para identificar las moléculas pequeñas que imitan el efecto transcripcional del silenciamiento de SUZ12. Este panel incluyó inhibidores SAM-competitivos experimentales y clínicamente aplicados de EZH2 y EZH1, disruptores de la interacción proteína-proteína (PPI) de la subunidad indispensable de PRC2, EED, y degradadores PROTAC de las subunidades de PRC2. Tres moléculas SAM-competitivas: tulmimetostat (TUL o CPI-0209), valemetostat (VAL o DS3201b) y mevrometostat (MEV o PF-1497), mostraron una eficacia superior en la reactivación del reportero SFRP1-NLuc solo o con la adición de DAC a baja dosis en comparación con otras moléculas SAM-competitivas (Figura 2A). Además, VAL, representativa de las moléculas SAM-competitivas de nivel superior, superó a todos los disruptores de PPI y a los degradadores PROTAC con o sin DAC a baja dosis (Figura 2B). Coherente con nuestros hallazgos anteriores, la eficacia de los inhibidores de PRC2 en este ensayo no se correlacionó con la toxicidad (Figura S2A-B) (^[15]). En particular, los inhibidores de PRC2 superiores tienen la aprobación clínica en Japón (VAL) o han avanzado al menos a ensayos clínicos de fase II en los Estados Unidos (TUL y MEV), lo que sugiere que comparten características que han contribuido a su avance clínico (^[20],^[21]).

Dado que PRC2 cataliza los tres estados de metilación de H3K27, preguntamos si la inhibición del objetivo fuera de H3K27me3 explica la capacidad de sinergizar con DAC. Mediante el análisis de Western blot, encontramos que la eficacia superior en la sinergia con DAC se correlaciona con la eficacia de los inhibidores de PRC2 en la reducción no solo de H3K27me3, sino también de H3K27me2 y H3K27me1, junto con el aumento de H3K27ac (Figura 2C y Figura S2C-D). De hecho, los niveles de H3K27me3 variaron entre los inhibidores de PRC2, pero las moléculas superiores (TUL, VAL y MEV) redujeron de manera robusta los tres estados de metilación, y esto fue particularmente distinto para H3K27me1.

Se informa que tanto VAL como TUL son inhibidores duales de EZH1/2 (^[22],^[23]). Nos preguntamos si MEV también actúa como un inhibidor dual y si esto diferencia a las moléculas eficaces de los otros inhibidores SAM-competitivos. Para probar esto, medimos la capacidad de seis moléculas representativas para inhibir la actividad de los complejos PRC2 que contienen EZH1 o EZH2 hacia los nucleosomas recombinantes en un ensayo de metiltransferasa in vitro. Coherente con nuestra hipótesis, TUL, VAL y MEV inhibieron fuertemente el PRC2 que contiene EZH2 de manera dependiente de la dosis y también fueron potentes inhibidores del PRC2 que contiene EZH1 (Figura 2D). TAZ, que informamos previamente que sinergiza con DAC (^[15]) y que mostró una eficacia intermedia en las células (Figura 2A-B), fue un inhibidor eficaz de los complejos PRC2 que contienen EZH2, pero no de EZH1 (Figura 2D). GSK126 y UNC1999, que tuvieron un rendimiento deficiente en las células, fueron débiles inhibidores de ambos tipos de complejos PRC2. Estos datos establecen una correlación entre la potencia dual contra EZH1 y EZH2 in vitro y la eficacia en la reactivación de los genes supresores de tumores y la inhibición de los tres estados de metilación de H3K27 en las células. En conjunto, estos resultados sugieren que EZH1 desempeña un papel importante, pero a menudo pasado por alto, en los estados de metilación de H3K27 y en la represión génica.

EZH1 contribuye al mantenimiento de la monometilación de H3K27 cuando se inhibe EZH2

Aunque otros también han demostrado recientemente la superioridad de los inhibidores duales de EZH1/2, como VAL, la contribución de EZH1 a los estados de metilación de H3K27 en el cáncer y el mecanismo subyacente a esta superioridad siguen sin estar claros (^[24],^[25]). Planteamos la hipótesis de que EZH1 deposita H3K27me1 cuando EZH2 está inhibido, lo que corresponde al papel que se le atribuye a EZH1 en la deposición de monometilación (^[26],^[27]). Para probar la contribución de EZH1 al estado de metilación de H3K27, seleccionamos RKO de un panel de líneas celulares de cáncer de colon, ya que presenta una alta expresión tanto de EZH1 como de EZH2 a nivel de proteínas (Figura 3A). Utilizando CRISPR/Cas9, dirigimos EZH1 y EZH2 para su eliminación (KO) y una región "desértica" del gen en el cromosoma 12 (Chr12) como control del ensayo CRISPR. Aislamos tres clones para cada gen diana CRISPR y validamos la pérdida de EZH1 o EZH2 (Figura 3B). A continuación, medimos la metilación y la acetilación globales de la lisina en las colas de las histonas mediante espectrometría de masas a partir de estos clones, como un enfoque cuantitativo e independiente de anticuerpos para identificar las contribuciones de cada metiltransferasa EZH a la metilación de H3K27 (Figura 3C y Figura S3A). La eliminación de EZH1 por sí sola no afectó a ninguno de los estados de metilación de H3K27. Sin embargo, la eliminación de EZH2 redujo significativamente los niveles de H3K27me2 y H3K27me3 en ambas variantes de histonas, H3.1 y H3.3, pero, sorprendentemente, mostró niveles aumentados de H3K27me1 en el péptido H3.1 y mantuvo H3K27me1 en el péptido H3.3. Cabe destacar que, si bien H3.1 está acoplado a la replicación, H3.3 es independiente de la replicación y se encuentra principalmente en genes activamente transcritos (^[28]-^[30]). Confirmamos estos resultados mediante inmunoblotaje con y sin la adición del inhibidor de la DNMT, DAC, lo que no produjo ningún cambio adicional (Figura 3D).

Para determinar si EZH1 es responsable del aumento de H3K27me1 en las líneas celulares con eliminación de EZH2, introdujimos un shRNA inducible con doxiciclina para EZH1. Esto conduce de forma rápida y robusta a la reducción de EZH1 y a la eliminación de EZH2 simultáneamente, al tiempo que se minimizan los defectos de proliferación celular que se producen con una eliminación dual. De hecho, la eliminación de EZH2 y la reducción de EZH1 simultáneamente redujeron el nivel de H3K27me1 tanto mediante inmunoblotaje como mediante espectrometría de masas de modificaciones postraduccionales de histonas (Figura 3E-F, S3B). Curiosamente, tanto la eliminación de EZH2 por sí sola como la eliminación de EZH2/reducción de EZH1 aumentaron la acetilación en H3K27, pero no la acetilación en otros sustratos de histonas (Figura 1G).

A continuación, investigamos si el inhibidor selectivo de EZH2, TAZ (Figura 2), reproduce el fenotipo de la eliminación de EZH2 y si el inhibidor dual de EZH1/2, VAL, reproduce el fenotipo de las células con eliminación dual de EZH2/reducción de EZH1. Estas moléculas tienen la aprobación de la FDA de EE. UU. y del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón, respectivamente, y ambas se utilizan activamente en la clínica. Como observamos con los clones con eliminación de EZH2, las células tratadas con TAZ presentaban niveles muy reducidos de H3K27me2 y H3K27me3, pero presentaban niveles aumentados de H3K27me1 (Figura 3H, Figura S3C). De manera similar, como vimos con la línea celular con eliminación de EZH2/shEZH1, observamos una reducción mucho mayor de las marcas H3K27me2 y H3K27me3 después del tratamiento con VAL, así como una disminución de H3K27me1 tanto en H3.1 como en H3.3. Estas tendencias también se repitieron cuando se combinaron TAZ o VAL con el inhibidor de la DNMT, DAC (Figura S3D). Tanto las manipulaciones genéticas con la eliminación de EZH2 mediante CRISPR y el shEZH1 como los tratamientos farmacológicos con TAZ o VAL aumentaron la abundancia del péptido H3K27ac, un objetivo de las histonas acetiltransferasas (HAT) p300/CBP, mientras que el otro objetivo conocido de la acetilación dependiente de p300/CBP, H3K18, y otras modificaciones postraduccionales de histonas acetiladas permanecieron sin cambios (Figura 3G, I y S3E), lo que indica una posible relación entre este aumento de la acetilación y la disminución de los niveles de metilación en H3K27 tras el tratamiento con TAZ o VAL.

Las distribuciones genómicas subyacentes de H3K27me3 y la metilación del ADN dan forma al patrón de H3K27me1 y a la respuesta al tratamiento con EZHi/DNMTi

Los datos de espectrometría de masas sugirieron que el cambio más característico en las modificaciones postraduccionales de histonas fue la disminución de H3K27me1 tras la pérdida de EZH1/2 o la inhibición dual de EZH1/2. Esto nos llevó a preguntarnos dónde se producen los cambios en H3K27me1 en el genoma. Dado el número limitado de estudios que analizan H3K27me1 en el cáncer, primero validamos los anticuerpos H3K27me1 antes de continuar con nuestro método cuantitativo de ChIP-seq, siQ-ChIP (^[31],^[32]), para responder a esta pregunta (Figura S4A). Utilizando nuestra matriz de péptidos de histonas, identificamos un anticuerpo H3K27me1 altamente específico de ActiveMotif (61015), cuyo isotérmico anticuerpo:cromatina indicó que las titulaciones de anticuerpos podían capturar la masa de cromatina de acuerdo con los perfiles de modificaciones postraduccionales de histonas obtenidos mediante espectrometría de masas tras los tratamientos con VAL o TAZ (Figura S4B). Es importante destacar que otros anticuerpos H3K27me1 (Invitrogen y Abclonal) mostraron una alta variación entre lotes y/o actividad fuera del objetivo contra modificaciones postraduccionales de alta abundancia, como H3K9me1 (Figura S4C-D). Utilizando nuestro anticuerpo validado, analizamos las distribuciones de H3K27me1 con resolución cuantitativa para establecer el patrón de referencia y la respuesta de esta modificación a los tratamientos con TAZ o VAL.

Coherente con los informes en células madre embrionarias de ratón y células madre hematopoyéticas humanas, las distribuciones de H3K27me1 en las células tratadas con vehículo (VEH) se enriquecieron principalmente en los cuerpos de los genes transcritos (Figura S5A) (^[33],^[34]). Utilizando nuestros datos de ChIP-seq previamente publicados y validados por anticuerpos para H3K27me3 (Figura S4E) y datos de secuenciación bisulfito del genoma completo (WGBS) disponibles públicamente para 5mC (^[16],^[35]), analizamos la distribución de referencia de estas marcas epigenéticas primarias, que son el objetivo de nuestra combinación de fármacos. En la línea de base, los perfiles enriquecidos de H3K27me1 se superponen con dominios altamente metilados en el ADN, donde H3K27me3 está notablemente ausente (Figura S5B), un patrón epigenético coherente con los cuerpos de los genes transcritos (Figura S5A) (^[33]).

A continuación, cuantificamos el cambio en la distribución de H3K27me1 a partir de estos patrones de referencia tras los tratamientos con TAZ o VAL. Tanto para los aumentos como para las disminuciones de H3K27me1 inducidos por los tratamientos con fármacos, observamos una alta densidad de picos relativamente cortos (~300-400 pb) y una cola de picos más amplios clasificados utilizando el modelado de mezclas gaussianas (Figura S5C). Coherente con la espectrometría de masas, siQ-ChIP mostró aumentos de la señal de H3K27me1 con el tratamiento con TAZ solo, que se producen principalmente en regiones represivas marcadas por la polycomb del genoma, mientras que VAL indujo aumentos mínimos de H3K27me1 (Figura 4A). Los estrechos aumentos de H3K27me1 asociados a TAZ también estaban presentes en los potenciadores bivalentes (EnhBiv), mientras que los picos amplios se localizaron adicionalmente en los promotores bivalentes (TssBiv). También identificamos regiones que mantuvieron H3K27me1 con el tratamiento con TAZ, pero que solo perdieron esta modificación con VAL (Figura 4A). Es importante destacar que el enriquecimiento de la pérdida de H3K27me1 solo con VAL se produjo en estados de cromatina similares a los aumentos de H3K27me1 asociados a TAZ, lo que indica una posible similitud en la regulación epigenética de estas regiones. Por último, la pérdida de H3K27me1 que se produce con los tratamientos con TAZ y VAL se enriqueció en los cuerpos de los genes transcritos y en las regiones potenciadoras (Figura 4A).

Dado el enriquecimiento observado en H3K27me1 en los potenciadores y promotores, a continuación, preguntamos si se encontraron motivos particulares en las regiones de H3K27me1 alterado por EZHi. Coherente con los patrones de estado de cromatina compartidos, los picos estrechos de aumento de H3K27me1 asociados a TAZ y la pérdida de H3K27me1 solo con VAL demostraron un enriquecimiento altamente significativo para los motivos de unión de los factores de transcripción Mef2 y Hox, con más del 25% de los aumentos de H3K27me1 asociados a TAZ que se predijo que eran objetivos de Mef2 (Figura 4B). Los picos amplios de aumento de H3K27me1 asociados a TAZ y la pérdida de H3K27me1 solo con VAL se enriquecieron significativamente para los motivos de unión de los factores de transcripción FOX (Figura 4B). Por último, la pérdida de H3K27me1 que comparten los tratamientos con TAZ y VAL se enriqueció adicionalmente con Mef2, Hoxd y NR2F en los picos estrechos y con los factores de transcripción FOX en los picos amplios (Figura 4B). Dado el enriquecimiento específico y coherente de los estados de cromatina y los motivos de unión de los factores de desarrollo asociados a los cambios en H3K27me1, estos resultados sugieren que H3K27me1 desempeña un papel importante en estas regiones reguladoras específicas. De hecho, se ha demostrado que EZH1 es necesario para la regeneración cardíaca y la diferenciación hematopoyética adecuada, mientras que EZH2 es prescindible, lo que indica que EZH1 (y presumiblemente su capacidad para mantener H3K27me1 en estas regiones (Figura 4A)) desempeña un papel importante en la regulación génica y la diferenciación celular (Figura S5D) (^[36]-^[39]).

Para comprender la regulación epigenética subyacente de estas regiones donde se producen los cambios en H3K27me1, analizamos de nuevo los perfiles de referencia de H3K27me3 y 5mC centrados en estos picos alterados de H3K27me1, y descubrimos que los patrones epigenéticos de referencia diferían entre las categorías de aumento o pérdida de H3K27me1 en la Figura 4A. Los picos de aumento de H3K27me1 asociados a TAZ presentaban niveles de referencia relativamente bajos de H3K27me1 y una metilación parcial del ADN, pero altos niveles de referencia de H3K27me3, lo que indica una profunda represión por la polycomb (Figura 4C y S5D). La forma de estos aumentos de H3K27me1 asociados a TAZ se asemeja a la distribución de H3K27me3 de la línea de base, lo que sugiere que podría ser un fallo en la catálisis hasta la trimetilación cuando EZH2 está inhibido (Figura 4C). El patrón de metilación del ADN en estas regiones refleja el de la profunda represión por la polycomb con perfiles de metilación parcial del ADN (Figura 4C, S5D). En comparación, las regiones susceptibles a la pérdida de H3K27me1 inducida solo por VAL demostraron un perfil subyacente distinto de H3K27me3 y 5mC (Figura 4D). En cambio, el nivel de referencia (tratado con VEH) tanto de H3K27me1 como de 5mC es más alto en el pico, mientras que la señal de H3K27me3 es más baja en estas regiones (Figura 4D y S5D). Esto se produjo tanto en las regiones represivas de la polycomb como, de forma más amplia, en otros estados de cromatina represivos (ZNF/Rpts, Het), lo que sugiere un posible "interruptor epigenético" entre la metilación del ADN y H3K27me3 cuando se desafía con la inhibición de la DNMT1 (Figura 4A y 4D). Por último, la pérdida de H3K27me1 que se produce con los tratamientos con TAZ y VAL se superpone significativamente con las altas señales de H3K27me1 observadas en VEH (Figura S5A), lo que se correlaciona con las regiones altamente metiladas en el ADN y la ausencia de H3K27me3, y es coherente con las fuertes asociaciones que observamos entre H3K27me1 y 5mC en los genes activamente transcritos (Figura 4E, S5A, D).

En conjunto, estos datos demuestran que el perfil subyacente de H3K27me3 dicta en gran medida las distribuciones de H3K27me1 y la respuesta a TAZ o VAL (Figura 4F). Cuando H3K27me3 es alto y los niveles de referencia de H3K27me1 son bajos, VAL agota eficazmente los tres estados de metilación, mientras que el tratamiento con TAZ induce un aumento de H3K27me1 en estas regiones profundamente marcadas por la polycomb (Figura 4F). Esto sugiere que, en ausencia de EZH2 (y la consiguiente pérdida de H3K27me3), EZH1 dirige estas regiones para la deposición de H3K27me1. Si bien presentan perfiles de estado de cromatina y enriquecimiento de motivos similares a los aumentos de H3K27me1 asociados a TAZ, la pérdida de H3K27me1 solo con VAL se produce en regiones genómicas con una mezcla de perfiles intermedios de H3K27me1, 5mC y H3K27me3, lo que indica posiblemente que estas regiones son más heterogéneas en su patrón epigenético en nuestra población celular y más vulnerables a la terapia epigenética dirigida tanto a EZH1 como a EZH2 (Figura 4F). Por último, observamos que H3K27me1 y la metilación del ADN están altamente correlacionados en los genes activamente transcritos, y tanto TAZ como VAL agotan H3K27me1 de forma similar en estas regiones (Figura 4F). Al igual que la metilación del ADN, las distribuciones de H3K27me1 se encuentran tanto en regiones represivas como activas del genoma, y los tratamientos con TAZ y VAL modulan H3K27me1 de forma específica del contexto.

La terapia combinada EZHi/DNMTi redistribuye H3K27ac para promover la activación transcripcional

El análisis por espectrometría de masas reveló además que los tratamientos con EZHi dan como resultado un aumento de la H3K27ac. Confirmamos la especificidad del anticuerpo H3K27ac (Figura S4F) y utilizamos siQ-ChIP cuantitativo de H3K27ac para perfilar la distribución de los cambios en H3K27ac con tratamientos con EZHi en monoterapia o con la combinación de EZHi y DNMTi. Tanto los tratamientos con EZHi en monoterapia como los tratamientos combinados indujeron cambios dinámicos en H3K27ac, que no solo implicaron un aumento, sino también una pérdida (Figura S6A). Los aumentos se produjeron en localizaciones genómicas con bajos niveles basales de H3K27ac y las pérdidas en localizaciones con altos niveles basales de H3K27ac (Figura S6A). Es importante destacar que, si bien el tratamiento con DNMTi solo tuvo efectos marginales sobre la H3K27ac, la adición de DNMTi al tratamiento con EZHi no solo mejoró los aumentos y las pérdidas de H3K27ac (Figura S6A), sino que también modificó la distribución genómica de estos cambios en relación con los tratamientos con EZHi en monoterapia (Figura 5A). Hipotetizamos que el tratamiento con EZH1/2i/DNMTi (VD) reduce eficazmente todos los estados de metilación de H3K27 y la metilación del ADN para permitir la deposición de H3K27ac por p300/CBP y la activación de la transcripción génica. Para evaluar esta hipótesis, primero nos centramos en el aumento de H3K27ac inducido por nuestros tratamientos con EZHi o la combinación de EZHi y DNMTi, que se produjo dentro de 10 kilobases (ascendente o descendente) de las marcas H3K27me1 (Figura 5B). Si bien los aumentos de H3K27ac asociados a VAL coincidieron casi exclusivamente con la pérdida de H3K27me1, los aumentos de H3K27ac asociados a TAZ se produjeron tanto en regiones con pérdida de H3K27me1 como en regiones con aumento de H3K27me1 (Figura 5B). El tratamiento con EZHi en monoterapia indujo aumentos de H3K27ac principalmente en los potenciadores y las regiones represoras del genoma (Figura 5B, C). La adición de DNMTi a los tratamientos con EZHi desplazó los aumentos de H3K27ac a diferentes coordenadas genómicas en comparación con los tratamientos con EZHi en monoterapia (Figura S6B) y mejoró los aumentos de H3K27ac en las regiones promotoras (Figura 5C). En conjunto, estos resultados indican que, si bien el tratamiento con DNMTi en monoterapia tiene un impacto mínimo en el aumento general de H3K27ac, influye sustancialmente en la redistribución genómica de H3K27ac en el contexto del tratamiento combinado con EZHi.

A continuación, buscamos comprender cómo la modulación de H3K27me1 se integra con el aumento de H3K27ac inducido por EZHi/DNMTi, dado que comparten el mismo sustrato. Agrupamos los aumentos de H3K27ac en nuestros paradigmas de tratamiento con fármacos individualmente según la señal basal de H3K27me1 (Figura 5D). La agrupación de H3K27ac de los aumentos de H3K27me1 reveló una divergencia en el enriquecimiento en los estados chromHMM entre el tratamiento con EZHi en monoterapia y el tratamiento con EZHi/DNMTi (Figura S6C). Si bien el tratamiento con EZHi en monoterapia se enriqueció constantemente en el aumento de H3K27ac en los potenciadores en los tres grupos de H3K27me1, el tratamiento con EZHi/DNMTi se enriqueció en el aumento de H3K27ac en los promotores (incluidos TssBiv) en el grupo bajo, tanto en los promotores como en los potenciadores en el grupo intermedio y en los potenciadores bivalentes en el grupo alto (Figura S6C). Para los tratamientos con EZHi en monoterapia, observamos constantemente entre los tres grupos diferentes de H3K27me1 que el tratamiento con DAC no tiene ningún efecto sobre la H3K27ac en estas regiones (Figura S6D), a pesar de los altos niveles de metilación del ADN presentes en estas regiones. De hecho, los tratamientos con EZHi en monoterapia indujeron un estado bivalente de H3K27ac/5mC en estos potenciadores en todos los grupos de H3K27me1 (Figura S6E). En contraste, el tratamiento con DAC solo induce pequeños aumentos medibles en la señal de H3K27ac en los aumentos de H3K27ac de EZHi/DNMTi y, de hecho, parece sinergizar con EZHi para amplificar la señal de H3K27ac en estas regiones (Figura 5E). A diferencia de los tratamientos con EZHi en monoterapia, los aumentos de H3K27ac inducidos por el tratamiento combinado con EZHi/DNMTi demostraron un estado de metilación del ADN basal que se correlaciona con la señal de H3K27me1 (Figura 5F y S6E); cuanto mayor es la señal de H3K27me1, mayor es el nivel de metilación del ADN dentro del pico de H3K27ac aumentado. En todos los casos, en todos los tratamientos con EZHi y los grupos de H3K27me1, en promedio, la pérdida de H3K27me1 coincide con el aumento de H3K27ac, lo que sugiere que la reducción en los estados monometilados de H3K27 proporciona, de hecho, una oportunidad para la adquisición de H3K27ac (Figura 5E y S6D).

Los tratamientos con EZHi/DNMTi demostraron un enriquecimiento particularmente fuerte de los motivos de los factores de transcripción p53/p73 y AP-1 (Jun/Fos) en los grupos bajos e intermedios de 5mC/H3K27me1, respectivamente (Figura 5G). Es notable que se ha demostrado que los factores de transcripción p73 y AP-1 comparten genes diana que regulan el equilibrio entre la apoptosis y la supervivencia de las células, y nuestro trabajo anterior mostró que el tratamiento con DAC indujo un cambio "epigenético" de la metilación del ADN a la represión de H3K27me3 en los motivos de unión de AP-1 (^[15], ^[40]). Para determinar si los aumentos de H3K27ac influyen en la transcripción génica, utilizamos la herramienta de enriquecimiento de regiones genómicas de anotaciones (GREAT) para vincular los aumentos de H3K27ac en los elementos reguladores cis (CRE) con los genes diferencialmente regulados al alza inducidos por nuestras combinaciones de fármacos (Figura 5H) (^[41]). Es importante destacar que los aumentos de H3K27ac inducidos por EZHi/DNMTi en los CRE estaban más estrechamente vinculados a la regulación al alza de la transcripción que EZHi solo (Figura 5H).

Para comprender la regulación epigenética de esta regulación al alza de la transcripción vinculada a CRE-VAL+DAC (VD), a continuación, analizamos la dinámica de H3K27ac (Figura 5I) y H3K27me1 (Figura 5J) en el CRE y el TSS vinculado entre nuestros grupos de H3K27me1. En el grupo bajo de H3K27me1, tanto el CRE como el TSS vinculado demuestran un aumento sinérgico de H3K27ac por el tratamiento con DAC con tanto TAZ como VAL (Figura 5I). Sin embargo, la dinámica de H3K27me1 en estos genes no se comparte entre el tratamiento con EZHi en monoterapia, ya que VAL elimina eficazmente H3K27me1 tanto en el CRE como en el TSS, mientras que TAZ reduce ligeramente H3K27me1 en el centro del CRE y no cambia H3K27me1 en el TSS (Figura 5J y S7A). De hecho, tanto el CRE como el TSS de los genes agrupados en el grupo bajo de H3K27me1 demuestran una H3K27me3 basal que no cambia cuando se desafía con DNMTi (Figura 5J). Estos resultados sugieren que el uso de VAL en el tratamiento combinado con EZHi/DNMTi es superior a TAZ para activar estos genes debido al doble objetivo de EZH1/2 y la reducción de H3K27me1 tanto en el CRE como en el TSS.

En el grupo intermedio de H3K27me1, observamos nuevamente la sinergia de DAC con tanto TAZ como VAL para los aumentos de H3K27ac tanto en el CRE como en el TSS (Figura 5I y S7A). Al igual que en el grupo bajo de H3K27me1, observamos que H3K27me1 se reduce ligeramente en el CRE y no cambia en el TSS con el tratamiento con TAZ, mientras que VAL eliminó H3K27me1 en ambas regiones. Es importante destacar que el TSS de estos genes está marcado por la metilación del ADN, y el trabajo previo de nuestro grupo demostró que estos TSS son propensos a un "cambio epigenético" de la metilación del ADN a la represión de H3K27me3 cuando se desafían con DNMTi solo (Figura 5I). Hipotetizamos que la sinergia para el aumento de H3K27ac en estos TSS se produce por un bloqueo en el "cambio epigenético" por la combinación de EZHi/DNMTi, y, de hecho, observamos que tanto los CRE como los TSS dentro de este grupo demuestran un aumento en H3K27me3 cuando se desafían con DNMTi (Figura 5J). Finalmente, el grupo alto de 5mC/H3K27me1 demuestra un aumento sinérgico/aditivo de H3K27ac en los CRE y los TSS tanto para TAZ como para VAL en combinación con DAC (Figura 5I y S7A), y H3K27me1 se reduce con TAZ y se elimina con VAL (Figura 5J). En conjunto, concluimos que la adición de DNMTi al tratamiento con EZHi redistribuye los perfiles de H3K27ac para mediar la activación de la transcripción de vías génicas reprimidas epigenéticamente bivalentes.

El tratamiento combinado con EZHi/DNMTi reprime los programas de transcripción oncogénicos independientemente de la activación génica impulsada por H3K27ac

Coherente con nuestro estudio anterior (^[15]), VAL en combinación con DAC reguló principalmente al alza las vías de señalización del calcio, la respuesta inmune y la inflamación (Figura 6A). Dado que la adquisición de H3K27ac en los CRE y los promotores bivalentes se observó después de EZHi/DNMTi y se asoció con la regulación al alza de la transcripción (Figura 5), preguntamos si estos efectos de activación de la transcripción dependen de p300/CBP. Utilizando una concentración del inhibidor de p300/CBP A485 que maximiza la inhibición del objetivo cuando se combina con EZHi, al tiempo que minimiza la toxicidad (Figura S8A-C), observamos la atenuación de más del 80 % de los genes regulados al alza por EZHi/DNMTi (Figura 6B, C) y los conjuntos de genes GSEA regulados al alza por VD mencionados anteriormente (Figura 6D, E). Asimismo, A485 mostró una inhibición dependiente de la dosis de la reactivación de SFRP1 cuando se combinó con EZHi y DAC en el reportero de células HCT116 NLuc (Figura S8D-F). Estos hallazgos indicaron que la activación completa de la transcripción después de EZHi/DNMTi requiere la actividad de p300/CBP.

Sorprendentemente, bloquear tanto la deposición de H3K27ac como la activación de estas vías con A485, que normalmente se asocian con efectos terapéuticos, no rescató el efecto antiproliferativo del tratamiento con EZHi/DNMTi y, en cambio, mejoró o mostró efectos antiproliferativos por sí solo (Figura 6F y S8G). Nuestro trabajo anterior demostró que la inhibición de la señalización del calcio atenuó las respuestas inmunitarias, inflamatorias y de TE en las células HCT116, pero mostramos aquí que esta inhibición también no logra rescatar el efecto antiproliferativo del tratamiento con EZHi/DNMTi (Figura S8H) (^[15]). Es notable que un fenotipo de transcripción compartido entre EZHi/DNMTi y A485 es la regulación a la baja de los conjuntos de genes oncogénicos (MYC, punto de control G2/M, objetivos de E2F) (Figura 6D-E y S8I). Estos fenotipos de proliferación y transcripción compartidos sugirieron que la regulación a la baja de las vías oncogénicas contribuye a la eficacia terapéutica en este entorno desprovisto de un compartimento inmunitario.

Aunque nuestra espectrometría de masas de histonas no mostró una pérdida global de H3K27ac (Figura 3I), sí observamos reducciones significativas en la señal de siQ-ChIP de H3K27ac con el tratamiento con EZHi que se produjo principalmente en los promotores de los genes y los potenciadores génicos (Figura S6A y 6A). Es importante destacar que observamos que la pérdida de H3K27ac en los promotores de los genes activos se correlaciona con la regulación a la baja de la transcripción (Figura 6G). Para comprender la relación entre la pérdida de H3K27ac, las distribuciones de H3K27me1 y la transcripción génica, seleccionamos los promotores de los genes con una pérdida significativa de H3K27ac dentro de 20 kilobases de la señal de H3K27me1 (Figura 6H). Es importante destacar que la pérdida de H3K27ac asociada a VD fue más profunda, más numerosa y se correlacionó con la pérdida de H3K27me1 más que la pérdida de H3K27ac asociada a TD en estos promotores de genes (Figura 6H, I). Es notable que las pérdidas más profundas en H3K27me1 tanto para el tratamiento con TD como con VD se produjeron en las regiones génicas activas (Figura 6I). De hecho, este fenotipo epigenético corresponde con la pérdida de H3K27me1 observada con TAZ y VAL en la Figura 4 que se produce en los cuerpos de los genes activos. A continuación, analizamos la señal de H3K27ac (Figura 6J), H3K27me1 (Figura 6K) y metilación del ADN (Figura 6L) en los cuerpos de los genes. Es importante destacar que las tres marcas epigenéticas se reducen en estos genes con el tratamiento con EZHi/DNMTi (Figura 6J-L). Coherente con estos resultados, se ha demostrado previamente que EZH1 promueve la elongación de la ARN polimerasa II para la producción de ARNm de los genes activos (^[42], ^[43]). Observamos que la pérdida de H3K27ac fue más profunda cerca y aguas abajo del TSS (Figura 6K), lo que sugiere que la inhibición dual de EZH1/2 bloquea esta función de EZH1. Esto corresponde con la regulación a la baja de la transcripción que es más profunda con la combinación de VD (Figura 6M). Sin embargo, la pérdida de H3K27ac y H3K27me1 por sí sola no es suficiente para mediar esta regulación a la baja de la transcripción, ya que los tratamientos con TAZ y VAL en monoterapia inducen una pérdida similar en estas marcas epigenéticas (Figura 6J, 6K) sin la regulación a la baja de la transcripción de estos genes (Figura 6M).

Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la disminución de la expresión de los genes que se están transcribiendo activamente requiere no solo la pérdida de H3K27me1 y H3K27ac, sino también la hipometilación del ADN. Al igual que H3K27me1, los niveles de metilación del ADN son altos en todo el cuerpo del gen de los genes activos y se ha demostrado que regulan la fidelidad de la transcripción (^[44]). Además, trabajos previos de Yang et al. demostraron que la hipometilación del ADN mediada por DAC en todo el cuerpo del gen reduce la producción transcripcional, particularmente de las vías metabólicas y relacionadas con c-MYC (^[45]). En nuestros modelos de tratamiento, DAC solo y en combinación con EZHi indujo regiones diferencialmente hipometiladas (DMR) que se encuentran en todo el genoma, incluidas las regiones génicas de los genes que se transcriben activamente (Figura S8J). El análisis de las DMR asociadas a VD demostró que las regiones altamente metiladas son más propensas a la pérdida de la metilación del ADN y, significativamente, pierden H3K27me1 con el tratamiento con TAZ y VAL (Figura S8K). En apoyo de esta hipótesis, la disminución de la expresión de los genes altamente activos se observa principalmente cuando EZHi se combina con DNMTi (Figura 6M). En conjunto, nuestros resultados demuestran que, si bien la deposición de H3K27ac en las células tratadas con VD promueve la activación transcripcional, es posible que no sea el fenotipo primario necesario para mediar el efecto antiproliferativo terapéutico. Más bien, la focalización de la metilación del ADN del cuerpo del gen y H3K27me1 por DNMTi y EZHi, respectivamente, redujo estas marcas en todo el cuerpo del gen activo, lo que resultó en la atenuación de los programas transcripcionales oncogénicos.

Los niveles de expresión de EZH1 predicen la sensibilidad a los inhibidores selectivos de EZH2 combinados con DNMTi

El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) de los tumores de pacientes con COADREAD de TCGA en comparación con las muestras de tejido sólido normal confirmó que los conjuntos de genes pro-supervivencia y oncogénicos, como el punto de control G2M, los objetivos de MYC y los objetivos de E2F, están sobreexpresados en los tumores de adenocarcinoma colorrectal de los pacientes (Figura 7A). Dentro de esta cohorte, los pacientes con la mayor expresión de ARNm de EZH1 en los tumores de COADREAD tuvieron una supervivencia general inferior a la de los pacientes con baja expresión de EZH1 (Figura 7B y S9B), mientras que la expresión de EZH2 no hizo esta distinción. Dado que los tratamientos asociados a VAL que se dirigen simultáneamente a EZH1/2 demuestran consistentemente una mayor pérdida de H3K27me1 y H3K27ac junto con la disminución de la expresión transcripcional (Figura 6), planteamos la hipótesis de que los tumores con alta expresión de la proteína EZH1 serían menos sensibles a la inhibición selectiva de EZH2 cuando se combina con DNMTi que con la inhibición dual de EZH1/2. Para probar esta hipótesis en líneas celulares cancerosas, comparamos RKO, que tiene una alta expresión de EZH1 a nivel de proteína, con SW620, una línea celular de cáncer de colon que expresa bajos niveles de EZH1 (Figura 3A). De hecho, las células RKO (EZH1-alto) fueron más sensibles al tratamiento con VD que al tratamiento con TD, mientras que las células SW620 (EZH1-bajo) fueron igualmente sensibles a ambos tratamientos, VD y TD (Figura 7C).

Para comprender la sensibilidad diferencial de las células RKO al tratamiento con TD y VD (y la falta de ella en las células SW620), analizamos las respuestas transcripcionales entre los diferentes tratamientos farmacológicos en las células RKO y SW620. Coherente con nuestra hipótesis, el tratamiento con VD no solo tuvo una mayor activación transcripcional que el tratamiento con TD, sino también una disminución más pronunciada específica del tratamiento con VD (Figura S9C). En contraste, la respuesta transcripcional en las células SW620 fue similar entre los tratamientos TD y VD tanto para la regulación al alza como para la regulación a la baja de los genes (Figura S9C). Para las células RKO y SW620, el tratamiento con TD y VD reguló al alza las vías de señalización proinflamatorias, de respuesta inmune y de calcio (Figura 7D). Sin embargo, como se analiza en la Figura 6, la activación de estas vías parece ser innecesaria para inducir el efecto antiproliferativo del tratamiento con EZHi/DNMTi en las células cancerosas. Más bien, encontramos que el tratamiento con VD en las células RKO redujo mejor las vías pro-supervivencia y oncogénicas que las células tratadas con TD, mientras que el tratamiento con TD y VD de las células SW620 redujo igualmente estos conjuntos de genes (Figura 7D y S9D, E). El perfilado epigenético en todo el cuerpo del gen de estos genes de enriquecimiento central de los objetivos de MYC y la fosforilación oxidativa reveló que H3K27ac, H3K27me1 y la metilación del ADN se redujeron significativamente, y los tratamientos asociados a VAL demostraron la mayor pérdida de H3K27ac y H3K27me1 en RKO (Figura S9F). Validamos estos hallazgos a nivel de proteína en las células HCT116, que, como informamos anteriormente, también responden al tratamiento combinado con EZHi/DNMTi (Figura 2) (^[15]), y, de hecho, el tratamiento combinado con EZHi/DNMTi da como resultado tanto la reducción de la proteína c-MYC como de los objetivos de MYC (Figura S9G).

La subunidad PRC2 SUZ12 ayuda a reprimir el gen supresor de tumores silenciado por la metilación del ADN

Para identificar los genes que ayudan a mantener el silenciamiento génico después de la hipometilación del ADN, realizamos un cribado genético de ARN de interferencia (ARNi) a nivel del genoma utilizando un reportero de células de cáncer de colon HCT116 previamente descrito para el gen TSG SFRP1 (Figura 1A) (^[15]). La hipermetilación de la isla CpG del promotor flanqueada por H3K27me3 silencia fuertemente SFRP1; la actividad de la nanoluciferasa (NLuc) del casete NLuc insertado aguas abajo del promotor endógeno informa sobre la reversión del silenciamiento de SFRP1, ya sea mediante la hipometilación del ADN y el bloqueo de la deposición de H3K27me3 o mediante otro mecanismo (Figura 1A). Esta línea celular de reportero está diseñada en un derivado hipomórfico de DNMT1 de HCT116 que reduce la metilación global del ADN en aproximadamente un 20%, incluido el SFRP1, para aumentar la susceptibilidad al cribado de alto rendimiento sin la adición de DNMTi (^[19]).

Utilizando esta línea de reportero, transfectamos individualmente grupos de ARN de interferencia contra aproximadamente 18.000 genes durante siete días, un período de tiempo optimizado según nuestro informe anterior sobre el silenciamiento de DNMT1 que induce la actividad de NLuc en la línea celular de reportero NLuc (Figura 1A) (^[15]). Después de medir la actividad de NLuc para cada grupo de ARN de interferencia, normalizamos la señal de luminiscencia con una medida de la confluencia consistente con la viabilidad celular (Figura 1B y S1A). Se excluyeron los falsos positivos basados en la expresión génica en estado basal y el silenciamiento de los genes que inhiben la viabilidad celular en lugar de inducir la expresión de SFRP1 para aislar los efectos regulatorios en este locus silenciado (Figura S1B-C, Tabla S1). A partir de aquí, identificamos una lista limitada de genes objetivo cuyo silenciamiento contribuye a la reactivación de SFRP1, incluido DNMT1. El único otro factor epigenético identificado fue SUZ12, que codifica una subunidad de andamiaje indispensable para la actividad de PRC2 (Figura 1C). Nosotros y otros hemos informado previamente que la actividad de PRC2 compensa para reforzar el silenciamiento génico después de la inhibición de DNMT para mantener el silenciamiento génico en el cáncer, y esto se puede superar mediante el uso de inhibidores que se dirigen selectivamente a EZH2, la subunidad catalítica primaria de PRC2 (^[15]). Dado que el cribado no identificó sorprendentemente EZH2, comparamos SUZ12 con todos los genes representados en la biblioteca de ARN de interferencia y asociados con PRC2, el complejo represor de polimbolo complementario (PRC1) que contribuye a la compactación de la cromatina/represión génica y la maquinaria de metilación del ADN. De hecho, solo el silenciamiento de SUZ12 y DNMT1 reactivó robustamente SFRP1 (Figura 1D). La capacidad de la pérdida de SUZ12 pero no de EZH2 para inducir la expresión de SFRP1 y otros genes en un estado de ADN hipometilado se validó mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcriptasa inversa (RT-PCR) en HCT116 de tipo salvaje tratadas con DAC a baja dosis (Figura 1E y S1D).

Hipótesis que, como una subunidad de andamiaje necesaria/indispensable para el PRC2 central, el silenciamiento de SUZ12 podría mostrar una mayor pérdida del producto de metilación de H3K27 más estudiado, la trimetilación de la histona 3 lisina 27 (H3K27me3) que el silenciamiento de EZH2. Sin embargo, tanto el silenciamiento de SUZ12 como el de EZH2, pero no el silenciamiento de la subunidad catalítica intercambiable EZH1, mostraron una eficacia similar en la reducción de H3K27me3 (Figura 1F). Esto indicó que los niveles de H3K27me3 represivo no pueden explicar las diferencias entre SUZ12 y EZH2 en el mantenimiento del silenciamiento de TSG después de la hipometilación del ADN.

La inhibición dual de EZH1 y EZH2 se dirige a los tres estados de metilación de H3K27 y mejora la regulación al alza transcripcional inducida por DNMTi

Dado que las medidas moleculares de la inhibición de H3K27me3 no pudieron explicar la insuficiencia del silenciamiento de EZH2 para reactivar los loci silenciados, realizamos un cribado farmacológico exhaustivo de los antagonistas de PRC2 para identificar moléculas pequeñas que imiten el efecto transcripcional del silenciamiento de SUZ12. Este panel incluyó inhibidores SAM-competitivos experimentales y clínicamente aplicados de EZH2 y EZH1, disruptores de la interacción proteína-proteína (PPI) de la subunidad indispensable de PRC2 EED y la cromatina, y degradadores PROTAC de las subunidades de PRC2. Tres moléculas SAM-competitivas: tulmimetostat (TUL o CPI-0209), valemetostat (VAL o DS3201b) y mevrometostat (MEV o PF-1497), mostraron una eficacia superior en la reactivación del reportero SFRP1-NLuc solo o con la adición de DAC a baja dosis en comparación con otras moléculas SAM-competitivas (Figura 2A). Además, VAL, representativa de las moléculas SAM-competitivas de nivel superior, superó a todos los disruptores de PPI y los degradadores PROTAC con o sin DAC a baja dosis (Figura 2B). Coherente con nuestros hallazgos anteriores, la eficacia del inhibidor de PRC2 en este ensayo no se correlacionó con la toxicidad (Figura S2A-B) (^[15]). En particular, los inhibidores de PRC2 superiores tienen la aprobación clínica en Japón (VAL) o han avanzado al menos a ensayos clínicos de fase II en los EE. UU. (TUL y MEV), lo que sugiere que comparten características que han contribuido a su avance clínico (^[20], ^[21]).

Dado que PRC2 cataliza los tres estados de metilación de H3K27, preguntamos si la inhibición dirigida fuera de H3K27me3 explica la capacidad de sinergizar con DAC. Mediante el análisis de Western blot, encontramos que la eficacia superior en la sinergia con DAC se correlaciona con la eficacia del inhibidor de PRC2 en la reducción no solo de H3K27me3, sino también de H3K27me2 y H3K27me1, junto con el aumento de H3K27ac (Figura 2C y Figura S2C-D). De hecho, los niveles de H3K27me3 variaron entre los inhibidores de PRC2, pero las moléculas superiores (TUL, VAL y MEV) redujeron robustamente los tres estados de metilación, y esto fue particularmente distinto para H3K27me1.

Tanto VAL como TUL se informan como inhibidores duales de EZH1/2 (^[22], ^[23]). Nos preguntamos si MEV también actúa como un inhibidor dual y si esto diferencia a las moléculas eficaces de los otros inhibidores SAM-competitivos. Para probar esto, medimos la capacidad de seis moléculas representativas para inhibir la actividad de los complejos PRC2 que contienen EZH1 o EZH2 hacia los nucleosomas recombinantes en un ensayo de metiltransferasa in vitro. Coherente con nuestra hipótesis, TUL, VAL y MEV inhibieron fuertemente el PRC2 que contiene EZH2 de manera dependiente de la dosis y también fueron potentes inhibidores del PRC2 que contiene EZH1 (Figura 2D). TAZ, que informamos previamente que se sinergiza con DAC (^[15]) y que mostró una eficacia intermedia en las células (Figura 2A-B), fue un inhibidor eficaz de los complejos PRC2 que contienen EZH2 pero no EZH1 (Figura 2D). GSK126 y UNC1999, que tuvieron un rendimiento deficiente en las células, fueron débiles inhibidores de ambos tipos de complejos PRC2. Estos datos establecen una correlación entre la potencia dual contra EZH1 y EZH2 in vitro y la eficacia en la reactivación de TSG y la inhibición de los tres estados de metilación de H3K27 en las células. En conjunto, estos resultados sugieren que EZH1 desempeña un papel importante, pero a menudo pasado por alto, en los estados de metilación de H3K27 y la represión génica.

EZH1 contribuye al mantenimiento de la monometilación de H3K27 cuando se inhibe EZH2

Aunque otros también han demostrado recientemente la superioridad de los inhibidores duales de EZH1/2, como VAL, la contribución de EZH1 a los estados de metilación de H3K27 en el cáncer y el mecanismo subyacente a esta superioridad siguen sin estar claros (^[24],^[25]). Planteamos la hipótesis de que EZH1 deposita H3K27me1 cuando EZH2 está inhibido, lo que corresponde al papel que se le atribuye a EZH1 en la deposición de monometilo (^[26],^[27]). Para probar la contribución de EZH1 al estado de metilación de H3K27, seleccionamos RKO de un panel de líneas celulares de cáncer de colon, ya que presenta una alta expresión tanto de EZH1 como de EZH2 a nivel de proteínas (Figura 3A). Utilizando CRISPR/Cas9, dirigimos EZH1 y EZH2 para su inactivación (KO) y una región "desértica" del gen en el cromosoma 12 (Chr12) como control del ensayo CRISPR. Aislamos tres clones para cada gen diana CRISPR y validamos la pérdida de EZH1 o EZH2 (Figura 3B). A continuación, medimos la metilación y la acetilación globales de la lisina en las colas de las histonas mediante espectrometría de masas a partir de estos clones, como un enfoque cuantitativo e independiente de anticuerpos para identificar las contribuciones de cada metiltransferasa EZH a la metilación de H3K27 (Figura 3C y Figura S3A). La inactivación de EZH1 por sí sola no afectó a ninguno de los estados de metilación de H3K27. Sin embargo, la inactivación de EZH2 redujo significativamente los niveles de H3K27me2 y H3K27me3 en ambas variantes de histonas, H3.1 y H3.3, pero, sorprendentemente, mostró niveles aumentados de H3K27me1 en el péptido H3.1 y mantuvo H3K27me1 en el péptido H3.3. Cabe destacar que, si bien H3.1 está acoplado a la replicación, H3.3 es independiente de la replicación y se encuentra principalmente en genes activamente transcritos (^[28]-^[30]). Confirmamos estos resultados mediante inmunoblotaje con y sin la adición del inhibidor de la ADN metiltransferasa (DNMTi) DAC, lo que no produjo ningún cambio adicional (Figura 3D).

Para determinar si EZH1 es responsable del aumento de H3K27me1 en las líneas celulares con EZH2 inactivado, introdujimos un shRNA inducible con doxiciclina para EZH1. Esto conduce de forma rápida y robusta a la reducción de EZH1 y a la inactivación de EZH2 simultáneamente, al tiempo que se minimizan los defectos de proliferación celular que se producen con una inactivación dual. De hecho, la inactivación de EZH2 y la reducción de EZH1 simultáneamente redujeron el nivel de H3K27me1 tanto mediante inmunoblotaje como mediante espectrometría de masas de modificaciones postraduccionales de histonas (Figura 3E-F, S3B). Curiosamente, tanto la inactivación de EZH2 por sí sola como la inactivación de EZH2/reducción de EZH1 aumentaron la acetilación en H3K27, pero no la acetilación en otros sustratos de histonas (Figura 1G).

A continuación, analizamos si el inhibidor selectivo de EZH2, TAZ (Figura 2), reproduce el fenotipo de la inactivación de EZH2 y si el inhibidor dual de EZH1/2, VAL, reproduce el fenotipo de las células con la inactivación dual de EZH2/reducción de EZH1. Estas moléculas tienen la aprobación de la FDA de EE. UU. y del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón, respectivamente, y ambas se utilizan activamente en la clínica. Como observamos con los clones con EZH2 inactivado, las células tratadas con TAZ presentaban niveles muy reducidos de H3K27me2 y H3K27me3, pero presentaban niveles aumentados de H3K27me1 (Figura 3H, Figura S3C). De manera similar, como vimos con la línea celular con EZH2 inactivado/shEZH1, observamos una reducción mucho mayor de las marcas H3K27me2 y H3K27me3 después del tratamiento con VAL, así como una disminución de H3K27me1 tanto en H3.1 como en H3.3. Estas tendencias también se repitieron cuando se combinaron TAZ o VAL con el inhibidor de la DNMTi, DAC (Figura S3D). Tanto las manipulaciones genéticas con la inactivación de EZH2 mediante CRISPR y shEZH1 como los tratamientos farmacológicos con TAZ o VAL aumentaron la abundancia del péptido H3K27ac, un objetivo de las histonas acetiltransferasas (HAT) p300/CBP, mientras que el otro objetivo conocido de la acetilación dependiente de p300/CBP, H3K18, y otras modificaciones postraduccionales de histonas acetiladas permanecieron sin cambios (Figura 3G, I y S3E), lo que indica una posible relación entre este aumento de la acetilación y la disminución de los niveles de metilación en H3K27 tras el tratamiento con TAZ o VAL.

Las distribuciones genómicas subyacentes de H3K27me3 y la metilación del ADN dan forma al patrón de H3K27me1 y a la respuesta al tratamiento con EZHi/DNMTi

Los datos de espectrometría de masas sugirieron que el cambio más característico en las modificaciones postraduccionales de histonas fue la disminución de H3K27me1 tras la pérdida de EZH1/2 o la inhibición dual de EZH1/2. Esto nos llevó a preguntarnos dónde se producen los cambios en H3K27me1 en el genoma. Dado el número limitado de estudios que analizan H3K27me1 en el cáncer, primero validamos los anticuerpos anti-H3K27me1 antes de continuar con nuestro método cuantitativo de ChIP-seq, siQ-ChIP (^[31],^[32]), para responder a esta pregunta (Figura S4A). Utilizando nuestra matriz de péptidos de histonas, identificamos un anticuerpo anti-H3K27me1 altamente específico de ActiveMotif (61015), cuyo isotérmico anticuerpo:cromatina indicó que las titulaciones de anticuerpos podían capturar la masa de cromatina de acuerdo con los perfiles de modificaciones postraduccionales de histonas obtenidos mediante espectrometría de masas tras los tratamientos con VAL o TAZ (Figura S4B). Es importante destacar que otros anticuerpos anti-H3K27me1 (Invitrogen y Abclonal) mostraron una alta variación entre lotes y/o actividad fuera del objetivo contra modificaciones postraduccionales de alta abundancia, como H3K9me1 (Figura S4C-D). Utilizando nuestro anticuerpo validado, analizamos las distribuciones de H3K27me1 con resolución cuantitativa para establecer el patrón de referencia y la respuesta de esta modificación a los tratamientos con TAZ o VAL.

Coherente con los informes en células madre embrionarias de ratón y células madre hematopoyéticas humanas, las distribuciones de H3K27me1 en las células tratadas con vehículo (VEH) se enriquecieron principalmente en los cuerpos de los genes transcritos (Figura S5A) (^[33],^[34]). Utilizando nuestros datos de ChIP-seq previamente publicados y validados por anticuerpos para H3K27me3 (Figura S4E) y datos de secuenciación de bisulfito del genoma completo (WGBS) disponibles públicamente para 5mC (^[16],^[35]), analizamos la distribución de referencia de estas marcas epigenéticas primarias, que son el objetivo de nuestra combinación de fármacos. En la línea de base, los perfiles enriquecidos de H3K27me1 se superponen con dominios altamente metilados en el ADN, donde H3K27me3 está notablemente ausente (Figura S5B), un patrón epigenético coherente con los cuerpos de los genes transcritos (Figura S5A) (^[33]).

A continuación, cuantificamos el cambio en la distribución de H3K27me1 a partir de estos patrones de referencia tras los tratamientos con TAZ o VAL. Tanto para los aumentos como para las disminuciones de H3K27me1 inducidos por los tratamientos con fármacos, observamos una alta densidad de picos relativamente cortos (~300-400 pb) y una cola de picos más amplios clasificados utilizando el modelado de mezclas gaussianas (Figura S5C). Coherente con la espectrometría de masas, siQ-ChIP mostró aumentos de la señal de H3K27me1 con el tratamiento con TAZ solo, que se producen principalmente en regiones represivas marcadas por la polycomb del genoma, mientras que VAL indujo aumentos mínimos de H3K27me1 (Figura 4A). Los estrechos aumentos de H3K27me1 asociados a TAZ también estaban presentes en los potenciadores bivalentes (EnhBiv), mientras que los picos amplios se localizaron adicionalmente en los promotores bivalentes (TssBiv). También identificamos regiones que mantuvieron H3K27me1 con el tratamiento con TAZ, pero que solo perdieron esta modificación con VAL (Figura 4A). Es importante destacar que el enriquecimiento de la pérdida de H3K27me1 solo con VAL se produjo en estados de cromatina similares a los aumentos de H3K27me1 asociados a TAZ, lo que indica una posible similitud en la regulación epigenética de estas regiones. Por último, la pérdida de H3K27me1 que se produce con los tratamientos con TAZ y VAL se enriqueció en los cuerpos de los genes transcritos y en las regiones potenciadoras (Figura 4A).

Dado el enriquecimiento observado en H3K27me1 en los potenciadores y promotores, a continuación, analizamos si se encontraron motivos específicos en las regiones de H3K27me1 alterado por EZHi. Coherente con los patrones de estado de cromatina compartidos, los picos estrechos de aumento de H3K27me1 asociados a TAZ y la pérdida de H3K27me1 solo con VAL demostraron un enriquecimiento altamente significativo de los motivos de unión de los factores de transcripción Mef2 y Hox, con más del 25% de los aumentos de H3K27me1 asociados a TAZ que se predijo que eran objetivos de Mef2 (Figura 4B). Los picos amplios de aumento de H3K27me1 asociados a TAZ y la pérdida de H3K27me1 solo con VAL se enriquecieron significativamente con los motivos de unión de los factores de transcripción FOX (Figura 4B). Por último, la pérdida de H3K27me1 que comparten los tratamientos con TAZ y VAL se enriqueció adicionalmente con Mef2, Hoxd y NR2F en los picos estrechos y con los factores de transcripción FOX en los picos amplios (Figura 4B). Dado el enriquecimiento específico y coherente de los estados de cromatina y los motivos de unión de los factores de desarrollo asociados a los cambios en H3K27me1, estos resultados sugieren que H3K27me1 desempeña un papel importante en estas regiones reguladoras específicas. De hecho, se requiere EZH1 para la regeneración cardíaca y la diferenciación hematopoyética adecuada, mientras que EZH2 es prescindible, lo que indica que EZH1 (y presumiblemente su capacidad para mantener H3K27me1 en estas regiones (Figura 4A)) desempeña un papel importante en la regulación génica y la diferenciación celular (Figura S5D) (^[36]-^[39]).

Para comprender la regulación epigenética subyacente de estas regiones donde se producen los cambios en H3K27me1, analizamos de nuevo los perfiles de referencia de H3K27me3 y 5mC centrados en estos picos alterados de H3K27me1, y descubrimos que los patrones epigenéticos de referencia diferían entre las categorías de aumento o pérdida de H3K27me1 en la Figura 4A. Los picos con aumento de H3K27me1 asociados a TAZ presentaban niveles de referencia relativamente bajos de H3K27me1 y una metilación parcial del ADN, pero altos niveles de referencia de H3K27me3, lo que indica una profunda represión por la polycomb (Figura 4C y S5D). La forma de estos aumentos de H3K27me1 asociados a TAZ se asemeja a la distribución de H3K27me3 de la línea de base, lo que sugiere una incapacidad para catalizar la trimetilación completa cuando EZH2 está inhibido (Figura 4C). El patrón de metilación del ADN en estas regiones refleja el de la profunda represión por la polycomb, con perfiles de metilación parcial del ADN (Figura 4C, S5D). En comparación, las regiones susceptibles a la pérdida de H3K27me1 inducida solo por VAL demostraron un perfil subyacente distinto de H3K27me3 y 5mC (Figura 4D). En cambio, el nivel de referencia (tratado con VEH) tanto de H3K27me1 como de 5mC es más alto en el pico, mientras que la señal de H3K27me3 es más baja en estas regiones (Figura 4D y S5D). Esto se produjo tanto en las regiones represivas de la polycomb como, más ampliamente, en otros estados de cromatina represivos (ZNF/Rpts, Het), lo que sugiere un posible "interruptor epigenético" entre la metilación del ADN y H3K27me3 cuando se desafía con la inhibición de la DNMT1 (Figura 4A y 4D). Por último, la pérdida de H3K27me1 que se produce con los tratamientos con TAZ y VAL se superpone significativamente con las altas señales de H3K27me1 observadas en VEH (Figura S5A), lo que se correlaciona con las regiones altamente metiladas en el ADN y la ausencia de H3K27me3, y es coherente con las fuertes asociaciones que observamos entre H3K27me1 y 5mC en los genes activamente transcritos (Figura 4E, S5A, D).

En conjunto, estos datos demuestran que el perfil subyacente de H3K27me3 dicta en gran medida las distribuciones de H3K27me1 y la respuesta a TAZ o VAL (Figura 4F). Cuando H3K27me3 es alto y los niveles de referencia de H3K27me1 son bajos, VAL agota eficazmente los tres estados de metilación, mientras que el tratamiento con TAZ induce un aumento de H3K27me1 en estas regiones profundamente marcadas por la polycomb (Figura 4F). Esto sugiere que, en ausencia de EZH2 (y la consiguiente pérdida de H3K27me3), EZH1 dirige estas regiones para la deposición de H3K27me1. Si bien presentan perfiles de estado de cromatina y enriquecimiento de motivos similares a los aumentos de H3K27me1 asociados a TAZ, la pérdida de H3K27me1 solo con VAL se produce en regiones genómicas con una mezcla de perfiles intermedios de H3K27me1, 5mC y H3K27me3, lo que indica posiblemente que estas regiones son más heterogéneas en su patrón epigenético en nuestra población celular y son más vulnerables a la terapia epigenética dirigida tanto a EZH1 como a EZH2 (Figura 4F). Por último, observamos que H3K27me1 y la metilación del ADN están altamente correlacionados en los genes activamente transcritos, y tanto TAZ como VAL agotan H3K27me1 de forma similar en estas regiones (Figura 4F). Al igual que la metilación del ADN, las distribuciones de H3K27me1 se encuentran tanto en regiones represivas como activas del genoma, y los tratamientos con TAZ y VAL modulan H3K27me1 de forma específica según el contexto.

La terapia combinada EZHi/DNMTi redistribuye H3K27ac para promover la activación transcripcional

El análisis por espectrometría de masas reveló además que los tratamientos con EZHi dan como resultado un aumento de la H3K27ac. Confirmamos la especificidad del anticuerpo H3K27ac (Figura S4F) y utilizamos siQ-ChIP cuantitativo de H3K27ac para perfilar la distribución de los cambios en H3K27ac con tratamientos con EZHi en monoterapia o con la combinación de EZHi/DNMTi. Tanto los tratamientos con EZHi en monoterapia como los tratamientos combinados indujeron cambios dinámicos en H3K27ac, no solo un aumento, sino también una pérdida (Figura S6A). Los aumentos se produjeron en localizaciones genómicas con bajos niveles basales de H3K27ac y las pérdidas en localizaciones con altos niveles basales de H3K27ac (Figura S6A). Es importante destacar que, si bien el tratamiento con DNMTi solo tuvo efectos marginales sobre la H3K27ac, la adición de DNMTi al tratamiento con EZHi no solo mejoró los aumentos y las pérdidas de H3K27ac (Figura S6A), sino que también modificó la distribución genómica de estos cambios en relación con los tratamientos con EZHi en monoterapia (Figura 5A). Hipotetizamos que el tratamiento con EZH1/2i/DNMTi (VD) reduce eficazmente todos los estados de metilación de H3K27 y la metilación del ADN para permitir la deposición de H3K27ac por p300/CBP y la activación de la transcripción génica. Para evaluar esta hipótesis, primero nos centramos en el aumento de H3K27ac inducido por nuestros tratamientos con EZHi o EZHi/DNMTi que se produjo dentro de 10 kilobases (ascendente o descendente) de las marcas H3K27me1 (Figura 5B). Si bien los aumentos de H3K27ac asociados a VAL coincidieron casi exclusivamente con la pérdida de H3K27me1, los aumentos de H3K27ac asociados a TAZ se produjeron tanto en regiones con pérdida de H3K27me1 como en regiones con aumento de H3K27me1 (Figura 5B). El tratamiento con EZHi en monoterapia indujo aumentos de H3K27ac principalmente en los potenciadores y las regiones represoras del genoma (Figura 5B, C). La adición de DNMTi a los tratamientos con EZHi desplazó los aumentos de H3K27ac a diferentes coordenadas genómicas en comparación con los tratamientos con EZHi en monoterapia (Figura S6B) y mejoró los aumentos de H3K27ac en las regiones promotoras (Figura 5C). En conjunto, estos resultados indican que, aunque el tratamiento con DNMTi en monoterapia tiene un impacto mínimo en el aumento general de H3K27ac, influye sustancialmente en la redistribución genómica de H3K27ac en el contexto del tratamiento combinado con EZHi.

A continuación, buscamos comprender cómo la modulación de H3K27me1 se integra con el aumento de H3K27ac inducido por EZHi/DNMTi, dado que comparten el mismo sustrato. Agrupamos los aumentos de H3K27ac en nuestros paradigmas de tratamiento con fármacos individualmente según la señal basal de H3K27me1 (Figura 5D). La agrupación de H3K27ac de los aumentos de H3K27me1 reveló una divergencia en el enriquecimiento en los estados chromHMM entre el tratamiento con EZHi en monoterapia y el tratamiento con EZHi/DNMTi (Figura S6C). Si bien el tratamiento con EZHi en monoterapia enriqueció constantemente el aumento de H3K27ac en los potenciadores en los tres grupos de H3K27me1, el tratamiento con EZHi/DNMTi enriqueció el aumento de H3K27ac en los promotores (incluidos TssBiv) en el grupo bajo, tanto en los promotores como en los potenciadores en el grupo intermedio y en los potenciadores bivalentes en el grupo alto (Figura S6C). Para los tratamientos con EZHi en monoterapia, observamos constantemente entre los tres grupos diferentes de H3K27me1 que el tratamiento con DAC no tiene ningún efecto sobre la H3K27ac en estas regiones (Figura S6D), a pesar de los altos niveles de metilación del ADN presentes en estas regiones. De hecho, los tratamientos con EZHi en monoterapia indujeron un estado bivalente de H3K27ac/5mC en estos potenciadores en todos los grupos de H3K27me1 (Figura S6E). En contraste, el tratamiento con DAC solo induce pequeños, pero medibles, aumentos en la señal de H3K27ac en los aumentos de H3K27ac de EZHi/DNMTi, y de hecho, parece sinergizar con EZHi para amplificar la señal de H3K27ac en estas regiones (Figura 5E). A diferencia de los tratamientos con EZHi en monoterapia, los aumentos de H3K27ac inducidos por el tratamiento combinado con EZHi/DNMTi demostraron un estado de metilación del ADN basal que se correlaciona con la señal de H3K27me1 (Figura 5F y S6E); cuanto mayor es la señal de H3K27me1, mayor es el nivel de metilación del ADN dentro del pico de H3K27ac aumentado. En todos los casos, en todos los tratamientos con EZHi y los grupos de H3K27me1, en promedio, la pérdida de H3K27me1 coincide con el aumento de H3K27ac, lo que sugiere que la reducción en los estados monometilados de H3K27 proporciona de hecho una oportunidad para la adquisición de H3K27ac (Figura 5E y S6D).

Los tratamientos con EZHi/DNMTi demostraron un enriquecimiento particularmente fuerte para los motivos de los factores de transcripción p53/p73 y AP-1 (Jun/Fos) en los grupos bajos e intermedios de 5mC/H3K27me1, respectivamente (Figura 5G). Es notable que se ha demostrado que los factores de transcripción p73 y AP-1 comparten genes diana que regulan el equilibrio entre apoptosis y supervivencia de las células, y nuestro trabajo anterior mostró que el tratamiento con DAC indujo un cambio "epigenético" de la metilación del ADN a la represión de H3K27me3 en los motivos de unión de AP-1 (^[15],^[40]). Para determinar si los aumentos de H3K27ac influyen en la transcripción génica, utilizamos la herramienta de enriquecimiento de regiones genómicas de anotaciones (GREAT) para vincular los aumentos de H3K27ac en los elementos reguladores cis (CRE) con los genes diferencialmente regulados al alza inducidos por nuestras combinaciones de fármacos (Figura 5H) (^[41]). Es importante destacar que los aumentos de H3K27ac inducidos por EZHi/DNMTi en los CRE estaban más estrechamente vinculados a la regulación al alza de la transcripción que EZHi solo (Figura 5H).

Para comprender la regulación epigenética de esta regulación al alza de la transcripción vinculada a CRE-VAL+DAC (VD), a continuación, analizamos la dinámica de H3K27ac (Figura 5I) y H3K27me1 (Figura 5J) en el CRE y el TSS vinculado entre nuestros grupos de H3K27me1. En el grupo bajo de H3K27me1, tanto el CRE como el TSS vinculado demuestran un aumento sinérgico de H3K27ac por el tratamiento con DAC con tanto TAZ como VAL (Figura 5I). Sin embargo, la dinámica de H3K27me1 en estos genes no se comparte entre el tratamiento con EZHi en monoterapia, ya que VAL agota eficazmente H3K27me1 tanto en el CRE como en el TSS, mientras que TAZ reduce ligeramente H3K27me1 en el centro del CRE y no cambia H3K27me1 en el TSS (Figura 5J y S7A). De hecho, tanto el CRE como el TSS de los genes agrupados en el grupo bajo de H3K27me1 demuestran una H3K27me3 basal que no cambia cuando se desafía con DNMTi (Figura 5J). Estos resultados sugieren que el uso de VAL en el tratamiento combinado con EZHi/DNMTi es superior a TAZ para activar estos genes debido al doble objetivo de EZH1/2 y la reducción de H3K27me1 tanto en el CRE como en el TSS.

En el grupo intermedio de H3K27me1, nuevamente observamos la sinergia de DAC con tanto TAZ como VAL para los aumentos de H3K27ac tanto en el CRE como en el TSS (Figura 5I y S7A). Al igual que en el grupo bajo de H3K27me1, observamos que H3K27me1 se reduce ligeramente en el CRE y no cambia en el TSS con el tratamiento con TAZ, mientras que VAL agota H3K27me1 en ambas regiones. Es importante destacar que el TSS de estos genes está marcado por la metilación del ADN, y el trabajo previo de nuestro grupo demostró que estos TSS son propensos a un "cambio epigenético" de la metilación del ADN a la represión de H3K27me3 cuando se desafían con DNMTi solo (Figura 5I). Hipotetizamos que la sinergia para el aumento de H3K27ac en estos TSS se produce por un bloqueo en el "cambio epigenético" por el tratamiento combinado con EZHi/DNMTi, y de hecho, observamos que tanto los CRE como los TSS dentro de este grupo demuestran un aumento en H3K27me3 cuando se desafían con DNMTi (Figura 5J). Finalmente, el grupo alto de 5mC/H3K27me1 demuestra un aumento sinérgico/aditivo de H3K27ac en los CRE y los TSS para tanto TAZ como VAL en combinación con DAC (Figura 5I y S7A), y H3K27me1 se reduce con TAZ y se agota con VAL (Figura 5J). En conjunto, concluimos que la adición de DNMTi al tratamiento con EZHi redistribuye los perfiles de H3K27ac para mediar la activación de la transcripción de vías génicas reprimidas epigenéticamente bivalentes.

El tratamiento combinado con EZHi/DNMTi reprime los programas de transcripción oncogénicos independientemente de la activación génica impulsada por H3K27ac

Coherente con nuestro estudio anterior (^[15]), VAL en combinación con DAC reguló principalmente al alza las vías de señalización del calcio, la respuesta inmune y la inflamación (Figura 6A). Dado que la adquisición de H3K27ac en los CRE y los promotores bivalentes se observó después de EZHi/DNMTi y se asoció con la regulación al alza de la transcripción (Figura 5), preguntamos si estos efectos de activación de la transcripción dependen de p300/CBP. Utilizando una concentración del inhibidor de p300/CBP A485 que maximiza la inhibición del objetivo cuando se combina con EZHi, al tiempo que minimiza la toxicidad (Figura S8A-C), observamos la atenuación de más del 80 % de los genes regulados al alza por EZHi/DNMTi (Figura 6B, C) y los conjuntos de genes GSEA regulados al alza por VD mencionados anteriormente (Figura 6D, E). Del mismo modo, A485 mostró una inhibición dependiente de la dosis de la reactivación de SFRP1 cuando se combinó con EZHi y DAC en el reportero de células HCT116 NLuc (Figura S8D-F). Estos hallazgos indicaron que la activación completa de la transcripción después de EZHi/DNMTi requiere la actividad de p300/CBP.

Sorprendentemente, bloquear tanto la deposición de H3K27ac como la activación de estas vías con A485, que normalmente se asocian con efectos terapéuticos, no rescató el efecto antiproliferativo del tratamiento con EZHi/DNMTi y, en cambio, mejoró o mostró efectos antiproliferativos por sí solo (Figura 6F y S8G). Nuestro trabajo anterior demostró que la inhibición de la señalización del calcio atenuó las respuestas inmunitarias, inflamatorias y de TE en las células HCT116, pero mostramos aquí que esta inhibición también no logra rescatar el efecto antiproliferativo del tratamiento con EZHi/DNMTi (Figura S8H) (^[15]). Es notable que un fenotipo de transcripción compartido en EZHi/DNMTi y A485 es la regulación a la baja de los conjuntos de genes oncogénicos (MYC, punto de control G2/M, objetivos de E2F) (Figura 6D-E y S8I). Estos fenotipos de proliferación y transcripción compartidos sugirieron que la regulación a la baja de las vías oncogénicas contribuye a la eficacia terapéutica en este entorno desprovisto de un compartimento inmunitario.

Aunque nuestra espectrometría de masas de histonas no mostró una pérdida global de H3K27ac (Figura 3I), sí observamos reducciones significativas en la señal de siQ-ChIP de H3K27ac con el tratamiento con EZHi que se produjo principalmente en los promotores de los genes y los potenciadores génicos (Figura S6A y 6A). Es importante destacar que observamos que la pérdida de H3K27ac en los promotores de los genes activos se correlaciona con la regulación a la baja de la transcripción (Figura 6G). Para comprender la relación entre la pérdida de H3K27ac, las distribuciones de H3K27me1 y la transcripción génica, seleccionamos los promotores de los genes con una pérdida significativa de H3K27ac dentro de 20 kilobases de la señal de H3K27me1 (Figura 6H). Es importante destacar que la pérdida de H3K27ac asociada a VD fue más profunda, más numerosa y se correlacionó con la pérdida de H3K27me1 más que la pérdida de H3K27ac asociada a TD en estos promotores de genes (Figura 6H, I). Es notable que las pérdidas más profundas en H3K27me1 tanto para el tratamiento con TD como con VD se produjeron en las regiones génicas activas (Figura 6I). De hecho, este fenotipo epigenético corresponde a la pérdida de H3K27me1 observada con TAZ y VAL en la Figura 4 que se produce en los cuerpos de los genes activos. A continuación, analizamos la señal de H3K27ac (Figura 6J), H3K27me1 (Figura 6K) y metilación del ADN (Figura 6L) en los cuerpos de los genes. Es importante destacar que todas las tres marcas epigenéticas se reducen en estos genes con el tratamiento con EZHi/DNMTi (Figura 6J-L). Coherente con estos resultados, se ha demostrado previamente que EZH1 promueve la elongación de la ARN polimerasa II para la producción de ARNm de los genes activos (^[42],^[43]). Observamos que la pérdida de H3K27ac fue más profunda cerca y aguas abajo del TSS (Figura 6K), lo que sugiere que la inhibición dual de EZH1/2 bloquea esta función de EZH1. Esto corresponde a la regulación a la baja de la transcripción que es más profunda con la combinación de VD (Figura 6M). Sin embargo, la pérdida de H3K27ac y H3K27me1 por sí sola no es suficiente para mediar esta regulación a la baja de la transcripción, ya que los tratamientos con TAZ y VAL en monoterapia inducen una pérdida similar en estas marcas epigenéticas (Figura 6J, 6K) sin la regulación a la baja de la transcripción de estos genes (Figura 6M).

Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la regulación a la baja de los genes que se transcriben activamente requiere no solo la pérdida de H3K27me1 y H3K27ac, sino también la hipometilación del ADN. Al igual que H3K27me1, los niveles de metilación del ADN son altos en todo el cuerpo del gen de los genes activos y se ha demostrado que regulan la fidelidad de la transcripción (^[44]). Además, trabajos previos de Yang et al. demostraron que la hipometilación del ADN mediada por DAC en todo el cuerpo del gen reduce la producción transcripcional, particularmente de las vías metabólicas y relacionadas con c-MYC (^[45]). En nuestros modelos de tratamiento, DAC solo y en combinación con EZHi indujo regiones diferencialmente hipometiladas (DMR) que se encuentran en todo el genoma, incluidas las regiones génicas de los genes que se transcriben activamente (Figura S8J). El enfoque en las DMR asociadas a VD demostró que las regiones altamente metiladas son más propensas a la pérdida de la metilación del ADN y, significativamente, pierden H3K27me1 con el tratamiento con TAZ y VAL (Figura S8K). En apoyo de esta hipótesis, la regulación a la baja transcripcional de los genes altamente activos se observa principalmente cuando EZHi se combina con DNMTi (Figura 6M). En conjunto, nuestros resultados demuestran que, si bien la deposición de H3K27ac en las células tratadas con VD promueve la activación transcripcional, es posible que no sea el fenotipo primario necesario para mediar el efecto antiproliferativo terapéutico. Más bien, la focalización de la metilación del ADN del cuerpo del gen y H3K27me1 por DNMTi y EZHi, respectivamente, redujo estas marcas en todo el cuerpo del gen activo, lo que resultó en la atenuación de los programas transcripcionales oncogénicos.

Los niveles de expresión de EZH1 predicen la sensibilidad a los inhibidores selectivos de EZH2 combinados con DNMTi

El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) de los tumores de pacientes con COADREAD de TCGA en comparación con las muestras de tejido sólido normal confirmó que los conjuntos de genes pro-supervivencia y oncogénicos, como el punto de control G2M, los objetivos de MYC y los objetivos de E2F, están sobreexpresados en los tumores de adenocarcinoma colorrectal de los pacientes (Figura 7A). Dentro de esta cohorte, los pacientes con la mayor expresión de ARNm de EZH1 en los tumores de COADREAD tuvieron una supervivencia general más pobre que los pacientes con baja expresión de EZH1 (Figura 7B y S9B), mientras que la expresión de EZH2 no hizo esta distinción. Dado que los tratamientos asociados a VAL que se dirigen a EZH1/2 de forma dual demuestran consistentemente una mayor pérdida de H3K27me1 y H3K27ac junto con la regulación a la baja transcripcional (Figura 6), planteamos la hipótesis de que los tumores con alta expresión de proteína EZH1 serían menos sensibles a la inhibición selectiva de EZH2 cuando se combina con DNMTi que con la inhibición dual de EZH1/2. Para probar esta hipótesis en líneas celulares cancerosas, comparamos RKO, que tiene una alta expresión de EZH1 a nivel de proteína, con SW620, una línea celular de cáncer de colon que expresa bajos niveles de EZH1 (Figura 3A). De hecho, las células RKO (EZH1-alto) fueron más sensibles al tratamiento con VD que al tratamiento con TD, mientras que las células SW620 (EZH1-bajo) fueron igualmente sensibles a ambos tratamientos, VD y TD (Figura 7C).

Para comprender la sensibilidad diferencial de las células RKO al tratamiento con TD y VD (y la falta de ella en las células SW620), analizamos las respuestas transcripcionales entre los diferentes tratamientos farmacológicos en las células RKO y SW620. Coherente con nuestra hipótesis, el tratamiento con VD no solo tuvo una mayor activación transcripcional que el tratamiento con TD, sino también una regulación a la baja más pronunciada específica del tratamiento con VD (Figura S9C). En contraste, la respuesta transcripcional en las células SW620 fue similar entre los tratamientos TD y VD tanto para la regulación al alza como para la regulación a la baja de los genes (Figura S9C). Para las células RKO y SW620, el tratamiento con TD y VD reguló al alza las vías proinflamatorias, de respuesta inmune y de señalización del calcio (Figura 7D). Sin embargo, como se analiza en la Figura 6, la activación de estas vías parece ser innecesaria para inducir el efecto antiproliferativo del tratamiento con EZHi/DNMTi en las células cancerosas. Más bien, encontramos que el tratamiento con VD en las células RKO reguló a la baja las vías pro-supervivencia y oncogénicas mejor que las células tratadas con TD, mientras que el tratamiento con TD y VD de las células SW620 reguló a la baja estos conjuntos de genes por igual (Figura 7D y S9D, E). El perfilado epigenético en todo el cuerpo del gen de estos genes de enriquecimiento central de los objetivos de MYC y la fosforilación oxidativa reveló que H3K27ac, H3K27me1 y la metilación del ADN se redujeron significativamente, y los tratamientos asociados a VAL demostraron la mayor pérdida en H3K27ac y H3K27me1 en RKO (Figura S9F). Validamos estos hallazgos a nivel de proteína en las células HCT116, que previamente informamos que también responden al tratamiento combinado con EZHi/DNMTi (Figura 2) (^[15]), y, de hecho, el tratamiento combinado con EZHi/DNMTi da como resultado tanto la reducción de la proteína c-MYC como de los objetivos de MYC (Figura S9G).

Discusión

Nuestro grupo demostró previamente una mayor eficacia en la activación de programas transcripcionales anti-tumorales al combinar DNMTi con la inhibición selectiva de EZH2 (^[15]). En este estudio, ampliamos esta investigación previa para demostrar que el uso de un inhibidor dual de EZH1/2 en combinación con DNMTi muestra una eficacia superior en la remodelación de las vías transcripcionales y la reducción de la proliferación celular, particularmente en las líneas celulares menos sensibles a la inhibición selectiva de EZH2 en combinación con DNMTi.

EZH1 y EZH2 son componentes mutuamente excluyentes del complejo PRC2. Se ha caracterizado bien a EZH2 como la principal subunidad catalítica del complejo PRC2, mientras que las contribuciones de EZH1 a la actividad mediada por PRC2 son menos conocidas. Nuestro estudio apoya a EZH2 como el principal impulsor de la deposición de H3K27me2 y H3K27me3, pero aquí demostramos además que EZH1 es el principal contribuyente a la marca de mono-metilación de H3K27 en ausencia de EZH2. Planteamos la hipótesis de que H3K27me1 tiene un papel regulador importante en ausencia de EZH2 y de la metilación de orden superior. De hecho, cuando inhibimos EZH2 farmacológicamente o genéticamente, observamos un aumento notable en H2K27me1 a pesar de una disminución significativa en los estados de di- y tri-metilación. Mecánicamente, esto sugiere que el PRC2 que contiene EZH2 tiene una preferencia por depositar H3K27me2/3, y por lo tanto, H3K27me1 puede acumularse como resultado de una catálisis deficiente a di- y tri-metilación. Alternativamente, el PRC2 que contiene EZH1 puede depositar más H3K27me1 para compensar la pérdida de me2/me3 en las regiones del genoma transcripcionalmente reprimidas. Nuestros resultados sugieren que quizás ambos mecanismos están en juego, ya que el mantenimiento resultante de H3K27me1 que observamos ocurrió principalmente en las regiones genómicas asociadas con los procesos de desarrollo e identidad celular marcados por una represión profunda de Polycomb.

Si bien la literatura previa se ha centrado principalmente en H3K27me1 como una marca del cuerpo del gen asociada con la expresión génica activa, análoga a la metilación del ADN en todo el cuerpo del gen (^[33]), aquí describimos un papel regulador previamente no reconocido en el que H3K27me1 mediado por EZH1 bloquea la redistribución de las marcas activadoras de H3K27ac. Demostramos que el tratamiento combinado con DNMTi e inhibición dual de EZH1/2 conduce a la pérdida de los tres estados de metilación de H3K27, una disminución de la metilación del ADN y la redistribución de las marcas activadoras de H3K27ac hacia las regiones bivalentes del genoma. Las regiones que ganan H3K27ac dependen de la actividad de p300/CBP para la activación transcripcional y están enriquecidas con perfiles de genes anti-tumorales como la mímica viral, la señalización del calcio y la respuesta inmune. Inesperadamente, también observamos la redistribución de H3K27ac lejos de los genes que impulsan los programas de transcripción oncogénicos, incluidos MYC y los genes objetivo de MYC. Planteamos la hipótesis de que la redistribución de H3K27ac lejos de estos genes probablemente contribuya a la eficacia terapéutica del inhibidor dual además de la activación génica.

Finalmente, identificamos una marca epigenética combinatoria donde ciertas regiones del genoma, particularmente los cuerpos de genes transcripcionalmente activos, están marcadas de forma dual por la metilación del ADN y la metilación basal de H3K27. El tratamiento combinado con PRC2i y DNMTi agota ambas PTM. Cuando tratamos las células con el inhibidor selectivo de EZH2, TAZ, observamos una ganancia en H3K27me1, específicamente en las regiones transcripcionalmente reprimidas marcadas previamente por H3K27me3 y la metilación del ADN. Cuando tratamos con VAL, eliminamos esta ganancia en la marca H3K27me1 y vemos una mayor redistribución de la marca H3K27ac. Estos resultados sugieren una interacción directa entre estas PTM que regulan los cambios transcripcionales inducidos por estos fármacos. Además, estos resultados sugieren que la eficacia terapéutica del tratamiento combinado con EZHi/DNMTi está mediada por la regulación a la baja transcripcional por la hipometilación del cuerpo del gen asociada a DNMTi y la reducción de H3K27me1 asociada a EZHi en todo el cuerpo del gen de los programas de transcripción oncogénicos.

A medida que las pruebas clínicas de los inhibidores selectivos de EZH2 se expanden en popularidad, nuestro trabajo indica el beneficio potencial de extender esto a los inhibidores duales de EZH1/2 (^[46]). Actualmente existe la aprobación de la FDA para TAZ en el sarcoma epitelioide, que exhibe hiperactivación de PRC2 resultante de mutaciones del complejo SWI/SNF, y el linfoma folicular, caracterizado por mutaciones de ganancia de función de EZH2 (^[8],^[9]). SWI/SNF y PRC2 son reguladores principales opuestos de la estructura de la cromatina y la expresión génica. Muchos tumores sólidos tienen mutaciones en SWI/SNF que causan hiperactividad de PRC2; por ejemplo, las células de cáncer de colon pueden tener mutaciones en los genes impulsores ARID1A y SMARCA4 (^[47]). Además, la focalización de EZH1 con inhibidores duales de EZH1/2 en tumores de crecimiento lento o no proliferativos puede ser beneficiosa, ya que los estudios sugieren que las células quiescentes utilizan principalmente el PRC2 que contiene EZH1 (^[48]). Las células de cáncer de colon tratadas con agentes hipometilantes del ADN también tienen una mayor actividad de PRC2 y, por lo tanto, más H3K27me3, lo que proporciona una justificación adicional para la focalización de PRC2 en combinación con la terapia hipometilante del ADN. Estos ejemplos destacan nuevos usos potenciales para estos fármacos aparte de su uso actual aprobado por la FDA.

La mayoría de los ensayos con terapias epigenéticas en tumores sólidos se han realizado en poblaciones muy pretratadas con epigenomas muy alterados; esto ha limitado la información disponible sobre los pacientes que tienen más probabilidades de responder a estas terapias. Además, estas poblaciones no exhiben hiperactividad de PRC2 hasta la terapia con DNMTi, como se señaló anteriormente. Por lo tanto, la hiperactividad de PRC2 en sí misma no es predictiva de la sensibilidad al tratamiento combinado con EZHi/DNMTi. Este estudio proporciona una justificación para el uso de EZH1 como biomarcador en las poblaciones de pacientes para determinar los individuos que tienen más probabilidades de responder a TAZ/DNMTi e indica además el uso preferencial de VAL/DNMTi para los pacientes con alto EZH1. Las direcciones futuras pueden incluir la identificación de biomarcadores concurrentes que ayudarían en las decisiones clínicas para el uso de un inhibidor único o dual de EZHi.

Métodos

Cultivo celular

Las líneas celulares de cáncer de colon HCT116 (ATCC CCL-247), RKO (ATCC CRL-2577), SW620 (ATCC CCL-227) y HEK293T (ATCC CRL-3216) se compraron a American Type Culture Collection (ATCC) y se mantuvieron de acuerdo con las recomendaciones de ATCC. HCT116 (tipo salvaje y la línea de reportero NLuc), SW620 y HEK293T se mantuvieron en medios de cultivo McCoy's (Gibco 16600-082), Leibovitz's L-15 (ATCC 30-2008) o DMEM (Gibco 11995-065), respectivamente. RKO se mantuvo en medio de cultivo RPMI 1640 (Gibco 11875-093) suplementado con L-glutamina (Gibco 25030-081), 0,1 mM de aminoácidos no esenciales (Gibco 11140-050), 1 mM de piruvato de sodio (Gibco 11360070). Todos los medios se suplementaron con 10% de suero fetal bovino (FBS, Millipore Sigma F0926) y 1% de penicilina/estreptomicina (Life Technologies 15140-122) al 5% de CO2 y 37 °C.

Generación de líneas celulares mediante knockout CRISPR/Cas9

El clonado se realizó según lo informado previamente (^[49]). Brevemente, pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0 (plásmido Addgene #62988) se digirió con la enzima de restricción BbsI-HF (New England Biolabs R3539L) en el tampón rCUTSMART (New England Biolabs B6004S) y se purificó utilizando los kits de extracción de ADN de gel y limpieza de ADN de Monarch Spin (New England Biolabs T1120S y T1130S). Los pares de oligonucleótidos para los genes de interés (ver más abajo) se anillaron y se ligaron al vector digerido utilizando la ligasa T4 (ThermoFisher EL0014) y luego se transformaron en células bacterianas ultracompetentes XL-10 Gold (Agilent 200315). Los plásmidos minipreparados (Qiagen 27104) se confirmaron mediante secuenciación de todo el plásmido a través de Plasmidsaurus.

Se transfectaron plásmidos en las líneas celulares diana a una relación de 1 µg:2 µL con XtremeGene HP (Sigma 6366244001) y se seleccionaron con 2 µg/mL de puromicina (Sigma P8833) durante 48 horas. Las células se dividieron en poblaciones clonales de células individuales mediante dilución limitante y se confirmó la inactivación de los clones individuales mediante Western blot para la proteína de interés y secuenciación Sanger de la región guía del CRISPR. Para analizar las mutaciones o inserciones/deleciones en cada alelo de un clon individual, primero amplificamos una región de aproximadamente 400 pares de bases alrededor del sitio de corte de la guía CRISPR (EZH2 For 5’-ACCATGCACAATATTTAGTTGGCT, EZH2 Rev 5’-TGATAGCACTCTCCAAGCTGC-3', EZH1 For 5’-GTTTTGTTAAGCAGCTCTCATTGT-3', EZH1 Rev 5’-CAGTGATCCTGGGTTTACCAGAG-3'), ligamos el amplicón en un vector pGEM-T (Promega A1360) y transformamos el plásmido en células JM109 (Promega L2001) según las instrucciones del fabricante. El ADN plasmídico se amplificó directamente a partir de colonias bacterianas en placas de 96 pocillos mediante amplificación PCR en cadena continua utilizando Temphliphi según el protocolo del fabricante (GE Healthcare 25-6400-10) y se envió a Genewiz para la secuenciación Sanger.

Generación de líneas celulares con shRNA inducible

Las líneas celulares con shRNA se generaron según el protocolo proporcionado por AddGene para el sistema pLKO1 para la clonación y la expresión inducible de shRNA (AddGene 21915) (^[50],^[51]). En resumen, el plásmido TET-pLKO-puro (Addgene 21915) se digirió con AgeI y EcoRI, y el fragmento se purificó mediante electroforesis en gel. Los oligonucleótidos shRNA se seleccionaron de la lista de la biblioteca shRNA del consorcio RNAi del Broad Institute. Los oligonucleótidos se solicitaron, se unieron y luego se ligaron al plásmido digerido. La secuencia del plásmido se confirmó mediante Plasmidsaurus.

El plásmido para el shEZH1 inducible con doxiciclina se transfectó en células HEK293T (ATCC CRL-3216) con los plásmidos de empaquetamiento pPAX2 (Addgene 12260) y pMD2.G (Addgene 12259) para producir lentivirus. Un clon de control CRISPR Chr12 de RKO (clon B2) o un clon de KO CRISPR de EZH2 (clon A8-5) se infectaron con medio que contenía virus mezclado con 1 mg/mL de polibreno (Millipore TR-1003-G) seguido de la selección con 2 µg/mL de puromicina (Sigma P8833). Para probar la inactivación, las células se trataron con 20 ng/mL de doxiciclina (Cayman Chemical 14422) durante 72 horas, se recogieron y se analizaron mediante Western blot como se indica a continuación, y se sondearon con un anticuerpo anti-EZH1 (Cell Signaling 42088).

Preparación y uso de moléculas pequeñas

5-aza-2’-desoxicitidina (DAC o decitabina, Sigma A3656), A485 (Cayman Chemicals 24119), A-395 (Cayman Chemicals 20257), CPI-169 (Selleck Chemicals S7616), CPI-1205 (Selleck Chemicals S8353), EED226 (MedChemExpress HY-101117), ciclosporina A (CsA, Selleck Chemicals S2286), EEDi-5285 (MedChemExpress HY-136977), EPZ0011989 (Selleck Chemicals S7805), EPZ005687 (Cayman Chemical 13966), EZH2 Degrader-2 (MedChemExpress HY-157164), GSK126 (Selleck Chemicals S7061), GSK343 (Selleck Chemicals S7164), GSK503 (Cayman Chemical 18531), MAK683 (MedChemExpress S8983), mevrometostat (MEV o PF-1497, Chemietek CT-PF0682), MS177 (Selleck Chemicals E1163), MS1943 (MedChemExpress HY-133129), ORIC-944 (Selleck Chemicals E1967), tazemetostat (TAZ o EPZ6438, Selleck Chemicals S7128), tulmimetostat (TUL o CPI-0209, Selleck Chemicals E1497), UNC1999 (Caymen Chemical 14621), valemetostat (VAL o DS-3210b, Chemietek CT-DS3201) y UNC6852 (MedChemExpress HY-130708) se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) al 100% a 5 o 10 µM y se almacenaron a -20°C. Las células adheridas se trataron con cada fármaco o vehículo (DMSO, % equivalente) durante 72 horas sin cambio de medio.

Ensayos de viabilidad celular y crecimiento

Para medir la viabilidad celular, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 3-4000 células/pocillo y se trataron al día siguiente. Se utilizó el kit CellTiter-Fluor (Promega G6080) según el protocolo del fabricante, y la señal de fluorescencia se midió utilizando un lector de microplacas BiotTek SynergyNeo2. Se restó la señal de fondo de los pocillos que contenían solo medio para obtener las unidades de fluorescencia relativas (UFR) finales.

Para medir el crecimiento de las células RKO y SW620 a lo largo del tiempo, se sembraron aproximadamente 5000 células/pocillo en placas de 24 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. Al día siguiente, se aplicaron fármacos epigenéticos, incluido el DAC (300 nM) con o sin TAZ o VAL (1 µM) y/o A485 (10 µM) en medio fresco a las células adheridas. Para cada pocillo y tratamiento, un Sartorius Incucyte S3 capturó de 9 a 12 imágenes de campo claro en cada punto temporal, y se calculó la confluencia media (%) por pocillo y punto temporal utilizando el software de Sartorius.

Para medir el crecimiento de HCT116 después del pretratamiento, se sembraron 100 000 células/pocillo en una placa de seis pocillos y las células adheridas se trataron con fármacos epigenéticos (DAC [30 nM] con o sin TAZ o VAL [1 µM]) y/o CsA (5 µM) en medio fresco al día siguiente. Después de 72 horas, las células se resembraron y se volvieron a tratar durante un segundo ciclo de tratamiento de 72 horas, para un total de 6 días de pretratamiento. A los 6 días, se sembraron 40 000 células/pocillo en una placa de seis pocillos y se volvieron a tratar con los fármacos por tercera vez, lo que se representa como "día 0" en los gráficos de confluencia después de los pretratamientos. El Sartorius Incucyte S3 capturó 12 imágenes de campo claro en cada punto temporal, y se calculó la confluencia media (%) por pocillo y punto temporal utilizando el software de Sartorius.

Ensayo de reportero celular SFRP1-NanoLuciferasa

Anteriormente, informamos sobre la ingeniería de la línea celular de reportero SFRP1-NanoLuciferasa (^[15]). En resumen, se insertó previamente una casete de NanoLuciferasa (NLuc) en el exón 2 de un alelo endógeno de SFRP1 en células de cáncer de colon HCT116 hipomórficas de DNMT1 con metilación reducida del ADN (^[19]). Para medir la actividad de NLuc en las células de reportero SFRP1-NLuc, el ensayo CellTiter-Fluor se combinó con el sistema de ensayo de luciferasa Nano-Glo (Promega N1110). Primero, las células se sembraron y se trataron en placas de 96 pocillos como se indicó anteriormente para los ensayos de viabilidad celular. Para combinar los ensayos, se utilizó CellTiter-Fluor a una concentración de 5x antes del ensayo Nano-Glo. Se aplicó el reactivo NanoGlo según el protocolo del fabricante, y se utilizó un lector de microplacas BioTek SynergyNeo2 para obtener unidades de luminiscencia relativas (ULR). Después de restar el fondo de los pocillos que contenían solo medio, las ULR se normalizaron a las UFR de CellTiter-Fluor para tener en cuenta la viabilidad celular.

Transfección con siRNA

Se transfectaron las mezclas SMART de ON-TARGETplus siRNA (5 µl de un stock de 20 µM) dirigidas a DNMT1, EZH1, EZH2, MYC o SUZ12 (Dharmacon L-004605-00-0005, L-004217-00-0005, L-004218-00-0005, L-003282-02-0005 y L-006957-00-0010) y las mezclas de control de siRNA no dirigidas (Dharmacon D-001810-10-05) o Lipofectamine RNAiMax (5 µl, ThermoFisher 13778075) se diluyeron por separado en 100 µl de Optimem (Life Technologies 31985-062). El siRNA diluido y el RNAiMax se mezclaron 1:1 y se incubaron durante 20 minutos. El medio de McCoy, con o sin DAC (30 nM) y suplementado con un 10% de FBS pero sin antibióticos, se renovó en las células adheridas que se habían sembrado el día anterior a 100 000/pocillo en una placa de seis pocillos. La mezcla de siRNA/lípidos se añadió por goteo al medio fresco para una concentración final de siRNA de 50 nM. Las células se recogieron 72 horas después de la transfección o se dividieron y se recogieron 96 horas después (un total de siete días).

Cribado de siRNA a nivel del genoma

La línea celular de reportero NLuc se utilizó en combinación con una biblioteca de siRNA a nivel del genoma (Biblioteca de siRNA ON-TARGETplus para todo el genoma – SMARTpool, Dharmacon G-105005). Las mezclas de siRNA de la biblioteca contenidas en placas de 384 pocillos se resuspendieron en un tampón de siRNA 1x (Dharmacon B-002000-UB-100) a 2 µM para un almacenamiento a largo plazo a -80°C y las placas secundarias intermedias se diluyeron a 500 nM en agua libre de RNasa para un almacenamiento a corto plazo a -20°C. Para la retrotransfección de las células, se añadió 1 µl del reactivo de transfección Oligofectamine diluido (ThermoFisher 1225201, 0,09 µl en 0,91 µl de agua libre de RNasa) a cada pocillo utilizando una pipeta electrónica Viaflo384 (Integra Biosciences). A continuación, se añadió 4,5 µl de cada mezcla de siRNA de las placas secundarias a los pocillos individuales. Las placas se centrifugaron a 300 g durante 1 minuto para mezclar el Oligofectamine y el siRNA y luego se incubaron durante 20-30 minutos. Durante esta incubación, las células de reportero NLuc se trataron con tripsina, se contaron y se resuspendieron en medio de McCoy suplementado con un 10% de FBS sin antibióticos; se añadieron aproximadamente 275 células en 39,5 µl de medio a cada pocillo, lo que dio como resultado una concentración final de siRNA de 50 nM. Las placas se centrifugaron de nuevo brevemente a 300 g y se incubaron a 5% de CO2 y 37°C. Dado el tamaño del cribado y la capacidad del manipulador de líquidos Viaflo, el cribado se dividió en cuatro partes, y todos los componentes y pasos se mantuvieron exactamente iguales.

Después de siete días, se utilizó un Sartorius Incucyte S3 para capturar imágenes de campo claro de cada pocillo para capturar la confluencia (%) como un indicador del número y la viabilidad de las células (Figura S1A). Se aplicaron 45 µl de reactivo NanoGlo según el protocolo del fabricante, y se utilizó un lector de microplacas BioTek SynergyNeo2 para obtener unidades de luminiscencia relativas (ULR). Después de restar el fondo de los pocillos que contenían solo medio, las ULR se normalizaron a la confluencia (%) para tener en cuenta el número de células. Para excluir los falsos positivos, se omitieron los genes que se expresan muy poco o nada (CPM