Modelado de la modulación del microbioma en las redes metabólicas tumorales para predecir terapias sinérgicas

Existe un interés creciente en comprender el impacto que los microbios tienen en el metabolismo del cáncer y, posteriormente, en la progresión del cáncer y los resultados del tratamiento.^[1] La variabilidad interpaciente en la respuesta al tratamiento se debe, en parte, a la variación individual en el microbioma del microambiente tumoral (MAT).^[2] Varios microbios se han relacionado con la progresión del cáncer y la resistencia a los fármacos, siendo Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum, Fn) el que presenta la evidencia más sólida en el cáncer colorrectal (CCR).^[3]–^[5] En los Estados Unidos, el CCR afecta al 4% de la población, y el 15-20% de los pacientes experimentan resistencia a los fármacos quimioterapéuticos, y el 30-40% sufren recurrencia del cáncer.^[6] Las altas tasas de resistencia a la quimioterapia, junto con el aumento de la incidencia de CCR en pacientes menores de 55 años, subrayan la urgente necesidad de nuevas estrategias terapéuticas.^[6]–^[8] Aunque los regímenes de múltiples agentes, como la combinación de ácido folínico (leucovorina), 5-fluorouracilo y oxaliplatino (FOLFOX), han mejorado los resultados, el 50-70% de los pacientes con CCR metastásico siguen sin responder.^[9],^[10] La variabilidad interpaciente en la respuesta al tratamiento se debe, en parte, a la variación individual en el microbioma del microambiente tumoral.^[2],^[11]–^[14] Estas complejidades presentan un importante obstáculo en el tratamiento del CCR y requieren enfoques más dinámicos y específicos para cada paciente.

Para abordar este desafío, investigamos cómo los agentes terapéuticos y los microbios asociados al tumor modulan el metabolismo del CCR. Las células de CCR exhiben una actividad glucolítica elevada y reprograman dinámicamente su metabolismo en función de las mutaciones oncogénicas, la disponibilidad de nutrientes y las presiones ambientales.^[1] Por ejemplo, en condiciones de agotamiento de la glutamina, las células de CCR pueden modificar sus programas metabólicos para favorecer la biosíntesis de asparagina.^[15]–^[17] Muchas terapias de primera línea para el CCR se dirigen directamente a las vías metabólicas, incluida la alteración de la biosíntesis de nucleótidos por parte del fluorouracilo.^[18],^[19] La fuerte relación entre el CCR y el metabolismo sirve de base para utilizar la alteración metabólica para predecir vulnerabilidades terapéuticas no evidentes.

La complejidad del tratamiento del CCR se ve aún más complicada por la influencia metabólica de los microbios intestinales, como Fn. Las variaciones en la composición del microbioma se han relacionado con la resistencia a la quimioterapia y los malos resultados clínicos.^[20],^[21] Aunque Fn es principalmente un comensal oral y rara vez se detecta en el colon sano, múltiples estudios informan de su enriquecimiento en los tumores de CCR.^[3],^[4],^[22] Además, Fn puede modular metabólicamente las células cancerosas.^[23],^[24]
La relación conocida de Fn con el cáncer de colon y su impacto metabólico lo convierten en una especie microbiana ideal para investigar los efectos metabólicos inducidos por los microbios en las respuestas a los fármacos y la inmunoterapia.

Hipótesis que estos cambios metabólicos, que hacen que el CCR sea resistente a las quimioterapias convencionales, podrían aprovecharse para identificar nuevas combinaciones de fármacos no intuitivas que contrarresten la reprogramación metabólica impulsada por los microbios. La modelización de esta interacción tripartita entre microbios, células cancerosas y agentes terapéuticos exige marcos computacionales que puedan capturar conjuntamente las limitaciones metabólicas y los patrones de respuesta a los fármacos. Para abordar los desafíos de simular la compleja interacción de microbios, células cancerosas y respuesta a los fármacos, aquí aplicamos una combinación de aprendizaje automático (ML) y modelado metabólico a escala genómica (GEM). Los GEM se han utilizado para estudiar los microbiomas y las interacciones microbio-huésped, pero no se han ampliado para predecir las respuestas a los fármacos o para identificar combinaciones de fármacos sinérgicas en presencia de microbios específicos.^[25]–^[32] De manera similar, los métodos de ML existentes pueden predecir las interacciones fármaco-fármaco, pero rara vez incorporan las influencias microbianas de las combinaciones microbio-fármaco.^[23],^[33]–^[35]

Aquí presentamos un nuevo marco Onco-Microbiome-GEM-ML (OMG-ML), que integra los GEM con el ML para identificar patrones metabólicos asociados con interacciones fármaco-microbio sinérgicas o antagónicas. Una innovación clave de OMG-ML es su incorporación de la modulación metabólica inducida por los microbios, lo que permite al modelo tener en cuenta los impactos del microbioma asociado al tumor en la respuesta a los fármacos. En el CCR, donde tanto la resistencia intrínseca a los fármacos como la modulación de la respuesta al tratamiento impulsada por los microbios son relevantes, hipotetizamos que OMG-ML se puede utilizar para identificar combinaciones de fármacos que sean eficaces en las células tumorales, tanto en condiciones estándar como en presencia de Fn y otros microbios. OMG-ML es fácilmente adaptable a otras especies microbianas y puede refinarse continuamente con datos emergentes sobre la sinergia de los fármacos, lo que permite su aplicación en diversos tipos de cáncer y contextos biológicos para descubrir combinaciones de tratamientos conscientes del microbioma.

Primero demostramos que OMG-ML predice con precisión las interacciones entre pares de fármacos y luego lo extendemos para simular las interacciones microbio-fármaco y las interacciones microbio-microbio-fármaco. En particular, el modelo descubrió varias combinaciones de fármacos altamente sinérgicas para tratar el CCR, incluida la cabazitaxel combinada con el acetato de megestrol. De manera significativa, también identificó fármacos, como el metotrexato y el fluorouracilo, que exhiben una mayor eficacia en presencia de Fn. Además, el marco reveló agentes como el talidomida y el pralatrexato, cuyos efectos predichos varían según la especie microbiana presente, lo que destaca la importancia de incorporar la modulación metabólica específica del microbio en el diseño terapéutico. En conjunto, estos resultados establecen OMG-ML como un método potente para integrar el modelado metabólico con el ML para guiar el diseño de tratamientos conscientes del microbioma y permitir el descubrimiento personalizado de combinaciones de fármacos.

Resultados

Predicción de combinaciones de quimioterapia

El análisis del equilibrio de flujo (FBA) de los GEM acoplado con el ML ofrece un marco mecanicista para identificar las vías metabólicas subyacentes a las combinaciones de fármacos eficaces. Los GEM permiten la simulación de combinaciones de factores estresantes por pares y de orden superior, y el ML identifica patrones de flujo no lineales que predicen resultados sinérgicos. En este enfoque, los GEM se restringen utilizando datos transcriptómicos de tratamientos individuales con fármacos para generar estados metabólicos específicos del tratamiento. Estos estados se combinan posteriormente para representar la respuesta metabólica a las combinaciones de fármacos, y las características basadas en el flujo resultantes se utilizan para entrenar un modelo de bosque aleatorio sobre las puntuaciones de sinergia de fármacos derivadas experimentalmente.^[36]

Nuestro modelo, basado en esta técnica, OMG-ML, se entrenó utilizando datos transcriptómicos de 110 tratamientos con fármacos en células HCT116 y HT29 obtenidos de la biblioteca de firmas celulares basadas en redes integradas (LINCS) y 6.514 combinaciones de quimioterapia de SynergyxDB.^[37],^[38] Las células HT29 son células epiteliales estables de microsatélites aisladas del colon de una paciente y tienen un fenotipo menos agresivo en comparación con las células HCT116.^[39] Las células HCT116 son células epiteliales inestables de microsatélites aisladas del colon de un paciente y se utilizan a menudo para estudiar la metástasis del CCR.^[40] El uso de estas líneas celulares proporciona una representación diversa de los fenotipos del CCR para mejorar la generalizabilidad del modelo en los subtipos de CCR. Los modelos de tratamiento individual con fármacos se combinaron para formar vectores de características compuestos para cada combinación de fármacos. Se entrenó un bosque aleatorio utilizando estas características y las puntuaciones de sinergia de combinaciones de fármacos conocidas de LINCS. Se seleccionó un bosque aleatorio debido a su rendimiento superior en comparación con otros modelos de ML basados en la validación cruzada de diez pliegues (área bajo la curva de sinergia (AUC) = 0,79, AUC de antagonismo = 0,73, r de Pearson = 0,54) (Figura suplementaria 4f). El modelo de ML basado en el flujo también superó a la entrada directa de datos transcriptómicos (Figura suplementaria 4a-e) y fue altamente significativo en comparación con las permutaciones aleatorias (valor p = 0,001) (Métodos). La figura 1 representa una descripción gráfica del desarrollo de OMG-ML. Este marco permite la predicción a partir de perfiles de flujo metabólico celular humano para tratamientos con fármacos y condiciones de cocultivo microbiano no vistos previamente.

El modelo entrenado se utilizó para predecir 6.333 nuevas puntuaciones de sinergia de combinación de fármacos (3.163 combinaciones de fármacos en células HCT116 y 3.170 en células HT29). Según el modelo de Loewe, la sinergia se define como valores negativos e indica que el fármaco tuvo un mejor rendimiento en la combinación que solo. Las combinaciones sinérgicas a menudo incluían cabazitaxel (un taxano utilizado para tratar el cáncer de próstata resistente a la castración). Las 15 combinaciones más sinérgicas en las células HCT116 fueron combinaciones que incluían cabazitaxel (Figura suplementaria 2). Una de estas combinaciones sinérgicas fue cabazitaxel y megestrol, lo que se confirmó in vitro y mostró fuertes efectos sinérgicos (Figura 2). El megestrol, o acetato de megestrol, es una forma sintética de progesterona y no se ha utilizado como tratamiento para el cáncer de colon, pero se ha utilizado para aumentar el apetito de los pacientes después de la quimioterapia.^[41] De las combinaciones predichas, 11 se evaluaron in vitro (Figura 2a). Estas fueron combinaciones de cabazitaxel o megestrol con erlotinib, gemcitabina, metformina, metotrexato y sorafenib. Los valores predichos y los valores experimentales demostraron una correlación de Pearson de 0,48, similar a la evaluación de la validación cruzada, lo que sugiere un rendimiento sinérgico generalizable.

Para probar aún más el rendimiento del modelo, se compararon las puntuaciones de combinación predichas con nuevas puntuaciones de SynergyxDB. Desde el desarrollo y el entrenamiento inicial del modelo, se han informado 554 combinaciones de fármacos adicionales para la línea celular de CCR HCT116, junto con 32 nuevas combinaciones para la línea celular HT29. Aplicamos nuestro modelo entrenado para predecir las puntuaciones de sinergia para estas combinaciones recién agregadas y comparamos los valores predichos con las puntuaciones de sinergia medidas experimentalmente. Las predicciones del modelo se correlacionaron significativamente con estas puntuaciones para ambas líneas celulares, con un r de Pearson de 0,51 para las combinaciones de HCT116 y 0,79 para las combinaciones de HT29 (Figura 2c-d).

Los resultados son comparables al rendimiento de modelos similares. El modelo CARAMeL, que utilizó técnicas de ingeniería de características y basadas en el flujo similares, también logró una correlación similar en nuevas combinaciones de antibióticos.^[42] Modelos similares que predicen la sinergia de la combinación de fármacos para el CCR, como el de Tsiryouli et al., que integra datos multiómicos y clasificaciones de subtipos moleculares de consenso, lograron valores de AUC que oscilan entre ~0,5 y 0,78.^[43] Nuestro modelo se destaca de los métodos existentes por su interpretabilidad de las vías de interés y su capacidad para tener en cuenta los efectos metabólicos de los tumores, la quimioterapia y el microbioma.

Otras combinaciones predichas por el modelo tienen respaldo en la literatura. Por ejemplo, MK1775 es un inhibidor selectivo de la quinasa Wee1 que ha demostrado mejorar los efectos del fluorouracilo en las células de cáncer de colon.^[42] Nuestra predicción de esta combinación se alinea con esta observación (puntuación de Loewe predicha = -0,31). Estos resultados brindan apoyo a la precisión de las predicciones de nuestro modelo.

Información metabólica sobre los tratamientos de combinación de fármacos

Como se esperaba de estudios anteriores, la reprogramación del flujo metabólico inducida por fármacos individuales refleja sus mecanismos de acción subyacentes, y los fármacos con mecanismos de acción similares se agrupan.^[36],^[44]

Dado que el modelo de ML se entrena utilizando datos de entrada metabólicos, analizamos a continuación qué reacciones contribuyen más a la precisión predictiva del modelo. Al identificar las características de mayor rango, destacamos reacciones metabólicas específicas que están más fuertemente asociadas con combinaciones de fármacos eficaces. La figura suplementaria 1c representa el flujo normalizado a través de las 25 características principales para todos los tratamientos con fármacos y la clasificación de cada fármaco como "sinérgico" o "antagónico". Como se muestra en la figura suplementaria 1c, el uso de estas características permite la separación entre fármacos sinérgicos y antagónicos.

Estas características pueden utilizarse para comprender el mecanismo subyacente que explica por qué se predijo que el cabazitaxel sería más eficaz que el paclitaxel (Fig. 2f). Esta comparación es importante porque el paclitaxel y el cabazitaxel son moléculas muy similares a nivel mecanístico, pero generaron predicciones muy diferentes.^[45] Estas características principales son especialmente informativas porque el cabazitaxel y el paclitaxel presentan perfiles metabólicos generales muy similares (distancia euclidiana = 4,2), en comparación con sus distancias promedio de otros fármacos (21,9 para el cabazitaxel, 22,1 para el paclitaxel). Al centrarnos en las diferencias de flujo en estas características mejor clasificadas, podemos identificar distinciones metabólicas sutiles pero significativas que pueden explicar sus predicciones de sinergia divergentes, a pesar de su similitud global.

Las cinco combinaciones de fármacos más sinérgicas en las células HT29 fueron el cabazitaxel combinado con erlotinib, navitoclax, estramustina fosfato sódico, pazopanib o MK1775. Como se muestra en la Fig. 2f, el cabazitaxel disminuyó de forma única la actividad de la citidilato quinasa, al tiempo que aumentaba el flujo a través de varias reacciones clave, incluidas la poliglutamato sintetasa, la fosfolipasa C, la isocitrato deshidrogenasa, la deshidrocolesterol reductasa y la lanoesterol oxidasa. Los fármacos asociados mostraron efectos variables en estas vías, exhibiendo generalmente una menor actividad de la lanoesterol oxidasa y la fosfolipasa C, y un mayor flujo de la citidilato quinasa en relación con el cabazitaxel solo.

Predicciones OMG-ML de fármacos en combinación con Fn

Dado el creciente reconocimiento de que el cáncer colorrectal (CCR) está fuertemente influenciado por el microbioma tumoral, Fn ha surgido como un factor microbiano particularmente relevante debido a su enriquecimiento constante en el CCR y sus funciones informadas en la reprogramación metabólica y la respuesta terapéutica. Para capturar estos efectos impulsados por el microbioma, el modelo se amplió para incorporar la influencia de los microbios en el metabolismo celular y la respuesta a los fármacos. Este enfoque se basa en la premisa de que los efectos metabólicos de los microbios individuales se asemejan a los de los tratamientos farmacológicos, pero siguen siendo distintos, capturando las perturbaciones específicas de cada microbio (Fig. 2e). Además, en este estudio, identificamos 254 genes metabólicos que se expresan de forma diferente en las células de CCR cultivadas en co-cultivo con Fn. Esto indica el profundo impacto que los microbios tienen en el metabolismo del CCR y las respuestas al tratamiento.

Se utilizó la transcriptómica de las células HCT116 del cáncer colorrectal tratadas con Fn (GSE141805) con el análisis de equilibrio de flujo (FBA) para generar un nuevo vector metabólico específico de las condiciones que representara los efectos metabólicos que Fn tuvo en las células HCT116.^[46] Esto se utilizó como se describió anteriormente para generar perfiles conjuntos con los 110 perfiles metabólicos de tratamiento con fármacos individuales y predecir las puntuaciones de sinergia fármaco-bacteria. Repetimos este proceso con los datos transcriptómicos de las células HT29 tratadas con Fn (GSE90944).^[47] Para las combinaciones de dos fármacos, la presencia de Fn alteró significativamente las respuestas predichas en relación con las predicciones sin Fn (p ≪ 0,05).

No se predijo que la mayoría de los fármacos fueran sinérgicos con Fn (Fig. 3c). Las predicciones se compararon con un estudio en el que a pacientes con CCR con presencia de Fn se les administró capecitabina y un estudio sobre muestras de pacientes con Fn combinadas con fluorouracilo.^[48],^[49] Los pacientes tratados con capecitabina mostraron altas tasas de recurrencia, lo que se correlaciona con nuestra predicción de que la capecitabina no es una combinación sinérgica con Fn. Por el contrario, se predijo que el fluorouracilo sería fuertemente sinérgico, lo que es consistente con su eficacia en el tratamiento del cáncer de colon.^[49]

El fármaco que se predijo que sería más sinérgico en ambas líneas celulares fue el cabazitaxel, similar a las predicciones realizadas para las combinaciones de dos fármacos sin Fn. Se predijo que el segundo fármaco más sinérgico para ambas líneas celulares sería el ixabepilone. El ixabepilone es un taxano que se utiliza habitualmente para tratar el cáncer de mama en pacientes que no responden al docetaxel o al paclitaxel.^[50] También se sabe que demuestra sinergia con varios otros fármacos, incluido el capecitabina y el brivanib.^[51] Curiosamente, el modelo predijo que el ixabepilone estaría involucrado en muchas de las combinaciones más sinérgicas, tanto con como sin Fn (Fig. 3c).

Tres de las combinaciones predichas se validaron in vitro (Fig. 3d) utilizando un sistema de co-cultivo que implica una configuración de gas asimétrica con condiciones de cultivo tanto aeróbicas como anaeróbicas, para permitir que tanto el monocapa de células HCT116 como Fn crezcan eficazmente (Fig. 3a).^[52] El bajo número de muestras se debió a la complejidad del sistema experimental de co-cultivo, que requiere un bajo rendimiento y una optimización cuidadosa. A pesar de estas limitaciones, este sistema de modelado es una recapitulación mucho más precisa del microentorno tumoral en comparación con los métodos de mayor rendimiento. Esto nos permite evaluar la capacidad predictiva y la relevancia fisiológica de las predicciones del modelo. Los principales candidatos para probar se priorizaron a partir de experimentos iniciales sin Fn (Fig. 2a). Se probó el fluorouracilo, dado su relevancia clínica para el CCR, y como se predijo que sería sinérgico en presencia de Fn.^[49] Se seleccionó la metformina para representar los resultados de una combinación no sinérgica. Se probó el metotrexato por su novedad en este entorno, que se ha aplicado al cáncer de colon, pero no suele ser un tratamiento de primera línea.^[53] Además, se sabe que el metotrexato altera el microbioma en los pacientes, pero no se ha estudiado en relación con Fn.^[54] Inicialmente, también se aplicó el cabazitaxel. Sin embargo, debido a su mala solubilidad, el cabazitaxel era incompatible con el sistema de co-cultivo.

El modelo se optimizó para predecir las puntuaciones de Loewe, mientras que los experimentos con Fn dieron como resultado las puntuaciones de Bliss. Por lo tanto, las puntuaciones sin procesar de la predicción del modelo y los experimentos no se pueden comparar directamente, ya que el modelo predice las puntuaciones de Loewe y los resultados del experimento están en las puntuaciones de Bliss. Utilizamos la independencia de Bliss para el análisis experimental porque los fármacos se examinaron a concentraciones fijas con las bacterias determinadas por sus perfiles de dosis-respuesta individuales, lo que hace que el marco de Bliss sea más apropiado para este diseño. Por el contrario, el modelo utiliza la aditividad de Loewe, que define la sinergia en relación con la aditividad de la dosis del mismo compuesto y es más adecuado para evaluar las interacciones computacionalmente en espacios de concentración continuos. Tanto el fluorouracilo como el metotrexato demostraron efectos sinérgicos con Fn in vitro, lo que se alinea con las puntuaciones predichas que son altamente sinérgicas (Fig. 3d). Por el contrario, la metformina mostró efectos antagónicos en el sistema de co-cultivo, lo que redujo la eficacia en presencia de Fn (Fig. 3d). Esto es de esperar, ya que la puntuación predicha para la metformina + Fn (−0,12) se clasificó como la 77.ª más eficaz de 111 fármacos, mientras que el fluorouracilo + Fn se clasificó en el 4.º lugar y el metotrexato + Fn en el 14.º lugar. Por lo tanto, la dirección cualitativa de la sinergia y los efectos relativos de los fármacos en combinación con Fn se alinean con la eficacia predicha.

Perspectivas metabólicas sobre los tratamientos con Fn

Las características principales del modelo se utilizaron a continuación para encontrar las reacciones que son predictivas de la sinergia fármaco-microbio. La Fig. 3b muestra las 25 características principales y su flujo relativo para los tratamientos que son sinérgicos y antagónicos con Fn. Los fármacos demuestran una gran variabilidad entre sí, y en relación con las células tratadas solo con Fn, entre estas características principales.

Un patrón que justificó una mayor investigación fue el aumento del flujo de la importación de cisteína-glicina y la actividad de la alanil aminopeptidasa (cisteína-glicina) en las células tratadas con fluorouracilo y metotrexato, en contraste con la disminución de la actividad de las mismas reacciones en las células tratadas con Fn (Fig. 3b). Para probar si esta reacción estaba relacionada con la actividad antitumoral del fluorouracilo y el metotrexato, las células en co-cultivo se trataron con estos fármacos individuales y erastina. La erastina es una molécula pequeña que inhibe la importación de cisteína a través de SLC7A11 y acelera el estrés oxidativo.^[55] Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que la erastina interrumpiría el transporte de cisteína y atenuaría los efectos sinérgicos observados con el fluorouracilo y el metotrexato. En consonancia con esto, la puntuación de Bliss para el fluorouracilo y Fn disminuyó en un 92% y la puntuación para el metotrexato y Fn disminuyó en un 85% con la adición de erastina (Fig. 3d). Curiosamente, la erastina y Fn mostraron débiles efectos sinérgicos (puntuación de Bliss = 0,13), lo que sugiere que Fn puede sensibilizar parcialmente a las células al estrés oxidativo cuando se inhibe la importación de cisteína.

Además, tres de los fármacos sinérgicos tienen un aumento de la actividad de las reacciones de fosfatidilinositol, mientras que los fármacos antagónicos y los tratamientos con Fn tienen un flujo disminuido a través de esta reacción (Fig. 3b). El metabolismo del inositol tiene una fuerte relación con el CCR, ya que se ha demostrado que el hexafosfato de inositol tiene actividad anticancerígena y mejora la eficacia de la quimioterapia.^[56],^[57] Esta observación se examinó más a fondo in vitro utilizando el inhibidor de la fosfolipasa C U73122. El tratamiento de las células HCT116 con U73122 en presencia de Fn dio como resultado una sinergia mínima (Fig. 3d). Sin embargo, la adición de fluorouracilo o metotrexato al tratamiento con U73122 y Fn condujo a interacciones antagónicas débiles (Fig. 3d).

Estos resultados sugieren que el efecto sinérgico del fluorouracilo y el metotrexato con Fn está mediado en parte por perturbaciones en el metabolismo de la cisteína y el metabolismo del fosfatidilinositol, y la inhibición concurrente de estas vías reduce su efecto sinérgico según el modelo de independencia de Bliss de las interacciones farmacológicas.

Predicciones de combinaciones de fármacos e inmunoterapia con otros microbios

La conexión entre los microbios y los fármacos contra el cáncer se está investigando cada vez más, particularmente en el CCR.^[11],^[20] Sin embargo, la comunidad microbiana intestinal es increíblemente diversa entre los pacientes, lo que dificulta determinar el impacto exacto de los microbios individuales.^[11] Por lo tanto, además de Fn, se agregaron cuatro especies microbianas más al modelo para las predicciones de combinación de fármacos. Estos microbios fueron Aeromonas veronii (A. veronii, Av), Escherichia coli (E. coli, Ec), Enterococcus gallinarum (E. gallinarum, Eg) y Streptococcus gallolyticus (S. gallolyticus, Sg).^[58]–^[60]

Sg y Ec se seleccionaron por sus fuertes vínculos con el CCR. ^[11] Además, incluimos Eg (un posible agente terapéutico) y Av (un patógeno intestinal) para analizar la diversidad de las influencias microbianas.^[59],^[61]

Estos microbios también se seleccionaron porque tenían un impacto transcriptómico en las células HT29 en co-cultivo que se podía mapear al modelo metabólico RECON1. Sin embargo, los efectos del co-cultivo microbiano en las células HT29 fueron considerablemente más débiles que los de los tratamientos farmacológicos, lo que requirió un umbral de puntuación z más bajo para identificar los genes expresados de forma diferencial (±1 para los tratamientos farmacológicos frente a ±0,2 para el co-cultivo bacteriano). Dado que el tiempo de residencia de estos microbios en el colon es mucho mayor que el de los fármacos, hipotetizamos que estos pequeños cambios transcriptómicos aún podrían tener un impacto metabólico significativo.

Las predicciones de microbios condicionadas con combinaciones de dos fármacos revelaron una reducción consistente y significativa de la sinergia de los fármacos en todos los microbios probados, con Fn ejerciendo el efecto más fuerte, seguido de Eg, Sg, Av y Ec (FDR < 0,001 para todos). Además, las puntuaciones predichas para cada combinación microbio-fármaco difirieron significativamente en todos los pares, excepto para Eg frente a Av y Sg frente a Av (Fig. 4a). Además, el cabazitaxel, el ixabepilone y el fluorouracilo se clasificaron constantemente entre las cinco combinaciones más sinérgicas en todos los tratamientos bacterianos. En particular, los resultados de la interacción de los fármacos variaron tanto entre las cepas microbianas como entre las dos líneas celulares del cáncer colorrectal (Fig. 4b, Fig. 5b complementaria). Estas diferencias probablemente reflejen las características biológicas específicas de la línea celular, como los distintos antecedentes genéticos o los estados metabólicos, y pueden indicar una modulación metabólica diferencial por las especies microbianas individuales.^[62]

Dado que el microbioma del colon rara vez es una monocultura, simulamos a continuación los efectos de combinaciones por pares de microbios, con y sin tratamientos farmacológicos (Fig. 4b, Fig. S5a–b). Algunas combinaciones de microbios mostraron fuertes efectos sinérgicos sobre los fármacos en comparación con los microbios individuales, especialmente las combinaciones que involucran Av y Fn, y Ec y Fn. Como ‘tratamientos’ individuales, cada microbio también mostró una débil sinergia con los demás, lo que sugiere una leve actividad inhibitoria contra las líneas celulares de CCRC, aunque existieron diferencias marcadas entre las dos líneas celulares para la combinación de Ec y Fn.

Al comparar el flujo a través de las características principales para las células HT29 tratadas con microbios, es evidente que Fn y Ec tienen perfiles distintos (Fig. S5a). En particular, las células HT29 tratadas con Fn presentan un fuerte aumento de la latesterol oxidasa, la deshidrocolesterol reductasa y el metabolismo de la vitamina D en comparación con los demás tratamientos microbianos. Ec, por otro lado, indujo aumentos en la fosfolipasa C, la alanil aminopeptidasa, el transporte de cisteína-glicina y disminuyó el transporte reversible de glicina y el transporte extracelular de L-carnitina. Curiosamente, el flujo a través de las características principales para las células HT29 tratadas con Fn fue relativamente diferente del flujo de las células HCT116 tratadas con Fn. En particular, Fn pareció tener un impacto menos profundo en las células HCT116, induciendo solo 106 DEG totales en las células HCT116 en comparación con 245 en las células HT29. Es importante destacar que los datos de transcriptómica utilizados se obtuvieron de estudios únicos, y diferentes condiciones podrían explicar esta discrepancia, ya que las predicciones de las dos líneas celulares tratadas con Fn se correlacionaron fuertemente (Fig. 3c).

Aunque el modelo se entrenó exclusivamente con combinaciones de fármacos de quimioterapia, evaluamos a continuación su aplicabilidad a estrategias de tratamiento más contemporáneas del cáncer colorrectal (CRC), incluido el inmunoterapia. Se utilizaron datos de transcriptómica de Sehgal et al. para generar perfiles de flujo metabólico correspondientes a las condiciones de tratamiento con αPD-1.^[63] Para evaluar el rendimiento del modelo en este contexto, predijimos la sinergia de la combinación entre la terapia αPD-1 y la cocultivo microbiana. Se ha asociado previamente Fn con una mejora de las respuestas a la terapia anti–PD-1 en comparación con las cepas derivadas de Ec K-12.^[64],^[65] En consonancia con estas observaciones experimentales, el modelo predijo una sinergia significativamente mayor entre Fn y la terapia αPD-1 en comparación con Ec y la terapia αPD-1 en dos modelos de líneas celulares de CRC (CT26, p = 4,39 × 10−14; MC38, p = 3,08 × 10−10; Fig. 4c–e). En conjunto, estos resultados demuestran que el modelo se generaliza más allá de las combinaciones convencionales de quimioterapia y puede capturar las interacciones metabólicas en microambientes más complejos asociados con la inmunoterapia.

Finalmente, simulamos los efectos del tratamiento con probióticos. La ruterina, un metabolito producido por la cepa probiótica Limosilactobacillus reuteri (Lr), suprime el crecimiento tumoral al alterar el equilibrio redox en las células cancerosas del colon. Además, Lr demuestra sinergia con el fluorouracilo.^[66] En línea con estas observaciones experimentales, predijimos que Lr y el fluorouracilo serían fuertemente sinérgicos (Fig. 4f). El fluorouracilo fue el fármaco más sinérgico en combinación con Lr de los 110 fármacos probados. En todos los 110 fármacos, los perfiles de sinergia predichos para Fn frente a ruterina fueron significativamente diferentes (p = 4,85 × 10−12). Además, el efecto de Lr sobre el cáncer de colon se ha relacionado con un aumento del estrés oxidativo mediante el agotamiento del glutatión.^[66] De manera similar, el flujo a través de la glutatión peroxidasa disminuyó en las células tratadas con ruterina en comparación con las células tratadas con Fn (Fig. 4g). Esto demuestra la precisión y la generalizabilidad del modelo en diferentes especies bacterianas.

Predicción de combinaciones de quimioterapia

El análisis del equilibrio de flujo (FBA) de los GEMs combinado con el aprendizaje automático (ML) ofrece un marco mecanicista para identificar las vías metabólicas subyacentes a las combinaciones de fármacos eficaces. Los GEMs permiten la simulación de combinaciones por pares y de orden superior de factores estresantes, y el ML identifica patrones de flujo no lineales que predicen resultados sinérgicos. En este enfoque, los GEMs se restringen utilizando datos de transcriptómica de tratamientos farmacológicos individuales para generar estados metabólicos específicos del tratamiento. Estos estados se combinan posteriormente para representar la respuesta metabólica a las combinaciones de fármacos, y las características basadas en el flujo resultantes se utilizan para entrenar un modelo de bosque aleatorio con puntuaciones de sinergia de fármacos derivadas experimentalmente.^[36]

Nuestro modelo, basado en esta técnica, OMG-ML, se entrenó utilizando datos de transcriptómica de 110 tratamientos farmacológicos en células HCT116 y HT29 obtenidos de la biblioteca de firmas celulares basadas en redes integradas (LINCS) y 6514 combinaciones de quimioterapia de SynergyxDB.^[37],^[38] Las células HT29 son células epiteliales estables de microsatélites aisladas del colon de una paciente y tienen un fenotipo menos agresivo en comparación con las células HCT116.^[39] Las células HCT116 son células epiteliales inestables de microsatélites aisladas del colon de un paciente y se utilizan a menudo para estudiar la metástasis del CCRC.^[40] El uso de estas líneas celulares proporciona una representación diversa de los fenotipos del CCRC para mejorar la generalizabilidad del modelo en los subtipos de CCRC. Los modelos de tratamiento farmacológico individuales se combinaron posteriormente para formar vectores de características compuestos para cada combinación de fármacos. Se entrenó un bosque aleatorio utilizando estas características y las sinergias de combinación de fármacos conocidas de LINCS. Se seleccionó un bosque aleatorio debido a su rendimiento superior en comparación con otros modelos de ML basados en la validación cruzada de diez pliegues (área bajo la curva de sinergia (AUC) = 0,79, AUC de antagonismo = 0,73, r de Pearson = 0,54) (Fig. S4f). El modelo de ML basado en el flujo también superó a la entrada directa de transcriptómica (Fig. S4a–e) y fue altamente significativo en comparación con permutaciones aleatorias (p-valor = 0,001) (Métodos). La Fig. 1 muestra una descripción gráfica general del desarrollo de OMG-ML. Este marco permite la predicción a partir de perfiles de flujo metabólico celular humano para tratamientos farmacológicos y condiciones de cocultivo microbiano previamente no vistos.

El modelo entrenado se utilizó para predecir 6333 nuevas puntuaciones de sinergia de combinación de fármacos (3163 combinaciones de fármacos en células HCT116 y 3170 en células HT29). Según el modelo de Loewe, la sinergia se define como valores negativos e indica que el fármaco tuvo un mejor rendimiento en la combinación que solo. Las combinaciones sinérgicas a menudo incluyeron cabazitaxel (un taxano utilizado para tratar el cáncer de próstata resistente a la castración). Las 15 combinaciones más sinérgicas en las células HCT116 fueron combinaciones que incluían cabazitaxel (Fig. S2). Una de estas combinaciones sinérgicas fue cabazitaxel y megestrol, que se confirmó in vitro y mostró fuertes efectos sinérgicos (Fig. 2). El megestrol, o acetato de megestrol, es una forma sintética de progesterona y no se ha utilizado como tratamiento para el cáncer de colon, pero se ha utilizado para aumentar el apetito de los pacientes después de la quimioterapia.^[41] De las combinaciones predichas, 11 se evaluaron in vitro (Fig. 2a). Estas fueron combinaciones de cabazitaxel o megestrol con erlotinib, gemcitabina, metformina, metotrexato y sorafenib. Los valores predichos y los valores experimentales demostraron una correlación de Pearson de 0,48, similar a la evaluación de validación cruzada, lo que sugiere un rendimiento sinérgico generalizable.

Para probar aún más el rendimiento del modelo, se compararon las puntuaciones de combinación predichas con nuevas puntuaciones de SynergyxDB. Desde el desarrollo y el entrenamiento inicial del modelo, se han informado 554 combinaciones de fármacos adicionales para la línea celular HCT116 CRC, junto con 32 nuevas combinaciones para la línea celular HT29. Aplicamos nuestro modelo entrenado para predecir las puntuaciones de sinergia para estas combinaciones recién agregadas y comparamos los valores predichos con las puntuaciones de sinergia medidas experimentalmente. Las predicciones del modelo se correlacionaron significativamente con estas puntuaciones para ambas líneas celulares, con un r de Pearson de 0,51 para las combinaciones de HCT116 y 0,79 para las combinaciones de HT29 (Fig. 2c–d).

Los resultados son comparables al rendimiento de modelos similares. El modelo CARAMeL, que utilizó técnicas de ingeniería de características y enfoques basados en el flujo similares, también logró una correlación similar en nuevas combinaciones de antibióticos.^[42] Modelos similares que predicen la sinergia de la combinación de fármacos para el CCRC, como el de Tsiryouli et al., que integra datos multiómicos y clasificaciones de subtipos moleculares de consenso, lograron valores de AUC que oscilaron entre ~0,5 y 0,78.^[43] Nuestro modelo se destaca de los métodos existentes por su interpretabilidad de las vías de interés y su capacidad para tener en cuenta los efectos metabólicos de los tumores, la quimioterapia y el microbioma.

Otras combinaciones predichas por el modelo cuentan con el respaldo de la literatura. Por ejemplo, MK1775 es un inhibidor selectivo de la quinasa Wee1 que ha demostrado mejorar los efectos del fluorouracilo en las células cancerosas del colon.^[42] Nuestra predicción de esta combinación se alinea con esta observación (puntuación de Loewe predicha = −0,31). Estos resultados brindan apoyo a la precisión de las predicciones de nuestro modelo.

Información metabólica sobre los tratamientos de combinación de fármacos

Como se esperaba de estudios anteriores, el cambio en el flujo metabólico inducido por fármacos individuales refleja sus mecanismos de acción subyacentes, y los fármacos con mecanismos de acción similares se agrupan. ^[36],^[44]

Dado que el modelo de ML se entrena utilizando datos de entrada metabólica, analizamos a continuación qué reacciones contribuyen más a la precisión predictiva del modelo. Al identificar las características de mayor rango, destacamos reacciones metabólicas específicas que están más fuertemente asociadas con combinaciones de fármacos eficaces. La Fig. S1c muestra el flujo normalizado a través de las 25 características principales para todos los tratamientos farmacológicos y la clasificación de cada fármaco como ‘sinérgico’ o ‘antagónico’. Como se muestra en la Fig. S1c, el uso de estas características permite la separación entre fármacos sinérgicos y antagónicos.

Estas características se pueden utilizar para comprender el mecanismo subyacente de por qué se predijo que el cabazitaxel sería más eficaz que el paclitaxel (Fig. 2f). Esta comparación es importante porque el paclitaxel y el cabazitaxel son moléculas muy similares a nivel mecanístico, pero provocaron predicciones muy diferentes.^[45] Estas características principales son especialmente informativas porque el cabazitaxel y el paclitaxel exhiben perfiles metabólicos generales muy similares (distancia euclidiana = 4,2), en comparación con sus distancias promedio de otros fármacos (21,9 para cabazitaxel, 22,1 para paclitaxel). Al centrarnos en las diferencias de flujo en estas características de mayor rango, podemos identificar distinciones metabólicas sutiles pero significativas que pueden explicar sus predicciones de sinergia divergentes, a pesar de su similitud global.

Las cinco combinaciones de fármacos más sinérgicas en las células HT29 fueron cabazitaxel combinado con erlotinib, navitoclax, estramustina fosfato de sodio, pazopanib o MK1775. Como se muestra en la Fig. 2f, el cabazitaxel disminuyó de forma única la actividad de la citidilato quinasa al tiempo que aumentaba el flujo a través de varias reacciones clave, incluidas la poliglutamato sintetasa, la fosfolipasa C, la isocitrato deshidrogenasa, la deshidrocolesterol reductasa y la latesterol oxidasa. Los fármacos asociados mostraron efectos variables en estas vías, exhibiendo generalmente una menor actividad de la latesterol oxidasa y la fosfolipasa C y un mayor flujo de la citidilato quinasa en relación con el cabazitaxel solo.

Predicciones de OMG-ML de fármacos en combinación con Fn

Dado el creciente reconocimiento de que el cáncer colorrectal (CCR) está fuertemente influenciado por el microbioma tumoral, Fn ha surgido como un factor microbiano particularmente relevante debido a su enriquecimiento constante en el CCR y sus funciones reportadas en la reprogramación metabólica y la respuesta terapéutica. Para capturar estos efectos impulsados por el microbioma, el modelo se amplió para incorporar la influencia de los microbios en el metabolismo celular y la respuesta a los fármacos. Este enfoque se basa en la premisa de que los efectos metabólicos de los microbios individuales se asemejan a los de los tratamientos farmacológicos, pero siguen siendo distintos, capturando las alteraciones específicas de cada microbio (Fig. 2e). Además, en este estudio, identificamos 254 genes metabólicos que se expresan de manera diferente en las células de CCR cultivadas en co-cultivo con Fn. Esto indica el profundo impacto que los microbios tienen en el metabolismo del CCR y las respuestas al tratamiento.

Se utilizó la transcriptómica de las células HCT116 de cáncer colorrectal tratadas con Fn (GSE141805) junto con el análisis de equilibrio de flujo (FBA) para generar un nuevo vector metabólico específico de la condición que representara los efectos metabólicos que Fn tuvo en las células HCT116.^[46] Esto se utilizó como se describió anteriormente para generar perfiles conjuntos con los 110 perfiles metabólicos de tratamiento con fármacos individuales y predecir las puntuaciones de sinergia fármaco-bacteria. Repetimos este proceso con los datos transcriptómicos de las células HT29 tratadas con Fn (GSE90944).^[47] Para las combinaciones de dos fármacos, la presencia de Fn alteró significativamente las respuestas predichas en relación con las predicciones sin Fn (p ≪ 0,05).

No se predijo que la mayoría de los fármacos fueran sinérgicos con Fn (Fig. 3c). Las predicciones se compararon con un estudio en el que se trató a pacientes con CCR con presencia de Fn con capecitabina y un estudio sobre muestras de pacientes con Fn combinadas con fluorouracilo.^[48],^[49] Los pacientes tratados con capecitabina mostraron altas tasas de recurrencia, lo que se correlaciona con nuestra predicción de que la capecitabina no es una combinación sinérgica con Fn. Por el contrario, se predijo que el fluorouracilo sería fuertemente sinérgico, lo que es consistente con su eficacia en el tratamiento del cáncer de colon.^[49]

El fármaco que se predijo que sería el más sinérgico en ambas líneas celulares fue el cabazitaxel, similar a las predicciones realizadas para las combinaciones de dos fármacos sin Fn. Se predijo que el segundo fármaco más sinérgico para ambas líneas celulares sería el ixabepilone. El ixabepilone es un taxano que se utiliza comúnmente para tratar el cáncer de mama en pacientes que no responden al docetaxel o al paclitaxel.^[50] También se sabe que demuestra sinergia con varios otros fármacos, incluida la capecitabina y el brivanib.^[51] Curiosamente, el modelo predijo que el ixabepilone estaría involucrado en muchas de las combinaciones más sinérgicas, tanto con como sin Fn (Fig. 3c).

Tres de las combinaciones predichas se validaron in vitro (Fig. 3d) utilizando un sistema de co-cultivo que implica una configuración de gas asimétrica con condiciones de cultivo tanto aeróbicas como anaeróbicas, para permitir que tanto el monocapa de células HCT116 como Fn crezcan eficazmente (Fig. 3a).^[52] El bajo número de muestras se debió a la complejidad del sistema experimental de co-cultivo, que requiere un bajo rendimiento y una optimización cuidadosa. A pesar de estas limitaciones, este sistema de modelado es una recapitulación mucho más precisa del microambiente tumoral en comparación con los métodos de mayor rendimiento. Esto nos permite evaluar la capacidad predictiva y la relevancia fisiológica de las predicciones del modelo. Se priorizaron los mejores candidatos para probar a partir de los experimentos iniciales sin Fn (Fig. 2a). Se probó el fluorouracilo, dado su relevancia clínica para el CCR, y como se predijo que sería sinérgico en presencia de Fn.^[49] Se seleccionó la metformina para representar los resultados de una combinación no sinérgica. Se probó el metotrexato por su novedad en este entorno, que se ha aplicado al cáncer de colon, pero no suele ser un tratamiento de primera línea.^[53] Además, se sabe que el metotrexato altera el microbioma en los pacientes, pero no se ha estudiado en relación con Fn.^[54] Inicialmente, también se aplicó el cabazitaxel. Sin embargo, debido a su mala solubilidad, el cabazitaxel era incompatible con el sistema de co-cultivo.

El modelo se optimizó para predecir las puntuaciones de Loewe, mientras que los experimentos con Fn dieron como resultado las puntuaciones de Bliss. Por lo tanto, las puntuaciones sin procesar de la predicción del modelo y los experimentos no se pueden comparar directamente, ya que el modelo predice las puntuaciones de Loewe y los resultados del experimento están en las puntuaciones de Bliss. Utilizamos la independencia de Bliss para el análisis experimental porque los fármacos se analizaron a concentraciones fijas con la bacteria determinada por sus perfiles de dosis-respuesta individuales, lo que hace que el marco de Bliss sea más apropiado para este diseño. En contraste, el modelo utiliza la aditividad de Loewe, que define la sinergia en relación con la aditividad de la dosis del mismo compuesto y es más adecuado para evaluar las interacciones computacionalmente en espacios de concentración continuos. Tanto el fluorouracilo como el metotrexato demostraron efectos sinérgicos con Fn in vitro, lo que se alinea con las puntuaciones predichas que son altamente sinérgicas (Fig. 3d). En contraste, la metformina mostró efectos antagónicos en el sistema de co-cultivo, reduciendo la eficacia en presencia de Fn (Fig. 3d). Esto es de esperar, ya que la puntuación predicha para la metformina + Fn (−0,12) se clasificó como la 77ª más eficaz de 111 fármacos, mientras que el fluorouracilo + Fn se clasificó en el 4º lugar y el metotrexato + Fn en el 14º lugar. Por lo tanto, la dirección cualitativa de la sinergia y los efectos relativos de los fármacos en combinación con Fn se alinean con la eficacia predicha.

Perspectivas metabólicas sobre los tratamientos con Fn

A continuación, se utilizaron las características principales del modelo para encontrar las reacciones que son predictivas de la sinergia fármaco-microbio. La Fig. 3b muestra las 25 características principales y su flujo relativo para los tratamientos que son sinérgicos y antagónicos con Fn. Los fármacos demuestran una gran variabilidad entre sí, y en comparación con las células tratadas solo con Fn, entre estas características principales.

Un patrón que justificó una mayor investigación fue el aumento del flujo de la importación de cisteína-glicina y la actividad de la alanil aminopeptidasa (cisteína-glicina) en las células tratadas con fluorouracilo y metotrexato, en contraste con la disminución de la actividad de las mismas reacciones en las células tratadas con Fn (Fig. 3b). Para probar si esta reacción estaba relacionada con la actividad antitumoral del fluorouracilo y el metotrexato, las células en co-cultivo se trataron con estos fármacos individuales y erastina. La erastina es una molécula pequeña que inhibe la importación de cisteína a través de SLC7A11 y acelera el estrés oxidativo.^[55] Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que la erastina interrumpiría el transporte de cisteína y atenuaría los efectos sinérgicos observados con el fluorouracilo y el metotrexato. En consonancia con esto, la puntuación de Bliss para el fluorouracilo y Fn disminuyó en un 92% y la puntuación para el metotrexato y Fn disminuyó en un 85% con la adición de erastina (Fig. 3d). Curiosamente, la erastina y Fn mostraron débiles efectos sinérgicos (puntuación de Bliss = 0,13), lo que sugiere que Fn puede sensibilizar parcialmente a las células al estrés oxidativo cuando se inhibe la importación de cisteína.

Además, tres de los fármacos sinérgicos predichos tienen un aumento de la actividad de las reacciones de fosfatidilinositol, mientras que los fármacos antagónicos y los tratamientos con Fn tienen una disminución del flujo a través de esta reacción (Fig. 3b). El metabolismo del inositol tiene una fuerte relación con el CCR, ya que se ha demostrado que el hexafosfato de inositol tiene actividad anticancerígena y mejora la eficacia de la quimioterapia.^[56],^[57] Esta observación se examinó más a fondo in vitro utilizando el inhibidor de la fosfolipasa C U73122. El tratamiento de las células HCT116 con U73122 en presencia de Fn resultó en una sinergia mínima (Fig. 3d). Sin embargo, la adición de fluorouracilo o metotrexato al tratamiento con U73122 y Fn condujo a débiles interacciones antagónicas (Fig. 3d).

Estos resultados sugieren que el efecto sinérgico del fluorouracilo y el metotrexato con Fn está mediado en parte por perturbaciones en el metabolismo de la cisteína y el metabolismo del fosfatidilinositol, y la inhibición concurrente de estas vías reduce su efecto sinérgico según el modelo de independencia de Bliss de las interacciones farmacológicas.

Predicciones de combinaciones de fármacos e inmunoterapia con otros microbios

La conexión entre los microbios y los fármacos contra el cáncer se está investigando cada vez más, particularmente en el CCR.^[11],^[20] Sin embargo, la comunidad microbiana intestinal es increíblemente diversa entre los pacientes, lo que dificulta determinar el impacto exacto de los microbios individuales.^[11] Por lo tanto, además de Fn, se agregaron cuatro especies microbianas más al modelo para las predicciones de combinación de fármacos. Estos microbios fueron Aeromonas veronii (A. veronii, Av), Escherichia coli (E. coli, Ec), Enterococcus gallinarum (E. gallinarum, Eg) y Streptococcus gallolyticus (S. gallolyticus, Sg).^[58]–^[60]
Sg y Ec se seleccionaron por sus fuertes vínculos con el CCR.^[11] Además, incluimos Eg (un posible agente terapéutico) y Av (un patógeno intestinal) para analizar la diversidad de las influencias microbianas.^[59],^[61]

Estos microbios también se seleccionaron porque tenían un impacto transcripcional en las células HT29 en co-cultivo que se podía mapear al modelo metabólico RECON1. Sin embargo, los efectos del co-cultivo microbiano en las células HT29 fueron considerablemente más débiles que los de los tratamientos farmacológicos, lo que requirió un umbral de puntuación z más bajo para identificar los genes expresados diferencialmente (±1 para los tratamientos farmacológicos frente a ±0,2 para el co-cultivo bacteriano). Dado que el tiempo de residencia de estos microbios en el colon es mucho mayor que el de los fármacos, hipotetizamos que estos pequeños cambios transcripcionales aún podrían tener un impacto metabólico significativo.

Las predicciones de microbios condicionadas con combinaciones de dos fármacos revelaron una reducción consistente y significativa de la sinergia de los fármacos en todos los microbios probados, con Fn ejerciendo el efecto más fuerte, seguido de Eg, Sg, Av y Ec (FDR < 0,001 para todos). Además, las puntuaciones predichas para cada combinación de microbios y fármacos difirieron significativamente en todos los pares, excepto para Eg frente a Av y Sg frente a Av (Fig. 4a). Además, el cabazitaxel, el ixabepilone y el fluorouracilo se clasificaron constantemente entre las cinco combinaciones más sinérgicas en todos los tratamientos bacterianos. En particular, los resultados de la interacción de los fármacos variaron tanto entre las cepas microbianas como entre las dos líneas celulares de cáncer colorrectal (Fig. 4b, Fig. S5b). Estas diferencias probablemente reflejen las características biológicas específicas de la línea celular, como los distintos antecedentes genéticos o los estados metabólicos, y pueden indicar una modulación metabólica diferencial por las especies microbianas individuales.^[62]

Dado que el microbioma del colon rara vez es un monocultivo, simulamos a continuación los efectos de las combinaciones por pares de microbios con y sin tratamientos farmacológicos (Fig. 4b, Fig. S5a–b). Algunas combinaciones de microbios mostraron fuertes efectos sinérgicos sobre los fármacos en comparación con los microbios individuales, especialmente las combinaciones que involucran Av y Fn, y Ec y Fn. Como "tratamientos" individuales, cada microbio también fue débilmente sinérgico con los demás, lo que sugiere una leve actividad inhibidora contra las líneas celulares de CCR, aunque hubo fuertes diferencias entre las dos líneas celulares para la combinación de Ec y Fn.

Al comparar el flujo a través de las características principales de las células HT29 tratadas con diferentes microorganismos, es evidente que Fn y Ec presentan perfiles distintos (Fig. S5a). En particular, las células HT29 tratadas con Fn muestran un aumento significativo en la lathosterol oxidasa, la deshidrocolesterol reductasa y el metabolismo de la vitamina D en comparación con los demás tratamientos microbianos. Por otro lado, Ec indujo aumentos en la fosfolipasa C, la alanil aminopeptidasa y el transporte de cisteína-glicina, y disminuyó el transporte reversible de glicina y el transporte extracelular de L-carnitina. Curiosamente, el flujo a través de las características principales de las células HT29 tratadas con Fn fue relativamente diferente del flujo de las células HCT116 tratadas con Fn. En particular, Fn pareció tener un impacto menos pronunciado en las células HCT116, induciendo solo 106 genes regulados diferencialmente (GRD) en las células HCT116 en comparación con 245 en las células HT29. Es importante destacar que los datos de transcriptómica utilizados se obtuvieron de estudios independientes, y diferentes condiciones podrían explicar esta discrepancia, ya que las predicciones de las dos líneas celulares tratadas con Fn se correlacionaron fuertemente (Fig. 3c).

Aunque el modelo se entrenó exclusivamente con combinaciones de fármacos quimioterapéuticos, a continuación, evaluamos su aplicabilidad a estrategias de tratamiento más contemporáneas del cáncer colorrectal (CCR), incluido el inmunoterapia. Se utilizaron datos de transcriptómica de Sehgal et al. para generar perfiles de flujo metabólico correspondientes a las condiciones de tratamiento con αPD-1.^[63] Para evaluar el rendimiento del modelo en este contexto, predijimos la sinergia de la combinación entre la terapia αPD-1 y la cocultivo microbiana. Se ha asociado previamente Fn con una mejora de las respuestas a la terapia anti-PD-1 en comparación con las cepas derivadas de Ec K-12.^[64],^[65] En consonancia con estas observaciones experimentales, el modelo predijo una sinergia significativamente mayor entre Fn y la terapia αPD-1 en comparación con Ec y la terapia αPD-1 en dos modelos de líneas celulares de CCR (CT26, p = 4,39 × 10−14; MC38, p = 3,08 × 10−10; Fig. 4c–e). En conjunto, estos resultados demuestran que el modelo se generaliza más allá de las combinaciones de quimioterapia convencionales y puede capturar las interacciones metabólicas en microambientes más complejos asociados con la inmunoterapia.

Finalmente, simulamos los efectos del tratamiento con probióticos. La ruterina, un metabolito producido por la cepa probiótica Limosilactobacillus reuteri (Lr), suprime el crecimiento tumoral al alterar el equilibrio redox en las células cancerosas del colon. Además, Lr demuestra sinergia con el fluorouracilo.^[66] En línea con estas observaciones experimentales, predijimos que Lr y el fluorouracilo serían fuertemente sinérgicos (Fig. 4f). El fluorouracilo fue el fármaco más sinérgico en combinación con Lr de los 110 fármacos probados. De todos los 110 fármacos, los perfiles de sinergia predichos para Fn frente a reuterina fueron significativamente diferentes (p = 4,85 × 10−12). Además, se ha relacionado el efecto de Lr sobre el cáncer de colon con un aumento del estrés oxidativo mediante el agotamiento del glutatión.^[66] De manera similar, el flujo a través de la glutatión peroxidasa disminuyó en las células tratadas con reuterina en comparación con las células tratadas con Fn (Fig. 4g). Esto demuestra la precisión y la capacidad de generalización del modelo en diferentes especies bacterianas.

Discusión

Son necesarios enfoques de biología de sistemas para comprender la variación metabólica y la interacción cruzada dentro de los microambientes tumorales (MAT). La complejidad combinatoria que implica la interacción entre cepas microbianas específicas, regímenes de fármacos y el metabolismo tumoral dificulta la modelización del MAT in vitro y hace que la detección experimental exhaustiva sea imposible. Presentamos un marco de aprendizaje automático generalizable, OMG-ML, que modela las interacciones entre diversas combinaciones microbianas, fármacos y combinaciones de fármacos novedosos, así como intervenciones probióticas, lo que permite la identificación sistemática de estrategias terapéuticas de alto impacto. Esto representa un marco único para adaptar los regímenes de fármacos para la terapia contra el cáncer en función de las especies microbianas.

El proceso de OMG-ML demuestra un rendimiento predictivo sólido para las combinaciones de quimioterapia, capturando tanto las interacciones sinérgicas como las antagónicas en las líneas celulares de cáncer colorrectal. El rendimiento del modelo se verificó mediante la validación cruzada, conjuntos de pruebas independientes, resultados experimentales y comparaciones con estudios similares y clínicos (Fig. 2a–e). Las predicciones del modelo se respaldaron aún más mediante experimentos in vitro, confirmando la eficacia predicha de combinaciones de fármacos específicas, como el cabazitaxel y el megestrol. La combinación de cabazitaxel y megestrol subraya el poder del aprendizaje automático para predecir las sinergias de los fármacos, ya que ni los taxanos ni la progesterona se utilizan comúnmente solos o juntos para el tratamiento del cáncer de colon.

Una ventaja clave de combinar el aprendizaje automático con el FBA es la capacidad de extraer las características más influyentes que impulsan las predicciones del modelo. Estas características pueden ofrecer información mecanicista sobre por qué se predice que ciertas combinaciones de fármacos son sinérgicas. Estas reacciones pueden representar vulnerabilidades metabólicas críticas en el CCR y, por lo tanto, servir como posibles objetivos terapéuticos. Identificamos un aumento del metabolismo del fosfoinositol y el transporte de cisteína en los fármacos que fueron eficaces en presencia de Fn e inhibimos estas vías para determinar si estos efectos existían in vitro. La lathosterol oxidasa y muchas otras enzimas de las características principales tienen fuertes vínculos con la señalización redox y la ferroptosis. Estas incluyen la 7- y la 24-deshidrocolesterol reductasa, la folilpoliglutamato sintetasa y el transporte de cisteína-glicina (Fig. 3a–b).^[67]–^[69] Estas vías se reconocen cada vez más como objetivos terapéuticos prometedores en el CCR.^[70]

Más allá de Fn, las cinco especies bacterianas adicionales y el tratamiento con reuterina revelaron varios patrones notables. Los efectos predichos de la reuterina fueron coherentes con los hallazgos experimentales anteriores, incluido el aumento de la actividad de la glutatión peroxidasa y la mejora de la sinergia con el fluorouracilo.^[66] En las combinaciones de fármacos y microorganismos, 8 de las 10 comparaciones por pares mostraron respuestas predichas significativamente diferentes, lo que subraya la medida en que el contexto microbiano puede remodelar la eficacia de los fármacos. Además, la introducción de múltiples microorganismos simultáneamente (predicciones de fármaco-microbio-microbio) cambió constantemente las respuestas hacia una mayor sinergia, lo que sugiere que la diversidad microbiana dentro del microambiente tumoral puede potenciar la eficacia terapéutica. Además, en las cinco especies bacterianas probadas, el cabazitaxel, el ixabepilone y el fluorouracilo se clasificaron entre los cinco fármacos más eficaces, lo que destaca su fuerza general en microbiomas únicos.

Nuestro modelo también puede predecir más allá de las quimioterapias tradicionales, como se ilustra en la Fig. 4c–e, donde el modelo predijo con precisión que el bloqueo de PD-1 sería más sinérgico con Fn que con Ec. Este resultado puede parecer contraintuitivo, pero varios estudios in vivo y en pacientes han encontrado que los niveles de Fn se asocian con una mejora de las respuestas a la inmunoterapia (bloqueo de PD-1 y PD-L1).^[64],^[65],^[71] Sin embargo, la relación entre Fn y la inmunoterapia no se comprende bien y algunos estudios contradicen que Fn mejore los resultados del tratamiento.^[72],^[73] A medida que surjan más investigaciones sobre la dinámica entre los microorganismos y la inmunoterapia, la capacidad de nuestro modelo para recapitular esta relación y predecir los resultados puede validarse y ajustarse aún más.

Nuestro modelo se distingue de otros modelos similares por su escalabilidad, precisión, interpretabilidad de las vías de interés y su conexión con el microambiente tumoral. En conjunto, estos resultados ilustran que la integración del modelado metabólico, el aprendizaje automático y el contexto microbiano puede revelar nuevas oportunidades terapéuticas y conocimientos mecanicistas para el cáncer colorrectal. Los estudios futuros que incorporen conjuntos de datos de pacientes más amplios y la validación metabolómica serán necesarios para confirmar estas tendencias y refinar la capacidad predictiva de los modelos basados en el flujo en entornos clínicos.

Métodos

Se obtuvieron perfiles de transcriptómica de las células de cáncer colorrectal (CCR) HT29 y HCT116 tratadas con un total de 110 fármacos del portal de datos LINCS, que comprenden 95 tratamientos en las células HT29 y 15 en las células HCT116.^[38] Debido a los datos de tratamiento limitados para HCT116, se generó una condición adicional utilizando genes regulados diferencialmente (GRD) de las células HCT116 no tratadas en comparación con las células HT29, obtenidos de la Enciclopedia de Líneas Celulares del Cáncer (CCLE). Los GRD de los cocultivos de las células HCT116 y HT29 con Fusobacterium nucleatum se obtuvieron del Repositorio de Expresión Génica (GEO; GSE141805; GSE90944).

Los GRD de cada condición de tratamiento se integraron en el modelo metabólico a escala genómica RECON1 o RECON3D para generar modelos metabólicos específicos de la condición. De los tratamientos con fármacos, se consideraron significativamente regulados a la alza o a la baja los genes con puntuaciones z > 1 o < −1, respectivamente. Mientras que el umbral se fijó en puntuaciones z > 0,2 o < −0,2 para los cocultivos microbianos. La integración en RECON1 se realizó utilizando una implementación basada en la optimización lineal de la herramienta de análisis metabólico integrativo (iMAT), que asigna los cambios de la transcriptómica a los cambios en el flujo metabólico.^[74],^[75] El algoritmo iMAT se parametrizó utilizando kappa = 10−2, rho = 102 y épsilon = 1, donde kappa y rho ponderan las penalizaciones para las reacciones "apagadas" y "encendidas", y épsilon especifica el flujo mínimo permitido a través de las reacciones "encendidas". Todos los análisis informados utilizaron la función objetivo de la biomasa. Aunque se evaluaron otras funciones objetivo, como la maximización de la producción de ATP, ninguna proporcionó un mejor rendimiento en la validación cruzada de 10 pliegues que la función objetivo de la biomasa.

Este proceso generó 113 perfiles de flujo metabólico individuales. Se generaron perfiles de flujo conjuntos para cada combinación de fármacos utilizando cuatro características clave: puntuación sigma, puntuaciones delta y entropía. Estas puntuaciones capturan los cambios metabólicos compartidos (sigma) y únicos (delta) entre los fármacos. Las puntuaciones sigma y delta se derivaron de perfiles de flujo binarios que indicaban si cada reacción metabólica era más o menos activa en comparación con la línea de base. Para cada condición (fármaco o cocultivo), las reacciones se marcaron como +1, −1 o 0 dependiendo de la dirección del cambio de flujo. Estos perfiles binarios se compararon luego entre pares de fármacos. Las puntuaciones sigma reflejaron las reacciones afectadas por ambos fármacos (efectos compartidos), mientras que las puntuaciones delta capturaron las reacciones influenciadas únicamente por un fármaco pero no por el otro (efectos distintos). La entropía acumulativa se calculó utilizando perfiles de flujo no binarios. Primero, calculamos la entropía metabólica para cada condición, lo que refleja la variabilidad de los flujos en todas las reacciones. Una entropía más alta indica un efecto metabólico más generalizado o menos específico. Luego, para cada combinación de fármacos, resumimos estos valores de entropía tomando tanto su media como su suma total, lo que da como resultado dos características que describen la magnitud general de la alteración metabólica causada por la combinación.

Para modelar la sinergia con la terapia anti-PD-1, se utilizaron datos de transcriptómica de MC38 y CT26 células inyectadas en ratones junto con el bloqueo anti-PD-1 de Sehgal et al.^[63] Los datos de expresión génica diferencial se generaron originalmente comparando las muestras tumorales tratadas y no tratadas. Para integrar estos datos en nuestro proceso de modelado, se identificaron los genes regulados diferencialmente (GRD) entre estos tumores y las células HT29 y se utilizaron para restringir los modelos metabólicos y calcular los flujos de reacción. Para tener en cuenta la variabilidad biológica, los perfiles de flujo metabólico de las simulaciones de cocultivo de Ec y Fn se sometieron a un análisis de eliminación de reacciones. Específicamente, para cada condición de tratamiento, el 20% de los flujos de reacción se establecieron aleatoriamente en cero, y este procedimiento se repitió 200 veces para generar distribuciones de flujo replicadas. Estas réplicas simuladas se utilizaron luego para realizar comparaciones estadísticas (pruebas t de Welch de dos colas) entre las dos condiciones de cocultivo microbiano más la terapia anti-PD-1 para evaluar la sinergia metabólica.

El modelo se entrenó utilizando la red metabólica RECON1, que mostró una mayor precisión en los datos de validación que RECON3D. En datos de prueba independientes de synergyxDB, las predicciones del modelo entrenado con RECON1 se correlacionaron significativamente con las respuestas observadas tanto en las células HT29 como en HCT116 (Pearson’s r = 0,79 y 0,51, respectivamente; Fig. 2d–e). El modelo entrenado con RECON3D también se correlacionó significativamente con los mismos datos de prueba (HT29: r = 0,62; HCT116: r = 0,52). Los valores de AUC siguieron un patrón similar: para las células HT29 y HCT116, el modelo entrenado con RECON1 alcanzó 0,77 y 0,91, respectivamente, en comparación con 0,75 y 0,83 para el modelo entrenado con RECON3D. En nuevas predicciones in vitro, el modelo entrenado con RECON1 tuvo un rendimiento ligeramente mejor (r = 0,48) que el modelo entrenado con RECON3D (r = 0,47). Sin embargo, el modelo RECON3D tuvo un rendimiento ligeramente mejor en la validación cruzada de 10 pliegues (r = 0,57, valor p < 2,2e-308; AUC de sinergia = 0,81; AUC de antagonismo = 0,75). A pesar de estas ligeras diferencias de rendimiento, las predicciones de los dos modelos se correlacionaron estrechamente para ambas líneas celulares (HT29: r = 0,81; HCT116: r = 0,79; Fig. 7a-b). Curiosamente, aunque las características principales identificadas por cada modelo fueron completamente distintas (Fig. 7c), la distribución de los subsistemas metabólicos entre estas características fue similar (Fig. 7d), particularmente para las reacciones de transporte extracelular y el metabolismo del inositol, lo que destaca la importancia de estas vías.

Predicción por aprendizaje automático

En este estudio, desarrollamos OMG-ML para predecir combinaciones de fármacos sinérgicas para el cáncer de colon, incorporando influencias metabólicas del microambiente tumoral. OMG-ML se construyó en MATLAB utilizando el algoritmo de bagging fitrensemble. Este algoritmo construye múltiples árboles de decisión, cada uno entrenado en una muestra bootstrap diferente de los datos originales. La predicción final se obtiene promediando las salidas de todos los modelos. En nuestra implementación, se utilizó fitrensemble con parámetros predeterminados, que incluyen árboles de decisión como modelos base con un número máximo de 10 divisiones por árbol (es decir, MaxNumSplits = 10), un máximo de 100 modelos (NumLearningCycles = 100) y sin poda. La entrada al modelo consistió en perfiles de flujo binarios que representan la actividad metabólica específica de cada condición.

Se utilizaron 6514 puntuaciones de sinergia de Loewe conocidas en el entrenamiento (HT29 N = 3256, HCT116 N = 3258). Dado que solo 15 de los tratamientos farmacológicos en el conjunto de datos transcriptómicos LINCS se superpusieron con las 6514 combinaciones de fármacos utilizadas para entrenar el modelo para las células HCT116, incorporamos una condición de referencia adicional para representar mejor el metabolismo específico de HCT116. Esta condición se generó identificando los genes expresados diferencialmente (DEG) entre las células HCT116 y HT29 no tratadas, utilizando datos de secuenciación de ARN del Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE). Esto permitió el entrenamiento con todas las puntuaciones de Loewe disponibles en SynergyxDB y la realización de predicciones basadas en el tipo de célula.

Para evaluar el rendimiento del modelo, también entrenamos modelos utilizando la entrada transcriptómica, incluido un conjunto de bagging de árboles de decisión (similar a random-forest) y un modelo de regresión con impulso de gradiente (GBM). Estos modelos utilizan firmas de expresión génica inducidas por fármacos para predecir las respuestas combinadas y proporcionan una comparación directa con el marco basado en el flujo (Figura suplementaria 4a). En la validación cruzada de 10 pliegues, estos modelos dieron como resultado un AUC de 0,80 y 0,81, respectivamente, lo que es similar al rendimiento del modelo basado en el flujo. Sin embargo, cuando se probaron en un conjunto de datos retenido, tuvieron un rendimiento inferior con un valor de r de Pearson de 0,55 y 0,52 para los datos de HT29 y 0,40 y 0,39 para los datos de HCT116 (Figura suplementaria 4b–e). En comparación, el modelo basado en el flujo logró un valor de r de Pearson de 0,79 y 0,51 en el mismo conjunto de prueba (Fig. 2c–d). Además, el rendimiento del modelo basado en el flujo se evaluó utilizando una prueba de permutación, en la que las etiquetas de los datos se barajaron aleatoriamente 1000 veces y la distribución nula resultante de los valores de R^2 se comparó con el valor de R^2 real del modelo para evaluar la significación estadística. El valor p de esta prueba fue muy significativo (valor p = 0,000999), lo que indica que el modelo aprendió una señal biológica o estadística significativa.

También evaluamos manualmente si los flujos coinciden con los efectos conocidos del tratamiento farmacológico. Por ejemplo, el tratamiento con alopurinol condujo a una disminución del flujo a través de su enzima diana, la xantina oxidasa.^[76] Sin embargo, no todos los fármacos fueron tan claros. Específicamente, la floxuridina y la capecitabina tuvieron un aumento del flujo a través de la timidilato sintasa a pesar de ser inhibidores de esta enzima.^[77],^[78] A pesar de esto, los otros fármacos que se dirigen a estas enzimas, el fluorouracilo, el metotrexato y el pemetrexed, indujeron una disminución esperada del flujo.^[79]–^[81] Asimismo, el ácido aminolevulínico causó una disminución del flujo a través de la aminolevulato sintasa, aunque esta conexión inhibitoria directa aún no se ha observado en el cáncer de colon.^[82] Curiosamente, el tratamiento con mercaptopurina y tioguanina causó una disminución de la hipoxantina fosforribosiltransferasa, que es una enzima esencial en la bioactivación de estos fármacos.^[83],^[84]

La importancia de las características se evaluó evaluando la reducción en el error cuadrático medio (MSE) atribuido a cada predictor en todo el modelo de conjunto. Específicamente, para cada árbol de decisión dentro del conjunto, el algoritmo realizó un seguimiento de cuánto contribuyó cada característica a la disminución del MSE en cada punto de división. Estas reducciones individuales se promediaron luego en todos los árboles para obtener una puntuación de importancia general para cada característica. A las características que condujeron consistentemente a una mayor reducción del error se les asignó una mayor importancia, lo que refleja su mayor influencia en la precisión predictiva del modelo.

Predicción basada en datos transcriptómicos

El modelo basado en el flujo se comparó con un modelo desarrollado utilizando datos transcriptómicos como entrada. Los genes expresados diferencialmente (DEG) fueron los mismos que se utilizaron para determinar el flujo (umbrales de |log2FC| ≥ 1]). Los DEG se convirtieron en características utilizando un estilo similar a OMG-ML mediante la generación de tres clases de características. La primera clase modeló la respuesta transcriptómica combinada bajo la acción independiente promediando las dos firmas de fármacos utilizando la ecuación a continuación ( y son la expresión de dos genes específicos en la firma del fármaco):

La segunda característica capturó la discrepancia entre las dos perturbaciones:

La última característica fue la entropía, que caracterizó la amplitud de la interrupción transcriptómica. Se calculó una métrica de entropía para cada fármaco y las magnitudes a nivel del gen se normalizaron para formar una distribución de probabilidad, pi, y la entropía se calculó como:

Para cada par de fármacos, las características , y se concatenaron para formar un vector de características conjunto que representa el estado transcriptómico combinado previsto de los dos fármacos. Estos vectores de características se utilizaron para entrenar tanto un modelo de bosque aleatorio como un modelo de impulso de gradiente. Las etiquetas de sinergia se obtuvieron de SynergyXDB y el rendimiento del modelo se evaluó utilizando una validación cruzada de 10 pliegues y un conjunto de pruebas independiente retenido.

Validación experimental

Dos combinaciones de fármacos

Las células HCT116 se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco y se trataron individualmente con metformina, cabazitaxel, acetato de megestrol, sorafenib, erlotinib, gemcitabina y metotrexato. También se trataron con combinaciones de cabazitaxel y megestrol con cada uno de los fármacos mencionados anteriormente (11 combinaciones en total). Las células se trataron con dosis de 0,9, 5, 10, 20 y 40 μM. La viabilidad celular se evaluó utilizando el tinte Cell Titer Glo y los resultados se utilizaron como entrada para SynergyFinder para derivar las puntuaciones de Loewe.

Fármaco único y Fn

En el colon, las células intestinales están expuestas al oxígeno del suministro de sangre, pero los microorganismos no. Esto crea un gradiente de oxígeno que no se puede replicar mediante sistemas de cocultivo simples. Por lo tanto, utilizamos un sistema en el que se bombea oxígeno a las células de CRC colocadas sobre una membrana basal de una placa de 24 pocillos. En la cámara superior del pocillo, se siembran las células Fn. La velocidad del flujo de oxígeno a las células de CRC es aproximadamente equivalente a la captación de oxígeno, lo que hace que la cámara superior sea anaeróbica. Esto proporciona un entorno óptimo para que ambos tipos de células sobrevivan a largo plazo, mientras que en un sistema de cocultivo simple, Fn moriría después de varias horas, causando estrés adicional a las células de CRC. Si bien esta configuración es una de las formas más precisas de replicar el MET de CRC, está limitada por el tamaño de la placa que es compatible (un máximo de 24 pocillos). Esto restringió nuestros posibles tratamientos farmacológicos predichos para validar. Probamos un total de 4 fármacos en combinación con Fn: fluorouracilo, metotrexato, metformina y cabazitaxel. Sin embargo, las pruebas de cabazitaxel no se completaron debido a las limitaciones de solubilidad. Las células HCT116 se cocultivaron con Fn durante 24 horas antes del tratamiento con 40 μM de cada fármaco y luego se incubaron con Fn y el fármaco durante 24 horas adicionales. Se utilizó Cell Titer Glo para evaluar la viabilidad y determinar las puntuaciones de sinergia.

Condiciones de cultivo bacteriano

Fusobacterium nucleatum (ATCC 23726, https://www.atcc.org/) se inoculó inicialmente a partir de un caldo de glicerol de 80 °C en medio de caldo de Columbia (CB) (BD, 294420) 48 h antes de la experimentación y se cultivó en condiciones anaeróbicas (10 % de CO2, 5 % de H2 y 85 % de N2, Welding Supply Corp.) a 37 °C utilizando una cámara anaeróbica de vinilo (COY Tipo A).^[85],^[86],^[87] Una vez que la cultura alcanzó la turbidez (OD600 = 0,5), se realizó una segunda inoculación en el medio de cocultivo (CCM) un día antes del inicio del experimento, con una dilución de 1:50.^[52] Las bacterias se cultivaron en las mismas condiciones anaeróbicas hasta alcanzar la fase de crecimiento logarítmico medio (OD600 = 0,5), cuando la viabilidad celular era óptima para los ensayos posteriores.

Recubrimiento de colágeno IV de insertos de Transwell

La solución de colágeno IV (1 mg/mL) se preparó disolviendo 5 mg de colágeno IV liofilizado (Sigma, C5533-5mg) en 5 mL de ácido acético frío de 100 mM (Fisher Scientific, A38-500).^[88] La solución de colágeno se agitó a 4 °C durante un mínimo de 5 h para permitir una solubilización completa, se dividió en alícuotas en condiciones estériles y se almacenó a -80 °C hasta su uso.

Para el recubrimiento de Transwell, las alícuotas de colágeno IV se descongelaron a 4 °C durante al menos 5 h. Se preparó una solución de trabajo de 33 μg/mL diluyendo la solución de stock en agua estéril fría (Milli-Q, Sigma-Aldrich).^[89] Las placas de Transwell (Avantor, 76313-906) se preenfriaron a -20 °C y se agregaron 100 μL de la solución de colágeno a cada inserto (10 μg/cm2).^[90] Las placas se incubaron en hielo a 4 °C durante 30 min, seguidas de una incubación a 37 °C durante 4 h para permitir la solidificación del colágeno. Después del recubrimiento, los Transwells se utilizaron inmediatamente o se envolvieron con parafilm y se almacenaron a 4 °C hasta su uso.

Preparación del monocapa de células HCT116

Las células HCT116 (ATCC CCL-247) se descongelaron de los bancos congelados y se expandieron una vez a una proporción de división de 1:3. Cuando las culturas alcanzaron aproximadamente el 70 % de confluencia, las células se desprendieron con 0,25 % de tripsina-EDTA (Gibco, 25200056) durante 2 min a 37 °C, se neutralizó con DMEM completo y se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS).^[91] Las células se resuspendieron a una concentración final de 2 × 106 células/mL. Los insertos de Transwell (tamaño de poro de 0,4 μm, membrana de policarbonato; Corning) pre-recubiertos con colágeno IV se aspiraron para eliminar la solución de recubrimiento residual y se sembraron 100 μL de la suspensión celular en cada cámara apical, lo que resultó en 2 × 105 células por inserto. Las cámaras basolaterales se llenaron con 600 μL de DMEM suplementado con 10 % de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor (Gibco, A5670701) y 1 % de penicilina-estreptomicina (P/S, 10 000 U/mL, Gibco, 15140122). Los cocultivos se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada con 5 % de CO2 durante 4 días. El medio apical se renovó cada 48 h, mientras que el medio basolateral se dejó sin tocar a menos que se indique lo contrario.

Cocultivo anaeróbico asimétrico de células HCT116

El procedimiento de cocultivo se realizó como se describió previamente, con modificaciones menores. En resumen, placas permeables a los gases, previamente llenadas con 600 μL de DMEM por pocillo, se fijaron a la cámara de cocultivo mediante tornillos. Los puertos de entrada y salida se conectaron a una corriente de gas mezclado (10 % de O2, 5 % de CO2, 85 % de N2) a un caudal final de 0,5 pies cúbicos estándar por hora (SCFH), y se aplicó agitación magnética para garantizar una distribución uniforme del gas. Los insertos Transwell que contenían monocapas de HCT116 en fase de crecimiento se retiraron de la incubadora, y el medio de cultivo en la cámara apical se reemplazó por DMEM sin antibióticos. Los insertos se transfirieron a la cámara anaeróbica y se mantuvieron bajo un flujo continuo de gas durante 3 horas para permitir la estabilización de la atmósfera.

Fn, previamente cultivado en medio CCM, se recogió, se ajustó a la concentración deseada y se diluyó para obtener una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1. El medio de la cámara apical se reemplazó por la suspensión bacteriana diluida, y los cocultivos se incubaron durante 24 horas en condiciones anaeróbicas. En el punto de las 24 horas, se añadieron agentes quimioterapéuticos (40 mM de concentración final) a cada Transwell (los inhibidores o estimulantes se añadieron a las concentraciones indicadas), seguido de 24 horas adicionales de incubación antes de los análisis posteriores. Esta configuración se replicó para el inhibidor U73122 (1 μM de concentración final) en combinación con 40 mM de metotrexato o fluorouracilo y 0,1 MOI de Fn.

Verificación de la viabilidad de la monocapa celular

Para la verificación de la viabilidad celular, se utilizó el ensayo CellTiter-Glo® 2.0 (Promega, G9241). Después del cocultivo, se retiró la monocapa celular y tanto las soluciones de la cámara apical como de la cámara basolateral se reemplazaron por DMSO que contenía penicilina/estreptomicina (P/S).^[92] La monocapa se incubó durante 2 horas bajo este tratamiento. Después del tratamiento, las células se lavaron con PBS, y se añadieron 100 μL del reactivo CellTiter-Glo® 2.0 a la cámara apical. Después de 10 minutos de incubación, se adquirieron imágenes de bioluminiscencia utilizando el sistema de imagen Azure 300 con el modo de autoexposición.^[93] Posteriormente, se cuantificó la intensidad de bioluminiscencia de los insertos Transwell utilizando un lector de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices).^[94]

Después de la obtención de imágenes, los insertos Transwell se lavaron una vez con PBS. Para evaluar la proporción de células muertas, se realizó una tinción conjunta con SYTO9 Green (Thermo Fisher, S34854) y bromuro de etidio (solución al 1 %, Fisher Scientific, BP1302–10), cada uno a una dilución de 1:10 000. La solución de tinción se añadió tanto a las cámaras apical como basolateral, y la monocapa se incubó durante 10 minutos. A continuación, se adquirieron imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio Nikon ECLIPSE Ts2-FL.^[95]

Modelado metabólico

Se obtuvieron los perfiles transcriptómicos de las células de cáncer colorrectal HT29 y HCT116 tratadas con un total de 110 fármacos del portal de datos LINCS, que comprenden 95 tratamientos en células HT29 y 15 en células HCT116.^[38] Debido a la cantidad limitada de datos de tratamiento para HCT116, se generó una condición adicional utilizando genes expresados diferencialmente (DEG) de las células HCT116 no tratadas en comparación con las células HT29, obtenidos de la Enciclopedia de Líneas Celulares del Cáncer (CCLE). Los DEG de los cocultivos de células HCT116 y HT29 con Fusobacterium nucleatum se obtuvieron del Gene Expression Omnibus (GEO; GSE141805; GSE90944).

Los DEG de cada condición de tratamiento se integraron en el modelo metabólico a escala genómica RECON1 o RECON3D para generar modelos metabólicos específicos de la condición. De los tratamientos con fármacos, se consideraron significativamente sobreexpresados o subexpresados los genes con puntuaciones z > 1 o < −1, respectivamente. Mientras que el umbral se fijó en puntuaciones z > 0,2 o < −0,2 para los cocultivos microbianos. La integración en RECON1 se realizó utilizando una implementación basada en la optimización lineal de la herramienta de análisis metabólico integrativo (iMAT), que asigna los cambios transcriptómicos a los cambios en el flujo metabólico.^[74],^[75] El algoritmo iMAT se parametrizó utilizando kappa = 10−2, rho = 102 y épsilon = 1, donde kappa y rho ponderan las penalizaciones para las reacciones "apagadas" y "encendidas", y épsilon especifica el flujo mínimo permitido a través de las reacciones "encendidas". Todos los análisis informados utilizaron la función objetivo de la biomasa. Aunque se evaluaron otras funciones objetivo, como la maximización de la producción de ATP, ninguna proporcionó un mejor rendimiento en la validación cruzada de 10 veces que la función objetivo de la biomasa.

Este proceso generó 113 perfiles de flujo metabólico individuales. Se generaron perfiles de flujo conjuntos para cada combinación de fármacos utilizando cuatro características clave: puntuación sigma, puntuaciones delta y entropía. Estas puntuaciones capturan los cambios metabólicos compartidos (sigma) y únicos (delta) entre los fármacos. Las puntuaciones sigma y delta se derivaron de perfiles de flujo binarios que indicaban si cada reacción metabólica era más o menos activa en comparación con la línea de base. Para cada condición (fármaco o cocultivo), las reacciones se marcaron como +1, −1 o 0 dependiendo de la dirección del cambio de flujo. Estos perfiles binarios se compararon a continuación entre pares de fármacos. Las puntuaciones sigma reflejaron las reacciones afectadas por ambos fármacos (efectos compartidos), mientras que las puntuaciones delta capturaron las reacciones influenciadas de forma única por un fármaco pero no por el otro (efectos distintos). La entropía acumulativa se calculó utilizando perfiles de flujo no binarios. Primero, calculamos la entropía metabólica para cada condición, lo que refleja la variabilidad de los flujos en todas las reacciones. Una entropía más alta indica un efecto metabólico más generalizado o menos específico. A continuación, para cada combinación de fármacos, resumimos estos valores de entropía tomando tanto su media como su suma total, lo que da como resultado dos características que describen la magnitud general de la alteración metabólica causada por la combinación.

Para modelar la sinergia con la terapia anti-PD-1, se obtuvieron datos transcriptómicos de las células MC38 y CT26 inyectadas en ratones junto con el bloqueo anti-PD-1 de Seghal et al.^[63] Los datos de expresión génica diferencial se generaron originalmente comparando las muestras tumorales tratadas y no tratadas. Para integrar estos datos en nuestra línea de modelado, se identificaron los genes expresados diferencialmente (DEG) entre estos tumores y las células HT29 y se utilizaron para restringir los modelos metabólicos y calcular los flujos de reacción. Para tener en cuenta la variabilidad biológica, los perfiles de flujo metabólico de las simulaciones de cocultivo de Ec y Fn se sometieron a un análisis de eliminación de reacciones. Específicamente, para cada condición de tratamiento, el 20 % de los flujos de reacción se establecieron aleatoriamente en cero, y este procedimiento se repitió 200 veces para generar distribuciones de flujo replicadas. Estas réplicas simuladas se utilizaron a continuación para realizar comparaciones estadísticas (pruebas t de Welch de dos colas) entre las dos condiciones de cocultivo microbiano más anti–PD-1 para evaluar la sinergia metabólica.

Comparación de modelos metabólicos

El modelo se entrenó utilizando la red metabólica RECON1, que mostró una mayor precisión en los datos de validación que RECON3D. En datos de prueba independientes de synergyxDB, las predicciones del modelo entrenado con RECON1 se correlacionaron significativamente con las respuestas observadas tanto en las células HT29 como en las HCT116 (r de Pearson = 0,79 y 0,51, respectivamente; Fig. 2d–e). El modelo entrenado con RECON3D también se correlacionó significativamente con los mismos datos de prueba (HT29: r = 0,62; HCT116: r = 0,52). Los valores de AUC siguieron un patrón similar: para las células HT29 y HCT116, el modelo entrenado con RECON1 alcanzó 0,77 y 0,91, respectivamente, en comparación con 0,75 y 0,83 para el modelo entrenado con RECON3D. En nuevas predicciones in vitro, el modelo entrenado con RECON1 tuvo un rendimiento ligeramente mejor (r = 0,48) que el modelo entrenado con RECON3D (r = 0,47). Sin embargo, el modelo RECON3D tuvo un rendimiento ligeramente mejor en la validación cruzada de 10 veces (r = 0,57, valor p < 2,2e-308; AUC de sinergia = 0,81; AUC de antagonismo = 0,75). A pesar de estas ligeras diferencias de rendimiento, las predicciones de los dos modelos se correlacionaron estrechamente para ambas líneas celulares (HT29: r = 0,81; HCT116: r = 0,79; Fig. 7a-b). Curiosamente, aunque las características principales identificadas por cada modelo fueron completamente distintas (Fig. 7c), la distribución de los subsistemas metabólicos entre estas características fue similar (Fig. 7d), particularmente para las reacciones de transporte extracelular y el metabolismo del inositol, lo que destaca la importancia de estas vías.

Predicción por aprendizaje automático

En este estudio, desarrollamos OMG-ML para predecir combinaciones de fármacos sinérgicas para el cáncer de colon, incorporando influencias metabólicas del microambiente tumoral. OMG-ML se construyó en MATLAB utilizando el algoritmo de bagging fitrensemble. Este algoritmo construye múltiples árboles de decisión, cada uno de ellos entrenado en una muestra bootstrap diferente de los datos originales. La predicción final se obtiene promediando las salidas de todos los aprendices. En nuestra implementación, se utilizó fitrensemble con parámetros predeterminados, que incluyen árboles de decisión como aprendices base con un número máximo de 10 divisiones por árbol (es decir, MaxNumSplits = 10), un máximo de 100 aprendices (NumLearningCycles = 100) y sin poda. La entrada al modelo consistió en perfiles de flujo binarios que representaban la actividad metabólica específica de cada condición.

Se utilizaron 6514 puntuaciones de sinergia de Loewe conocidas en el entrenamiento (HT29 N = 3256, HCT116 N = 3258). Dado que solo 15 de los tratamientos con fármacos en el conjunto de datos transcriptómicos LINCS se superpusieron con las 6514 combinaciones de fármacos utilizadas para entrenar el modelo para las células HCT116, incorporamos una condición de línea de base adicional para representar mejor el metabolismo específico de HCT116. Esta condición se generó identificando los genes expresados diferencialmente (DEG) entre las células HCT116 no tratadas y las células HT29, utilizando datos de ARN-seq de la Enciclopedia de Líneas Celulares del Cáncer (CCLE). Esto permitió el entrenamiento con todas las puntuaciones de Loewe disponibles en SynergyxDB y la realización de predicciones basadas en el tipo de célula.

Para evaluar el rendimiento del modelo, también entrenamos modelos utilizando la entrada transcriptómica, incluido un conjunto de árboles de decisión (similar a un bosque aleatorio) y un modelo de regresión con impulso de gradiente (GBM). Estos modelos utilizan las firmas de expresión génica inducidas por fármacos para predecir las respuestas de combinación y proporcionan una comparación directa con el marco basado en el flujo (Figura S4a. En la validación cruzada de 10 veces, estos modelos dieron como resultado un AUC de 0,80 y 0,81, respectivamente, lo que es similar al rendimiento del modelo basado en el flujo. Sin embargo, cuando se probaron en un conjunto de datos retenido, tuvieron un rendimiento inferior con un r de Pearson de 0,55 y 0,52 para los datos de HT29 y 0,40 y 0,39 para los datos de HCT116 (Figura S4.b–e). En comparación, el modelo basado en el flujo logró un r de Pearson de 0,79 y 0,51 en el mismo conjunto de pruebas (Fig. 2c–d). Además, el rendimiento del modelo basado en el flujo se evaluó utilizando una prueba de permutación, en la que las etiquetas de los datos se barajaron aleatoriamente 1000 veces y la distribución nula resultante de los valores de R^2 se comparó con el R^2 real del modelo para evaluar la significación estadística. El valor p de esta prueba fue muy significativo (valor p = 0,000999), lo que indica que el modelo aprendió una señal biológica o estadística significativa.

También evaluamos manualmente si los flujos coinciden con los efectos conocidos del tratamiento con fármacos. Por ejemplo, el tratamiento con alopurinol condujo a una disminución del flujo a través de su enzima diana, la xantina oxidasa.^[76] Sin embargo, no todos los fármacos fueron tan claros. Específicamente, la floxuridina y la capecitabina tuvieron un aumento del flujo a través de la timidilato sintasa a pesar de ser inhibidores de esta enzima.^[77],^[78] A pesar de esto, los otros fármacos que se dirigen a estas enzimas, el fluorouracilo, el metotrexato y el pemetrexedo, indujeron una disminución esperada del flujo.^[79]–^[81] Asimismo, el tratamiento con ácido aminolevulínico provocó una disminución del flujo a través de la aminolevulinato sintasa, aunque esta conexión inhibitoria directa aún no se ha observado en el cáncer de colon.^[82] Curiosamente, el tratamiento con mercaptopurina y tioguanina provocó una disminución de la hipoxantina fosforribosiltransferasa, que es una enzima esencial en la bioactivación de estos fármacos.^[83],^[84]

La importancia de las características se evaluó mediante la evaluación de la reducción en el error cuadrático medio (MSE) atribuida a cada predictor en todo el modelo de conjunto. Específicamente, para cada árbol de decisión dentro del conjunto, el algoritmo realizó un seguimiento de cuánto contribuyó cada característica a disminuir el MSE en cada punto de división. Estas reducciones individuales se promediaron luego en todos los árboles para obtener una puntuación de importancia general para cada característica. Las características que consistentemente condujeron a una mayor reducción del error recibieron una mayor importancia, lo que refleja su mayor influencia en la precisión predictiva del modelo.

Predicción basada en la transcriptómica

El modelo basado en el flujo se comparó con un modelo desarrollado utilizando datos transcriptómicos como entrada. Los genes expresados diferencialmente (DEG) fueron los mismos que se utilizaron para determinar el flujo (umbrales de |log2FC| ≥ 1]). Los DEG se convirtieron en características utilizando un estilo similar a OMG-ML mediante la generación de tres clases de características. La primera clase modeló la respuesta transcripcional combinada bajo la acción independiente promediando las dos firmas de fármacos utilizando la ecuación a continuación ( y son la expresión de dos genes específicos en la firma del fármaco):

La segunda característica capturó la discrepancia entre las dos perturbaciones:

La última característica fue la entropía, que caracterizó la amplitud de la alteración transcripcional. Se calculó una métrica de entropía para cada fármaco y las magnitudes a nivel de gen se normalizaron para formar una distribución de probabilidad, pi, y la entropía se calculó como:

Para cada par de fármacos, las características , y se concatenaron para formar un vector de características conjunto que representa el estado transcripcional combinado predicho de los dos fármacos. Estos vectores de características se utilizaron para entrenar tanto un modelo de bosque aleatorio como un modelo de aumento de gradiente. Las etiquetas de sinergia se obtuvieron de SynergyXDB, y el rendimiento del modelo se evaluó utilizando una validación cruzada de 10 pliegues y un conjunto de pruebas independiente retenido.

Validación experimental

Combinaciones de dos fármacos

Las células HCT116 se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco y se trataron individualmente con metformina, cabazitaxel, acetato de megestrol, sorafenib, erlotinib, gemcitabina y metotrexato. También se trataron con combinaciones de cabazitaxel y megestrol con cada uno de los fármacos mencionados anteriormente (11 combinaciones en total). Las células se trataron con dosis de 0,9, 5, 10, 20 y 40 μM. La viabilidad celular se evaluó utilizando la tinción Cell Titer Glo, y los resultados se utilizaron como entrada para SynergyFinder para derivar las puntuaciones de Loewe.

Fármaco único y Fn

En el colon, las células intestinales están expuestas al oxígeno del suministro de sangre, pero los microorganismos no. Esto crea un gradiente de oxígeno que no se puede replicar mediante sistemas de cocultivo simples. Por lo tanto, utilizamos un sistema en el que se bombea oxígeno a las células de CRC sembradas en una membrana basal de una placa de 24 pocillos. En la cámara superior del pocillo, se siembran las células Fn. La velocidad del flujo de oxígeno a las células de CRC es aproximadamente equivalente a la captación de oxígeno, lo que hace que la cámara superior sea anaeróbica. Esto proporciona un entorno óptimo para que ambos tipos de células sobrevivan a largo plazo, mientras que en un sistema de cocultivo simple, Fn moriría después de varias horas, lo que causaría estrés adicional a las células de CRC. Si bien esta configuración es una de las formas más precisas de replicar el microambiente tumoral de CRC, está limitada por el tamaño de la placa que es compatible (un máximo de 24 pocillos). Esto restringió nuestros posibles tratamientos farmacológicos predichos para validar. Probamos 4 fármacos en total en combinación con Fn: fluorouracilo, metotrexato, metformina y cabazitaxel. Sin embargo, las pruebas con cabazitaxel no se completaron debido a limitaciones de solubilidad. Las células HCT116 se cocultivaron con Fn durante 24 horas antes del tratamiento con 40 μM de cada fármaco y luego se incubaron con Fn y el fármaco durante 24 horas adicionales. Se utilizó Cell Titer Glo para evaluar la viabilidad y determinar las puntuaciones de sinergia. Las células HCT116 se cotrataron con fluorouracilo o metotrexato y los inhibidores de la vía erastina (10 μM) o U73122 (1 μM) en presencia de Fn. Todas las combinaciones se aplicaron 24 horas antes de la medición de la viabilidad.

Condiciones de cultivo bacteriano

Fusobacterium nucleatum (ATCC 23726, https://www.atcc.org/) se inoculó inicialmente a partir de un caldo de glicerol a 80 °C en medio de caldo de Columbia (CB) (BD, 294420) 48 h antes de la experimentación y se cultivó en condiciones anaeróbicas (10% de CO2, 5% de H2 y 85% de N2, Welding Supply Corp.) a 37 °C utilizando una cámara anaeróbica de vinilo (COY Tipo A).^[85],^[86],^[87] Una vez que el cultivo alcanzó la turbidez (OD600 = 0,5), se realizó una segunda inoculación en el medio de cocultivo (CCM) un día antes del inicio del experimento, con una dilución de 1:50.^[52] Las bacterias se cultivaron en las mismas condiciones anaeróbicas hasta alcanzar la fase de crecimiento logarítmico medio (OD600 = 0,5), cuando la viabilidad celular era óptima para los ensayos posteriores.

Recubrimiento de insertos Transwell con colágeno IV

Se preparó una solución de colágeno IV (1 mg/mL) disolviendo 5 mg de colágeno IV liofilizado (Sigma, C5533-5 mg) en 5 mL de ácido acético frío al 100 mM (Fisher Scientific, A38-500).^[88] La solución de colágeno se agitó a 4 °C durante un mínimo de 5 h para permitir una solubilización completa, se dividió en alícuotas en condiciones estériles y se almacenó a -80 °C hasta su uso.

Para el recubrimiento de Transwell, las alícuotas de colágeno IV se descongelaron a 4 °C durante al menos 5 h. Se preparó una solución de trabajo de 33 μg/mL diluyendo la solución de stock en agua estéril fría (Milli-Q, Sigma-Aldrich).^[89] Las placas Transwell (Avantor, 76313-906) se preenfriaron a -20 °C y se agregaron 100 μL de la solución de colágeno a cada inserto (10 μg/cm2).^[90] Las placas se incubaron en hielo a 4 °C durante 30 min, seguido de una incubación a 37 °C durante 4 h para permitir la solidificación del colágeno. Después del recubrimiento, los insertos Transwell se utilizaron inmediatamente o se envolvieron con parafilm y se almacenaron a 4 °C hasta su uso.

Preparación de la monocapa celular de células HCT116

Las células HCT116 (ATCC CCL-247) se descongelaron de los cultivos almacenados y se expandieron una vez a una proporción de división de 1:3. Cuando los cultivos alcanzaron aproximadamente el 70% de confluencia, las células se separaron con tripsina-EDTA al 0,25% (Gibco, 25200056) durante 2 min a 37 °C, se neutralizó con DMEM completo y se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS).^[91] Las células se resuspendieron a una concentración final de 2 × 106 células/mL. Los insertos Transwell (tamaño de poro de 0,4 μm, membrana de policarbonato; Corning) pre-recubiertos con colágeno IV se aspiraron para eliminar la solución de recubrimiento residual y se sembraron 100 μL de la suspensión celular en cada cámara apical, lo que resultó en 2 × 105 células por inserto. Las cámaras basolaterales se llenaron con 600 μL de DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor (Gibco, A5670701) y 1% de penicilina-estreptomicina (P/S, 10 000 U/mL, Gibco, 15140122). Los cocultivos se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 durante 4 días. El medio apical se renovó cada 48 h, mientras que el medio basolateral se dejó sin tocar a menos que se indique lo contrario.

Cocultivo anaeróbico asimétrico de células HCT116

El procedimiento de cocultivo se realizó según lo descrito anteriormente con modificaciones menores. Brevemente, las placas permeables a los gases prellenadas con 600 μL de DMEM por pocillo se aseguraron en la cámara de cocultivo mediante tornillos. Los puertos de entrada y salida se conectaron a una corriente de gas mezclado (10% de O2, 5% de CO2, 85% de N2) a una velocidad de flujo final de 0,5 pies cúbicos estándar por hora (SCFH) y se aplicó agitación magnética para garantizar una distribución uniforme del gas. Los insertos Transwell que contenían monocapas celulares de HCT116 se retiraron de la incubadora y el medio de la cámara apical se reemplazó con DMEM sin antibióticos. Los insertos se transfirieron a la cámara anaeróbica y se mantuvieron bajo flujo de gas continuo durante 3 h para permitir el equilibrio de la atmósfera.

Fn previamente pasadas en medio CCM se cosecharon, se ajustaron a la concentración deseada y se diluyeron para lograr una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1. El medio de la cámara apical se reemplazó con la suspensión bacteriana diluida y los cocultivos se incubaron durante 24 h en condiciones anaeróbicas. En el punto de tiempo de 24 h, los agentes quimioterapéuticos (40 mM de concentración final) se agregaron a cada Transwell (los inhibidores o estimulantes se agregaron a las concentraciones indicadas), seguido de una incubación adicional de 24 h antes de los análisis posteriores. Esta configuración se replicó para el inhibidor U73122 (1 μM de concentración final) en combinación con 40 mM de metotrexato o fluorouracilo y 0,1 MOI de Fn.

Verificación de la viabilidad de la monocapa celular

Para la verificación de la viabilidad celular, se utilizó el ensayo CellTiter-Glo® 2.0 (Promega, G9241). Después del cocultivo, la monocapa celular se retiró y tanto las soluciones de la cámara apical como la basolateral se reemplazaron con DMSO que contenía penicilina/estreptomicina (P/S).^[92] La monocapa se incubó bajo este tratamiento durante 2 h. Después del tratamiento, las células se lavaron con PBS y se agregaron 100 μL del reactivo CellTiter-Glo® 2.0 a la cámara apical. Después de 10 min de incubación, se adquirieron imágenes de bioluminiscencia utilizando el sistema de imágenes Azure 300 con el modo de exposición automática.^[93] La intensidad de bioluminiscencia de los insertos Transwell se cuantificó posteriormente utilizando un lector de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices).^[94]

Después de la obtención de imágenes, los insertos Transwell se lavaron una vez con PBS. Para evaluar la proporción de células muertas, se realizó una tinción conjunta con SYTO9 Green (Thermo Fisher, S34854) y bromuro de etidio (solución al 1%, Fisher Scientific, BP1302-10), cada uno a una dilución de 1:10 000. La solución de tinción se agregó tanto a las cámaras apical como a la basolateral y la monocapa se incubó durante 10 min. Luego, se adquirieron imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio Nikon ECLIPSE Ts2-FL.^[95]

Combinaciones de dos fármacos

Las células HCT116 se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco y se trataron individualmente con metformina, cabazitaxel, acetato de megestrol, sorafenib, erlotinib, gemcitabina y metotrexato. También se trataron con combinaciones de cabazitaxel y megestrol con cada uno de los fármacos mencionados anteriormente (11 combinaciones en total). Las células se trataron con dosis de 0,9, 5, 10, 20 y 40 μM. La viabilidad celular se evaluó utilizando la tinción Cell Titer Glo, y los resultados se utilizaron como entrada para SynergyFinder para derivar las puntuaciones de Loewe.

Fármaco único y Fn

En el colon, las células intestinales están expuestas al oxígeno del suministro de sangre, pero los microorganismos no. Esto crea un gradiente de oxígeno que no se puede replicar mediante sistemas de cocultivo simples. Por lo tanto, utilizamos un sistema en el que se bombea oxígeno a las células de CRC sembradas en una membrana basal de una placa de 24 pocillos. En la cámara superior del pocillo, se siembran las células Fn. La velocidad del flujo de oxígeno a las células de CRC es aproximadamente equivalente a la captación de oxígeno, lo que hace que la cámara superior sea anaeróbica. Esto proporciona un entorno óptimo para que ambos tipos de células sobrevivan a largo plazo, mientras que en un sistema de cocultivo simple, Fn moriría después de varias horas, lo que causaría estrés adicional a las células de CRC. Si bien esta configuración es una de las formas más precisas de replicar el microambiente tumoral de CRC, está limitada por el tamaño de la placa que es compatible (un máximo de 24 pocillos). Esto restringió nuestros posibles tratamientos farmacológicos predichos para validar. Probamos 4 fármacos en total en combinación con Fn: fluorouracilo, metotrexato, metformina y cabazitaxel. Sin embargo, las pruebas con cabazitaxel no se completaron debido a limitaciones de solubilidad. Las células HCT116 se cocultivaron con Fn durante 24 horas antes del tratamiento con 40 μM de cada fármaco y luego se incubaron con Fn y el fármaco durante 24 horas adicionales. Se utilizó Cell Titer Glo para evaluar la viabilidad y determinar las puntuaciones de sinergia. Las células HCT116 se cotrataron con fluorouracilo o metotrexato y los inhibidores de la vía erastina (10 μM) o U73122 (1 μM) en presencia de Fn. Todas las combinaciones se aplicaron 24 horas antes de la medición de la viabilidad.

Condiciones de cultivo bacteriano

Fusobacterium nucleatum (ATCC 23726, https://www.atcc.org/) se inoculó inicialmente a partir de un cultivo de glicerol almacenado a 80 °C en medio Columbia (CB) (BD, 294420) 48 h antes del experimento y se cultivó en condiciones anaeróbicas (10 % de CO2, 5 % de H2 y 85 % de N2, Welding Supply Corp.) a 37 °C utilizando una cámara anaeróbica de vinilo (COY Type A).^[85],^[86],^[87] Una vez que el cultivo alcanzó turbidez (OD600 = 0,5), se realizó una segunda inoculación en el medio de cocultivo (CCM) un día antes del inicio del experimento, con una dilución de 1:50.^[52] Las bacterias se cultivaron en las mismas condiciones anaeróbicas hasta alcanzar la fase de crecimiento logarítmica media (OD600 = 0,5), momento en el que la viabilidad celular era óptima para los ensayos posteriores.

Recubrimiento con colágeno IV de los insertos de Transwell

Se preparó una solución de colágeno IV (1 mg/mL) disolviendo 5 mg de colágeno IV liofilizado (Sigma, C5533-5 mg) en 5 mL de ácido acético frío al 100 mM (Fisher Scientific, A38-500).^[88] La solución de colágeno se agitó a 4 °C durante un mínimo de 5 h para permitir una solubilización completa, se dividió en alícuotas en condiciones estériles y se almacenó a −80 °C hasta su uso.

Para el recubrimiento de Transwell, las alícuotas de colágeno IV se descongelaron a 4 °C durante al menos 5 h. Se preparó una solución de trabajo de 33 μg/mL diluyendo la solución de stock en agua estéril fría (Milli-Q, Sigma-Aldrich).^[89] Las placas de Transwell (Avantor, 76313-906) se preenfriaron a −20 °C y se añadieron 100 μL de la solución de colágeno a cada inserto (10 μg/cm2).^[90] Las placas se incubaron sobre hielo a 4 °C durante 30 min, seguido de una incubación a 37 °C durante 4 h para permitir la solidificación del colágeno. Después del recubrimiento, los insertos de Transwell se utilizaron inmediatamente o se envolvieron con parafilm y se almacenaron a 4 °C hasta su uso.

Preparación del monocapa celular de células HCT116

Las células HCT116 (ATCC CCL-247) se descongelaron a partir de cultivos almacenados y se expandieron una vez con una proporción de división de 1:3. Cuando los cultivos alcanzaron aproximadamente el 70 % de confluencia, las células se separaron con tripsina-EDTA al 0,25 % (Gibco, 25200056) durante 2 min a 37 °C, se neutralizó con DMEM completo y se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS).^[91] Las células se resuspendieron a una concentración final de 2 × 106 células/mL. Los insertos de Transwell (tamaño de poro de 0,4 μm, membrana de policarbonato; Corning) previamente recubiertos con colágeno IV se aspiraron para eliminar la solución de recubrimiento residual y se sembraron 100 μL de la suspensión celular en cada cámara apical, lo que resultó en 2 × 105 células por inserto. Las cámaras basolaterales se llenaron con 600 μL de DMEM suplementado con 10 % de suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor (Gibco, A5670701) y 1 % de penicilina-estreptomicina (P/S, 10 000 U/mL, Gibco, 15140122). Los cocultivos se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada con 5 % de CO2 durante 4 días. El medio apical se renovó cada 48 h, mientras que el medio basolateral se dejó sin modificar, a menos que se indicara lo contrario.

Cocultivo anaeróbico asimétrico de células HCT116

El procedimiento de cocultivo se realizó como se describió previamente con modificaciones menores. Brevemente, las placas permeables a los gases, previamente llenas con 600 μL de DMEM por pocillo, se fijaron a la cámara de cocultivo mediante tornillos. Los puertos de entrada y salida se conectaron a una corriente de gas mezclado (10 % de O2, 5 % de CO2, 85 % de N2) a una velocidad de flujo final de 0,5 pies cúbicos estándar por hora (SCFH), y se aplicó agitación magnética para garantizar una distribución uniforme del gas. Los insertos de Transwell que contenían monocapas de HCT116 en confluencia se retiraron de la incubadora y el medio de la cámara apical se reemplazó con DMEM sin antibióticos. Los insertos se transfirieron a la cámara anaeróbica y se mantuvieron bajo flujo de gas continuo durante 3 h para permitir la estabilización de la atmósfera.

Fn, previamente cultivado en medio CCM, se recolectó, se ajustó a la concentración deseada y se diluyó para lograr una relación de infección (MOI) de 0,1. El medio de la cámara apical se reemplazó con la suspensión bacteriana diluida y los cocultivos se incubaron durante 24 h en condiciones anaeróbicas. En el punto de las 24 h, se añadieron agentes quimioterapéuticos (40 mM de concentración final) a cada inserto de Transwell (inhibidores o estimulantes añadidos a las concentraciones indicadas), seguido de una incubación adicional de 24 h antes de los análisis posteriores. Esta configuración se replicó para el inhibidor U73122 (1 μM de concentración final) en combinación con 40 mM de metotrexato o fluorouracilo y 0,1 MOI de Fn.

Verificación de la viabilidad del monocapa celular

Para la verificación de la viabilidad celular, se utilizó el ensayo CellTiter-Glo® 2.0 (Promega, G9241). Después del cocultivo, el monocapa celular se retiró y tanto las soluciones de la cámara apical como de la basolateral se reemplazaron con DMSO que contenía penicilina/estreptomicina (P/S).^[92] El monocapa se incubó durante 2 h bajo este tratamiento. Después del tratamiento, las células se lavaron con PBS y se añadieron 100 μL del reactivo CellTiter-Glo® 2.0 a la cámara apical. Después de 10 min de incubación, se adquirieron imágenes de bioluminiscencia utilizando el sistema de imagen Azure 300 con el modo de autoexposición.^[93] Posteriormente, la intensidad de bioluminiscencia de los insertos de Transwell se cuantificó utilizando un lector de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices).^[94]

Después de la imagen, los insertos de Transwell se lavaron una vez con PBS. Para evaluar la proporción de células muertas, se realizó una tinción conjunta con SYTO9 Green (Thermo Fisher, S34854) y bromuro de etidio (solución al 1 %, Fisher Scientific, BP1302-10), cada uno a una dilución de 1:10 000. La solución de tinción se añadió tanto a las cámaras apical como basolateral y el monocapa se incubó durante 10 min. A continuación, se adquirieron imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio Nikon ECLIPSE Ts2-FL.^[95]