Células CAR-T dirigidas a MUC4 restringen el cáncer colorrectal resistente a la quimioterapia

La incidencia del cáncer colorrectal (CCR) ha aumentado considerablemente entre los adultos de 45 a 49 años, con incrementos anuales que se aceleraron del 1,1 % durante el período 2004-2019 al 12,0 % durante el período 2019-2022. Estos datos se deben principalmente a tumores en estadio local. La enfermedad en estadio avanzado ha aumentado de forma constante en individuos menores de 45 años y en aquellos de entre 45 y 54 años, lo que subraya la urgente necesidad de nuevas estrategias terapéuticas (^[1]). Dentro de los casos de CCR, los CCRs mucinosos se asocian con frecuencia a la diseminación metastásica, un mal pronóstico y resistencia a las quimioterapias convencionales. A pesar de los avances en los agentes dirigidos y el bloqueo de los puntos de control inmunitario, las respuestas duraderas en el CCR metastásico, especialmente en la enfermedad refractaria a la quimioterapia, siguen siendo limitadas (^[2]).

Las mucinas son proteínas secretadas y transmembrana de alto peso molecular y con un alto grado de glicosilación, que contribuyen a la protección epitelial, pero que con frecuencia están desreguladas en las neoplasias (^[3]). En el CCR y otros tumores sólidos, las mucinas se expresan de forma aberrante, con pérdida de la polaridad celular y adquisición de propiedades tumorales agresivas, y promueven la progresión tumoral, la evasión inmune y la resistencia terapéutica (^[3]). Entre las mucinas unidas a la membrana, MUC1 y MUC16 se han estudiado ampliamente como dianas de inmunoterapia; sin embargo, su amplia expresión basal en los epitelios normales y en el compartimento hematopoyético plantea preocupaciones sobre la toxicidad "on-target/off-tumor" (^[4]). En contraste, MUC4 presenta varias características que la convierten en un antígeno tumoral atractivo en varios tipos de tumores sólidos. MUC4 a menudo se encuentra significativamente sobreexpresada y despolarizada en el epitelio maligno, al tiempo que muestra una expresión más restringida en muchos tejidos normales, lo que podría ofrecer una ventana terapéutica mejorada (^[5]). Además, los polimorfismos genéticos de MUC4 y los niveles de expresión se asocian con la prevalencia y la supervivencia del CCR (^[6],^[7]).

La terapia con células T con receptor quimérico de antígeno (CAR) ha revolucionado el tratamiento de las neoplasias hematológicas al permitir la redirección específica de antígeno de la citotoxicidad de las células T, y cuenta con siete aprobaciones de la FDA y tasas de remisión de hasta el 90 % (^[8]). Sin embargo, la traslación de la eficacia de la terapia CAR-T a los tumores sólidos se ha visto obstaculizada por la heterogeneidad del antígeno diana, la toxicidad "on-target/off-tumor", la mala infiltración tumoral y el microambiente tumoral inmunosupresor (^[9],^[10]). El direccionamiento de MUC4 en el CCR representa una estrategia prometedora para superar algunas de estas barreras. Aquí, desarrollamos y caracterizamos funcionalmente células CAR-T de segunda generación dirigidas a MUC4 y evaluamos su eficacia contra modelos humanos de CCR resistentes a la quimioterapia in vitro e in vivo.

Métodos

Biología molecular y producción de lentivirus

Los plásmidos lentivirales MUC4CAR-2A-NGFRt y Luciferasa-2A-GFP fueron sintetizados por VectorBuilder (Chicago, IL). Todos los genes fueron impulsados por un promotor EF1A. El gen MUC4CAR contenía una señal peptídica CD8a, una etiqueta Myc N-terminal, una secuencia scFv derivada del clon de anticuerpo 8G7 que reconoce la MUC4 humana, un dominio de bisagra CD8, un dominio transmembrana CD28 y un dominio de señalización CD28-CD3z (^[11]). El lentivirus se produjo mediante la transfección de células HEK293FT con el plásmido de interés y plásmidos de empaquetamiento de lentivirus, según se describió anteriormente (^[12]). El lentivirus se tituló, se dividió en alícuotas y se almacenó a −80 °C hasta su uso.

Cultivo celular

Las células HT-29-MTX, T84 y HEK293T se utilizaron entre los pasajes 50 y 100 para las dos primeras líneas celulares y hasta el pasaje 25 para las células HEK293FT. Todas las líneas celulares se cultivaron de forma rutinaria en DMEM-10, compuesto por medio basal DMEM (25 mM de glucosa) suplementado con un 10 % de suero fetal bovino (SFB) inactivado térmicamente (30 min, 56 °C) y penicilina-estreptomicina (todos de Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Las líneas celulares se pasaron utilizando tripsina-EDTA al 0,25 % (Gibco), se sembraron a 1 x 106 células por frasco de 75 cm2 y se mantuvieron en una incubadora de cultivo celular a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2 y 95 % de aire. Para fines de mantenimiento, las células se pasaron cada 2-3 días para mantener el crecimiento logarítmico. Todos los experimentos se realizaron en placas de 24 pocillos (5 x 10 células por pocillo) o placas de 96 pocillos (1 x 10 células por pocillo). Las células T humanas primarias se cultivaron en RPMI-10, compuesto por medio basal RPMI-1640 suplementado con un 10 % de SFB inactivado térmicamente, GlutaMAX, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales (AANE), HEPES y penicilina-estreptomicina (todos de Gibco) en presencia de 100 UI/ml de IL-2 recombinada humana (PeproTech, ThermoFisher Scientific). Las células se pasaron y se añadió medio fresco y IL-2 cada dos días.

Generación de células CAR-T

Las células T humanas se aislaron de las células mononucleares de sangre periférica (CMNP) obtenidas de donantes de sangre desidentificados (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canadá) mediante selección negativa magnética utilizando un kit de aislamiento de células T CD3+ humanas (STEMCELL Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante y se activaron con cuentas dynabeads anti-CD3/CD28 (Gibco) en una proporción de 1:1 de cuentas a células y 100 UI/ml de IL-2. Dos días después de la activación, las células T se transfectaron con lentivirus MUC4CAR a una multiplicidad de infección de 1 (una partícula por célula) en presencia de 100 UI/ml de IL-2. Inmediatamente después de añadir el lentivirus, las células T se centrifugaron a 1000 x g a 32 °C durante 1 h y luego se devolvieron a la incubadora de cultivo celular, según se describió anteriormente (^[12]). Después de la transducción, las células T se mantuvieron y se expandieron en medio RPMI-10, añadiendo medio fresco e IL-2 cada 2 días. Las células T que expresan CAR se purificaron mediante selección positiva magnética basada en la expresión del reportero NGFRt utilizando un kit de selección positiva de CD271 humano (STEMCELL Technologies), según las instrucciones del fabricante, antes de utilizarlas en los experimentos.

Citometría de flujo

Las líneas celulares y las células T se tiñeron en superficie con anticuerpos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Gibco) en tubos de FACS durante 30 min a 4 °C en la oscuridad, se lavaron y se resuspendieron en PBS para su lectura en un citómetro de flujo CytoFLEX (Beckman Coulter, Brea, CA). Los anticuerpos utilizados en este estudio fueron MUC4 (clon 87G, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), AlexaFluor647 anti-cabra (ThermoFisher), Myc-tag AlexaFluor647 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) y NGFR/CD271 PE (Biolegend, San Diego, CA), así como el colorante de viabilidad Ghost Red780 (Cytek, Fremont, CA). Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando FlowJo v10.0 (FlowJo, Ashland, OR).

Generación de células cancerosas marcadas con luciferasa

La transducción lentiviral de las líneas celulares con el constructo de doble reportero que codifica la luciferasa de luciérnaga y la GFP separadas por una secuencia 2A se realizó a diferentes multiplicidades de infección (MOI). Entre las condiciones probadas, una MOI de 10 produjo una integración óptima y uniforme del gen del reportero sin comprometer la viabilidad celular. Después de la transducción, las células positivas para GFP se clasificaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando un clasificador BD FACS Aria (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y luego se expandieron en múltiples pasajes. Las células T84-Luc-GFP y HT29-MTX-Luc-GFP clasificadas por FACS mantuvieron una expresión estable de GFP, lo que sugiere una integración lentiviral duradera y estabilidad transcripcional. Para confirmar la actividad funcional de la luciferasa, las células diseñadas se incubaron con el sustrato D-luciferina (Biosynth, Gardner, MA) y se visualizaron para la emisión de fotones utilizando un sistema de detección de bioluminiscencia AMI (Spectral Instruments Imaging, Tucson, AZ). Tanto las líneas celulares T84-Luc-GFP como HT29-MTX-Luc-GFP emitieron señales de bioluminiscencia robustas y cuantificables, lo que validó su idoneidad para el seguimiento in vivo.

Medición de la citotoxicidad

Las células cancerosas diana se sembraron a una densidad de 104 células/pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos y se cocultivaron con células CAR-T MUC4CAR o UT-T a diferentes relaciones efector:diána (E:D) durante 36 horas. Al final de la cocultivación, se emplearon tres técnicas diferentes para medir la citotoxicidad. Se realizó el ensayo de citotoxicidad de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) CyQUANT según las instrucciones del fabricante (ThermoFisher). Al final de la incubación, se recogieron cuidadosamente 50 μL del sobrenadante del cultivo y se transfirieron a una nueva placa, tras lo cual se añadió el reactivo de detección de LDH. Después del desarrollo del color, se midió la absorbancia a 490 nm utilizando un lector de microplacas (SpectraMax, Molecular Devices, San Jose, CA). El porcentaje de citotoxicidad se calculó en relación con los controles de lisis espontánea y máxima, lo que permitió la normalización entre los experimentos. Todas las condiciones se realizaron en triplicado técnico. Se realizó el ensayo de viabilidad (citotoxicidad) CCK-8 según las instrucciones del fabricante (Millipore-Sigma, Burlington, MA). Al final de la incubación, se aspiró el medio, se lavaron las células cancerosas adheridas con PBS y se añadió medio fresco con 10 μL del reactivo CCK-8 directamente a cada pocillo con un volumen total de 100 μL y se incubó a 37 °C para permitir la reducción de WST-8 por las células metabólicamente activas. Se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas y se calculó la viabilidad relativa después de la sustracción del fondo y la normalización con los controles solo de diana. Una reducción de la señal metabólica se interpretó como un aumento de la citotoxicidad mediada por las células CAR-T. La viabilidad celular también se determinó mediante citometría de flujo mediante la recolección de los cocultivos con tripsina-EDTA, la tinción de las células con el colorante de viabilidad Ghost Red780 y la cuantificación del porcentaje de células positivas para el colorante.

Modelos de xenoinjerto de ratón NSG

Todos los experimentos se realizaron en ratones NSG inmunodeficientes de 8 a 12 semanas de edad (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). A las hembras de ratón NSG se inyectaron por vía subcutánea 5 x 106 células HT29-MTX. Las mediciones del tumor se realizaron utilizando un calibrador a partir de una semana después de la inyección del tumor, momento en el que los ratones se aleatorizaron en función del tamaño del tumor y recibieron 5 x 106 células UT o CAR-T MUC4 por vía intravenosa mediante inyección retroorbital (^[13]). El tamaño del tumor se midió a lo largo del tiempo con un calibrador. Para el modelo de diseminación metastásica del cáncer, las células modificadas con luciferasa se inyectaron por vía intraperitoneal en ratones NSG: 5 x 106 T84-luc-GFP en ratones macho y 5 x 106 HT29-MTX-luc-GFP en ratones hembra. Una semana después, se iniciaron las mediciones de la actividad de la luciferasa. Los ratones se inyectaron por vía intraperitoneal con 100 μL de sustrato de luciferina de 0,22 mm filtrado y esterilizado a 15 mg/ml y, 8 minutos después, se visualizaron en el sistema de imagen AMI bajo anestesia con isoflurano durante 1 minuto (^[14]). El análisis de los datos de la actividad de la luciferasa se realizó utilizando el software Aura (Spectral Instruments Imaging). Los ratones se aleatorizaron en función de la señal de luciferasa y recibieron 5 x 106 células UT o CAR-T MUC4 por vía intravenosa mediante inyección retroorbital. El tamaño del tumor se midió a lo largo del tiempo con un calibrador. La carga tumoral se midió a lo largo del tiempo mediante imagen de bioluminiscencia y, al final del experimento, mediante necropsia del ratón.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism v10.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Los datos se presentan como media ± DE, a menos que se indique lo contrario. La significación estadística se determinó utilizando las pruebas especificadas en las leyendas de las figuras correspondientes. Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo.

Biología molecular y producción de lentivirus

Los plásmidos lentivirales MUC4CAR-2A-NGFRt y Luciferasa-2A-GFP fueron sintetizados por VectorBuilder (Chicago, IL). Todos los genes fueron impulsados por un promotor EF1A. El gen MUC4CAR contenía una señal peptídica CD8a, una etiqueta Myc N-terminal, una secuencia scFv derivada del clon de anticuerpo 8G7 que reconoce la MUC4 humana, un dominio de bisagra CD8, un dominio transmembrana CD28 y un dominio de señalización CD28-CD3z (^[11]). El lentivirus se produjo mediante la transfección de células HEK293FT con el plásmido de interés y plásmidos de empaquetamiento de lentivirus, según se describió anteriormente (^[12]). El lentivirus se tituló, se dividió en alícuotas y se almacenó a −80 °C hasta su uso.

Cultivo celular

Se utilizaron las células HT-29-MTX, T84 y HEK293T entre los pasajes 50 y 100 para las dos primeras líneas celulares y hasta el pasaje 25 para las células HEK293FT. Todas las líneas celulares se cultivaron de forma rutinaria en DMEM-10, compuesto por medio basal DMEM (25 mM de glucosa) suplementado con suero bovino fetal (FBS) inactivado térmicamente (30 min, 56 °C) al 10% y penicilina-estreptomicina (todo de Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Las líneas celulares se pasaron utilizando 0,25% de tripsina-EDTA (Gibco), se sembraron a 1 x 106 células por frasco de 75 cm2 y se mantuvieron en una incubadora de cultivo celular a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2 y 95% de aire. Para fines de mantenimiento, las células se pasaron cada 2-3 días para mantener un crecimiento logarítmico. Todos los experimentos se realizaron en placas de 24 pocillos (5 × 10 células por pocillo) o de 96 pocillos (1 × 10 células por pocillo). Las células T humanas primarias se cultivaron en RPMI-10, compuesto por medio basal RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS inactivado térmicamente, GlutaMAX, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales (NEAA), HEPES y penicilina-estreptomicina (todo de Gibco) en presencia de 100 UI/ml de IL-2 humana recombinante (PeproTech, ThermoFisher Scientific). Las células se pasaron y se añadió medio fresco y IL-2 cada dos días.

Generación de células CAR-T

Las células T humanas se aislaron de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de donantes de sangre desidentificados (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canadá) mediante selección negativa magnética utilizando un kit de aislamiento de células T CD3+ humanas (STEMCELL Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante y se activaron con cuentas dynabeads anti-CD3/CD28 (Gibco) en una proporción de 1:1 de cuentas a células y 100 UI/ml de IL-2. Dos días después de la activación, las células T se transducieron con lentivirus MUC4CAR a una multiplicidad de infección de 1 (una partícula por célula) en presencia de 100 UI/ml de IL-2. Inmediatamente después de añadir el lentivirus, las células T se centrifugaron a 1.000 x g a 32 °C durante 1 h y luego se devolvieron a la incubadora de cultivo celular, como se describió anteriormente (^[12]). Después de la transducción, las células T se mantuvieron y se expandieron en medio RPMI-10, añadiendo medio fresco e IL-2 cada 2 días. Las células T que expresan CAR se purificaron mediante selección magnética positiva basada en la expresión del reportero NGFRt utilizando un kit de selección positiva de CD271 humano (STEMCELL Technologies), según las instrucciones del fabricante, antes de usarse en los experimentos.

Citometría de flujo

Las líneas celulares y las células T se tiñeron superficialmente con anticuerpos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Gibco) en tubos de FACS durante 30 min a 4 °C en la oscuridad, se lavaron y se resuspendieron en PBS para la lectura en un citómetro de flujo CytoFLEX (Beckman Coulter, Brea, CA). Los anticuerpos utilizados en este estudio fueron MUC4 (clon 87G, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-ratón AlexaFluor647 (ThermoFisher), Myc-tag AlexaFluor647 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) y NGFR/CD271 PE (Biolegend, San Diego, CA), así como el colorante de viabilidad Ghost Red780 (Cytek, Fremont, CA). Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando FlowJo v10.0 (FlowJo, Ashland, OR).

Generación de células cancerosas marcadas con luciferasa

La transducción lentiviral de las líneas celulares con el constructo de doble reportero que codifica la luciferasa de luciérnaga y GFP separados por una secuencia 2A se realizó a diferentes multiplicidades de infección (MOI). Entre las condiciones probadas, una MOI de 10 produjo una integración óptima y uniforme del gen reportero sin comprometer la viabilidad celular. Después de la transducción, las células GFP positivas se clasificaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando un clasificador BD FACS Aria (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y posteriormente se expandieron en múltiples pasajes. Las células T84-Luc-GFP y HT29-MTX-Luc-GFP clasificadas por FACS mantuvieron una expresión estable de GFP, lo que sugiere una integración lentiviral duradera y estabilidad transcripcional. Para confirmar la actividad funcional de la luciferasa, las células modificadas se incubaron con el sustrato D-luciferina (Biosynth, Gardner, MA) y se visualizaron para la emisión de fotones utilizando un sistema de detección de bioluminiscencia AMI (Spectral Instruments Imaging, Tucson, AZ). Tanto las líneas celulares T84-Luc-GFP como HT29-MTX-Luc-GFP emitieron señales de bioluminiscencia robustas y cuantificables, lo que validó su idoneidad para el seguimiento in vivo.

Medición de la citotoxicidad

Las células cancerosas diana se sembraron a una densidad de 104 células/pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo plano y se cocultivaron con células MUC4CAR-T o UT-T a diferentes relaciones efector:diána (E:T) durante 36 horas. Al final del cocultivo, se emplearon tres técnicas diferentes para medir la citotoxicidad. Se realizó el ensayo de citotoxicidad de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) CyQUANT según las instrucciones del fabricante (ThermoFisher). Al final de la incubación, se recogieron cuidadosamente 50 μL del sobrenadante del cultivo y se transfirieron a una nueva placa, después de lo cual se añadió el reactivo de detección de LDH. Después del desarrollo del color, se midió la absorbancia a 490 nm utilizando un lector de microplacas (SpectraMax, Molecular Devices, San Jose, CA). El porcentaje de citotoxicidad se calculó en relación con los controles de lisis espontánea y máxima, lo que permitió la normalización entre los experimentos. Todas las condiciones se realizaron en triplicado técnico. Se realizó el ensayo de viabilidad (citotoxicidad) CCK-8 según las instrucciones del fabricante (Millipore-Sigma, Burlington, MA). Al final de la incubación, se aspiró el medio, se lavaron las células cancerosas adheridas con PBS y se añadió medio fresco con 10 μL del reactivo CCK-8 directamente a cada pocillo con un volumen total de 100 μL y se incubó a 37 °C para permitir la reducción de WST-8 por las células metabólicamente activas. Se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas y se calculó la viabilidad relativa después de la sustracción del fondo y la normalización con los controles solo de diana. Se interpretó una señal metabólica reducida como un aumento de la citotoxicidad mediada por las células CAR-T. La viabilidad celular también se determinó mediante citometría de flujo mediante la recolección de los cocultivos con tripsina-EDTA, la tinción de las células con el colorante de viabilidad Ghost Red780 y la cuantificación del porcentaje de células positivas al colorante.

Modelos de xenoinjerto de ratón NSG

Todos los experimentos se realizaron en ratones NSG inmunodeficientes de 8 a 12 semanas de edad (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Se inyectaron por vía subcutánea 5 x 106 células HT29-MTX a ratones NSG hembra. Las mediciones del tumor se realizaron utilizando un calibrador a partir de una semana después de la inyección del tumor, momento en el que los ratones se aleatorizaron en función del tamaño del tumor y recibieron 5 x 106 células CAR T no transducidas (UT) o MUC4 por vía intravenosa mediante inyección retro-orbital (^[13]). El tamaño del tumor se midió a lo largo del tiempo con un calibrador. Para el modelo de diseminación de cáncer metastásico, se inyectaron células modificadas con luciferasa por vía intraperitoneal en ratones NSG: 5 x 106 T84-luc-GFP en ratones macho y 5 x 106 HT29-MTX-luc-GFP en ratones hembra. Una semana después, se iniciaron las mediciones de la actividad de la luciferasa. Se inyectaron por vía intraperitoneal a los ratones 100 μL de sustrato de D-luciferina filtrado y esterilizado a 0,22 mm a 15 mg/ml y, 8 minutos después, se visualizaron en el sistema de imagen óptica AMI bajo anestesia con isoflurano durante 1 minuto (^[14]). El análisis de los datos de la actividad de la luciferasa se realizó utilizando el software Aura (Spectral Instruments Imaging). Los ratones se aleatorizaron en función de la señal de luciferasa y recibieron 5 x 106 células CAR T UT o MUC4 por vía intravenosa mediante inyección retro-orbital. El tamaño del tumor se midió a lo largo del tiempo con un calibrador. La carga tumoral se midió a lo largo del tiempo mediante imagen de bioluminiscencia y al final del experimento mediante necropsia del ratón.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism v10.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Los datos se presentan como media ± DE, a menos que se indique lo contrario. La significación estadística se determinó utilizando las pruebas especificadas en las leyendas de las figuras correspondientes. Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo.

Resultados

MUC4 es un objetivo de superficie celular en el cáncer colorrectal

Para probar nuestra hipótesis de que MUC4 es un nuevo objetivo para la terapia con células T receptor de antígeno quimérico (CAR) contra el cáncer colorrectal (CRC) difícil de tratar, primero evaluamos la expresión del gen MUC4 en diferentes subtipos y estadios de CRC. Descubrimos que la expresión de MUC4 es mayor en el CRC mucinoso en comparación con el no mucinoso en todos los estadios, desde el estadio I (localizado) hasta el estadio IV (metastásico) (Fig. 1A). A continuación, buscamos analizar la expresión superficial de MUC4 en un panel de líneas celulares humanas de CRC. Todas las líneas probadas expresaron MUC4, según lo determinado por citometría de flujo con el anticuerpo anti-MUC4 clon 8G7 (Fig. 1B). Curiosamente, dos de los mayores expresores de MUC4, HT29-MTX y T84, se sabe que son muy mucinosos y resistentes a los agentes quimioterapéuticos, como el metotrexato (MTX) (^[15]-^[17]). Dada esta observación y el hecho de que el CRC resistente a la quimioterapia representa la mayor necesidad de nuevas terapias, nos centramos en las células HT29-MTX y T84 en los experimentos posteriores.

Las células CAR-T MUC4 median una citotoxicidad potente y selectiva contra las células de CRC resistentes a la quimioterapia

Para atacar MUC4, tomamos una secuencia de fragmento de variable de cadena única (scFv) correspondiente al anticuerpo anti-humano MUC4 clon 8G7 y diseñamos un constructo CAR CD28-CD3zeta de segunda generación que ataca a MUC4. Este constructo incorporó una secuencia de Kozak aguas arriba de una secuencia de péptido señal CD8α para optimizar la expresión y el tráfico de membrana. Además, se incluyó una etiqueta Myc N-terminal para facilitar la detección de esta nueva CAR en la superficie celular. El dominio de unión al antígeno, que comprende el scFv formado por los dominios VL y VH derivados del clon 8G7 específico de MUC4 enlazados mediante un enlazador flexible (GGGS)3, se fusionó a un dominio transmembrana CD28 y un dominio de señalización intracelular tándem CD28-CD3zeta. Importante, una secuencia de péptido de auto-escisión T2A permitió la expresión bicistrónica de la CAR y un gen de reportero del receptor de crecimiento nervioso truncado (NGFRt) como un marcador de superficie independiente y seleccionable de la transducción de células T (Fig. 2A).

Las células T humanas primarias se aislaron de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), se activaron con cuentas anti-CD3/CD28 y 100 UI/ml de IL-2, se transducieron con lentivirus MUC4 CAR y se expandieron in vitro (Fig. 2B). La CAR MUC4 se expresó con éxito en la superficie de las células T, según lo demostró la tinción de la etiqueta Myc (Fig. 2C) y logramos eficiencias de transducción iniciales de ~30% en los donantes, según lo evaluado por la frecuencia de células Myc-tag+NGFR+ (Fig. 2C). Para reducir la contaminación de células T no transducidas (UT) en los ensayos inmunitarios, las células NGFRt+ se enriquecieron magnéticamente, lo que resultó en una población de células CAR+ de aproximadamente 90% pura según la frecuencia de células Myc-tag+ y NGFR+ (Fig. 2D). Las células CAR-T MUC4 se utilizaron para los experimentos de 10 a 12 días después del aislamiento y la activación inicial de las células T (Fig. 2B). Como se esperaba, observamos una disminución pronunciada en el número y la viabilidad de las células T 48 horas después de la estimulación de las células T con anti-CD3/CD28 e IL-2, el pico de activación de las células T (Fig. 2E). No obstante, a lo largo de una semana, tanto las células T UT como las células T transducidas con MUC4 CAR se expandieron ~30 veces y recuperaron ~90% de viabilidad (Fig. 2F), lo que indica que la expresión de MUC4 CAR por sí sola no es tóxica para las células T. Importante, las células CAR-T MUC4 continuaron expandiéndose y mantuvieron una alta viabilidad celular después de la selección magnética de NGFR (Fig. 2G), estableciendo nuestro flujo de trabajo de generación de células CAR-T.

A continuación, evaluamos la citotoxicidad in vitro específica del antígeno MUC4 en las células CAR. Las células CAR-T MUC4 se cocultivaron con células HEK293T MUC4-negativas como control de especificidad negativa y con las líneas de CRC que expresan MUC4, T84 (metastásica) y HT29-MTX (resistente al metotrexato) (Fig. 3A). En múltiples relaciones efector/diálogo (E:T) (0,5:1 a 4:1), las células HEK293T permanecieron resistentes a la muerte mediada por las células CAR-T, lo que indica una actividad fuera del objetivo mínima. En contraste, las células CAR-T MUC4 indujeron una citotoxicidad pronunciada y dependiente de la dosis contra las células T84 y HT29-MTX. Esta actividad antitumoral selectiva se confirmó de manera consistente en diferentes plataformas, incluyendo la liberación de LDH (Fig. 3B), la viabilidad CCK-8 (Fig. 3C), el examen microscópico (Fig. S1A) y la detección de células vivas/muertas mediante citometría de flujo (Fig. S1B). En conjunto, estos datos demuestran una robusta función citotóxica restringida por el antígeno de las células CAR-T MUC4 contra los tumores de CRC resistentes al metotrexato in vitro.

Las células CAR-T MUC4 suprimen el crecimiento tumoral localizado y metastásico resistente al metotrexato HT29-MTX in vivo.

Tras establecer una potente actividad citotóxica in vitro contra las células diana quimioresistentes MUC4+, evaluamos a continuación la eficacia y seguridad in vivo de las células CAR-T MUC4. Inicialmente, probamos modelos de xenoinjerto subcutáneo (s.c.) en ratones NSG utilizando las células HT29-MTX y T84. Si bien las células T84 demostraron un engraftamiento subcutáneo deficiente e inconsistente, los tumores HT29-MTX crecieron de manera robusta y, por lo tanto, se priorizaron para los estudios de eficacia in vivo (datos no mostrados).

La transferencia adoptiva intravenosa (i.v.) de células CAR-T MUC4, pero no de células T UT, en ratones NSG con tumores s.c. HT29-MTX atenuó significativamente la progresión tumoral (Fig. 4A). La cinética de crecimiento tumoral analizada mediante modelado de efectos mixtos (tiempo × tratamiento) demostró un efecto de tratamiento altamente significativo (p < 0,0001), lo que se corroboró de forma independiente mediante el análisis del área bajo la curva (AUC) (Fig. 4B). No se observaron efectos secundarios adversos causados por la inyección de células CAR-T MUC4. Estos datos indican que las células CAR-T MUC4 restringen eficazmente el crecimiento de los tumores de CRC resistentes al metotrexato localizados in vivo.

Para permitir el seguimiento longitudinal y anatómicamente relevante de la CRC metastásica, generamos variantes de las líneas celulares T84 y HT29-MTX que expresan luciferasa. Ambas líneas se transducieron mediante lentivirus con un doble gen reportero de luciferasa de luciérnaga y GFP separados por un péptido 2A. Una multiplicidad de infección (MOI, número de partículas virales por célula) de 10 logró una integración uniforme del gen reportero GFP sin comprometer la viabilidad (Fig. S2A, B). Las células GFP+ se purificaron mediante FACS (Fig. S2C) y se expandieron, manteniendo una expresión estable del gen reportero GFP a lo largo de los cultivos seriados (Fig. 2D), lo que es consistente con una integración duradera del transgen. La validación funcional confirmó una robusta señal de bioluminiscencia tras la incubación con el sustrato D-luciferina (Fig. S2E), lo que respalda su idoneidad para el seguimiento in vivo. En esencia, los niveles de expresión de MUC4 en la superficie no se vieron afectados en comparación con las líneas celulares parentales (Fig. S2F). El peritoneo es un sitio metastásico común para la CRC avanzada y se asocia con malos resultados (^[18]). Por lo tanto, buscamos establecer modelos de xenoinjerto de CRC intraperitoneal para recapitular mejor el comportamiento metastásico de la CRC mucinosa. De acuerdo con el sexo del paciente con cáncer de origen, las células T84-Luc-GFP se implantaron en ratones NSG machos y las células HT29-MTX-Luc-GFP en ratones NSG hembra a dos dosis celulares diferentes, 2x106 y 5x106 células (Fig. S3A). La imagen de bioluminiscencia longitudinal reveló un engraftamiento marcadamente superior y más consistente de las células HT29-MTX-Luc-GFP en comparación con las células T84-Luc-GFP (Fig. S3B, C), lo que llevó a la selección del modelo HT29-MTX para estudios posteriores.

La administración de células CAR-T MUC4 por vía intravenosa (i.v.) retrasó significativamente la progresión tumoral diseminada de HT29-MTX, según se evaluó mediante la actividad de la luciferasa (Fig. 4C, D) y se calculó utilizando el análisis de AUC (Fig. 4E), y mejoró significativamente la supervivencia general de los ratones con tumores (Fig. 4F). El análisis patológico general tras la necropsia de los ratones a las 3 semanas después de la infusión i.v. de células CAR-T MUC4 no reveló diferencias en el peso corporal o el peso de los órganos normalizado al peso corporal entre los grupos de solución salina, células T UT y células CAR-T MUC4 (Fig. S4). Se observó una engraftación tumoral frecuente en el diafragma, el páncreas y el útero en los animales tratados con solución salina y células T UT, mientras que los ratones tratados con células CAR-T MUC4 exhibieron una carga tumoral sustancialmente reducida en estos sitios.

En conjunto, estos hallazgos demuestran que las células CAR-T MUC4 ejercen una robusta actividad antitumoral contra la CRC localizada resistente al metotrexato in vivo, conservan la eficacia en un modelo clínicamente relevante de CRC diseminada resistente al metotrexato y son seguras.

MUC4 es un objetivo de superficie celular en el cáncer colorrectal

Para probar nuestra hipótesis de que MUC4 es un nuevo objetivo para la terapia con células T receptor de antígeno quimérico (CAR) contra el cáncer colorrectal (CRC) difícil de tratar, primero evaluamos la expresión del gen MUC4 en diferentes subtipos y etapas de CRC. Descubrimos que la expresión de MUC4 es mayor en la CRC mucinosa en comparación con la no mucinosa en todas las etapas, desde la etapa I (localizada) hasta la etapa IV (metastásica) (Fig. 1A). A continuación, buscamos analizar la expresión de MUC4 en la superficie en un panel de líneas celulares humanas de CRC. Todas las líneas probadas expresaron MUC4, según lo determinado por citometría de flujo con el anticuerpo del clon 8G7 anti-MUC4 (Fig. 1B). Curiosamente, dos de los mayores expresores de MUC4, HT29-MTX y T84, se sabe que son altamente mucinosos y resistentes a los agentes quimioterapéuticos, como el metotrexato (MTX) (^[15]-^[17]). Dada esta observación y el hecho de que la CRC resistente a la quimioterapia representa la mayor necesidad de nuevas terapias, nos centramos en las células HT29-MTX y T84 en los experimentos posteriores.

Las células CAR-T MUC4 median una citotoxicidad potente y selectiva contra las células de CRC resistentes a la quimioterapia

Para atacar MUC4, tomamos una secuencia de fragmento variable de cadena única (scFv) correspondiente al anticuerpo anti-humano MUC4 clon 8G7 y diseñamos una construcción CAR de segunda generación CD28-CD3zeta que ataca a MUC4. Esta construcción incorporó una secuencia de Kozak aguas arriba de una secuencia de péptido de señal CD8α para optimizar la expresión y el tráfico de membrana. Además, se incluyó una etiqueta Myc N-terminal para facilitar la detección de esta nueva CAR en la superficie celular. El dominio de unión al antígeno, que comprende el scFv formado por los dominios VL y VH derivados del clon 8G7 específico de MUC4 unidos mediante un enlazador flexible (GGGS)3, se fusionó a un dominio transmembrana CD8 y un dominio de señalización intracelular tándem CD28-CD3zeta. Es importante destacar que una secuencia de péptido de autolimpieza T2A permitió la expresión bicistrónica de la CAR y un gen reportero del receptor de factor de crecimiento nervioso truncado (NGFRt) como un marcador de superficie independiente y seleccionable de la transducción de células T (Fig. 2A).

Se aislaron células T humanas primarias de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), se activaron con cuentas anti-CD3/CD28 y 100 UI/ml de IL-2, se transducieron con lentivirus CAR MUC4 y se expandieron in vitro (Fig. 2B). La CAR MUC4 se expresó con éxito en la superficie de las células T, según lo demostró la tinción con la etiqueta Myc (Fig. 2C) y logramos eficiencias de transducción iniciales de aproximadamente el 30% en los donantes, según lo evaluado por la frecuencia de células Myc-tag+NGFR+ (Fig. 2C). Para reducir la contaminación de células T no transducidas (UT) en los ensayos inmunitarios, las células NGFRt+ se enriquecieron magnéticamente, lo que resultó en una población de células CAR+ de aproximadamente el 90% según la frecuencia de células Myc-tag+ y NGFR+ (Fig. 2D). Las células CAR-T MUC4 se utilizaron para los experimentos de 10 a 12 días después del aislamiento y la activación inicial de las células T (Fig. 2B). Como se esperaba, observamos una disminución pronunciada en el número de células T y la viabilidad 48 horas después de la estimulación de las células T con anti-CD3/CD28 e IL-2, el pico de la activación de las células T (Fig. 2E). Sin embargo, en el transcurso de una semana, tanto las células T UT como las células CAR-T MUC4 transducidas se expandieron aproximadamente 30 veces y recuperaron aproximadamente el 90% de la viabilidad (Fig. 2F), lo que indica que la expresión de la CAR MUC4 por sí sola no es tóxica para las células T. Es importante destacar que las células CAR-T MUC4 continuaron expandiéndose y mantuvieron una alta viabilidad celular después de la selección magnética de NGFR (Fig. 2G), lo que estableció nuestro flujo de trabajo de generación de células CAR-T.

La administración de células CAR-T MUC4 por vía intravenosa retrasó significativamente la progresión del tumor diseminado HT29-MTX, según se evaluó mediante la actividad de la luciferasa (Fig. 4C, D) y se calculó utilizando el análisis del AUC (Fig. 4E), y mejoró significativamente la supervivencia general de los ratones portadores de tumores (Fig. 4F). El análisis patológico general tras la necropsia de los ratones a las 3 semanas de la infusión intravenosa de células CAR-T MUC4 no reveló diferencias en el peso corporal o el peso de los órganos normalizados al peso corporal entre los grupos de solución salina, células T UT y células CAR-T MUC4 (Fig. S4). Se observó una frecuente implantación tumoral en el diafragma, el páncreas y el útero en los animales tratados con solución salina y células T UT, mientras que los ratones tratados con células CAR-T MUC4 mostraron una reducción sustancial de la carga tumoral en estos sitios.

En conjunto, estos hallazgos demuestran que las células CAR-T MUC4 ejercen una potente actividad antitumoral contra el CRC resistente al metotrexato localizado in vivo, mantienen la eficacia en un modelo clínicamente relevante de CRC diseminado resistente al metotrexato y son seguras.

Discusión

La terapia con células CAR-T se está investigando activamente en el CRC como una estrategia para superar la resistencia a la quimioterapia mediante la eliminación de células tumorales específica del antígeno. Se han explorado varios objetivos CAR en el CRC, incluidos GUCY2C, CEA, EpCAM, HER2, EGFR y CLDN18.2 (^[19]). Sin embargo, como se observa en los tumores sólidos en general (^[9], ^[10]), las estrategias de células CAR-T dirigidas a antígenos epiteliales convencionales en el CRC han mostrado un éxito clínico limitado debido a la heterogeneidad de los antígenos, la toxicidad "on-target/off-tumor" resultante de la expresión compartida en los tejidos normales y la escasa persistencia dentro del microambiente tumoral inmunosupresor. Además, las barreras físicas específicas de los tumores de CRC ricos en mucina dificultan la infiltración de las células inmunitarias, la formación efectiva de sinapsis y conducen a fallos en la inmunoterapia (^[3]). Estas limitaciones resaltan la necesidad de estrategias alternativas que sean tanto de restricción tumoral como biológicamente relevantes para la progresión de la enfermedad.

Las mucinas son proteínas de alto peso molecular y muy glicosiladas que forman barreras protectoras, lubricantes y de señalización en las superficies epiteliales, y se clasifican en dos tipos principales: secretadas y asociadas a la superficie celular. Las mucinas secretadas (formadoras de gel), como MUC2 y MUC5AC, forman una capa de moco, mientras que las mucinas unidas a la membrana, como MUC1, MUC4 y MUC16, se anclan a la superficie apical de las células y desempeñan un papel en la unión de patógenos y la señalización celular (^[20]). La inmunoterapia dirigida a mucinas unidas a la membrana en tumores sólidos se ha centrado principalmente en MUC1 y, más recientemente, en MUC16; sin embargo, cada una presenta limitaciones traslacionales que han atenuado el éxito clínico (^[21], ^[22]). MUC1 está sobreexpresada y despolarizada en muchos carcinomas, pero también tiene una expresión apreciable en una variedad de epitelios normales y células hematopoyéticas, mientras que MUC16 se expresa normalmente en la superficie ocular como protección contra los patógenos (^[23], ^[24]). Además, MUC16 a menudo se escinde proteolíticamente en el dominio extracelular y se desprende de la superficie celular, lo que limita el compromiso duradero de CAR y la eficacia antitumoral (^[21], ^[25]). En contraste, MUC4 presenta varios atributos que respaldan su candidatura como antígeno asociado al tumor en las neoplasias mucinosas. La expresión de MUC4 se encuentra frecuentemente elevada y despolarizada en tumores epiteliales agresivos, incluidos los subtipos de cáncer colorrectal (CRC), mientras que permanece relativamente restringida en muchos tejidos normales. Funcionalmente, MUC4 contribuye a la progresión tumoral, la aptitud metastásica, la resistencia a la quimioterapia y la evasión inmune a través del blindaje estérico y la señalización pro-supervivencia (^[3]). Estas características posicionan a MUC4 no solo como un marcador de superficie, sino también como una vulnerabilidad biológicamente relevante contra los tumores agresivos.

En este estudio, las células CAR-T MUC4 retrasaron significativamente la progresión tumoral tanto en modelos subcutáneos como diseminados de CRC resistente al metotrexato. Cabe destacar que establecimos un modelo in vivo de invasión peritoneal de CRC humano. La invasión del cáncer peritoneal presenta desafíos significativos debido al diagnóstico en etapas tardías, la rápida propagación por toda la cavidad abdominal y las altas tasas de recurrencia, lo que limita en gran medida las opciones de tratamiento actuales para los pacientes (^[18]). La capacidad de restringir el crecimiento de tumores mucinosos refractarios a la terapia estándar destaca el potencial de este enfoque para abordar una brecha terapéutica crítica donde las modalidades convencionales a menudo fallan.

Sin embargo, los tumores HT29-MTX CRC fueron controlados en lugar de erradicados por completo por las células CAR-T MUC4, lo que indica que se necesitan mejoras adicionales en nuestra estrategia para lograr la máxima eficacia in vivo. Múltiples estrategias de ingeniería pueden mejorar el límite terapéutico de las células CAR-T dirigidas a MUC4. Estudios recientes revelaron que la señalización CAR 4-1BB-CD3zeta induce una respuesta antitumoral más duradera que la señalización CAR CD28-CD3zeta contra tumores sólidos (^[26]). Por lo tanto, una evaluación comparativa futura de los dominios CD28-CD3zeta (utilizados en el presente estudio) frente a 4-1BB-CD3zeta en el diseño CAR MUC4 podría aclarar si la aptitud metabólica, la persistencia y, en última instancia, la eficacia pueden mejorarse mediante programas de señalización alternativos. En paralelo, los enfoques de reprogramación transcripcional, como la sobreexpresión de FOXP3, que se ha relacionado previamente con la promoción de la resiliencia dentro de los microambientes supresores, pueden aumentar la estabilidad funcional y la aptitud del microambiente tumoral de las células CAR-T en los tumores ricos en mucina (^[27]). Nuestros hallazgos respaldan la exploración adicional de diseños que mejoren la persistencia de las células CAR-T en el contexto del CRC.

Es importante destacar que la sobreexpresión de MUC4 se extiende más allá del cáncer colorrectal a otras neoplasias epiteliales agresivas. Los ejemplos más destacados son el adenocarcinoma ductal pancreático (^[28]), que, de manera similar al CRC, presenta diseminación peritoneal y diafragmática (^[29]), y el cáncer de ovario, con una expresión de MUC4 significativamente mayor que la de MUC1 o MUC16 en tumores de ovario en etapa temprana con una incidencia del 100% y en tumores de ovario en etapa avanzada (^[30]). Estas características amplían el alcance traslacional potencial de la terapia CAR-T dirigida a MUC4 en múltiples tumores impulsados por la mucina.

En general, nuestros hallazgos proporcionan evidencia preclínica de que las células CAR-T dirigidas a MUC4 pueden reconocer y eliminar los objetivos de CRC resistentes a la quimioterapia, lo que respalda la priorización de MUC4 como un objetivo terapéutico en los tumores sólidos ricos en mucina.