Implicaciones clínicas e inmunológicas de la expresión del gen de activación de linfocitos 3 en el cáncer colorrectal metastásico.

El cáncer colorrectal (CCR) se sitúa como el tercer cáncer más diagnosticado a nivel mundial y es la segunda causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer [^[1]]. A pesar de los avances en las terapias sistémicas, los pacientes con cáncer colorrectal metastásico (CCRM) presentan malos resultados, con una tasa de supervivencia a 5 años inferior al 15% [^[2]]. La heterogeneidad clínica del CCRM se debe a diversos subtipos moleculares, que no solo influyen en la agresividad del tumor, sino que también determinan las respuestas a los regímenes de tratamiento específicos [^[3]]. Por ejemplo, los pacientes con CCRM deficiente en la reparación del apareamiento de bases/con alta inestabilidad de microsatélites (dMMR/MSI-H) representan una entidad biológicamente distinta, que presenta una peor supervivencia global (SG) que los tumores con reparación del apareamiento de bases competente/estables en microsatélites (pMMR/MSS) cuando se tratan con quimioterapia convencional más terapia dirigida [^[4]], pero obtienen beneficio clínico de los inhibidores del punto de control inmunitario [^[5]]. Por lo tanto, comprender la biología molecular e identificar biomarcadores críticos es fundamental para desarrollar una terapia individualizada para los pacientes con CCRM.

La evidencia acumulada subraya la importancia del microambiente inmunitario tumoral en el CCR. La densidad, el tipo, el estado funcional y la localización espacial de las células inmunitarias infiltrantes en el tumor han surgido como marcadores pronósticos y predictivos importantes en el CCR [^[6]]. El Immunoscore, basado en la infiltración de células T CD3+ y CD8+ en el núcleo del tumor y el margen invasivo, proporciona información pronóstica no solo en el CCR en etapa temprana, sino también en pacientes con CCRM sometidos a metastectomía [^[7]]. La infiltración inmunitaria también tiene valor predictivo en la enfermedad avanzada. En un ensayo de fase 2 de pembrolizumab más azacitidina en CCRM refractario a la quimioterapia, una mayor densidad basal de linfocitos T infiltrantes tumorales (TIL) CD8+ se correlacionó con una mejor respuesta clínica [^[8]]. De manera similar, el análisis de KEYNOTE-177 mostró que el enriquecimiento de células T CD8 PD-1+ en la línea de base se asoció con la respuesta a pembrolizumab en CCRM dMMR/MSI-H [^[9]]. Estos estudios destacan que tanto los TIL como los puntos de control inmunitario tienen relevancia pronóstica y predictiva en el CCRM.

El gen de la activación de linfocitos 3 (LAG3) es otro receptor inhibidor del punto de control inmunitario que se expresa principalmente en las células T CD8+ y CD4+ activadas, donde regula negativamente la activación, la proliferación y la producción de citocinas de las células T [^[10], ^[11]]. La sobreexpresión de LAG3 contribuye al agotamiento de las células T, un estado disfuncional caracterizado por una actividad efectora alterada y una reducción de la inmunidad antitumoral [^[12]]. Aunque varios estudios han investigado la expresión de LAG3 y su efecto sobre el pronóstico en el CCR, la mayoría se han centrado en la enfermedad en etapa temprana [^[13], ^[14]]. Las asociaciones clinicopatológicas de la expresión de LAG3 en el CCRM no se han investigado de manera exhaustiva, y su impacto pronóstico sigue sin estar claro. LAG3 se expresa con frecuencia junto con PD-1 en los TIL en varios tumores sólidos, incluido el CCR [^[15]]. Los estudios preclínicos han demostrado que el bloqueo dual de LAG3 y PD-1 restaura sinérgicamente la función de las células T y mejora la actividad antitumoral [^[15]]. Clínicamente, la inhibición de LAG3 combinada con la terapia anti-PD-1 ha demostrado eficacia en el melanoma avanzado [^[16]]; sin embargo, los resultados de esta combinación en el CCRM pMMR/MSS han sido decepcionantes [^[17], ^[18]]. Una comprensión más profunda de los mecanismos inmunosupresores asociados con la expresión de LAG3 puede proporcionar oportunidades para desarrollar una estrategia de combinación racional y superar la resistencia a la terapia dirigida a LAG3 en el CCRM. El objetivo de este estudio fue explorar el patrón de expresión, la relevancia pronóstica y el contexto del microambiente inmunitario de LAG3 en el CCRM.

Materiales y métodos

Cohorte de estudio y recopilación de datos

Se incluyeron de forma retrospectiva pacientes con CCRM que se sometieron a un perfil genómico completo con FoundationOne CDx en el Hospital Universitario Nacional Cheng Kung (NCKUH) entre enero de 2018 y marzo de 2024 [^[19]]. Se recopilaron datos clinicopatológicos de los registros médicos. Se revisaron los resultados del perfil molecular de FoundationOne CDx, incluidas las alteraciones en RAS, BRAF y HER2 y la carga de mutación tumoral. Este estudio fue aprobado por el comité de ética institucional de NCKUH (B-ER-110-172) y se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki.

Tinción inmunohistoquímica de LAG3

La inmunohistoquímica (IHC) se realizó en tejidos tumorales primarios y/o metastásicos fijados en formalina e incluidos en parafina (FFPE) utilizando el tinte IHC automatizado Bond-Max (Leica Biosystems, Australia). Se cortaron secciones de 4 micrómetros de espesor, se montaron, se desparafinaron, se rehidrataron y se sometieron a una recuperación de epítopos inducida por calor a 100 °C durante 20 minutos. Las láminas se incubaron con anticuerpos durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de la incubación con el anticuerpo secundario de polímero-peroxidasa de rábano picante durante 10 minutos. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-LAG3 (anticuerpo monoclonal de conejo, clon D2G4O, #15,372, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.; dilución 1:100), anti-TIM-3 (anticuerpo monoclonal de conejo, clon D5D5R, #45,208, Cell Signaling Technology; dilución 1:50) y anti-galectina-9 (anticuerpo monoclonal de conejo, clon D9R4A, #54,330, Cell Signaling Technology; dilución 1:100). La inmunorreactividad se visualizó utilizando 3,3'-diaminobencidina (DAB; Bond Polymer Refine Detection Kit, Leica Biosystems, DS9800). Las láminas se contrateñieron con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron según los protocolos estándar.

Puntuación de la expresión de LAG3

Un patólogo certificado evaluó la expresión de LAG3. Se definió la tinción positiva de LAG3 como cualquier señal membranosa o citoplasmática en los TIL. Primero, se revisaron las láminas a un aumento de 100×. Luego, se seleccionaron diez campos de alto poder (HPF, 400×) aleatorios dentro del centro del tumor o el frente invasivo para la cuantificación. El nivel de LAG3 para cada muestra se informó como el número promedio de células inmunitarias LAG3-positivas por HPF.

Análisis bioinformático

Se obtuvieron datos de expresión génica, clínicos y de supervivencia del conjunto de datos del Proyecto Genoma del Cáncer (TCGA) de cáncer de colon y recto (COADREAD) de UCSC Xena [^[20]]. Se recuperaron los perfiles de alteraciones genómicas para TCGA COADREAD de cBioPortal [^[21]] y se fusionaron los conjuntos de datos por ID de muestra. Se obtuvieron datos de expresión génica de ARN-sec y datos de proteómica de fosfoproteínas de adenocarcinoma de colon del Consorcio de Proteómica del Tumor Clínico (CPTAC) de LinkedOmics [^[22]].

Se obtuvieron firmas génicas de referencia [^[23]] y una firma de células T CD8+ agotadas derivadas de células T CD8+ específicas del VIH (GSE24081CONTROLLERVSPROGRESSORHIVSPECIFICCD8TCELLDN) [^[24]] de MSigDB. Se calcularon las puntuaciones de actividad de la firma génica utilizando el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes en una sola muestra (ssGSEA) implementado en el paquete ‘escape’ [^[25]]. Se generaron diagramas de caja y diagramas de correlación utilizando ‘ggpubr’. Se generaron curvas de supervivencia utilizando el método de Kaplan-Meier, y se evaluaron las diferencias entre grupos utilizando la prueba de rango logarítmico (‘survival’, ‘survminer’ packages). Se determinaron los puntos de corte óptimos para los análisis de supervivencia utilizando survcutpoint() en ‘survminer’. Se evaluaron las asociaciones entre la expresión de LAG3 y la actividad de las firmas génicas de referencia utilizando el análisis de correlación de Spearman. Los resultados se representaron como un diagrama de puntos, generado con ‘ggplot2’. Los valores de p_ se ajustaron mediante el método de Benjamini-Hochberg. Se evaluaron las diferencias medias entre grupos utilizando una prueba t para dos grupos o una prueba de Kruskal-Wallis para más de tres grupos. Todos los análisis bioinformáticos se realizaron en R (versión 4.2.1).

Análisis de datos de secuenciación de ARN de una sola célula

Se analizaron los datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) de 23 pacientes coreanos con cáncer colorrectal (cohorte SMC; número de acceso GEO GSE132465) [^[26]] utilizando el paquete ‘Seurat’ [^[27]]. Se construyó un objeto Seurat a partir de las matrices de expresión génica normalizadas y las anotaciones de tipo celular proporcionadas. Se identificaron características variables, se escalaron los datos y se realizó un análisis de componentes principales. Los primeros 30 componentes principales capturaron la señal biológica principal y se utilizaron para la agrupación basada en gráficos mediante Louvain. Luego, se utilizó la aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) para la visualización bidimensional. Se definieron las células LAG3-positivas como células con un recuento de identificador molecular único (UMI) mayor que cero para LAG3 [^[28]]. Se visualizaron la composición del tipo celular y la distribución de LAG3 utilizando ‘dittoSeq’ [^[29]]. Se calcularon las puntuaciones de actividad de la firma génica utilizando el algoritmo UCell [^[30]] implementado en ‘escape’ [^[25]].

Se infirieron las redes de comunicación entre células utilizando ‘CellChat’ [^[31]] (CellChatDB.human) con datos de scRNA-seq procesados y tipos de células anotados. Se resumieron las interacciones ligando-receptor predichas y las vías de señalización utilizando visualizaciones de red y mapas de calor de probabilidad de comunicación.

Análisis estadístico

Se compararon las variables categóricas utilizando pruebas de chi-cuadrado o pruebas exactas de Fisher. Se compararon las variables continuas utilizando pruebas t no pareadas o pruebas U de Mann-Whitney. Se evaluó la correlación de la expresión de LAG3 entre tumores primarios y metastásicos coincidentes utilizando el coeficiente de correlación de Spearman. Se definió la supervivencia global (SG) como el intervalo desde el diagnóstico inicial del CCRM hasta la muerte por cualquier causa. Se aplicó el análisis de Kaplan-Meier con la prueba de rango logarítmico para las comparaciones de supervivencia. Se utilizó la regresión de riesgos proporcionales de Cox para los análisis de supervivencia univariados y multivariados. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (versión 10.0.2, Boston, Massachusetts, EE. UU.) y R (versión 4.2.1). Se consideró que un valor de p < 0,05 era significativo.

Se realizó una estimación del tamaño de la muestra utilizando el método de Schoenfeld bajo un marco de riesgos proporcionales de Cox y rango logarítmico para evaluar si la cohorte estaba suficientemente dimensionada para detectar una diferencia de supervivencia entre los grupos LAG3-alto y LAG3-bajo. El número de eventos requeridos se estimó de acuerdo con la fórmula de Schoenfeld (N eventos = (Z1/2 + Z1)2 / [p(1 - p) x (log HR)2]), donde p denota la proporción de pacientes en el grupo LAG3-alto. Suponiendo una prevalencia de LAG3-alto del 60% [^[13], ^[39]], una tasa de eventos general de aproximadamente el 80%, una razón de riesgos de 1,8, una α bilateral de 0,05 y una potencia del 80%, el tamaño de la muestra total requerido estimado fue de aproximadamente 114 pacientes. Teniendo en cuenta los posibles casos no evaluables debido a un tejido insuficiente o un fallo en la inmunohistoquímica (~10%), se consideró que un tamaño de muestra objetivo de aproximadamente 140 pacientes era apropiado.

Cohorte de estudio y recopilación de datos

Se incluyeron de forma retrospectiva pacientes con CCRM que se sometieron a un perfil genómico completo con FoundationOne CDx en el Hospital Universitario Nacional Cheng Kung (NCKUH) entre enero de 2018 y marzo de 2024 [^[19]]. Se recopilaron datos clinicopatológicos de los registros médicos. Se revisaron los resultados del perfil molecular de FoundationOne CDx, incluidas las alteraciones en RAS, BRAF y HER2 y la carga de mutación tumoral. Este estudio fue aprobado por el comité de ética institucional de NCKUH (B-ER-110-172) y se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki.

Tinción inmunohistoquímica de LAG3

Se realizó inmunohistoquímica (IHQ) en tejidos tumorales primarios y/o metastásicos fijados en formalina e incluidos en parafina (FFPE) utilizando el tinte automático de IHQ Bond-Max (Leica Biosystems, Australia). Se cortaron secciones de cuatro micrómetros de espesor, se montaron, se desparafinaron, se rehidrataron y se sometieron a la recuperación del epítopo inducida por calor a 100 °C durante 20 minutos. Las láminas se incubaron con anticuerpos durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de la incubación con el anticuerpo secundario de peroxidasa de rábano picante (horseradish peroxidase) durante 10 minutos. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-LAG3 (anticuerpo monoclonal de conejo, clon D2G4O, n.º 15.372, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.; dilución 1:100), anti-TIM-3 (anticuerpo monoclonal de conejo, clon D5D5R, n.º 45.208, Cell Signaling Technology; dilución 1:50) y anti-galectina-9 (anticuerpo monoclonal de conejo, clon D9R4A, n.º 54.330, Cell Signaling Technology; dilución 1:100). La inmunorreactividad se visualizó utilizando 3,3'-diaminobencidina (DAB; Bond Polymer Refine Detection Kit, Leica Biosystems, DS9800). Las láminas se contrateñieron con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron según los protocolos estándar.

Puntuación de la expresión de LAG3

La expresión de LAG3 fue evaluada por un patólogo certificado. La tinción positiva de LAG3 se definió como cualquier señal membranosa o citoplasmática en las células infiltrantes del tumor (TIL). Primero, se revisaron las láminas a un aumento de 100×. Luego, se seleccionaron diez campos de alta potencia (HPF, 400×) aleatorios dentro del centro del tumor o del borde invasor para la cuantificación. El nivel de LAG3 para cada muestra se informó como el número promedio de células inmunitarias LAG3-positivas por HPF.

Análisis bioinformático

Se obtuvieron datos de expresión génica, datos clínicos y datos de supervivencia del conjunto de datos del Proyecto del Genoma del Cáncer (TCGA) de cáncer de colon y recto (COADREAD) de UCSC Xena [^[20]]. Los perfiles de alteraciones genómicas para TCGA COADREAD se obtuvieron de cBioPortal [^[21]], y los conjuntos de datos se fusionaron por ID de muestra. Los datos de expresión génica de ARN-seq y los datos de proteómica de fosfoproteínas de adenocarcinoma de colon del Consorcio de Análisis Proteómico del Tumor Clínico (CPTAC) se obtuvieron de LinkedOmics [^[22]].

Se obtuvieron firmas génicas de referencia [^[23]] y una firma de células T CD8+ agotadas derivadas de células T CD8+ específicas del VIH (GSE24081CONTROLLERVSPROGRESSORHIVSPECIFICCD8TCELLDN) [^[24]] de MSigDB. Los puntajes de actividad de la firma génica se calcularon utilizando el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes en una sola muestra (ssGSEA) implementado en el paquete ‘escape’ [^[25]]. Los diagramas de caja y los diagramas de correlación se generaron utilizando ‘ggpubr’. Las curvas de supervivencia se generaron utilizando el método de Kaplan-Meier, y las diferencias entre grupos se evaluaron utilizando la prueba de rango logarítmico (‘survival’, ‘survminer’ packages). Los puntos de corte óptimos para los análisis de supervivencia se determinaron utilizando survcutpoint() en ‘survminer’. Las asociaciones entre la expresión de LAG3 y la actividad de las firmas génicas de referencia se evaluaron utilizando el análisis de correlación de Spearman. Los resultados se representaron como un diagrama de puntos, generado con ‘ggplot2’. Los valores de P_ se ajustaron mediante el método de Benjamini-Hochberg. Las diferencias medias entre grupos se evaluaron utilizando una prueba t para dos grupos o una prueba de Kruskal-Wallis para más de tres grupos. Todos los análisis bioinformáticos se realizaron en R (versión 4.2.1).

Análisis de datos de secuenciación de ARN de una sola célula

Se analizaron los datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) de 23 pacientes coreanos con cáncer colorrectal (cohorte SMC; número de acceso GEO GSE132465) [^[26]] utilizando el paquete ‘Seurat’ [^[27]]. Se construyó un objeto Seurat a partir de las matrices de expresión génica normalizadas y las anotaciones de tipo celular proporcionadas. Se identificaron características variables, los datos se escalaron y se realizó un análisis de componentes principales. Los primeros 30 componentes principales capturaron la señal biológica principal y se utilizaron para la agrupación basada en gráficos de Louvain. Luego, se utilizó la aproximación y proyección uniforme del colector (UMAP) para la visualización bidimensional. Las células LAG3-positivas se definieron como células con un recuento de identificador molecular único (UMI) mayor que cero para LAG3 [^[28]]. La composición del tipo celular y la distribución de LAG3 se visualizaron utilizando ‘dittoSeq’ [^[29]]. Los puntajes de actividad de la firma génica se calcularon utilizando el algoritmo UCell [^[30]] implementado en ‘escape’ [^[25]].

Las redes de comunicación célula-célula se infirieron utilizando ‘CellChat’ [^[31]] (CellChatDB.human) con datos de scRNA-seq procesados y tipos celulares anotados. Las interacciones ligando-receptor predichas y las vías de señalización se resumieron utilizando visualizaciones de red y mapas de calor de probabilidad de comunicación.

Análisis estadístico

Las variables categóricas se compararon utilizando las pruebas de chi-cuadrado o de Fisher. Las variables continuas se compararon utilizando pruebas t no pareadas o pruebas de Mann-Whitney U. La correlación de la expresión de LAG3 entre tumores primarios y metastásicos emparejados se evaluó utilizando el coeficiente de correlación de Spearman. La supervivencia global (OS) se definió como el intervalo desde el diagnóstico inicial de cáncer colorrectal metastásico (mCRC) hasta la muerte por cualquier causa. Se aplicó el análisis de Kaplan-Meier con la prueba de rango logarítmico para las comparaciones de supervivencia. Se utilizó la regresión de riesgos proporcionales de Cox para los análisis de supervivencia univariados y multivariados. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (versión 10.0.2, Boston, Massachusetts, EE. UU.) y R (versión 4.2.1). Se consideró que un valor de p < 0,05 era significativo.

Se realizó una estimación del tamaño de la muestra utilizando el método de Schoenfeld bajo un marco de riesgos proporcionales de Cox y rango logarítmico para evaluar si la cohorte estaba suficientemente dimensionada para detectar una diferencia de supervivencia entre los grupos LAG3-alto y LAG3-bajo. El número requerido de eventos se estimó de acuerdo con la fórmula de Schoenfeld (N eventos = (Z1/2 + Z1)2 / [p(1 - p) x (log HR)2]), donde p denota la proporción de pacientes en el grupo LAG3-alto. Asumiendo una prevalencia de LAG3-alto del 60% [^[13], ^[39]], una tasa de eventos general de aproximadamente el 80%, una razón de riesgos de 1,8, una prueba de dos colas α = 0,05 y una potencia del 80%, el tamaño de muestra total requerido estimado fue de aproximadamente 114 pacientes. Teniendo en cuenta los posibles casos no evaluables debido a un tejido insuficiente o un fallo en la inmunohistoquímica (~10%), se consideró que un tamaño de muestra objetivo de aproximadamente 140 pacientes era apropiado.

Resultados

Características clínicas de la cohorte NCKUH

Se incluyeron un total de 144 pacientes con mCRC. Las características clínicas se resumen en la Tabla 1. La edad media fue de 61 años; 86 pacientes (60%) eran hombres y 35 pacientes (24%) tenían tumores primarios en el lado derecho. El sitio metastásico más común fue el pulmón (70%), seguido del hígado (58%) y el peritoneo (34%). Nueve pacientes (6%) tenían tumores dMMR/MSI-H. La mutación RAS, la mutación BRAF V600 y la amplificación HER2 se detectaron en 71 (50%), 13 (9) y 6 (3%) tumores, respectivamente. La expresión de LAG3 fue evaluable en tumores primarios de 121 pacientes (84%) y en tumores metastásicos de 102 pacientes (72%). Ochenta y seis pacientes (60%) tenían tanto muestras de tumores primarios como metastásicos disponibles para el análisis por pares. Las imágenes representativas de la tinción de IHQ de LAG3 en tumores primarios se muestran en la Fig. 1a-d.

Correlaciones entre la expresión de LAG3 y las características clínicas

La expresión de LAG3 fue significativamente mayor en los tumores primarios que en los tumores metastásicos (mediana: 1,40 frente a 0,60 células/HPF, p = 0,034; Fig. 2a). En 86 muestras de tumores primarios y metastásicos emparejados, los niveles de LAG3 estuvieron correlacionados positivamente (r = 0,27, p = 0,012; Fig. 2b), lo que indica que los pacientes con niveles elevados de LAG3 en el tumor primario tendieron a tener una mayor expresión en las metástasis correspondientes. La expresión de LAG3 fue mayor en los tumores primarios del lado derecho que en los del lado izquierdo (2,90 frente a 1,25 células/HPF, p = 0,034; Fig. 2c). No se observaron diferencias significativas en la expresión de LAG3 con respecto a la edad (1,30 frente a 1,50 células/HPF; Fig. S1a), el sexo (1,30 frente a 1,50 células/HPF; Fig. S1b), el estado MSI-H (3,25 frente a 1,30 células/HPF; Fig. 2d) o la carga mutacional tumoral (5,40 frente a 1,45 células/HPF; Fig. S1c). De manera similar, la expresión de LAG3 no diferenció significativamente por mutación RAS, mutación BRAF V600E o amplificación HER2 (p = 0,412; Fig. 2e; Fig. S1d-f). Interesantemente, hubo una diferencia significativa en los niveles de expresión de LAG3 entre las muestras de tumores de diferentes sitios metastásicos (p = 0,034, Fig. 2f), con las metástasis hepáticas que exhibían los niveles de expresión más altos, mientras que las lesiones peritoneales mostraron los niveles más bajos. Las imágenes de IHQ representativas correspondientes a los subgrupos clinicopatológicos se presentan en la Fig. S2.

Impacto pronóstico de la expresión de LAG3

Para evaluar el impacto pronóstico de la expresión de LAG3, se realizó un análisis de punto de corte para la OS basado en diferentes niveles de expresión de LAG3. Cuando se definió una alta expresión de LAG3 en los tumores primarios como ≥ 0 o ≥ 1 célula/HPF, no hubo diferencia en la OS entre los grupos de alta y baja expresión (Fig. 3a, b). Utilizando un punto de corte de ≥ 3 células/HPF, los pacientes con alta expresión de LAG3 tuvieron una OS significativamente más corta que aquellos con menor expresión (30,1 frente a 45,2 meses; razón de riesgos [HR] 1,66; p = 0,048; Fig. 3c). La diferencia en la OS aumentó con puntos de corte más altos: a ≥ 5 células/HPF, la OS fue de 30,1 frente a 45,2 meses (HR 1,81; p = 0,026; Fig. 3d) y a ≥ 10 células/HPF, la OS fue de 28,0 frente a 45,2 meses (HR 2,20; p = 0,007; Fig. 3e). Cuando se utilizó ≥ 3 células/HPF para definir la alta expresión, el análisis univariado identificó la mutación BRAF y la alta expresión de LAG3 como factores adversos para la OS (Tabla 2). En el análisis multivariado, la expresión de LAG3 siguió siendo un factor pronóstico independiente. Por el contrario, el impacto pronóstico negativo de la expresión de LAG3 en la OS no se observó cuando solo se analizaron los tumores metastásicos. En las lesiones metastásicas, una mayor expresión de LAG3 se asoció con una OS más larga cuando se aplicó un punto de corte de ≥ 0 células/HPF (Fig. S3a), aunque este efecto no fue consistente en los puntos de corte alternativos (Fig. S3b-e).

La expresión de LAG3 está relacionada con el enriquecimiento de la vía de señalización de TGF-β

Para validar las asociaciones clínicas y explorar la biología subyacente, analizamos 380 pacientes con cáncer colorrectal en estadio I-IV en la cohorte TCGA COADREAD. Las características clínicas detalladas se resumen en la Tabla S1. El análisis de los datos de adenocarcinoma de colon del CPTAC demostró una correlación positiva entre la expresión de ARNm y proteína de LAG3 (Fig. S4a), lo que respalda el uso de datos a nivel de transcripción para inferir la biología a nivel de proteína.

En TCGA COADREAD, los tumores primarios del lado derecho exhibieron una mayor expresión de LAG3 que los tumores del lado izquierdo (Fig. 4a), y los tumores MSI-H mostraron niveles más altos de LAG3 que los tumores MSI-L/MSS (Fig. 4b). Los CRCs con mutación BRAF se asociaron con una mayor expresión de LAG3 (Fig. 4d), mientras que los tumores con mutaciones RAS o amplificación HER2 mostraron una menor expresión (Fig. 4c, e). En particular, la asociación entre una mayor LAG3 y la mutación BRAF se observó en los tumores MSS pero no en los MSI-H (Fig. 4f). Coherente con los hallazgos de la cohorte NCKUH, los pacientes con alta expresión de LAG3 tuvieron una OS significativamente más corta (Fig. S4b-d). Esta asociación pronóstica negativa se extendió a la supervivencia específica de la enfermedad (DSS) y al intervalo de supervivencia libre de progresión (PFI), particularmente en los pacientes metastásicos (n = 51) (Fig. 4g-i). Estos datos respaldan a LAG3 como un biomarcador pronóstico en el mCRC.

Para investigar los posibles mecanismos asociados con el impacto pronóstico de la expresión de LAG3, realizamos un análisis ssGSEA utilizando conjuntos de genes Hallmark. La expresión de LAG3 se correlacionó positivamente con múltiples firmas, incluyendo la señalización del interferón, la señalización IL6/JAK/STAT3, la respuesta inflamatoria, la angiogénesis y la transición epitelio-mesenquimal (EMT) (Fig. 5a). La angiogénesis y la EMT son procesos clave que impulsan la inmunosupresión en el microambiente tumoral (TME) [^[32], ^[33]] y se asocian con peores resultados en el CCRC [^[34], ^[35]]. De manera consistente, los CCRCs con mayor expresión de LAG3 mostraron puntuaciones de angiogénesis más altas (Fig. 5b) y puntuaciones de EMT más altas (Fig. 5c). Varias vías de señalización oncogénica relevantes para el CCRC, incluyendo PI3K, TGF-β y la señalización WNT/β-catenina, también se asociaron positivamente con la expresión de LAG3 (Fig. 5a). Entre estas, la señalización de TGF-β es un regulador clave de la exclusión inmune y el remodelado del estroma en el TME [^[36]] y se ha relacionado con malos resultados en el CCRC metastásico [^[19]]. Los tumores con mayor expresión de LAG3 mostraron una mayor señalización de TGF-β (Fig. 5d) y una firma de células T CD8+ agotadas (Fig. 5e), lo que sugiere que LAG3 marca un TME enriquecido con activación del estroma, señalización de citocinas supresoras y disfunción de las células T.

Validación de la actividad de la firma génica a nivel de célula única

Para examinar estas asociaciones a nivel celular, analizamos datos de secuenciación de ARN de célula única de 23 tumores de CCRC y 10 muestras de mucosa normal emparejadas de la cohorte coreana SMC [^[26]]. En total, se analizaron 63.689 células, incluyendo 47.285 de muestras tumorales y 16.404 de mucosa normal. El agrupamiento no supervisado y la proyección UMAP identificaron seis poblaciones celulares principales: células epiteliales, células T, células B, células mieloides, mastocitos y células del estroma (Fig. 6a). La expresión de LAG3 se limitó en gran medida a las células inmunitarias, siendo las células T la población predominante que expresa LAG3 (Fig. 6b, c). Los tumores de CCRC contenían proporciones más altas de células LAG3-positivas que la mucosa normal (Fig. 6d). Entre los subconjuntos de células T, las células T CD8+ fueron la población dominante que expresaba LAG3 tanto en el tumor como en la mucosa normal (56,3% frente a 47,8%) (Fig. 6e, f). En comparación con la mucosa normal, los tumores de CCRC tenían una proporción menor de células T CD4+ LAG3+ (8,7% frente a 26,4%) y células γδ T (1,4% frente a 18,3%), pero una proporción mayor de células T reguladoras (Tregs) LAG3+ y células T helper 17 (8,6% frente a 3,0% y 9,6 frente a 0,5%, respectivamente).

Para relacionar la expresión de LAG3 con la actividad de la vía, los 23 tumores de la cohorte SMC se clasificaron según la proporción de células LAG3-positivas (rango 32,4–3,4%). Los cinco tumores principales (SMC05: 32,4%, SMC24: 19,3%, SMC06: 16,1%, SMC09: 15,5% y SMC08: 14,5%) se designaron como LAG3-alto, y los tumores restantes se consideraron LAG3-bajo. Cuando se analizaron las células tumorales epiteliales (n = 17.469), los tumores LAG3-alto mostraron una mayor angiogénesis (Fig. 6g), EMT (Fig. 6h) y puntuaciones de señalización de TGF-β (Fig. 6i). Cuando se analizaron las células T por separado, los tumores LAG3-alto mostraron puntuaciones más altas de la firma de células T CD8+ agotadas que los tumores LAG3-bajo (Fig. 6j). Estos hallazgos a nivel de célula única fueron coherentes con las observaciones de la secuenciación de ARN a granel de TCGA COADREAD, lo que refuerza el vínculo entre la alta expresión de LAG3, los programas de remodelado del estroma y el agotamiento de las células T.

Las células inmunitarias LAG3+ reciben señales supresoras distintas del TME

El TME está regulado dinámicamente por redes de señalización intercelular que orquestan la supresión inmune y la progresión tumoral. Para dilucidar cómo se regulan las células inmunitarias LAG3+, se realizó un análisis de comunicación célula a célula utilizando CellChat [^[31]]. Nos centramos en las células T CD8+, el subconjunto de células T que expresa LAG3 de forma predominante en los tumores de CCRC, y comparamos las entradas de señalización recibidas por las células T CD8+ LAG3+ y LAG3-. Se identificaron un total de 1.036 interacciones ligando-receptor inferidas en las principales poblaciones celulares (Fig. 6k). Las células T CD8+ LAG3 recibieron las señales entrantes más fuertes de las células del estroma (12 vías), las células mieloides SPP1+ (10 vías) y las células epiteliales (tumorales) (9 vías). Estos tres tipos de células también fueron las principales fuentes de señalización para las células T CD8+ LAG3-. Entre las interacciones entre estos tres tipos de células y las células T CD8+, los pares ligando-receptor fueron en gran medida los mismos en las células T CD8+ LAG3+ y las células T CD8+ LAG3- (Fig. 6l). En particular, la interacción LGALS9-HAVCR2 (galectina 9-TIM-3), una de las vías de señalización de la galectina, se enriqueció de forma única en las interacciones en las células T CD8+ LAG3+ en los tres tipos de células remitentes, pero estuvo ausente en las células T CD8+ LAG3- (Fig. 6l). Coherente con estos hallazgos, la coexpresión de TIM-3 se detectó con mayor frecuencia en las células T CD8+ LAG3+ que en las células T CD8+ LAG3- (Fig. 6m). Además, la expresión de LAG3 se correlacionó positivamente con la expresión de TIM-3 en la cohorte TCGA COADREAD (Fig. 6n). Para validar aún más estos hallazgos a nivel de proteínas, realizamos una tinción de inmunohistoquímica (IHC) para TIM-3 y galectina-9 en muestras tumorales primarias de la cohorte NCKUH. Los tumores con alta expresión de LAG3 mostraron una mayor densidad de células inmunitarias TIM-3+ y una fuerte tinción de galectina-9 dentro del TME, mientras que los tumores LAG3-bajo mostraron menos células TIM-3+ y una expresión débil de galectina-9. Se muestran imágenes representativas en la Figura S5 complementaria. En conjunto, estos datos respaldan un modelo en el que las células T CD8+ LAG3+ están expuestas a una señalización coordinada de galectina-9-TIM-3 que refuerza un TME supresor en el CCRC.

Características clínicas de la cohorte NCKUH

Se incluyeron un total de 144 pacientes con CCRC metastásico. Las características clínicas se resumen en la Tabla 1. La mediana de edad fue de 61 años; 86 pacientes (60%) eran hombres y 35 pacientes (24%) tenían tumores primarios en el lado derecho. El sitio metastásico más común fue el pulmón (70%), seguido del hígado (58%) y el peritoneo (34%). Nueve pacientes (6%) tenían tumores dMMR/MSI-H. La mutación RAS, la mutación BRAF V600 y la amplificación de HER2 se detectaron en 71 (50%), 13 (9%) y 6 (3%) tumores, respectivamente. La expresión de LAG3 se pudo evaluar en tumores primarios de 121 pacientes (84%) y en tumores metastásicos de 102 pacientes (72%). Ochenta y seis pacientes (60%) tenían muestras de tumores primarios y metastásicos disponibles para un análisis emparejado. Se muestran imágenes representativas de la tinción IHC de LAG3 en tumores primarios en la Fig. 1a-d.

Correlaciones entre la expresión de LAG3 y las características clínicas

La expresión de LAG3 fue significativamente mayor en los tumores primarios que en los tumores metastásicos (mediana: 1,40 frente a 0,60 células/HPF, p = 0,034; Fig. 2a). En 86 muestras de tumores primarios y metastásicos emparejados, los niveles de LAG3 se correlacionaron positivamente (r = 0,27, p = 0,012; Fig. 2b), lo que indica que los pacientes con una expresión elevada de LAG3 en el tumor primario tendieron a tener una mayor expresión en las metástasis emparejadas. La expresión de LAG3 fue mayor en los tumores primarios del lado derecho que en los del lado izquierdo (2,90 frente a 1,25 células/HPF, p = 0,034; Fig. 2c). No se observaron diferencias significativas en la expresión de LAG3 con respecto a la edad (1,30 frente a 1,50 células/HPF; Fig. S1a complementaria), el sexo (1,30 frente a 1,50 células/HPF; Fig. S1b complementaria), el estado MSI-H (3,25 frente a 1,30 células/HPF; Fig. 2d) o la carga mutacional tumoral (5,40 frente a 1,45 células/HPF; Fig. S1c complementaria). De manera similar, la expresión de LAG3 no diferenció significativamente por la mutación RAS, la mutación BRAF V600E o la amplificación de HER2 (p = 0,412; Fig. 2e; Fig. S1d-f complementaria). Interesantemente, hubo una diferencia significativa en los niveles de expresión de LAG3 entre las muestras tumorales de diferentes sitios metastásicos (p = 0,034, Fig. 2f), con las metástasis hepáticas que exhibieron los niveles de expresión más altos, mientras que las lesiones peritoneales mostraron los niveles más bajos. Se presentan imágenes IHC representativas correspondientes a los subgrupos clinicopatológicos en la Fig. S2 complementaria.

Impacto pronóstico de la expresión de LAG3

Para evaluar el impacto pronóstico de la expresión de LAG3, se realizó un análisis de punto de corte para la supervivencia global (OS) en función de los diferentes niveles de expresión de LAG3. Cuando se definió una alta expresión de LAG3 en los tumores primarios como ≥ 0 o ≥ 1 célula/HPF, no hubo diferencia en la OS entre los grupos de alta y baja expresión (Fig. 3a, b). Utilizando un punto de corte de ≥ 3 células/HPF, los pacientes con alta expresión de LAG3 tuvieron una OS significativamente más corta que aquellos con menor expresión (30,1 frente a 45,2 meses; razón de riesgo [HR] 1,66; p = 0,048; Fig. 3c). La diferencia en la OS aumentó con puntos de corte más altos: a ≥ 5 células/HPF, la OS fue de 30,1 frente a 45,2 meses (HR 1,81; p = 0,026; Fig. 3d) y a ≥ 10 células/HPF, la OS fue de 28,0 frente a 45,2 meses (HR 2,20; p = 0,007; Fig. 3e). Cuando se utilizó ≥ 3 células/HPF para definir la alta expresión, el análisis univariado identificó la mutación BRAF y la alta expresión de LAG3 como factores adversos para la OS (Tabla 2). En el análisis multivariado, la expresión de LAG3 siguió siendo un factor pronóstico independiente. Por el contrario, no se observó el impacto pronóstico negativo de la expresión de LAG3 en la OS cuando solo se analizaron los tumores metastásicos. En las lesiones metastásicas, una mayor expresión de LAG3 se asoció con una OS más larga cuando se aplicó un punto de corte de ≥ 0 células/HPF (Fig. S3a complementaria), aunque este efecto no fue consistente en los puntos de corte alternativos (Fig. S3b-e complementaria).

La expresión de LAG3 está relacionada con una vía de señalización de TGF-β enriquecida

Para validar las asociaciones clínicas y explorar la biología subyacente, analizamos 380 pacientes con CCRC en estadio I-IV en la cohorte TCGA COADREAD. Se resumen las características clínicas detalladas en la Tabla S1 complementaria. El análisis de los datos de CPTAC de adenocarcinoma de colon demostró una correlación positiva entre la expresión de LAG3 de ARNm y proteínas (Fig. S4a complementaria), lo que respalda el uso de datos a nivel de transcripción para inferir la biología a nivel de proteínas.

En TCGA COADREAD, los tumores primarios del lado derecho mostraron una mayor expresión de LAG3 que los tumores del lado izquierdo (Fig. 4a), y los tumores MSI-H mostraron niveles más altos de LAG3 que los tumores MSI-L/MSS (Fig. 4b). Los CCRCs con mutación BRAF se asociaron con una mayor expresión de LAG3 (Fig. 4d), mientras que los tumores con mutaciones RAS o amplificación de HER2 mostraron una menor expresión (Fig. 4c, e). En particular, la asociación entre una mayor LAG3 y la mutación BRAF se observó en los tumores MSS pero no en los tumores MSI-H (Fig. 4f). Coherente con los hallazgos de la cohorte NCKUH, los pacientes con alta expresión de LAG3 tuvieron una OS significativamente más corta (Fig. S4b-d complementaria). Esta asociación pronóstica negativa se extendió a la supervivencia específica de la enfermedad (DSS) y el intervalo de supervivencia libre de progresión (PFI), particularmente en los pacientes metastásicos (n = 51) (Fig. 4g-i). Estos datos respaldan a LAG3 como un biomarcador pronóstico en el CCRC metastásico.

Para investigar los posibles mecanismos asociados con el impacto pronóstico de la expresión de LAG3, realizamos un análisis ssGSEA utilizando conjuntos de genes Hallmark. La expresión de LAG3 se correlacionó positivamente con múltiples firmas, incluyendo la señalización del interferón, la señalización IL6/JAK/STAT3, la respuesta inflamatoria, la angiogénesis y la transición epitelio-mesenquimal (EMT) (Fig. 5a). La angiogénesis y la EMT son procesos clave que impulsan la inmunosupresión en el microambiente tumoral (TME) [^[32], ^[33]] y se asocian con peores resultados en el CCRC [^[34], ^[35]]. De manera consistente, los CCRCs con mayor expresión de LAG3 mostraron puntuaciones de angiogénesis más altas (Fig. 5b) y puntuaciones de EMT más altas (Fig. 5c). Varias vías de señalización oncogénica relevantes para el CCRC, incluyendo PI3K, TGF-β y la señalización WNT/β-catenina, también se asociaron positivamente con la expresión de LAG3 (Fig. 5a). Entre estas, la señalización de TGF-β es un regulador clave de la exclusión inmune y el remodelado del estroma en el TME [^[36]] y se ha relacionado con malos resultados en el CCRC metastásico [^[19]]. Los tumores con mayor expresión de LAG3 mostraron una mayor señalización de TGF-β (Fig. 5d) y una firma de células T CD8+ agotadas (Fig. 5e), lo que sugiere que LAG3 marca un TME enriquecido con activación del estroma, señalización de citocinas supresoras y disfunción de las células T.

Validación de la actividad de la firma génica a nivel de célula única

Para examinar estas asociaciones a nivel celular, analizamos datos de secuenciación de ARN de una sola célula obtenidos de 23 tumores de CRC y 10 muestras de mucosa normal correspondientes, procedentes de la cohorte coreana SMC [^[26]]. En total, se analizaron 63.689 células, incluidas 47.285 de muestras tumorales y 16.404 de mucosa normal. El agrupamiento no supervisado y la proyección UMAP identificaron seis poblaciones celulares principales: células epiteliales, células T, células B, células mieloides, mastocitos y células estromales (Fig. 6a). La expresión de LAG3 se limitó en gran medida a las células inmunitarias, siendo las células T la población predominante que expresaba LAG3 (Fig. 6b, c). Los tumores de CRC contenían proporciones más altas de células LAG3-positivas que la mucosa normal (Fig. 6d). Entre los subconjuntos de células T, las células T CD8+ fueron la población predominante que expresaba LAG3 tanto en el tumor como en la mucosa normal (56,3% frente a 47,8%) (Fig. 6e, f). En comparación con la mucosa normal, los tumores de CRC presentaban una proporción menor de células T CD4+ LAG3+ (8,7% frente a 26,4%) y células T ?? (1,4% frente a 18,3%), pero una proporción mayor de células T reguladoras (Tregs) LAG3+ y células T helper 17 (8,6% frente a 3,0% y 9,6% frente a 0,5%, respectivamente).

Para relacionar la expresión de LAG3 con la actividad de las vías de señalización, los 23 tumores de la cohorte SMC se clasificaron según la proporción de células LAG3-positivas (rango 32,4–3,4%). Los cinco tumores principales (SMC05: 32,4%, SMC24: 19,3%, SMC06: 16,1%, SMC09: 15,5% y SMC08: 14,5%) se designaron como LAG3-alto, y los tumores restantes se consideraron LAG3-bajo. Cuando se analizaron las células tumorales epiteliales (n = 17.469), los tumores LAG3-alto mostraron un aumento de la angiogénesis (Fig. 6g), la EMT (Fig. 6h) y las puntuaciones de señalización de TGF-β (Fig. 6i). Cuando se analizaron las células T por separado, los tumores LAG3-alto mostraron puntuaciones más altas de la firma de células T CD8+ agotadas que los tumores LAG3-bajo (Fig. 6j). Estos hallazgos a nivel de una sola célula concordaron con las observaciones de la secuenciación de ARN a granel de TCGA COADREAD, lo que refuerza la relación entre la alta expresión de LAG3, los programas de remodelación del estroma y el agotamiento de las células T.

Las células inmunitarias LAG3+ reciben señales supresoras distintas del microambiente tumoral (TME)

El TME está regulado dinámicamente por redes de señalización intercelular que orquestan la supresión inmunitaria y la progresión tumoral. Para dilucidar cómo se regulan las células inmunitarias LAG3+, se realizó un análisis de comunicación célula-célula utilizando CellChat [^[31]]. Nos centramos en las células T CD8+, el subconjunto de células T predominante que expresa LAG3 en los tumores de CRC, y comparamos las señales de entrada recibidas por las células T CD8+ LAG3+ y LAG3-. Se identificaron un total de 1.036 interacciones ligando-receptor inferidas en las principales poblaciones celulares (Fig. 6k). Las células T CD8+ LAG3 recibieron las señales entrantes más fuertes de las células estromales (12 vías), las células mieloides SPP1+ (10 vías) y las células epiteliales (tumorales) (9 vías). Estos tres tipos de células también fueron las principales fuentes de señalización para las células T CD8+ LAG3-. Entre las interacciones entre estos tres tipos de células y las células T CD8+, los pares ligando-receptor fueron en gran medida los mismos en las células T CD8+ LAG3+ y las células T CD8+ LAG3- (Fig. 6l). En particular, la interacción LGALS9-HAVCR2 (galectina 9-TIM-3), una de las vías de señalización de la galectina, se enriqueció de forma única en las interacciones en las células T CD8+ LAG3+ en los tres tipos de células emisoras, pero estaba ausente en las células T CD8+ LAG3- (Fig. 6l). En consonancia con estos hallazgos, la coexpresión de TIM-3 se detectó con mayor frecuencia en las células T CD8+ LAG3+ que en las células T CD8+ LAG3- (Fig. 6m). Además, la expresión de LAG3 se correlacionó positivamente con la expresión de TIM-3 en la cohorte TCGA COADREAD (Fig. 6n). Para validar aún más estos hallazgos a nivel de proteínas, realizamos una tinción de inmunohistoquímica (IHC) para TIM-3 y galectina-9 en muestras tumorales primarias de la cohorte NCKUH. Los tumores con alta expresión de LAG3 mostraron un aumento de la densidad de células inmunitarias TIM-3+ y una fuerte tinción de galectina-9 dentro del TME, mientras que los tumores LAG3-bajo mostraron menos células TIM-3+ y una expresión débil de galectina-9. Se muestran imágenes representativas en la Figura S5 del material suplementario. En conjunto, estos datos respaldan un modelo en el que las células T CD8+ LAG3+ están expuestas a una señalización coordinada de galectina-9-TIM-3 que refuerza un TME supresor en el CRC.

Discusión

Las células inmunitarias y las moléculas de control inmunitario dentro del TME son reguladores críticos de la progresión tumoral, la metástasis y la respuesta terapéutica. Entre ellas, LAG3 ha surgido recientemente como un prometedor objetivo inmunoterapéutico. Sin embargo, en el CRC metastásico (mCRC), su impacto pronóstico sigue sin estar claro y los resultados clínicos del tratamiento dirigido a LAG3 han sido decepcionantes. En este estudio, integramos una cohorte institucional de mCRC de NCKUH con dos conjuntos de datos de CRC disponibles públicamente para dilucidar la relevancia clínica y biológica de LAG3 en el mCRC. Nuestros análisis revelaron varios hallazgos clave. En primer lugar, una mayor expresión de LAG3 se asoció con una peor supervivencia general en el mCRC. En segundo lugar, la alta expresión de LAG3 se relacionó con la angiogénesis, la EMT y la señalización de TGF-β, lo que refleja un microambiente tumoral inmunosupresor. En tercer lugar, el análisis de la comunicación célula-célula reveló una vía de señalización única de galectina-9-TIM-3 presente exclusivamente en las células T CD8+ LAG3+, pero ausente en las células T CD8+ LAG3-, lo que sugiere interacciones supresoras cooperativas que pueden contribuir a la disfunción inmunitaria y la resistencia terapéutica. En conjunto, estos hallazgos proporcionan un nuevo biomarcador pronóstico y ofrecen una justificación mecanicista para el tratamiento combinado de LAG3 y TIM-3 para superar la resistencia inmunitaria en el mCRC.

Estudios previos que evalúan la relevancia pronóstica de LAG3 en el CRC han informado resultados inconsistentes. Chen et al. encontraron que un mayor porcentaje de células LAG3+ se correlacionó con una menor supervivencia en 108 pacientes con CRC en estadio I-IV [^[37]]. En contraste, un estudio de 142 pacientes con CRC en estadio II informó que la expresión de LAG3, particularmente cuando las células TIL LAG3+ estaban presentes en el borde invasor, se asoció con una mejor supervivencia libre de enfermedad [^[13]]. Los metaanálisis que agrupan a pacientes en estadio I-IV concluyeron que LAG3 por sí solo no era un factor pronóstico en el CRC [^[14], ^[38], ^[39]]. Estas discrepancias probablemente reflejan diferencias en la composición del estadio de la enfermedad, el sitio anatómico analizado (primario frente a metastásico), los enfoques de puntuación y el contexto biológico. Nuestro estudio se centró específicamente en la enfermedad metastásica. Tanto los análisis univariados como los multivariados demostraron que una mayor expresión de LAG3 en los tumores primarios se correlacionó con una peor supervivencia general en el mCRC, y este hallazgo se validó en la cohorte TCGA COADREAD. Estos datos respaldan que LAG3 es un biomarcador pronóstico independiente en el mCRC.

Se observaron asociaciones clínicamente relevantes entre la expresión de LAG3 y las características tumorales. En las cohortes NCKUH y TCGA COADREAD, la expresión de LAG3 fue mayor en los tumores primarios del lado derecho que en los del lado izquierdo. El CRC del lado derecho se caracteriza por alteraciones genómicas distintas, patrones de infiltración inmunitaria y comportamiento metastásico en comparación con el CRC del lado izquierdo, lo que a menudo confiere un peor pronóstico en el entorno metastásico. En consonancia con el fenotipo inmuno-inflamado del CRC dMMR/MSI-H, los tumores MSI-H en TCGA COADREAD mostraron una expresión significativamente mayor de LAG3 que los tumores MSS. En nuestra cohorte institucional, los tumores MSI-H mostraron solo niveles numéricamente más altos de LAG3, lo que probablemente refleja la baja frecuencia de MSI-H (6%), lo que es consistente con informes previos en el mCRC [^[40]], y el consiguiente poder estadístico limitado. En particular, también encontramos una expresión significativamente mayor de LAG3 en las metástasis hepáticas en comparación con otros sitios metastásicos. Estudios previos han informado de manera similar un enriquecimiento de las células T CD8+ y CD4+ LAG3+ en las metástasis hepáticas de CRC en relación con las lesiones peritoneales [^[41]]. Estas observaciones sugieren que las metástasis hepáticas albergan un microambiente inmunitario distinto, lo que podría influir en la sensibilidad diferencial a la inhibición del punto de control en los diferentes sitios metastásicos.

Demostramos que las firmas de angiogénesis y EMT se enriquecieron en el CRC LAG3-positivo en dos cohortes independientes. La angiogénesis es una característica de la progresión del CRC [^[42]] y se ha relacionado cada vez más con la supresión inmunitaria al promover la exclusión inmunitaria y la alteración de la infiltración de células efectoras en el TME [^[32], ^[42]]. La EMT es un programa celular conservado que se activa de forma aberrante durante la progresión del cáncer y que promueve la capacidad migratoria, las propiedades similares a las de las células madre, la metástasis y la resistencia terapéutica. Además de estos papeles oncogénicos, la EMT también contribuye a la evasión inmunitaria dentro del TME [^[33]]. Dado que tanto la angiogénesis como la EMT se asocian con malos resultados en el mCRC [^[34], ^[35]], su enriquecimiento en los tumores LAG3-alto puede ayudar a explicar la asociación pronóstica negativa de la expresión de LAG3.

Entre las vías oncogénicas del CRC, la señalización de TGF-β surgió como una vía prominente asociada con la expresión de LAG3. TGF-β es un regulador central tanto de la EMT como de la angiogénesis y está ampliamente implicado en la progresión del mCRC y la resistencia inmunitaria [^[42], ^[43]]. Mecánicamente, TGF-β impulsa la disfunción de las células T y aumenta las moléculas de control inmunitario inhibitorias, lo que podría incluir LAG3, lo que perjudica la inmunidad antitumoral. Además, estudios previos han demostrado que las células T reguladoras LAG3+ pueden producir altos niveles de TGF-β [^[44]], y estas células T reguladoras que secretan TGF-β exhiben una mayor potencia supresora que las células T reguladoras convencionales en el CRC [^[45]]. En conjunto, estas observaciones respaldan una relación recíproca entre LAG3 y la señalización de TGF-β, que sustentan de forma sinérgica un TME inmunosupresor en el mCRC.

Nuestro análisis de comunicación célula-célula revela además un enriquecimiento distintivo de la señalización de galectina-9-TIM-3 hacia las células T CD8+ LAG3+. Esto sugiere que las células estromales, epiteliales y mieloides SPP1+ contribuyen colectivamente a la disfunción de las células T a través de la interacción de galectina-9-TIM-3. La orientación concurrente de las células T CD8+ LAG3+ por la señalización de galectina-9-TIM-3, junto con la coexpresión observada de LAG3 y TIM-3, respalda un mecanismo inhibitorio cooperativo que puede reforzar el agotamiento de las células T. Esta interacción también puede proporcionar una explicación potencial para la eficacia limitada del bloqueo de LAG3 en el mCRC [^[17], ^[18]], ya que otras vías inhibitorias pueden mantener la supresión inmunitaria a pesar de la inhibición de LAG3. El tratamiento combinado de LAG3 y TIM-3 puede, por lo tanto, ofrecer una estrategia racional para superar la resistencia y restaurar la función de las células T en pacientes seleccionados con mCRC, aunque esto requerirá una validación funcional y una investigación clínica.

Este estudio tiene varias limitaciones. En primer lugar, representa un análisis retrospectivo de un solo centro con un tamaño de cohorte relativamente limitado, lo que puede restringir la generalizabilidad de los hallazgos. En segundo lugar, la falta de un marco estandarizado para evaluar la expresión de LAG3 complica las comparaciones entre estudios y limita la traducción clínica. En tercer lugar, la escasez de conjuntos de datos metastásicos emparejados impidió una comparación transcriptómica directa de la actividad de las vías entre los tumores primarios y metastásicos. Los estudios futuros que integren perfiles transcriptómicos primarios y metastásicos emparejados, de una sola célula y espaciales serán esenciales para dilucidar la regulación inmunitaria específica del sitio metastásico asociada con la expresión de LAG3. Por último, dado que nuestras interpretaciones mecanicistas se derivan en gran medida de los análisis transcriptómicos a granel y de una sola célula, es necesaria una validación funcional utilizando modelos in vitro e in vivo para confirmar la relevancia biológica de estas observaciones.

Conclusiones

La expresión de LAG3 sirve como un biomarcador pronóstico adverso independiente en el mCRC y se asocia con la angiogénesis, la EMT, la señalización de TGF-β y el agotamiento de las células T. La vía de señalización de galectina-9-TIM-3 distinta identificada en las células T CD8+ LAG3+ puede contribuir a las respuestas subóptimas al bloqueo de LAG3. Estos hallazgos subrayan la necesidad de estrategias racionales de inmunoterapia combinada dirigidas a vías inhibitorias complementarias para mejorar la eficacia clínica en el mCRC.

Información complementaria

A continuación, se muestra el enlace al material complementario electrónico.