La eficacia de la quimioterapia combinada con el bloqueo del punto de control inmunitario programado para la muerte celular (ICB PD-1) está limitada por la citotoxicidad colateral de la quimioterapia hacia las células T CD8+ específicas del tumor en proliferación (TTST), una población indispensable para la inmunidad antitumoral.
Este estudio buscó superar esta limitación mediante el objetivo de un reservorio inmunitario celular resistente a la quimioterapia. Utilizando los modelos murinos de resolución aguda de la infección por virus de la meningitis linfocítica quoriomeningea (LCMV) y tumores (cáncer colorrectal y melanoma), caracterizamos la susceptibilidad de las células TTST CD8+ y las células T memoria específicas del virus CD8+ alopáticas (TBYS) a la citotoxicidad inducida por quimioterapia basada en platino. A continuación, evaluamos la eficacia antitumoral y los mecanismos subyacentes de la combinación de quimioterapia y terapia oncolítica viral dirigida a las células TBYS (OV-BYTE) en ratones portadores de tumores con infección previa por LCMV o vacunación contra SARS-CoV-2. Finalmente, evaluamos la eficacia antitumoral del régimen combinado triple (que incluye OV-BYTE, quimioterapia y bloqueo de PD-1 ICB) en el modelo murino de cáncer colorrectal y en organoides derivados de pacientes con cáncer colorrectal.
Primero demostramos que dentro del microambiente tumoral, las células TTST CD8+ son altamente susceptibles a la quimioterapia basada en platino, mientras que las células TBYS CD8+ constituyen una población quiescente y resistente a la quimioterapia. Aprovechando esto, la terapia OV-BYTE dirigida a las células TBYS CD8+ se sintetizó con la quimioterapia para controlar la tumorigénesis en varios modelos murinos. Mecanicamente, esta combinación dual directamente comprometió el reservorio de células TBYS CD8+ para la eliminación del tumor, lo que fue acompañado por la restauración de la función de las células TTST CD8+ mediante una reducción de la susceptibilidad apoptótica y la adquisición de un estado polifuncional similar a los efectores. Como resultado, integrar OV-BYTE en el régimen estándar chemo-PD-1 ICB resultó en una mayor eficacia antitumoral tanto en modelos preclínicos como en modelos tumorales derivados de pacientes.
Nuestro estudio establece el nicho resistente a la quimioterapia de células TBYS CD8+ como un objetivo terapéutico pivotal. Al comprometer este objetivo, OV-BYTE emerge como un agente combinatorio potente que logra sortear una limitación central del tratamiento chemo-inmunoterápico estándar, ofreciendo así una estrategia razonablemente diseñada y transitable para avanzar en el tratamiento combinado del cáncer.
La combinación de quimioterapia e inmunoterapia con inhibidores del punto de control PD-1 (proteína de muerte celular programada) ha demostrado una eficacia antitumoral significativa en un amplio espectro de neoplasias.[1] Una de las principales bases mecanísticas de esta sinergia terapéutica es que la quimioterapia elimina las células tumorales que proliferan rápidamente y libera antígenos tumorales para activar las células T CD8+ específicas del tumor (TTST), mientras que la inmunoterapia con inhibidores de PD-1 mantiene esta respuesta antitumoral al promover la proliferación y la función efectora de la población activada de células T CD8+ TTST.[1 2] Sin embargo, las células T CD8+ TTST en el microambiente tumoral (TME), especialmente aquellas que se encuentran en un estado de alta proliferación debido a la inmunoterapia con inhibidores de PD-1, corren un alto riesgo de citotoxicidad inducida por la quimioterapia.[3 4] Este conflicto farmacológico intrínseco socava inevitablemente el potencial completo del régimen combinado y destaca la necesidad de nuevas estrategias para superar esta limitación.
En contraste con las células T CD8+ TTST susceptibles a la quimioterapia, estudios previos han identificado que las células T CD8+ de memoria específicas de virus (TMEM) persisten después de la quimioterapia citotóxica.[5 6] Estas células T CD8+ TMEM específicas de virus, evocadas por una infección natural o una vacunación, migran ampliamente hacia el TME y conservan persistentemente sus características de memoria.[7][10] Debido a su falta de especificidad tumoral, las células T CD8+ TMEM específicas de virus que infiltran el TME se denominan células T "espectadoras" (TBYS) y pueden utilizarse de forma duradera para lograr beneficios terapéuticos antitumorales.[811][15] Entre estas terapias dirigidas a las TBYS, informamos sobre un virus oncolítico modificado que codifica epítopos de células TBYS (OV-BYTE) que redirigen las células TBYS infiltrantes del TME para la destrucción tumoral. Además, la terapia OV-BYTE mostró una eficacia sinérgica con la inmunoterapia con inhibidores de PD-1 en el refuerzo de la inmunidad antitumoral de las células T CD8+ TTST.[8] Sin embargo, aún se desconoce si la potencial naturaleza resistente a la quimioterapia de las células TBYS podría conferir a la terapia OV-BYTE una ventaja terapéutica única al sinergizar con la quimioterapia y restaurar la respuesta atenuada de las células T CD8+ TTST bajo un régimen de quimioterapia e inmunoterapia con inhibidores de PD-1.
En este estudio, primero encontramos que, si bien las células T CD8+ TTST infiltrantes del TME eran altamente susceptibles a la citotoxicidad inducida por la quimioterapia a base de platino, las células T CD8+ TBYS representaban una población quiescente que persistía durante dicho tratamiento. Aprovechando la naturaleza resistente a la quimioterapia de las células T CD8+ TBYS, demostramos a continuación que la terapia OV-BYTE dirigida a las TBYS sinergiza con la quimioterapia a base de platino en el control de la tumorigénesis en múltiples modelos tumorales preclínicos. Mecánicamente, esta combinación no solo involucra directamente el reservorio de células TBYS resistentes a la quimioterapia, sino que también restaura la respuesta antitumoral de las células T CD8+ TTST atenuadas por la quimioterapia a través de una menor susceptibilidad a la apoptosis inducida por la quimioterapia. Además, la combinación de OV-BYTE y quimioterapia promovió sinérgicamente la adquisición de un estado polifuncional y similar a un efector entre las células T CD8+ TTST. Lo más importante es que, utilizando tanto modelos tumorales murinos preclínicos como un modelo de organoides de cáncer colorrectal derivado de pacientes clínicamente relevante, demostramos que la integración de OV-BYTE en el régimen estándar de quimioterapia e inmunoterapia con inhibidores de PD-1 produjo resultados terapéuticos superiores. Por lo tanto, nuestro estudio estableció a OV-BYTE como un potente agente combinatorio capaz de potenciar la quimioinmunoterapia al involucrar las células T CD8+ TBYS resistentes a la quimioterapia.
Métodos
Ratones
Se adquirieron ratones C57BL/6 (RRID: IMSRJAX:000664), BALB/c (RRID: IMSRJAX:000651), transgénicos OT-1 (RRID: IMSRJAX:003831) y con línea celular CD45.1+ (RRID: IMSRJAX:002014) de los Laboratorios Jackson. Los ratones transgénicos P14 fueron un regalo del Dr. Rafi Ahmed (Universidad de Emory). Todos los ratones utilizados en los experimentos con animales tenían entre 6 y 8 semanas de edad, y se incluyeron ambos sexos, excepto que solo se utilizaron ratonas BALB/c para el injerto de células de cáncer de mama 4T1. Todos los ratones se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos, se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas a una temperatura controlada de 20-22 °C y una humedad de 40-60 %. Todos los alojamientos de ratones y los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Tercera Universidad Militar, bajo el número de protocolo AMUWEC20234674.
Infección viral e inmunización con proteínas
El virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), cepa Armstrong, fue amablemente proporcionado por el Dr. Rafi Ahmed (Universidad de Emory) y se propagó en nuestro laboratorio. Para la infección con LCMV Armstrong, se infectaron ratones C57BL/6 por vía intraperitoneal con 2 × 105 unidades formadoras de placa de la cepa LCMV Armstrong. Para la inmunización con el dominio de unión al receptor (RBD), se inmunizaron ratones BALB/c por vía intranasal con dos dosis de 10 µg de proteína SARS-CoV-2 RBD-mFC (Sino Biological, 40592-V05H) conjugada con 10 µg de CpG ODN 1826 (Invitrogen, tlrl-1826) con un intervalo de 2 semanas.
Modelos tumorales en ratones
Las células B16-F10 (B16; RRID: CVCL0159), MC38 (RRID: CVCLB288) y 4T1 (RRID: CVCL0125) se adquirieron de ATCC. Las células MC38-OVA (RRID: CVCLXJ96) se adquirieron del Centro de Organismos Modelo de Shanghái. Las células B16-GP se generaron mediante la inserción mediada por CRISPR-Cas9 del gen de la glicoproteína (GP) del LCMV en el genoma de las células B16-F10. Las líneas celulares se autenticaron mediante citometría de flujo al recibirlas y cada 3 meses a partir de entonces para garantizar la identidad. Además, las células se analizaron rutinariamente para detectar contaminación por Mycoplasma utilizando el kit de detección por PCR de Mycoplasma (Abcam, ab289834) antes de los experimentos críticos. Todas las líneas celulares tumorales se cultivaron en medio Dulbecco modificado completo (DMEM; Gibco, 11995065) suplementado con un 10 % de suero fetal bovino (SFB; Gibco, A5256701) y un 1 % de penicilina/estreptomicina (Gibco, 15140122) en una incubadora humidificada a 37 °C y un 5 % de CO2. Para las células B16-GP, se añadió puromicina adicional (100 U/mL, Gibco, A1113803) al medio de cultivo. Para los modelos tumorales subcutáneos, se implantaron 5 × 105 células MC38, MC38-OVA, B16 o B16-GP en el flanco izquierdo de los ratones. Para el modelo de cáncer de mama, se implantaron 3 × 105 células 4T1 en el tejido adiposo mamario de ratonas BALB/c. Los tumores se midieron cada 2-3 días y los volúmenes tumorales se determinaron en dos dimensiones con un calibrador y se calcularon utilizando la fórmula (longitud × ancho2)/2. Los ratones se sacrificaron en los puntos temporales indicados o cuando los tumores alcanzaron el volumen final de 2000 mm3.
Transferencia adoptiva de células T
Para el modelo de infección con LCMV Armstrong, se transfirieron adoptivamente 5 × 104 células T CD8+ esplénicas naïf de P14 a los ratones receptores 1 día antes de la infección. Para los modelos tumorales MC38-OVA, se transfirieron adoptivamente 5 × 105 células T CD8+ esplénicas naïf de OT-1 a los ratones receptores 1 día antes del injerto tumoral. Para el modelo tumoral B16-GP, se transfirieron adoptivamente 5 × 105 células T CD8+ esplénicas naïf de P14 a los ratones receptores 1 día antes del injerto tumoral.
Administración de virus oncolíticos, fármacos de quimioterapia y anticuerpo anti-ligando de muerte programada 1 en ratones
Para el tratamiento con OV, las construcciones y las administraciones intratumorales de todos los tipos de virus oncolíticos de Newcastle Disease Virus (NDV) utilizados en este estudio se describieron previamente.[8] A los ratones con tumores se les administró diariamente 2 × 106 unidades formadoras de placa de NDV de tipo salvaje (WT) o NDV-GP o NDV-RBD en 50 µL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) desde los días 5 hasta el 11 después de la tumorigénesis por vía intratumoral. Para la quimioterapia, a los ratones con tumores se les administró un régimen de quimioterapia que consistió en cisplatino y pemetrexed en los días 5, 8, 11, 14 y 17 después de la tumorigénesis. El cisplatino (Yuanye Bio-Technology, CAS#15663-27-1) se disolvió en solución salina al 0,9 % y se administró por vía intraperitoneal a una dosis de 2,5 mg/kg. El pemetrexed (GLPBIO, No. GC11610) se disolvió en PBS y se administró por vía intraperitoneal a una dosis de 300 mg/kg. Para el tratamiento con inmunoterapia con inhibidores de PD-1, los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de 200 µg de anticuerpo anti-ligando de muerte programada 1 (PD-L1) (Bio X Cell, BE0101, RRID: AB_10949073).
Aislamiento de linfocitos
Para el aislamiento de linfocitos infiltrantes del TME, se disecaron los tumores, se picaron mecánicamente y se trataron con colagenasa tipo 1 (Diamond, A004194) durante 45 minutos a 37 °C. Después de la digestión, las suspensiones tumorales se pasaron a través de un filtro de malla de nylon de 70 µm (BD Falcon, 352350) para obtener preparaciones de células individuales. Posteriormente, los linfocitos infiltrantes del TME se enriquecieron aún más utilizando un gradiente de densidad discontinuo de Percoll (Cytiva, 17-0891-09), recolectando las células de la interfase, que luego se lavaron dos veces antes de las aplicaciones posteriores. Los esplenocitos se obtuvieron presionando suavemente el bazo a través de un filtro de malla de nylon de 70 µm (BD Falcon, 352350) para producir suspensiones de células individuales.
Citometría de flujo
Para la tinción de superficie, los linfocitos aislados de los tumores se resuspendieron y se tiñeron con tampón de tinción para citometría de flujo (PBS que contiene un 2 % de SFB inactivado por calor y 2 mM de EDTA). Para la detección de citocinas, las células se estimularon con 0,2 µg/mL de péptido OVA257-264, brefeldina A (BD Biosciences, 555029) y monensina (BD Biosciences, 554724) a 37 °C durante 5 horas. La tinción intracelular de interleucina (IL)-2, interferón (IFN)-γ y factor de necrosis tumoral (TNF)-α se realizó con el kit de fijación/permeabilización Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, 554714). La tinción de Ki67, Bcl-2, Bim y Caspasa 3 se realizó utilizando el conjunto de tampones de tinción de Foxp3/factores de transcripción (Invitrogen, 00-5523-00) y luego se incubó con anticuerpos fluorocromados de factores de transcripción específicos. La apoptosis se evaluó utilizando el kit Annexin V (eBioscience, 88-8102-72) según las instrucciones del fabricante. Para la incorporación de 5-Bromo-2'-desoxiuridina (BrdU), los ratones recibieron BrdU (100 mg/kg, inyección intraperitoneal o i.p.; Sigma, B5002-1G) diariamente durante 1 semana antes del sacrificio según las instrucciones del fabricante. Posteriormente, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-BrdU conjugado con aloficocianina (APC) utilizando el kit de tinción para citometría de flujo de eBioscience BrdU (eBioscience, clon BU20A, 8817-6600-42, RRID: AB11040534). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-CD8α (BioLegend, clon 53-6.7, RRID: AB2563057; BD Biosciences, clon YTS156, RRID: AB3687647), anti-CD4 (BioLegend, clon RM4-5, RRID: AB893325), anti-CD3 (BioLegend, clon 17A2, RRID: AB2242784), anti-CD44 (BioLegend, clon IM7, RRID: AB312959), anti-CD45.1 (BioLegend, clon A20, RRID: AB493733), anti-CD45.2 (BioLegend, clon 104, RRID: AB492872), anti-CD25 (BioLegend, clon PC61, RRID: AB312861), anti-PD-1 (BioLegend, clon 29F.1A12, RRID: AB2561447), anti-CD39 (BioLegend, clon Duha59, RRID: AB2563394), anti-CD11c (BioLegend, clon N418, RRID: AB313777), anti-CD11b (BioLegend, clon M1/70, RRID: AB493705), anti-F4/80 (BioLegend, clon BM8, RRID: AB893502), anti-B220 (BioLegend, clon RA3-6B2, RRID: AB893353), anti-I-Ab (BioLegend, clon AF6-120.1, RRID: AB10574160), anti-Ly6C (BioLegend, clon HK1.4, RRID: AB1186135), anti-Ly6G (BioLegend, clon 1A8, RRID: AB2251161), anti-XCR1 (BioLegend, clon ZET, RRID: AB2563932), anti-IFN-γ (BioLegend, clon XMG1.2, RRID: AB315402), anti-TNF-α (BD Biosciences, clon MP6-XT22, RRID: AB3684949), anti-IL-2 (BD Biosciences, clon JES6-5H4, RRID: AB1645256), anti-Ki67 (BioLegend, clon 16A8, RRID: AB2629531), anti-Bim (CST, clon C34C5, RRID: AB1030947), anti-Bcl-2 (BD Biosciences, clon 3F11, RRID: AB396457), anti-Caspasa-3 (BD Biosciences, clon C92-605.rMAb, RRID: AB3685826), tetrámero H-2Kb Rpl18 Neoepitope (KILTFDRL; MBL Life science, TC-5116-4) y anti-Foxp3 (BioLegend, clon MF-14, RRID: AB2750493). Los datos de citometría de flujo se adquirieron en un BD LSRFortessa (BD Biosciences) utilizando el software FACSDiva (V.7.0, RRID: SCR001456) y se analizaron utilizando FlowJo (V.10.8.1, RRID: SCR_008520). Los experimentos de clasificación celular se realizaron con el BD FACSAria III (BD Biosciences).
Preparación y secuenciación de la biblioteca de scRNA-seq
Se prepararon bibliotecas de secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) utilizando el sistema de análisis de célula única BD Rhapsody Express, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las células individuales se aislaron en nanopozo, utilizando un flujo microfluídico, seguido de la lisis celular y la transcripción inversa, incorporando códigos de barras específicos de cada célula e identificadores moleculares únicos. El ADN complementario resultante se amplificó por PCR, y luego se procesó mediante fragmentación enzimática, ligación de adaptadores y purificación para generar bibliotecas listas para la secuenciación. La distribución del tamaño de la biblioteca y la concentración se evaluaron utilizando un Bioanalyzer y Qubit, respectivamente. Las bibliotecas se secuenciaron en un instrumento Illumina NovaSeq 6000 (lectura pareada, 150 pb), asignando un carril por muestra. Se obtuvieron matrices de recuento brutos alineando las lecturas al genoma de referencia mm10 con Cell Ranger (V.6.1.1).### Procesamiento y análisis de datos de scRNA-seq
Todos los análisis posteriores se realizaron en R. Los datos brutos se importaron a Seurat (V.4.0) para el control de calidad. Se retuvieron las células si tenían >1000 genes detectados y 0,5 y valor p ajustado 0,01). El enriquecimiento funcional se evaluó mediante el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) en los genes regulados positivamente, utilizando el paquete clusterProfiler (RRID:SCR_016884). Las trayectorias de diferenciación se infirieron mediante el análisis de pseudotiempo con Monocle 3. Además, los estados funcionales a lo largo de las trayectorias se cuantificaron puntuando los grupos en relación con conjuntos de genes efectores predefinidos y calculando las proporciones de células en las fases de pseudotiempo.### Cultivo de organoides a partir de tejidos de cáncer colorrectal
Los pacientes con cáncer colorrectal (CRC) fueron incluidos en el estudio en el Hospital Xinqiao (Universidad de Ciencias de la Salud del Ejército). Todos los diagnósticos fueron confirmados patológicamente. Antes de la cirugía, se proporcionó a cada paciente el consentimiento informado por escrito para la recolección de muestras de tejido con fines de investigación. El método de cultivo de organoides tumorales se describió previamente.[16] En resumen, se recolectaron tejidos frescos de CRC en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Gibco, 11875093) al 1% de penicilina-estreptomicina, a temperatura de hielo. Las muestras se picaron en fragmentos de 1-5 mm3 y se resuspendieron en Advanced DMEM/F12 (Gibco, 12634010). Después de la filtración secuencial a través de tamices celulares de 100 µm y 40 µm, se recolectó la fracción de 40-100 µm, se centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos a 4 °C y se resuspendió en Matrigel reducido en factores de crecimiento a temperatura ambiente. Aproximadamente 50-60 µL de la mezcla de Matrigel y células se sembraron como domos en placas de 48 pocillos de baja adherencia, se solidificaron a 37 °C y se recubrieron con medio de cultivo de organoides de CRC para el cultivo. El medio de cultivo de organoides de CRC consistió en Advanced DMEM/F12 suplementado con 1% de penicilina-estreptomicina, 1% de GlutaMAX (Gibco, 35050061), 10 mM de HEPES (Gibco, 15630080), 1 mM de N-acetil-L-cisteína (Selleckchem, S1623), 5 mM de nicotinamida (Selleckchem, S1899), 10 nM de gastrina I humana recombinante (Leu15) (Sigma, G9145), 50 ng/mL de EGF humano recombinante (Gibco, AF-100-15), 100 ng/mL de Noggin humano recombinante (Gibco, 120-10C), 10 µM de forskolin (Selleckchem, S2449), 5 µM de A83-01 (TOCRIS, 2939), 10 µM de Y27632 (Selleckchem, S1049), 3 µM de SB202190 (Selleckchem, S1077), 3 nM de dexametasona (Selleckchem, S1322) y 100 ng/mL de Primocin (InvivoGen, ant-pm-05).### Aislamiento de PBMCs y cocultivo con organoides de CRC
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron mediante centrifugación de gradiente de densidad con Lymphoprep (STEMCELL, 18061), se crioconservaron en nitrógeno líquido y se descongelaron 1 día antes de su uso. Las células se cultivaron durante la noche en medio de expansión de células T ImmunoCult-XF (STEMCELL, 10981) suplementado con 150 U/mL de IL-2 a una densidad de 2×106 células/mL. Los organoides de CRC se recuperaron, se contaron y se resuspendieron a 5×104 células/mL. El cocultivo se realizó a una relación efector-diana de 20:1 bajo ocho condiciones de tratamiento diferentes, que incluyen el anticuerpo anti-PD-1 (10 µg/mL; nivolumab, Bio X Cell, SIM0003, RRID: AB_2894724), fármacos de quimioterapia que comprenden oxaliplatino (OXP, 10 µM; Selleckchem, S1224) y 5-fluorouracilo (5-FU, 10 µM; Selleckchem, S1209), NDV que expresa H1N1 NP/NDV-RBD (2×106 UFC/mL) y sus combinaciones.### Tinción por fluorescencia y evaluación cuantitativa del índice de respuesta
Después de 5 días de cocultivo, la viabilidad de los organoides de CRC se evaluó mediante Calcein-AM/PI (Yeasen, 40 747ES76) y Hoechst 33 342 (10 µg/mL; Beyotime, C1022). Los organoides se incubaron con los colorantes a 37 °C durante 30 minutos en la oscuridad y se visualizaron utilizando un objetivo de 10× en un microscopio confocal Olympus SpinSR. El análisis de la imagen se realizó utilizando el software Imaris (RRID:SCR_007370). Las células tumorales se identificaron mediante la tinción con Hoechst y se definieron como células con un diámetro de ~12-13 µm. Las células viables fueron Hoechst+/Calcein-AM+, y las células muertas fueron Hoechst+/PI+. El índice de respuesta se calculó como el porcentaje de células tumorales muertas entre el total de células tumorales.### Disponibilidad de datos
Los datos de scRNA-seq de las células OT-1 infiltrantes en el microambiente tumoral (TME) de MC38-OVA de cuatro grupos (control, CT, NDV-GP y CT+NDV GP) se han depositado en el Gene Expression Omnibus y están disponibles (GSE314954). Los datos de scRNA-seq públicos reanalizados aquí están disponibles bajo los códigos de acceso (GSE290082, DOI: 10.1186/s12943-025-02311-z; GSE222002, DOI: 10.1038/s43018-024-00760-x). Todo el código personalizado utilizado en el estudio está disponible bajo solicitud.### Análisis estadísticos
No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra; sin embargo, los tamaños de muestra utilizados fueron comparables a los informados en estudios anteriores.[8 17] Todos los datos recopilados se incluyeron en los análisis sin exclusión. Los experimentos se llevaron a cabo sin aleatorización, y los investigadores no estaban cegados a la asignación de grupos durante la experimentación y la evaluación de los resultados. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism V.10.0 (GraphPad Software, RRID:SCR_002798). Las comparaciones entre dos grupos no apareados se analizaron mediante una prueba t de Student de dos colas no apareada. Las comparaciones entre dos grupos apareados se analizaron mediante una prueba t de Student de dos colas apareada. Para las comparaciones que involucran tres o más grupos, se aplicó un análisis de varianza (ANOVA) de un factor seguido de la prueba post hoc de Tukey. Las curvas de crecimiento tumoral se analizaron utilizando ANOVA de dos vías. El análisis de supervivencia se realizó utilizando la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox). Los datos se presentan como puntos individuales con media ± SEM. Se consideró que un valor p de
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