La adaptación experimental del rotavirus A de paloma (pRVA) en células de cáncer colorrectal humano revela respuestas del huésped impulsadas por interferón y modulación de los puntos de control inmunitario.

Los virus oncolíticos, a diferencia de los tratamientos convencionales contra el cáncer, utilizan virus que se dirigen selectivamente a las células cancerosas. Estos virus pueden replicarse dentro de las células tumorales, lo que finalmente conduce a la ruptura de las células tumorales y a la apoptosis. No todos los virus son adecuados para ser virus oncolíticos; los que típicamente presentan baja seroprevalencia en humanos, estabilidad genética y baja patogenicidad en humanos son los más adecuados [^[1],^[2]]. Los virus oncolíticos entran en las células cancerosas uniéndose a receptores de superficie específicos que a menudo están sobreexpresados en las células malignas, como CAR, HVEM y LDLR. Una vez dentro, los virus oncolíticos explotan las vías de señalización aberrantes únicas de las células cancerosas para promover la replicación viral y la posterior lisis de las células tumorales [^[3]]. Los virus oncolíticos han demostrado selectividad por las mutaciones comunes del cáncer. Por ejemplo, los adenovirus y los reovirus se replican de manera más eficiente en las células deficientes en p53, ya que el p53 intacto desencadena la apoptosis tras la detección viral [^[4],^[5]]. De manera similar, la desregulación de la vía de Rb, que regula el ciclo celular, permite que los virus oncolíticos como el adenovirus [^[4]], el reovirus [^[5]], el poxvirus [^[6]], el herpesvirus [^[7]] y el rotavirus [[^[8]], [^[9]], [^[10]], [^[11]]] proliferen e induzcan la apoptosis en las células con actividad E2F aberrante.

El cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa más común de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. Según el Observatorio Mundial del Cáncer de la Organización Mundial de la Salud, en 2020 se notificaron más de 1,9 millones de nuevos casos de CCR, lo que subraya la urgente necesidad de estrategias terapéuticas innovadoras [^[12]]. En un ensayo clínico, la terapia combinada del virus herpes humano oncolítico tipo 2 (OH2) y un anticuerpo anti-PDL1 transforma eficazmente un tumor "frío" en uno "caliente" en pacientes con CCR [^[13]]. En un ensayo preclínico, una nueva plataforma de virus vaccinia, los virus de enlace bispecíficos (BEVirs), demostró una eficacia combinatoria con los activadores de células T (TCE) y mejoró la respuesta de las células T en el microambiente tumoral [^[14]]. Una plataforma vaccinia similar, la cepa Guang9 del virus vaccinia que alberga IL-24 (VG9-IL-24), exhibe potentes efectos antitumorales contra el CCR tanto in vitro como in vivo mediante la inducción de la apoptosis o un efecto oncolítico directo [^[15]]. En una plataforma viral diferente, un adenovirus oncolítico triplemente regulado que contiene el gen terapéutico miR-143 (Ad-RGD-Survivin-ZD55-miR-143) inhibe los xenoinjertos de CCR en ratones BALB/c desnudos hembra de 4 semanas de edad e induce la apoptosis al inhibir KRAS. Enadenotucirev, un adenovirus quimérico selectivo para tumores, se encuentra actualmente en fase 1, administrado por vía intravenosa e intratumoral, lo que resulta en una infiltración altamente localizada de células CD8+ en las muestras tumorales sin efectos adversos en los tejidos normales [^[16]].

En los rotavirus oncolíticos, Rotarix (rotavirus humano) y Rotateq (rotavirus humano-bovino recombinante) se han reutilizado para superar la resistencia a las terapias de bloqueo de puntos de control inmunitarios, sinergizando con las terapias anti-CTLA-4 y anti-PDL1 en modelos de neuroblastoma in vitro e in vivo [^[10]]. El rotavirus oncolítico facilita la afluencia de calcio mediada por NSP4, que interrumpe la integridad del citoesqueleto y las uniones estrechas en las células epiteliales, lo que conduce a la lisis celular y la apoptosis. Este proceso permite la liberación de viriones y la propagación de la infección a las células vecinas [^[17],^[18]]. La respuesta inmunitaria innata contra el rotavirus se inicia mediante la producción de interferones (IFN), que activan los genes estimulados por interferones (ISG) a través de la vía JAK/STAT. En las células epiteliales intestinales, tanto el tipo I de IFN, como el IFN-α, como el tipo III de IFN, como el IFN-λ, desempeñan funciones críticas en la defensa antiviral [^[19],^[20]]. Si bien los IFN de tipo I se unen a IFNAR1 e IFNAR2, los IFN de tipo III señalan a través de IFNLR1, también conocido como IL-28Rα, e IL-10Rα. Los IFN de tipo I se expresan ampliamente en varios tejidos epiteliales, mientras que los IFN de tipo III actúan principalmente en las barreras mucosas, incluido el tracto gastrointestinal, respiratorio y reproductivo, donde son esenciales para limitar la replicación viral y modular las respuestas inmunitarias [^[21],^[22]]. También se informó que hsa-miR-142-5p favorece la infección por rotavirus en las células HT29, en las que NSP5 regula al alza e inhibe la apoptosis inducida por TGF-β y la transición epitelio-mesenquimal al bloquear las vías no canónicas [^[23]]. Las cepas de rotavirus TRF-41 (G5) (porcino), RRV (G3) (simio), UK (G6-P5) (bovino), Ym (G11-P9) (porcino), Wa (G1-P8), Wi61 (G9) y M69 (G8) (humano), ECwt (rotavirus murino de tipo salvaje) y WT1, WT2, WT3, WT4 y WT5 (rotavirus humano pediátrico de tipo salvaje) se agruparon y se adaptaron en diferentes líneas de células tumorales: U937, AGS, Caco2, Kato III, MCF-7, PC-3, REH, A549 y Sp2/0-Ag14 y en células no tumorales MA104, L929 y PBMC, lo que resultó en una mayor capacidad de infección en comparación con el rotavirus parental con muerte celular por apoptosis [^[24]]. Los rotavirus pueden unirse a la proteína cognada de choque térmico (Hsc70), una proteína de choque térmico implicada en la proliferación, diferenciación y desarrollo y progresión del cáncer, como receptor o correceptor [^[25]], que también está presente en las células de CCR.

El concepto de utilizar virus oncolíticos como herramientas terapéuticas para el CCR ha ganado cada vez más atención, y varios estudios destacan su capacidad para dirigirse selectivamente a las células tumorales [[^[2]], [^[3]], [^[4]], [^[5]], [^[6]], [^[7]], [^[13]], [^[14]], [^[15]], [^[26]], [^[27]], [^[28]], [^[29]], [^[30]]], inducir oncolisis con modulación inmunitaria [^[23],^[24]], mejorar el microambiente tumoral [^[26]] y mejorar la eficacia de las terapias existentes [^[27]]. En el caso de los rotavirus oncolíticos, la mayoría de las cepas o aislados probados eran de origen mamífero, incluidos los humanos, simios, porcinos, bovinos y murinos. Hasta la fecha, no se ha demostrado que el rotavirus de origen aviar se someta a una adaptación experimental en líneas de células tumorales, especialmente en el CCR. La mayoría de los estudios sobre el rotavirus oncolítico se han realizado in vitro utilizando líneas de células como HT29 y Caco2, con actividad apoptótica [^[8],^[9],^[11],^[17],^[23],^[24],^[31]]. Hasta la fecha, ninguno de los rotavirus oncolíticos se ha evaluado en ensayos clínicos o en combinación con inmunoterapia, como se observa comúnmente con otras plataformas de virus oncolíticos, posiblemente debido a la mayor infectividad del rotavirus de origen mamífero en las líneas de células tumorales y su capacidad para reasortarse con otras cepas de rotavirus.

En este estudio, investigamos la infección experimental de la cepa NPUST-001 del rotavirus A de paloma (pRVA) [^[20]] en las líneas de células de cáncer colorrectal humano HT29 y Caco2. El rotavirus A de paloma es un virus entérico que causa el síndrome de enfermedad de las palomas jóvenes (YPDS). Nuestro pRVA demostró una alta infectividad y pronunciados efectos citopáticos en ambas líneas de células. En particular, el pRVA indujo la apoptosis en las células de CCR, activó las vías mediadas por IFN, reguló los puntos de control inmunitarios y los receptores de reconocimiento de patrones, y moduló la expresión de citocinas y quimiocinas inflamatorias, lo que sugiere la activación de las vías relacionadas con la apoptosis. Estos hallazgos respaldan el potencial del pRVA como un nuevo agente oncolítico para el tratamiento del CCR. Nuestros hallazgos se suman a esta creciente evidencia, proponiendo los rotavirus como un candidato prometedor en el campo en expansión de la viroterapia oncolítica, especialmente para el cáncer colorrectal. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que adapta el rotavirus de origen aviar a las células de cáncer colorrectal humano con potencial oncolítico.

Métodos

Cultivo celular

Las células de adenocarcinoma colorrectal humano, HT29 y Caco2, las células no tumorales, HaCaT y CCD-996Sk, y los tipos de células no humanos Vero y BHK-21 se cultivaron con medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Gibco, EE. UU.) suplementado con 10 % de suero fetal bovino (SFB) (Cytiva, Hyclone, EE. UU.), 100 mM de L-glutamina (Gibco, EE. UU.), 100 mM de piruvato de sodio (Gibco, EE. UU.), 10 µg/mL de penicilina-estreptomicina (Gibco, EE. UU.), MEMM NEAA (100X) (Gibco, EE. UU.), 1 M de HEPES (Cytiva, EE. UU.) y se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2.

Para el subcultivo, se descartaron los medios y las células se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) al 10 % (p/v), las células se separaron con tripsina-EDTA al 0,25 % (Gibco, EE. UU.), las células separadas se recogieron añadiendo una proporción de 1:2 de DMEM con 10 % de SFB, se centrifugaron con Kubota 5100 (Kubota, Japón) durante 5 minutos a 1200 rpm, se descartó el sobrenadante, los gránulos celulares se resuspendieron de manera homogénea con DMEM fresco con 10 % de SFB y se sembraron las células necesarias. La concentración celular se midió utilizando el Countess™ 3 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Singapur).

Adaptación del rotavirus A de paloma en células de cáncer colorrectal

El rotavirus A de paloma (pRVA), la cepa de Taiwán, NPUST-001, se ha aislado y cultivado con éxito en células MARC-145 [^[32]]. Las células HT29 y Caco2 se sembraron en una placa de 6 pocillos (Jet Biofil, China) al 80 % de confluencia. Antes de la infección, se descartó el medio DMEM de las células y las células se lavaron tres veces con DMEM sin suero. Para la primera infección de adaptación del pRVA en las células HT29 y Caco2, se añadió 500 µL de sobrenadante de la cepa viral pRVA de MARC-145 a 2,15 × 104 TCID50 (dosis infecciosa del 50 % en células tisulares) y se activó con 20 µg/mL de tripsina durante 1 hora a 37 °C. El pRVA activado con tripsina se inoculó en las células HT29 o Caco2 durante 1 hora a 37 °C con 5 % de CO2 para permitir la adsorción del virus. Luego, se retiró el medio de cultivo. Las células se lavaron tres veces con DMEM sin suero para eliminar los virus residuales del medio de cultivo y luego se incubaron en 2 mL de DMEM fresco sin suero que contenía 1,0 µg/mL de tripsina. Luego, se permitió que la infección creciera durante seis días a 37 °C con 5 % de CO2. Después de 6 días de infección, se recogió el sobrenadante viral y se utilizó para infectar las células nuevamente. El protocolo se realizó tres veces. Antes de la infección y en los días 3 y 6 posteriores a la infección, se recogió un sobrenadante de infección de 300 µL para RT-qPCR para probar el crecimiento y la cantidad de virus. El efecto citopático (CPE) se observó durante la infección bajo un microscopio de luz CKX41SF (Olympus, Japón) y las imágenes se capturaron con un sistema de cámara científica Spot 27.2-3.1 MP – 0.55X HR055-CMT (Diagnostic Instrument, EE. UU.).

La TCID50 se realizó utilizando células MARC-145 sembrando 1 × 106 células en una placa de 96 pocillos (Jet Biofil, China). 1 mL de virus se diluyó a 10-9; se añadió 100 µL del virus diluido a cada pocillo. Cada columna tenía el mismo factor de dilución y la placa se incubó durante 1 hora. Posteriormente, se retiró el medio viral, se añadió medio fresco y se registró el CPE después de 6 días de infección. Finalmente, la TCID50 se determinó utilizando el método de Reed-Muench.

Cuantificación del genoma del rotavirus con RT-qPCR

La propagación de la infección por pRVA se cuantificó mediante RT-qPCR, con ARN extraído de 300 µL de sobrenadante viral recogido en los días indicados. Se utilizó un reactivo listo para usar para el aislamiento de ARN, REzol™ C & T (Protech, Taiwán), para la extracción de ARN siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la extracción de ARN, se realizó RT-qPCR utilizando el kit qPCRBIO SyGreen® 1-Step Go Hi-ROX (PCR Biosystems Ltd, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con ligeras modificaciones. Cada reacción contenía 5 µL de mezcla 2 × qPCRBIO SyGreen® 1-Step, 0,4 µL de cada cebador directo (VP-6; 5'-GCCCGCAATTTCGATTCAATACG-3') y cebador inverso (VP-6; 5'-GTGCTGCTACTCCAGGTGTCAT3') [^[33]], 0,5 µL de 20 × RTase GO, 1,7 µL de agua ultrapura DEPC (Protech, Taiwán) y 2 µL de ARN en un volumen total de reacción de 10 µL. El ciclo de reacción térmica fue el siguiente: 45 °C durante 10 minutos para la transcripción inversa, 95 °C durante 2 minutos para la activación de la polimerasa y 40 ciclos de 95 °C durante 5 segundos y 60 °C durante 30 segundos para la desnaturalización y el hibridación/extensión. La RT-qPCR se realizó en un termociclador de PCR en tiempo real Step One™ (Applied Biosystems, Singapur).

Los valores de CT se convirtieron en copias genómicas de pRVA log10/L utilizando la ecuación de regresión lineal de la curva estándar generada a partir de diluciones seriales de 10 pliegues (de 1010 a 104) de cDNA de pRVA, cuantificado en un NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). El ARN del rotavirus de paloma se convirtió en cDNA mediante el kit de síntesis de cDNA RScript (Bio-helix, Taiwán) siguiendo el protocolo del fabricante.

Viabilidad celular

Para determinar la viabilidad celular de las células HT29 y Caco2 después de la infección con pRVA a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 y 1, la suspensión celular se mezcló con una solución de azul de trypan al 0,4% (Gibco, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) en una proporción de 1:1 (vol/vol), y se utilizaron 10 µL para contar las células viables con el contador Countess™ 3 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Singapur). La viabilidad celular se evaluó a los 3 y 6 días posteriores a la infección para las células HT29 y Caco2, respectivamente, en función de las diferencias en la cinética de la infección y los efectos citopáticos.

Tinción con cristal violeta

Las células HT29 y Caco2 infectadas con pRVA con una MOI de 0,1 y 1 se tiñeron después de la infección. Primero, se descartó el medio de infección, luego se añadió un 4% de formaldehído durante 5 minutos, se descartó y, a continuación, se añadió un 4% de cristal violeta (Merk, Sigma-Aldrich, EE. UU.). La tinción con cristal violeta se evaluó a los 3 y 6 días posteriores a la infección para las células HT29 y Caco2, respectivamente, en función de las diferencias en la cinética de la infección y los efectos citopáticos.

Microscopía electrónica de transmisión

Se utilizó un microscopio electrónico de transmisión Hitachi H-7500 (Hitachi, Tokio, Japón) para obtener imágenes del virus, siguiendo un método similar al descrito en un estudio anterior [^[34]]. Los sobrenadantes de la infección de HT29 y Caco2 se centrifugaron (Centrisart A-14C, Sartorius Lab Instruments, Alemania) a 3500×g durante 5 minutos y se pasaron a través de una membrana de filtro Millex®-GV de 0,22 µm (Merck Millipore, Irlanda). A continuación, el sobrenadante del virus se concentró mediante glicol de polietileno 6000 (Alfa Aesar, Alemania) al 10% p/v, y se añadieron 1,45 g de NaCl (Showa Chemical, Japón) por cada 20 mL de solución de virus, y se incubó durante la noche con agitación a 4 °C. Las soluciones de virus se centrifugaron a continuación a 10.000×g durante 30 minutos, y se descartó el sobrenadante. Los sedimentos se disolvieron en PBS 1X. A continuación, se dejaron reposar en una rejilla de cobre con recubrimiento de formvar/carbono de 200 mallas (Ted Pella, Redding, EE. UU.) durante 30 segundos, seguido de una solución acuosa de acetato de uranilo al 2% (Spi-Chem, EE. UU.) durante 45 segundos para el recubrimiento.

RT-qPCR para la expresión de ARNm de genes relacionados con el interferón, puntos de control inmunitarios y receptores tipo Toll

La expresión de ARNm de los genes relacionados con el interferón MX1, STAT1, NF-κB, IRF7 e IRF9; los genes de los puntos de control inmunitarios PD1, PDL1 y CTLA4; y los genes de los receptores tipo Toll (TLR) TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8 y TLR9 se midieron mediante RT-qPCR en puntos de tiempo específicos, utilizando GAPDH como control interno. Las células HT29 infectadas con pRVA se utilizaron en este estudio. El ARN total se extrajo con REzol™ C & T. La RT-qPCR se realizó utilizando el bloque de ciclado térmico del sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus™ (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Singapur) con el kit qPCRBIO SyGreen® 1-Step Go Hi-ROX (PCR Biosystems Ltd, Reino Unido) siguiendo las instrucciones del fabricante, con ligeras modificaciones. Cada reacción contiene 5 µL de mezcla 2× qPCR BIO SyGreen 1-Step, 0,4 µL de cada cebador directo e inverso a una concentración final de 400 nM, 0,5 µL de RTase Go 20×, 1,7 µL de agua tratada con DEPC y 2 µL de ARN. Los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1. Los ciclos térmicos se realizaron de la siguiente manera: transcripción inversa a 45 °C durante 10 minutos, activación de la polimerasa a 95 °C durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 5 segundos, hibridación a 60 °C durante 30 segundos y etapa de curva de fusión a 95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 minuto y 95 °C durante 15 segundos. Los valores de CT se utilizaron para calcular los niveles de expresión de ARNm de cada gen, expresados como o cambio relativo, de forma similar a los métodos de un estudio anterior [^[35]].

RNAseq para el análisis del transcriptoma

Después de 24 horas de infección con pRVA en células HT29, se retiró el medio y se utilizó REzol™ C & T para extraer el ARN total. A partir de este, se utilizaron 1 µg de ARN para construir la biblioteca de ARNm. El ARNm poli(A) se aisló con cuentas de Oligo(dT). El ARN se fragmentó utilizando cationes divalentes a altas temperaturas. La preparación se realizó con cebadores aleatorios. A continuación, se realizó la síntesis de ADNc de primera y segunda cadena. El ADNc bicatenario purificado se reparó a continuación en ambos extremos, se añadió una cola de dA en un solo paso y se ligaron adaptadores mediante la ligación T-A. El ADN ligado a los adaptadores se seleccionó por tamaño con cuentas de limpieza de ADN. Cada muestra se amplificó mediante PCR con los cebadores P5 y P7, y se validaron los productos de PCR. Las bibliotecas con diferentes índices se multiplexaron y se secuenciaron en una plataforma Illumina Novaseq (AllBio Science, Taiwán) con un protocolo de lectura emparejada de 2 × 150, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para eliminar las secuencias técnicas, como los adaptadores, los cebadores de PCR, los fragmentos y las bases con puntuaciones de calidad inferiores a 20, los archivos FastQ se procesaron con Cutadapt versión 1.9.1 utilizando los siguientes parámetros: umbral Phred 20, tasa de error 0,1, superposición de adaptadores de 1 pb, longitud mínima 75 y proporción de N 0,1 para obtener datos de alta calidad y limpios. Inicialmente, se descargaron las secuencias del genoma de referencia y los archivos de anotación de genes de fuentes como UCSC, NCBI y ENSEMBL para cada especie. A continuación, se utilizó Hisat2 versión 2.2.1 para indexar los genomas de referencia. A continuación, se alinearon los datos limpios con el genoma de referencia mediante Hisat2. Los transcritos en formato FASTA se derivaron de las anotaciones GFF conocidas y se indexaron. Utilizando estos como referencia, HTSeq versión 0.6.1 estimó los niveles de expresión de genes y isoformas a partir de los datos de lectura emparejada limpios. El análisis de expresión diferencial se realizó con DESeq2, que modela los datos utilizando la distribución binomial negativa e incorpora priors basados en datos para la dispersión y los cambios de pliegue. Se consideraron diferencialmente expresados los genes con valores p ajustados (Padj) = 0,05. Después de ensamblar un transcriptoma a partir de múltiples muestras, Cuffcompare, que forma parte de Cufflinks versión 2.2.1, se utilizó para comparar el ensamblaje con los transcritos conocidos, lo que permite predecir nuevos transcritos. Asprofile versión 1.0 se utilizó para extraer, cuantificar y comparar los eventos de empalme alternativo a partir de los datos de RNA-seq, utilizando los archivos GTF generados por Cufflinks. La llamada de SNV se realizó con Samtools versión 0.1.19 (mpileup) y Bcftools v0.1.19. Los términos de la ontología génica (GO) para los genes enriquecidos (Padj ≤ 0,05) se identificaron utilizando GOSeq versión 1.34.1, y el DAG se visualizó utilizando topGO. Los análisis de enriquecimiento de la vía KEGG de los genes expresados diferencialmente se realizaron utilizando scripts personalizados.

El uso diferencial de exones (DEU) se analizó contando las lecturas que se asignan a cada exón y comparando las proporciones entre las condiciones, lo que refleja los cambios, como el empalme alternativo o el uso de sitios de inicio y poliadenilación alternativos. La detección de DEU utilizó el paquete Bioconductor DEXSeq versión 1.21.1. Las distancias entre muestras se visualizaron utilizando el análisis de componentes principales (PCA) después de calcular los valores de FPKM en R. Las muestras se proyectaron en un plano 2D, con PC1 y PC2 que representan la mayor parte de la varianza, y se muestran sus respectivas etiquetas de porcentaje.

Ensayo de citocinas inflamatorias

Para determinar la expresión de citocinas relacionadas con la inflamación en las células HT29 infectadas con pRVA, se recogieron los sobrenadantes de cultivo después de 3 días de infección y se analizaron para detectar las citocinas relacionadas con la inflamación utilizando el ensayo de citocinas inflamatorias humanas C2 (RayBiotech, Norcross, Georgia, EE. UU.). La membrana del ensayo de anticuerpos se colocó en una bandeja de incubación de 8 pocillos con una tapa. Se añadió 2 mL de tampón de bloqueo a cada pocillo durante 30 minutos a temperatura ambiente, luego se añadió 1 mL de sobrenadantes de medios de cultivo de células infectadas y no infectadas con pRVA y se incubó durante la noche a 4 °C.

A continuación, se aspiraron las muestras de cada pocillo y se lavaron con 2 mL de tampón de lavado 1× durante 5 minutos a temperatura ambiente, tres veces, seguido de 2 mL de tampón de lavado 2× durante 5 minutos a temperatura ambiente, dos veces más que en el primer lavado. A continuación, se colocó 1 mL de cóctel de anticuerpos biotinilados en cada pocillo y se incubó durante la noche a 4 °C, y luego se lavó como en el segundo lavado del primer protocolo de lavado.

A continuación, se añadió 2 mL de HRP-estreptavidina 1× a cada pocillo, se incubó durante la noche a 4 °C y se lavó por tercera vez. La membrana se transfirió a un papel de filtro y se eliminó el exceso de tampón, y luego se transfirió a una lámina de plástico.

El tampón de detección C y el tampón de detección D se premezclaron en una proporción de 1:1, y se aplicaron 500 µL a cada membrana, que se incubó durante 2 minutos a temperatura ambiente. La membrana se colocó entre una lámina de plástico y se utilizó con un sistema de imagen de quimioluminiscencia para la visualización y el análisis.

Análisis estadístico

El experimento se realizó por triplicado, y la visualización de datos y los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 10.1.2 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Los datos se presentaron como medias ± desviación estándar (DE) entre los grupos. La significación estadística entre el grupo de control y el grupo infectado con pRVA se analizó utilizando ANOVA de dos vías. La significación estadística se definió como un valor p < 0,0001.

Cultivo celular

Las células de adenocarcinoma de colon humano, HT29 y Caco2, las células no tumorales, HaCaT y CCD-996Sk, y los tipos de células no humanas Vero y BHK-21 se cultivaron con medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Gibco, EE. UU.) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) (Cytiva, Hyclone, EE. UU.), 100 mM de L-glutamina (Gibco, EE. UU.), 100 mM de piruvato de sodio (Gibco, EE. UU.), 10 µg/mL de penicilina-estreptomicina (Gibco, EE. UU.), MEMM NEAA (100X) (Gibco, EE. UU.) y 1 M de HEPES (Cytiva, EE. UU.), y se incubaron a 37 °C con un 5% de CO2.

Para el subcultivo, se descartaron los medios y las células se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) al 10% p/v, las células se separaron con tripsina-EDTA al 0,25% (Gibco, EE. UU.), las células separadas se recogieron añadiendo una proporción de 1:2 de DMEM con un 10% de FBS, se centrifugaron con Kubota 5100 (Kubota, Japón) durante 5 minutos a 1200 rpm, se descartó el sobrenadante, los sedimentos celulares se resuspendieron de forma homogénea con DMEM fresco con un 10% de FBS y se sembraron las células necesarias. La concentración celular se midió utilizando el contador Countess™ 3 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Singapur).

Adaptación del rotavirus A porcino en células de cáncer de colon

El rotavirus A porcino (pRVA), la cepa de Taiwán, NPUST-001, se ha aislado y cultivado con éxito en células MARC-145 [^[32]]. Las células HT29 y Caco2 se sembraron en una placa de 6 pocillos (Jet Biofil, China) al 80% de confluencia. Antes de la infección, se descartó el medio DMEM de las células y se lavaron tres veces con DMEM sin suero. Para la primera infección de adaptación de pRVA en células HT29 y Caco2, se añadió 500 µL de sobrenadante de virus pRVA del stock de MARC-145 a 2,15 × 104 TCID50 (dosis infecciosa del 50% en células tisulares) y se activó con 20 µg/mL de tripsina durante 1 hora a 37 °C. La tripsina activada con pRVA se inoculó en células HT29 o Caco2 durante 1 hora a 37 °C con un 5% de CO2 para permitir la adsorción del virus. A continuación, se retiró el medio de cultivo. Las células se lavaron tres veces con DMEM sin suero para eliminar los virus residuales del medio de cultivo y, a continuación, se incubaron en 2 mL de DMEM fresco sin suero que contenía 1,0 µg/mL de tripsina. A continuación, se permitió que la infección creciera durante seis días a 37 °C con un 5% de CO2. Después de 6 días de infección, se recogió el sobrenadante del virus y se utilizó para infectar las células de nuevo. El protocolo se realizó tres veces. Antes de la infección y en los días 3 y 6 posteriores a la infección, se recogió un sobrenadante de infección de 300 µL para RT-qPCR para probar el crecimiento y la titulación del virus. El efecto citopático (CPE) se observó durante la infección bajo un microscopio de luz CKX41SF (Olympus, Japón) y se capturaron imágenes con un sistema de cámara científica Spot 27.2-3.1 MP – 0.55X HR055-CMT (Diagnostic Instrument, EE. UU.).

La TCID50 se realizó utilizando células MARC-145 sembrando 1 × 106 células en una placa de 96 pocillos (Jet Biofil, China). 1 mL de virus se diluyó a 10-9; se añadió 100 µL del virus diluido a cada pocillo. Cada columna tenía el mismo factor de dilución, y la placa se incubó durante 1 hora. A continuación, se retiró el medio del virus, se añadió medio fresco y se registró el CPE después de 6 días de infección. Por último, se determinó la TCID50 utilizando el método de Reed-Muench.

Cuantificación del genoma del rotavirus con RT-qPCR

La propagación de la infección por pRVA se cuantificó mediante RT-qPCR, con ARN extraído de 300 µL de sobrenadante viral recogido en los días indicados. Se utilizó un reactivo listo para usar para el aislamiento de ARN, REzol™ C & T (Protech, Taiwán), para la extracción de ARN siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la extracción de ARN, se realizó RT-qPCR utilizando el kit qPCRBIO SyGreen® 1-Step Go Hi-ROX (PCR Biosystems Ltd, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante, con ligeras modificaciones. Cada reacción contenía 5 µL de 2 × qPCRBIO SyGreen® 1-Step Mix, 0,4 µL de cada cebador directo (VP-6; 5'-GCCCGCAATTTCGATTCAATACG-3') y cebador inverso (VP-6; 5'-GTGCTGCTACTCCAGGTGTCAT3') [^[33]], 0,5 µL de 20 × RTase GO, 1,7 µL de agua UltraPure DEPC (Protech, Taiwán) y 2 µL de ARN en un volumen total de reacción de 10 µL. El ciclo de reacción térmica fue el siguiente: 45 °C durante 10 min para la transcripción inversa, 95 °C durante 2 min para la activación de la polimerasa y 40 ciclos de 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 30 s para la desnaturalización y el hibridamiento/extensión. La RT-qPCR se realizó en un termociclador de PCR en tiempo real Step One™ (Applied Biosystems, Singapur).

Los valores de CT se convirtieron a copias genómicas (GC) de pRVA log10/L utilizando la ecuación de regresión lineal de la curva estándar generada a partir de diluciones seriadas de 10 pliegues (de 10^10 a 10^4) de cDNA de pRVA, cuantificado en un NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). El ARN del rotavirus aviar se convirtió en cDNA mediante el kit de síntesis de cDNA RScript (Bio-helix, Taiwán) siguiendo el protocolo del fabricante.

Viabilidad celular

Para determinar la viabilidad celular de las células HT29 y Caco2 después de la infección por pRVA a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 y 1, la suspensión celular se mezcló con una solución de azul de trypan al 0,4 % (Gibco, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) en una proporción de 1:1 (vol/vol), y se utilizaron 10 µL para contar las células viables con Countess™ 3 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Singapur). La viabilidad celular se evaluó a los 3 y 6 días posteriores a la infección para las células HT29 y Caco2, respectivamente, en función de las diferencias en la cinética de la infección y los efectos citopáticos.

Tinción con cristal violeta

Las células HT29 y Caco2 infectadas con pRVA con una MOI de 0,1 y 1 se tiñeron después de la infección. Primero, se descartó el medio de infección, luego se añadió un 4 % de formaldehído durante 5 min, se descartó y, a continuación, se añadió un 4 % de cristal violeta (Merk, Sigma-Aldrich, EE. UU.). La tinción con cristal violeta se evaluó a los 3 y 6 días posteriores a la infección para las células HT29 y Caco2, respectivamente, en función de las diferencias en la cinética de la infección y los efectos citopáticos.

Microscopía electrónica de transmisión

Se utilizó un microscopio electrónico de transmisión Hitachi H-7500 (Hitachi, Tokio, Japón) para obtener imágenes del virus, siguiendo un método similar al descrito en un estudio anterior [^[34]]. Los sobrenadantes de infección de HT29 y Caco2 se centrifugaron (Centrisart A-14C, Sartorius Lab Instruments, Alemania) a 3500 × g durante 5 min y se pasaron a través de una membrana de filtro Millex®-GV de 0,22 µm (Merck Millipore, Irlanda). A continuación, el sobrenadante viral se concentró mediante glicol de polietileno 6000 (Alfa Aesar, Alemania) al 10 % p/v, y se añadieron 1,45 g de NaCl (Showa Chemical, Japón) por cada 20 mL de solución viral, se incubó durante la noche con agitación a 4 °C. Las soluciones virales se centrifugaron a 10 000 × g durante 30 min y se descartó el sobrenadante. Los sedimentos se disolvieron en PBS 1X. A continuación, se dejó reposar en una rejilla de cobre con formvar/carbono de 200 mallas (Ted Pella, Redding, EE. UU.) durante 30 s, seguida de una solución acuosa de acetato de uranilo al 2 % (Spi-Chem, EE. UU.) durante 45 s para el recubrimiento.

RT-qPCR para la expresión de ARNm de genes relacionados con el interferón, puntos de control inmunitarios y receptores tipo Toll

Se midió la expresión de ARNm de los genes relacionados con el interferón MX1, STAT1, NF-κB, IRF7 e IRF9; los genes de los puntos de control inmunitarios PD1, PDL1 y CTLA4; y los genes de los receptores tipo Toll (TLR) TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8 y TLR9 mediante RT-qPCR en puntos de tiempo específicos, utilizando GAPDH como control interno. Las células HT29 infectadas con pRVA se utilizaron en este estudio. El ARN total se extrajo con REzol™ C & T. Se realizó RT-qPCR utilizando el sistema de termociclado en tiempo real StepOnePlus™ (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Singapur) con el kit qPCRBIO SyGreen® 1-Step Go Hi-ROX (PCR Biosystems Ltd, Reino Unido) siguiendo las instrucciones del fabricante, con ligeras modificaciones. Cada reacción contiene 5 µL de 2 × qPCR BIO SyGreen 1-Step Mix, 0,4 µL de cada cebador directo e inverso a una concentración final de 400 nM, 0,5 µL de 20 × RTase Go, 1,7 µL de agua tratada con DEPC y 2 µL de ARN. Los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1. Los ciclos térmicos se realizaron de la siguiente manera: transcripción inversa a 45 °C durante 10 min, activación de la polimerasa a 95 °C durante 2 min, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 5 s, hibridación a 60 °C durante 30 s y etapa de curva de fusión de 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 1 min y 95 °C durante 15 s. Los valores de CT se utilizaron para calcular los niveles de expresión de ARNm de cada gen, expresados como o cambio de pliegue, de forma similar a los métodos de un estudio anterior [^[35]].

RNAseq para el análisis del transcriptoma

Después de 24 h de infección por pRVA en células HT29, se retiró el medio y se utilizó REzol™ C & T para extraer el ARN total. A partir de este, se utilizaron 1 µg de ARN para construir la biblioteca de ARNm. El ARNm poli(A) se aisló con cuentas de Oligo(dT). El ARN se fragmentó utilizando cationes divalentes a altas temperaturas. La preparación se realizó con cebadores aleatorios. A continuación, se realizó la síntesis de cDNA de primera y segunda cadena. El cDNA bicatenario purificado se reparó en ambos extremos, se añadió una cola de dA en un solo paso y se ligaron adaptadores mediante la ligación T-A. El ADN ligado a los adaptadores se seleccionó por tamaño con cuentas de limpieza de ADN. Cada muestra se amplificó mediante PCR con los cebadores P5 y P7, y se validaron los productos de PCR. Las bibliotecas con diferentes índices se multiplexaron y se secuenciaron en una plataforma Illumina Novaseq (AllBio Science, Taiwán) con un protocolo de lectura emparejada de 2 × 150, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para eliminar las secuencias técnicas, como los adaptadores, los cebadores de PCR, los fragmentos y las bases con puntuaciones de calidad inferiores a 20, los archivos FastQ se procesaron con Cutadapt versión 1.9.1 utilizando los siguientes parámetros: corte de Phred 20, tasa de error 0,1, superposición de adaptadores de 1 pb, longitud mínima 75 y proporción de N 0,1 para obtener datos limpios y de alta calidad. Inicialmente, se descargaron las secuencias del genoma de referencia y los archivos de anotación de genes de fuentes como UCSC, NCBI y ENSEMBL para cada especie. A continuación, se utilizó Hisat2 versión 2.2.1 para indexar los genomas de referencia. A continuación, se alinearon los datos limpios con el genoma de referencia mediante Hisat2. Los transcritos en formato FASTA se derivaron de las anotaciones GFF conocidas y se indexaron. Utilizando estos como referencia, HTSeq versión 0.6.1 estimó los niveles de expresión de genes y isoformas a partir de los datos de lectura emparejada. El análisis de expresión diferencial se realizó con DESeq2, que modela los datos utilizando la distribución binomial negativa e incorpora priors basados en datos para la dispersión y los cambios de pliegue. Se consideraron diferencialmente expresados los genes con valores p ajustados (Padj) = 0,05. Después de ensamblar un transcriptoma a partir de múltiples muestras, Cuffcompare, que forma parte de Cufflinks versión 2.2.1, se utilizó para comparar el ensamblaje con los transcritos conocidos, lo que permite predecir nuevos transcritos. Asprofile versión 1.0 se utilizó para extraer, cuantificar y comparar los eventos de empalme alternativo a partir de los datos de RNA-seq, utilizando los archivos GTF generados por Cufflinks. La llamada de SNV se realizó con Samtools versión 0.1.19 (mpileup) y Bcftools v0.1.19. Los términos de la ontología génica (GO) para los genes enriquecidos (Padj ≤ 0,05) se identificaron utilizando GOSeq versión 1.34.1, y el DAG se visualizó utilizando topGO. Los análisis de enriquecimiento de la vía KEGG de los genes expresados diferencialmente se realizaron utilizando scripts personalizados.

El uso diferencial de exones (DEU) se analizó contando las lecturas que se asignan a cada exón y comparando las proporciones entre las condiciones, lo que refleja los cambios, como el empalme alternativo o el uso de sitios de inicio y poliadenilación alternativos. La detección de DEU utilizó el paquete Bioconductor DEXSeq versión 1.21.1. Las distancias entre muestras se visualizaron utilizando el análisis de componentes principales (PCA) después de calcular los valores de FPKM en R. Las muestras se proyectaron en un plano 2D, con PC1 y PC2 que representan la mayor parte de la varianza, y se muestran sus respectivas etiquetas de porcentaje.

Ensayo de citocinas inflamatorias

Para determinar la expresión de citocinas relacionadas con la inflamación en las células HT29 infectadas con pRVA, se recogieron los sobrenadantes de cultivo después de 3 días de infección y se analizaron las citocinas relacionadas con la inflamación utilizando el Human Inflammation Array C2 (RayBiotech, Norcross, Georgia, EE. UU.). La membrana del ensayo de anticuerpos se colocó en una bandeja de incubación de 8 pocillos con una tapa. Se añadió 2 mL de tampón de bloqueo a cada pocillo durante 30 min a temperatura ambiente, luego se añadió 1 mL de sobrenadantes de medios de cultivo de células infectadas y no infectadas con pRVA y se incubó durante la noche a 4 °C.

A continuación, se aspiraron las muestras de cada pocillo y se lavaron con 2 mL de tampón de lavado 1 × durante 5 min a temperatura ambiente, tres veces, seguido de 2 mL de tampón de lavado 2 × durante 5 min a temperatura ambiente, dos veces más que en el primer lavado. A continuación, se colocó 1 mL de un cóctel de anticuerpos biotinilados en cada pocillo y se incubó durante la noche a 4 °C, y luego se lavó como en el segundo lavado del primer protocolo de lavado.

A continuación, se añadió 2 mL de 1 × HRP-Streptavidina a cada pocillo, se incubó durante la noche a 4 °C y se lavó por tercera vez. La membrana se transfirió a un papel de filtro y se eliminó el exceso de tampón, y luego se transfirió a una lámina de plástico.

El tampón de detección C y el tampón de detección D se premezclaron en una proporción de 1:1, y se aplicaron 500 µL a cada membrana, que se incubó durante 2 min a temperatura ambiente. La membrana se colocó entre una lámina de plástico y se utilizó con un sistema de imagen de quimioluminiscencia para la visualización y el análisis.

Análisis estadístico

El experimento se realizó por triplicado, y la visualización de datos y los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 10.1.2 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Los datos se presentaron como medias ± desviación estándar (DE) entre los grupos. La significación estadística entre el grupo de control y el grupo infectado con pRVA se analizó utilizando ANOVA de dos vías. La significación estadística se definió como un valor p < 0,0001.

Resultados

El aislado de rotavirus aviar (pRVA) NPUST-001 se aisló previamente en células MARC-145 y se pudo propagar o cultivar continuamente, como se muestra en la Fig. 1A. Después del primer aislamiento de la infección a partir de muestras hepáticas positivas para pRVA, la carga viral comienza a aumentar en MARC-145. Después del 3.º al 8.º pasaje, el virus mostró un crecimiento estable, con el pico a los 3 días posteriores a la infección. En la Fig. 1B, la curva estándar de RT-qPCR con cebadores VP6-pRVA, que convierte los valores de CT en copias genómicas (GC) de pRVA log10/L, tiene la ecuación y = -3,904x + 45,1164, con un coeficiente de determinación (R2) de 0,9985.

El sobrenadante de infección por pRVA de MARC-145 a los 3 días posteriores a la infección se utilizó para adaptar la infección a las líneas celulares de cáncer colorrectal (HT29 y Caco2), las líneas celulares no cancerosas HaCaT y CCD-996Sk, y los tipos de células BHK-21 y Vero. Para nuestra sorpresa, pRVA infectó con éxito las células de cáncer colorrectal (HT29 y Caco2) pero no infectó las células no cancerosas (HaCaT, CCD-966Sk, BHK-21 y Vero). HT29 y Caco2 mostraron una mayor carga de GC/L de pRVA después de 6 días de infección que MARC-145 (véase la Fig. 2). Además, se observaron efectos citopáticos, como la apoptosis, en las células HT29 y Caco2. Tanto las infecciones de HT29 como de Caco2 mostraron una mayor carga viral en el día 6 que MARC-145, que se utilizó inicialmente para aislar y cultivar el virus.

Tras la exitosa infección con pRVA de las células HT29 y Caco2, se confirmó que estas líneas celulares eran susceptibles al virus mediante el cultivo continuo del virus a partir del pasaje anterior. Esto se demuestra mediante el aumento continuo de la titulación del virus después de múltiples pasajes de propagación, como se ilustra en la Fig. 3. Las células HT29 (2,7 × 108 GC/L) muestran una mayor susceptibilidad a pRVA que las células Caco2 (1,2 × 108 GC/L) después de 6 días de infección en el tercer pasaje. Las células HT29 mostraron un aumento en la titulación del virus después de 3 días en el segundo pasaje, mayor que las células Caco2. El pRVA favorece la infección y la replicación en las células HT29 en comparación con las células Caco2.

La oncolisis por pRVA se exploró más a fondo en las células HT29 y Caco2. Para HT29, se investigó más a fondo la eficacia de pRVA desde el día 1 hasta el día 3 después de la infección (dpi), ya que se observó un efecto citopático (CPE) después de 24 horas de la infección. El aumento en la MOI, de 0,1 a 1, mejoró significativamente la eficacia de la infección en HT29, como se muestra en la Fig. 4A. En la Fig. 4B, la viabilidad celular se redujo en un 13,98% con una MOI de 0,1, mientras que la viabilidad celular se redujo en un 57,74% con una MOI de 1 después de 3 días de infección. De manera similar, la tinción con cristal violet mostró el efecto tóxico de pRVA en las células HT29, más evidente con una MOI de 1. El pRVA fue altamente susceptible en las células HT29, con menos del 50% de muerte celular observada después del día 3.

En el caso de Caco2, la eficiencia de eliminación de pRVA fue un poco más lenta, ya que el CPE se pudo observar después del día 3 después de la infección. Sin embargo, la titulación del virus aumentó continuamente (ver Fig. 5A), y una MOI más alta condujo a una mayor eficacia de la infección, de manera similar a lo observado con HT29. La Fig. 5B mostró que la viabilidad celular también se redujo después de la infección con pRVA. Se observó una reducción del 27,17% en la viabilidad celular después del día 6 después de la infección para una MOI de 0,1, y una reducción del 47,83% para una MOI de 1. La tinción con cristal violet mostró una extensa formación de placas con MOI de 0,1 y 1. Sin embargo, las células viables aún eran visibles después de la tinción. Aunque Caco2 exhibe una citotoxicidad ligeramente más lenta en comparación con HT29 después de la infección con pRVA, el virus aún pudo exhibir CPE y reducir la muerte celular al 50% después de 6 días.

La Fig. 6 muestra el efecto citopático de pRVA contra las células de cáncer colorrectal, HT29 y Caco2. En la Fig. 6A, las células HT29 sin infección con pRVA exhiben células viables con morfología normal, mientras que en la Fig. 6B, las células HT29 infectadas con pRVA exhiben un fuerte efecto citopático con menos células adherentes. Coherente con la propagación viral, se observó que las células estaban en lisis, redondeadas, refractivas y desprendidas. Además, la Fig. 6D mostró células Caco2 sanas con características epiteliales típicas y una estructura de monocapa intacta, mientras que en la Fig. 6E, se observó una interrupción parcial de la monocapa, redondeamiento celular y aumento de la granularidad. Estos resultados mostraron que tanto HT29 como Caco2 exhibieron CPE y susceptibilidad a pRVA, con HT29 mostrando una mayor susceptibilidad según las observaciones de CPE, y Caco2 mostrando una respuesta menos permisiva. El daño celular es más pronunciado en las células HT29 que en las células Caco2. También se observó una imagen de microscopía electrónica de transmisión del rotavirus A de la paloma del sobrenadante de la infección de las células HT29 y Caco2 (ver Fig. 6C y F).

En la Fig. 7, se muestran los niveles de expresión relativa de ARNm dependientes del tiempo de los genes relacionados con el interferón involucrados en la activación de las vías de señalización inmune innata en las células HT29 infectadas con pRVA. Se observó que el gen estimulado por el interferón MX1 se sobreexpresaba, alcanzando su punto máximo a las 9 horas posteriores a la infección (hpi) y permaneciendo elevado a las 24 hpi, lo que indica la activación del interferón de tipo I. Además, las expresiones de STAT1, IRF7 e IRF9 aumentaron significativamente a las nueve hpi, lo que sugiere la participación temprana de la señalización del interferón. IRF7 mostró una respuesta más temprana y una mayor expresión en las células infectadas con pRVA desde las 3 hpi hasta las 24 hpi, con diferencias significativas observadas solo a las 6, 9 y 12 hpi. De manera similar, IRF9 fue mayor en las células infectadas con pRVA, alcanzando su punto máximo significativamente a las 9 y 24 hpi. En contraste, la expresión de NFKB1 se suprimió a las nueve hpi, seguida de una sobreexpresión significativa a las 24 hpi en las células infectadas con pRVA. Esto indica una posible modulación de las respuestas inflamatorias mediadas por NF-B. En conjunto, los niveles de expresión de ARNm de los genes relacionados con el interferón en la infección por pRVA provocan una respuesta inmune innata coordinada facilitada por una fuerte activación de la vía del interferón y una señalización inflamatoria retrasada en las células HT29.

Se muestra en la Fig. 8 la expresión dependiente del tiempo de los genes de control de puntos de control inmunitarios (PD1, PDL1 y CTL4) tras la infección con pRVA. La expresión de PD1 se elevó significativamente a las 24 hpi, mientras que PDL1 se sobreexpresó constantemente de manera significativa a las 9, 12 y 24 hpi, alcanzando su punto máximo a las 12 hpi. En particular, CTL4 se expresó en gran medida mucho más tarde, después de las 24 hpi. PDL1 muestra una expresión significativa más temprana que PD1 y CTL4. Estos hallazgos sugieren que la infección por pRVA podría modular las vías de los puntos de control inmunitarios, lo que podría contribuir a la evasión inmune y a la infección viral sostenida.

La expresión de RT-PCR cuantitativa reveló que la infección por rotavirus A de la paloma modulaba selectivamente la expresión del receptor tipo Toll (TLR) en las células HT29, junto con PDL1, como se observó en la Fig. 9. Los receptores de ARN viral, incluidos TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9, se sobreexpresaron significativamente a los 1 días posteriores a la infección (dpi). En particular, solo TLR3 se expresó a un nivel más alto a los tres dpi, mientras que TLR7 se redujo en este momento. Si bien la expresión de TLR4 permaneció sin cambios, TLR5 se sobreexpresó en el momento posterior, tres dpi. En particular, la expresión de PDL1 aumentó significativamente en los días 1 y 3 posteriores a la infección, lo que es consistente con la activación dependiente de TLR de la vía de señalización del interferón. Estos hallazgos indican que la infección por pRVA puede inducir una detección inmune innata dirigida al tiempo que promueve la regulación de los puntos de control inmunitarios.

El análisis del transcriptoma de RNA-seq reveló 114 genes que se expresaron diferencialmente de manera significativa después de la infección por pRVA (ver Fig. 10A y B). Tras la infección por pRVA, la mayoría de los genes se sobreexpresaron considerablemente (112), mientras que unos pocos se subexpresaron (2). Basado en la función molecular en los términos GO, la actividad de las citocinas muestra el mayor número de genes expresados diferencialmente (DEG). La infección por pRVA en HT29 se apoyó aún más mediante el enriquecimiento de la unión de ARN de doble cadena y las actividades de la helicasa de ARN entre los DEG. Entre los componentes celulares en los términos GO, el citoplasma y el citosol se enriquecieron, posiblemente involucrados en la producción y replicación de proteínas virales, mientras que la región extracelular puede estar involucrada en la infección viral. El proceso biológico del término GO enriquecido mecanismo de defensa viral y estimulación de la respuesta inmune basada en el interferón (ver Fig. 10C y D). En las vías KEGG (Fig. 10E), la apoptosis se enriqueció entre los DEG, junto con la activación de las vías de señalización de citocinas y TLR. Entre las vías relacionadas con la inmunidad y la inflamación, varias cascadas de señalización estuvieron notablemente representadas, incluidas la señalización IL-17, la señalización del receptor tipo Toll (TLR), la señalización del receptor tipo NOD, la señalización del receptor tipo RIG-I, la señalización TNF, la señalización JAK-STAT y las interacciones citocina-receptor de citocinas. Estas vías son fundamentales tanto para las respuestas inmunes innatas como adaptativas, lo que destaca el importante papel de la activación inmune en el contexto biológico de este conjunto de datos. Además, se enriquecieron significativamente múltiples vías asociadas con la infección viral, incluidas las relacionadas con el virus de Epstein-Barr, la influenza A, la hepatitis B/C, el sarampión y el virus de la leucemia de células T humanas 1. Esto indica que los genes expresados diferencialmente (DEG) identificados están más estrechamente asociados con los mecanismos de defensa antiviral del huésped que con la infección viral directa. En particular, las vías como la señalización del receptor tipo RIG-I, la señalización IL-17, la señalización TLR, la señalización TNF, la señalización JAK-STAT y la vía de detección de ADN citosólico mostraron factores de enriquecimiento altos y valores Q bajos, lo que indica un enriquecimiento robusto y estadísticamente significativo (ver Fig. 10F). Estas vías son bien conocidas por sus funciones en el reconocimiento de patógenos, la producción de citocinas y la transducción de señales inflamatorias.

La expresión de los receptores de reconocimiento de patrones se alteró notablemente tras la infección por pRVA. Los sensores de ARN viral, en particular RIG-I y MDA5, mostraron una fuerte sobreexpresión en comparación con el control negativo, mientras que la mayoría de los receptores tipo Toll (TLR) exhibieron una inducción mínima o nula. Esto sugiere una activación preferencial de las vías de detección de ARN viral citosólicas (ver Fig. 11A). Varios ISG, incluidos PDL1, MX1, IFI6, CXCL10, GM-CSF y TNF-α, se sobreexpresaron en las muestras infectadas, lo que indica una activación descendente robusta de la respuesta del interferón (ver Fig. 11B). Los principales factores de transcripción del complejo ISGF3, STAT1, STAT2, IRF9 e IRF1, mostraron una mayor expresión tras la infección, lo que apoya una mayor actividad de transcripción mediada por el interferón (ver Fig. 11C). Entre los interferones, IFN-α e IFN-λ se indujeron fuertemente tras la infección por pRVA, mientras que IFN-β e IFN-γ mostraron pocos o ningún cambio, lo que indica una respuesta dominante del interferón de tipo I y tipo III (ver Fig. 11D). La expresión de IRF3 e IRF7 se elevó en las células infectadas, mientras que NF-κB1 no mostró diferencias notables, lo que sugiere que la señalización antiviral se media principalmente a través de las vías dependientes de IRF (ver Fig. 11E). En la Fig. 11F, se sobreexpresaron varios genes asociados con IL-17, incluidos MMP13, FOSB, FOS, CXCL10, CXCL8, JUN, FOSL1 y CSF2, lo que indica la activación de las cascadas de señalización proinflamatorias. Los genes asociados con la regulación de los puntos de control inmunitarios, incluidos FOS, CD274 (PDL1) y JUN, aumentaron tras la infección, lo que sugiere la modulación de las vías inhibitorias inmunitarias, como se muestra en la Fig. 11G. Entre los genes regulados por PDL1, IFN-α y TNF-α mostraron inducción, mientras que IFN-β y EGF permanecieron sin cambios, lo que indica una regulación descendente selectiva (Fig. 11H). Finalmente, en la Fig. 11I-K, se sobreexpresaron varios genes relacionados con la apoptosis, incluidos PMAIP1, FOS, GADD45B, SEPTIN4, JUN, MAP3K14 y TNF-α, lo que sugiere la activación de las vías de muerte celular programada. La expresión de los genes asociados con la necroptosis, ZBP1 e IFN-λ, aumentó notablemente, lo que indica la participación de los mecanismos de muerte celular necrótica regulada. Los genes asociados con la senescencia celular, incluidos GADD45B y CXCL8, se elevaron tras la infección, lo que sugiere la inducción de vías de detención del crecimiento asociadas con el estrés.

La expresión de citocinas inflamatorias tras la infección por pRVA en las células HT29 después de 3 días se muestra en la Fig. 12. En las células infectadas, las citocinas inflamatorias como MIG y PDGF-BB se expresaron a niveles significativamente más altos que en las células no infectadas, con aumentos de 2294 y 3075 veces, respectivamente. ICAM también mostró un aumento de 1300 veces en la expresión después de la infección por pRVA. En contraste, el resto de las citocinas y quimiocinas inflamatorias redujeron su expresión en las células pRVA infectadas, como IL-6sR (7349 veces), IL-15 (388 veces), IL-16 (9 veces), IL-17 (298 veces), IP-10 (3843 veces), MCP-1 (1890 veces), MCP-2 (204 veces), M-CSF (866 veces), MIP-1a (72 veces), MIP-1b (782 veces), MIP-1γ (18 658 veces), RANTES (2565 veces), TGF-β1 (539 veces), TNF-α (491 veces), TNF-β (413 veces), sTNF-RI (1953 veces) y sTNF-RII (1551 veces). La reducción más significativa en la expresión se observó en IL-6sR, IP-10, MIP-1γ y RANTES. La inhibición de las citocinas inflamatorias demuestra que el mecanismo de infección por pRVA inhibe la respuesta inflamatoria innata, lo que es favorable para la evasión inmune. Las variadas respuestas de las citocinas y quimiocinas inflamatorias inducidas por pRVA sugieren un potencial inmunostimulante u oncolítico a través de la activación selectiva de citocinas.

Discusión

Anteriormente, informamos sobre el primer caso de rotavirus A de paloma (pRVA) en Taiwán [^[32]]. Esta detección en tejidos hepáticos condujo al aislamiento exitoso del virus utilizando células MARC-145. Hemos aislado y propagado el virus de forma continua. Junto con el aislamiento de la infección, se probaron varias células para evaluar su susceptibilidad al pRVA. Sin embargo, las células HaCaT, CCD-966Sk, BHK-21 y Vero no son susceptibles al virus. Curiosamente, las líneas celulares HT29 y Caco2, de cáncer colorrectal (CRC) humano, son altamente susceptibles al pRVA, lo que provoca un aumento continuo de la carga viral. En contraste con las dos células de CRC, HT29 tiene una tasa de infectividad más alta que Caco2. Esto puede deberse a la diferenciación intestinal en las células Caco2 [^[8]]. Los resultados mostraron que el pRVA tiene una mayor infectividad específica en las líneas celulares de CRC que en las células no cancerosas. Después de la primera infección, el sobrenadante viral se utilizó para infectar las células en el tercer pasaje, y el pRVA se mantuvo, lo que resultó en una mayor carga viral que la cultivada con MARC-145. Después de la adaptación exitosa del pRVA en las células Caco2 y HT29, se probó la infectividad del virus a diferentes multiplicidades de infección (MOI). A una MOI de 0,1, la enfermedad aún podía ser inducida, mientras que a una relación de 1:1 de virus a célula, se mostró una infectividad suficiente. Tanto las células como el pRVA indujeron un efecto citopático y apoptosis. Confirmamos además la presencia de pRVA mediante imágenes de TEM del sobrenadante de la infección.

En las células Caco2, la infección con rotavirus del macaco Rhesus (RRV) ha provocado un aumento de la liberación de vesículas extracelulares, lo que ha resultado en la expresión de cuerpos apoptóticos relacionados con la histona H3 y exosomas que modulan la respuesta inmune [^[9]]. Un estudio similar que utilizó la infección de Caco2 con RRV mostró que el rotavirus inducía apoptosis, como lo demuestra la fragmentación del ADN, debido a la disfunción mitocondrial y la liberación de citocromo C [^[8]]. En las células Caco2 infectadas con una cepa de rotavirus símio SA114F, la expresión de quimiocinas no es diferente a la de las células no infectadas. En contraste, en las células HT29, la expresión de IL-8, GRO- y RANTES aumenta tras la activación con TNF-α e IL-1α, a una MOI más alta y en presencia de dpi [^[11]]. El pronunciado efecto citopático de los rotavirus en las células cancerosas ha sido un indicador evidente de su potencial como viroterapia oncolítica. En los últimos años, varios rotavirus de origen bovino, porcino, símio y humano han mostrado una fuerte adaptación en las líneas celulares cancerosas, lo que indica una ganancia de función y un aumento de la infectividad en comparación con sus rotavirus parentales [^[10],^[24],^[29],^[30],^[37]]. Sin embargo, la inactivación del rotavirus puede provocar la pérdida de su capacidad para inducir la apoptosis [^[8],^[11]], mientras que el estrés oxidativo promueve la oncolisis [^[37]]. Al igual que otros rotavirus de mamíferos, nuestro rotavirus de paloma de origen aviar infectó con éxito las células de CRC.

La señalización inmune innata desempeña un papel crucial en los virus oncolíticos, ya que facilita la defensa antiviral y las cascadas de evasión inmune para mantener la infección viral. En este estudio, demostramos que la infección por rotavirus A de paloma induce una respuesta inmune innata coordinada pero temporalmente regulada en las células de cáncer colorrectal, a través de la activación de las vías asociadas con el interferón (IFN) y la modulación retardada de la señalización de NF-κB. Tras la infección por pRVA, el gen estimulado por el interferón MX1, que se induce rápidamente a las 9 y 24 horas posteriores a la infección (hpi), indicó una activación eficaz del interferón en las células infectadas. Esto se corroboró aún más con STAT1, un mediador de la transducción de la señal de IFN, lo que sugiere un compromiso temprano de la señalización canónica de IFN tras la infección por pRVA. En paralelo, los factores reguladores del interferón, IRF7 e IRF9, esenciales para la amplificación y el mantenimiento del tipo I de IFN, forman una regulación coordinada en las células infectadas por pRVA. La regulación coordinada de IRF7 e IRF9, junto con la inducción de MX1, indica una activación sostenida de los programas antivirales mediados por el interferón durante la infección por pRVA. En contraste, NFKB1 se suprimió en los primeros puntos temporales, seguido de una regulación significativa en los puntos temporales posteriores de la infección. Esto demuestra que la modulación de la vía de NF-κB exhibió un patrón retardado y bifásico, reduciendo la respuesta proinflamatoria para permitir la presencia y replicación del virus dentro de las células cancerosas [^[5]]. La activación retardada de NF-κB en los puntos temporales posteriores puede ser el resultado de la acumulación de estrés celular o la señalización inmune secundaria, lo que es consistente con las observaciones en otros virus oncolíticos y tumores selectivos [^[26]].

La inducción de puntos de control inmunitarios, como PD1, PDL1 y CTLA-4, tras la infección por pRVA permite que las células infectadas eviten el reconocimiento inmunitario. Tanto PD1 como PDL1 se regularon significativamente después de 12 a 24 hpi, mientras que CTLA-4 no se observó hasta las 24 hpi. La expresión de PDL1 aumentó significativamente en los puntos temporales medios de la infección, lo que es consistente con la señalización impulsada por el interferón observada en este estudio, ya que PDL1 es un gen estimulado por el interferón conocido. La inducción retardada de CTL-4 durante las etapas posteriores de la infección puede indicar una respuesta retardada del punto de control inmunitario, lo que contribuye a la evasión inmune y a la infección viral sostenida dentro de las células tumorales. Varios virus oncolíticos han demostrado un mecanismo de infección similar al de pRVA, equilibrando la respuesta inmune antiviral y suprimiendo los puntos de control inmunitarios [^[10]]. Estos hallazgos sugieren que la infección por pRVA promueve un entorno tumoral inmunomodulador, convirtiendo un tumor "frío" en uno "caliente" [^[13]], con posibles implicaciones para combinar las estrategias oncolíticas basadas en pRVA con la inhibición de los puntos de control inmunitarios [^[10],^[13]].

Las vías de detección inmune innata se activaron en HT29 tras la infección por pRVA al regular al alza significativamente los receptores tipo Toll que reconocen el ARN viral, incluidos TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9. En contraste, los receptores que participan principalmente en el reconocimiento bacteriano (TLR4 y TLR5) no cambiaron o se regularon a la baja. Esto sugiere que el reconocimiento del ARN viral fue el objetivo de la célula infectada en lugar de la activación generalizada de la inflamación. Cabe destacar que PDL1 se indujo significativamente después de la infección por pRVA, lo que es consistente con la señalización dependiente de TLR del interferón. Esta activación coordinada de la señalización de IFN para la detección antiviral, junto con los puntos de control inmunitarios, sugiere que nuestro rotavirus puede facilitar una respuesta inmune innata controlada. Este mecanismo promueve la evasión inmune para apoyar la replicación viral dentro de las células tumorales, lo que refuerza su potencial relevancia como agente oncolítico [^[5],[^[13]], [^[14]], [^[15]],^[27]].

El perfil transcriptómico de este estudio muestra que la infección por pRVA desencadena respuestas inmunes innatas, inflamación y vías implicadas en el destino celular. El análisis KEGG reveló que los genes expresados diferencialmente (DEG) estaban principalmente relacionados con la señalización del receptor de reconocimiento de patrones, las interacciones citocina-receptor de citocinas, la señalización de IL-17 y las vías del interferón, lo que destaca una fuerte respuesta inmune antiviral [^[21]]. Los datos a nivel de gen indicaron una regulación significativa al alza de los sensores de ARN viral citosólicos, como RIG-I y MDA5, con una menor participación de los receptores tipo Toll, lo que sugiere que la detección del ARN viral intracelular es el mecanismo de detección primario [^[5]]. Esta activación condujo a un aumento de la producción de interferones de tipo I y III, especialmente IFN-λ1 e IFN-λ1, y a una regulación marcada al alza de los genes estimulados por el interferón, lo que demuestra una señalización descendente eficaz a través del eje IRF3/7-ISGF3 [^[5],[^[19]], [^[20]], [^[21]], [^[22]]]. El análisis de la vía KEGG mostró que la mayoría de los DEG participaron en cascadas de señalización inmune e inflamatoria, incluido IL-17, el receptor tipo Toll, el receptor tipo NOD, el receptor tipo RIG-I, TNF y las vías JAK-STAT. Estos son fundamentales para la detección inmune innata y la respuesta de las citocinas, lo que indica una fuerte activación de las defensas inmunes del huésped en condiciones experimentales [^[5]]. Además, la presencia de múltiples vías relacionadas con la infección viral sugiere un programa de respuesta antiviral compartido. El análisis del diagrama de burbujas confirmó la solidez de estos hallazgos al mostrar altas proporciones de enriquecimiento y bajos valores Q para las vías inmunes clave, lo que subraya su importancia estadística. En general, estos cambios transcripcionales están estrechamente relacionados con la activación inmune, el control de la inflamación y las defensas antivirales, lo que proporciona una comprensión mecanicista de las respuestas biológicas observadas.

El análisis del transcriptoma utilizando fragmentos por kilobase millón (FPKM) revela una sólida respuesta antiviral innata caracterizada por la activación de los receptores de reconocimiento de patrones citosólicos, la señalización del interferón y las vías inflamatorias asociadas. La regulación al alza de RIG-I y MDA5, junto con los receptores tipo Toll intracelulares (TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9), indica que el reconocimiento del rotavirus se produce predominantemente a través de los mecanismos de detección del ARN intracelular. Esta respuesta se ve reforzada por el aumento de los niveles de interferones de tipo I y tipo III, en particular IFN-λ1 e IFN-λ1, que sirven como mediadores críticos de la defensa antiviral [^[38],^[39]]. En línea con la producción de interferones, se observa un aumento notable en la expresión de los genes estimulados por el interferón (ISG) y los componentes del complejo de transcripción ISGF3 (STAT1, STAT2, IRF9), lo que sugiere una amplificación de la señal adecuada a través de la vía IRF3/7-JAK-STAT [[^[38]], [^[39]], [^[40]], [^[41]]]. Al mismo tiempo, la activación de la vía de señalización de IL-17 y el aumento de la expresión de los mediadores inflamatorios, incluidos CXCL8, CXCL10, JUN y FOS, indican un entorno proinflamatorio mejorado tras la infección. Además, la regulación al alza de PD-L1 (CD274) y los genes relacionados con los puntos de control sugiere una posible modulación de las vías de regulación inmune en respuesta a la infección viral [^[13],^[42]]. Además, la activación simultánea de los genes asociados con la apoptosis, la necroptosis y la senescencia celular indica que las células infectadas participan en múltiples decisiones de destino inducidas por el estrés, lo que puede contribuir tanto a la restricción viral como a la patología tisular [^[8],^[9],^[23],^[43]].

Varios estudios han informado sobre la adaptación de los rotavirus en líneas celulares tumorales [^[10], ^[24], ^[29], ^[30]]. Debido a su capacidad de infección en células de cáncer colorrectal (HT29 y Caco2) y sus efectos citopáticos apoptóticos, demuestra un fuerte potencial oncolítico. El rotavirus A de paloma emplea múltiples mecanismos que causan efectos perjudiciales en las células de cáncer colorrectal. La estrategia de evasión inmune del rotavirus se centra en inhibir la producción de citocinas y quimiocinas inflamatorias. Las citocinas y quimiocinas inflamatorias, tras 3 días de infección en HT29, mostraron que IL-6sR, IP-10, MIP-1 y RANTES se inhibieron. La supresión del receptor soluble de IL-6 (IL-6sR) puede suprimir la eficacia del daño tumoral inducido por el bloqueo de los puntos de control inmunitario [^[44]]. La alteración de la trans-señalización de IL-6 debido a la reducción de IL-6sR permite la supervivencia de las células de cáncer colorrectal. La proteína 10 kDa inducida por el interferón gamma (IP-10), que se une al receptor CXCR3 para inducir quimiotaxis, apoptosis, crecimiento celular y angiostasis [^[45]]. La infección por rotavirus puede facilitar la supresión de la secreción de quimiocinas, modulando la señalización del interferón, lo que permite la evasión inmune y la prolongación de la detección del virus. La reducción de la secreción de la proteína inflamatoria de macrófagos-1 ? (MIP-1 ?), producida selectivamente por las células Th1, inhibe la defensa intracelular primaria y esencial del patógeno hospedador [^[46]]. Esta inhibición conduce a una disminución de los mecanismos de defensa viral de las células infectadas, activando así la evasión de los puntos de control inmunitario. También se observaron inhibiciones de RANTES en la inducción de la apoptosis mediante la escisión de NF-kB, observada tanto en mamíferos como en moscas [^[43]]. Sin embargo, MIG (CXCL9), una monocina inducida por el interferón gamma, está causada principalmente por el IFN-?, que, en dosis bajas, podría mejorar la eficacia terapéutica en el carcinoma [^[36], ^[37]], y se observó que estaba más altamente expresada en la infección por pRVA. Esto inhibe el reclutamiento inmunitario antiviral, prolongando la replicación viral dentro de las células tumorales, una característica adecuada para los virus oncolíticos. Además, se sintetiza el factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB), un indicador pronóstico predictivo para el CRC, para estimular el crecimiento [^[47], ^[48]]. Esto contribuye a la evasión inmune de las células cancerosas, lo que permite que el rotavirus se replique y cause lisis celular. En general, estos hallazgos indican que la infección por pRVA provoca una respuesta coordinada del huésped que implica la detección viral, la defensa antiviral mediada por el interferón, la señalización inflamatoria y la regulación del destino celular. Todavía queda mucho por explorar con respecto al mecanismo oncolítico de los rotavirus aviares. Los hallazgos actuales resaltan la necesidad de investigaciones adicionales para comprender mejor los mecanismos y el potencial terapéutico de los virus oncolíticos.

Como se informó para el reovirus aviar, un virus de la misma familia que el rotavirus (Rheoviridae), la selectividad del virus oncolítico puede deberse a la sobreexpresión de PDL1 en las células cancerosas y a sus efectos antiinflamatorios tras la infección. Esto facilita la señalización y la expresión de TLR3, lo que conduce a la liberación de IFN-? y activa la vía STAT1 para promover la autofagia [^[5], ^[20]]. El rotavirus emplea su proteína no estructural 1 (NSP1) para contrarrestar la respuesta inmune innata del huésped mediante la degradación de los factores reguladores del interferón, como IRF3 e IRF7 [[^[49], ^[50], ^[51]]. También puede degradar ?-TrCP, lo que, de manera similar, altera la señalización del interferón y dificulta la activación de NF-B [^[25]]. La inducción de NF-B, junto con la acumulación nuclear de STAT1 y STAT2, interrumpe la respuesta antiviral posterior en las células infectadas. Además, la VP3 del rotavirus posee actividad fosfodiesterasa que degrada la 2'-5'-oligoadenilato, lo que a su vez inhibe la actividad endorribonucleasa antiviral de la RNasa L [^[52]]. El rotavirus también puede inducir fluctuaciones de Ca2+ en el citoplasma a través de RhoA, interrumpiendo los microfilamentos de actina y el citoesqueleto de tubulina a través de NSP4 durante la infección temprana [^[17]]. Otra vía podría implicar la inducción de Ca2+ intracelular a través de la señalización de ADP, lo que afectaría a las vías de señalización celular. Por último, el rotavirus puede formar cúmulos recubiertos de vesículas, protegiendo los componentes virales de la respuesta inmune [^[25]].

Este estudio ilustró la adaptación a la infección del rotavirus de origen aviar en las células de cáncer colorrectal. La capacidad de infección del rotavirus A de paloma en las células humanas de cáncer colorrectal también puede sugerir un potencial zoonótico y una transmisión cruzada entre las infecciones por rotavirus aviares y mamíferos, o viceversa. La validación adicional utilizando células colorrectales humanas primarias y sanas será esencial en futuros estudios para delimitar completamente su tropismo tumoral específico. El estudio también está limitado por la falta de estudios in vivo, como un modelo de xenoinjerto murino, para probar aún más la seguridad y la eficacia del rotavirus A de paloma como vacuna oncolítica. La falta de células no cancerosas para la infección por pRVA limita en gran medida este estudio para la persistencia viral y la viroterapia oncolítica. El estudio utiliza RT-qPCR para medir la carga viral durante la infección, sin embargo, no se determinó la cantidad de virus infecciosos. El ARN viral se detectó mediante RT-qPCR hasta el día 6 después de la infección. Sin embargo, la RT-qPCR detecta el material genómico viral y no distingue entre virus infecciosos y no infecciosos. Dado que todas las células no eran viables al día 6, no podemos concluir que persista el virus infeccioso en este momento. Por lo tanto, la señal observada probablemente refleja el ARN viral residual en lugar de una infección productiva en curso. Además, los enfoques de neutralización de citocinas y de eliminación de genes pueden proporcionar información valiosa sobre los mecanismos de evasión inmune del rotavirus.

El rotavirus A de paloma demuestra una actividad oncolítica selectiva, pero emplea múltiples estrategias de evasión inmune. Esto incluye la supresión de las principales citocinas inflamatorias, la regulación al alza de los genes de los puntos de control inmunitario y la degradación de los factores reguladores relacionados con el interferón, lo que permite la estabilidad de la infección viral de las células tumorales y el daño celular. Estas características de pRVA son prometedoras para la viroterapia oncolítica, específicamente para el cáncer colorrectal. Sin embargo, las interacciones moleculares precisas y la dinámica huésped-patógeno siguen siendo poco conocidas. Asimismo, se sugiere encarecidamente que la dirección futura de este estudio utilice modelos in vivo para demostrar su potencial oncolítico. También vale la pena señalar que la capacidad de infección de este rotavirus aviar en las células humanas de cáncer colorrectal sugiere fuertemente un potencial zoonótico o una transmisión cruzada. Además, se requerirían estudios que incorporen ensayos de titulación de virus infecciosos, como el ensayo de placa o TCID50, para determinar si el virus infeccioso permanece presente en momentos posteriores. Una mayor investigación sobre las interacciones pRVA-huésped, la modulación inmune y los sistemas de administración terapéutica es crucial para realizar plenamente las implicaciones clínicas de este nuevo rotavirus de origen aviar en el tratamiento del cáncer.

Conclusión

En este estudio, adaptamos con éxito el rotavirus A de paloma (NPUST-001) a las células de cáncer colorrectal con pronunciados efectos citopáticos y apoptóticos, una característica importante para los virus oncolíticos. El éxito del rotavirus de paloma en la infección de las células de cáncer colorrectal, en particular las células HT29, tiene implicaciones para sus mecanismos únicos de evasión inmune. El rotavirus modula la señalización del interferón, lo que conduce a la inhibición temprana de los puntos de control inmunitario relacionados con NF-B, seguida de la expresión posterior de PD-L1, lo que permite la infección viral y la evasión inmune. Además, los rotavirus inhiben la secreción de citocinas y quimiocinas inflamatorias, priorizando la autofagia y la apoptosis celular. Nuestro rotavirus A de paloma es el primer virus oncolítico de origen aviar que se dirige a las células de cáncer colorrectal. Una limitación de este estudio es la ausencia de controles epiteliales colorrectales no cancerosos, lo que limita la interpretación de si los efectos observados son específicos de las células malignas. Esto destaca la importancia de una mayor exploración del virus y sus implicaciones clínicas en las terapias contra el cáncer.

Declaración de contribución de la autoría CRediT

Brian Harvey Avanceña Villanueva: Redacción: revisión y edición, Redacción: borrador original, Visualización, Validación, Administración del proyecto, Metodología, Investigación, Análisis formal, Curación de datos, Conceptualización. Jun-Bi Zhang: Redacción: borrador original, Visualización, Validación, Metodología, Investigación, Análisis formal, Curación de datos, Conceptualización. Jen-Pin Chuang: Redacción: revisión y edición, Validación, Supervisión, Recursos, Administración del proyecto, Metodología, Adquisición de financiación, Conceptualización. Kuo-Pin Chuang: Redacción: revisión y edición, Validación, Supervisión, Recursos, Metodología, Investigación, Adquisición de financiación, Conceptualización.

Disponibilidad de datos

Todos los datos están disponibles en este manuscrito.

Financiación

Este estudio fue apoyado por el Ministerio de Salud y Bienestar de Taiwán, bajo el Programa de Subvenciones para la Investigación y el Desarrollo con el número de proyecto 11238.

Declaración de conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses financiero o personal conocido que pueda haber influido en el trabajo que se informa en este documento.