La hipermetilación de SFMBT2 promueve el progreso del cáncer colorrectal y es un potencial marcador no invasivo para el CRC avanzado.

La hipermetilación aberrante del ADN es un mecanismo epigenético bien establecido que impulsa la tumorigénesis y la progresión a través del silenciamiento transcripcional de los genes supresores de tumores en diversos cánceres.^[1],^[2],^[3],^[4] Una extensa investigación ha identificado promotores hipermetilados de genes supresores clave, como MGMT, SFRP2, SEPT y P16, en el CCRC.^[5],^[6],^[7],^[8] En nuestra investigación previa sobre la identificación de biomarcadores para la detección temprana y la evaluación del riesgo de recurrencia en el CCRC, SFMBT2 surgió como un candidato prometedor.^[9],^[10]
SFMBT2, un gen regulado epigenéticamente que codifica una proteína represora transcripcional que se une a las colas de histonas H3 y H4 metiladas, se silencia con frecuencia mediante hipermetilación en diversos cánceres.^[11],^[12] Este silenciamiento promueve la progresión del cáncer, como facilitar la transición epitelio-mesenquimal (TEM) y la metástasis en el cáncer de próstata a través de la desregulación de vías clave (Wnt, TGF-β y Notch).^[13] Además, el silenciamiento inducido por la hipermetilación de SFMBT2 se ha relacionado con la patogénesis de los cánceres de mama, pulmón, estómago, riñón y esófago al inactivar las vías supresoras de tumores.^[14],^[15],^[16],^[17] Además, se ha validado la participación de la hipermetilación de SFMBT2 en la detección temprana del CCRC, lo que refuerza su potencial como biomarcador diagnóstico y pronóstico.^[18],^[19] El objetivo de este estudio es dilucidar el papel de la hipermetilación del promotor de SFMBT2 en la patogénesis del CCRC y su utilidad clínica mediante la cuantificación de los niveles de metilación en muestras de tejido y plasma en las diferentes etapas del CCRC, y la evaluación de su valor para la estratificación del riesgo de recurrencia y la evaluación pronóstica. Además, se llevaron a cabo estudios funcionales básicos para caracterizar los mecanismos supresores de tumores.

Resultados

Significado biológico de la expresión de SFMBT2 en los tejidos de cáncer colorrectal y las células humanas de cáncer colorrectal

Se realizó inmunohistoquímica (IHQ) para evaluar la expresión de la proteína SFMBT2 en muestras de tejido fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE),^[20], incluidas 111 muestras de CCRC primario, 44 AA, 127 muestras de mucosa intestinal normal emparejadas, 54 metástasis en ganglios linfáticos y 36 metástasis hepáticas. Los resultados indicaron que la proteína SFMBT2 se expresaba abundantemente en la mucosa intestinal normal, pero se redujo o estaba ausente en las AA, los tejidos de CCRC primario y las lesiones metastásicas (Figuras 1A y 1B). El análisis cuantitativo reveló que la expresión de SFMBT2 en la mucosa normal era significativamente mayor que en las AA, el CCRC primario y las metástasis (Tabla S1). Por el contrario, no se detectaron diferencias significativas en la expresión de SFMBT2 entre las AA, el CCRC primario, las metástasis en los ganglios linfáticos y las metástasis hepáticas (p > 0,05). Además, la expresión de SFMBT2 no mostró asociaciones significativas con la edad del paciente, el sexo, la diferenciación tumoral, el estadio clínico o la ubicación del tumor (Tabla S2).

El análisis de RT-qPCR reveló que el ARNm de SFMBT2 se expresaba en gran medida en las líneas celulares de CCRC con baja capacidad metastásica (HT29 y SW480), así como en las células FHC, pero se expresaba en niveles más bajos en las líneas celulares con alta capacidad metastásica (Lovo y SW620) (Figura 1C). Tras el tratamiento con 5-aza-dC, la expresión del ARNm de SFMBT2 aumentó en todas las líneas celulares de CCRC, y el aumento más pronunciado se observó en las células SW480 y HT29 (Figura 1D). Estos resultados sugieren que la expresión de SFMBT2 está regulada por la metilación del ADN, y su disminución en las células de CCRC con alta capacidad metastásica puede contribuir a la progresión tumoral, lo que indica un posible papel supresor de tumores de SFMBT2 en el CCRC.

Los niveles de metilación del gen SFMBT2 en los tejidos de cáncer colorrectal

Se realizó una secuenciación de metilación dirigida en 65 muestras de mucosa normal, 40 AA, 134 muestras de CCRC y 40 metástasis distantes (Tabla 1). La detección de la metilación dirigida de SFMBT2 abarca 18 sitios CG situados dentro de la región genómica que va de 7.452.763 a 7.452.895 en el cromosoma 10. Los resultados revelaron que el gen SFMBT2 estaba hipometilado en la mucosa normal, pero significativamente hipermetilado en las AA, los tejidos de CCRC y las metástasis distantes (Figuras 2A y 2B). En particular, no se observaron diferencias significativas en los niveles de metilación entre las AA, el CCRC y las lesiones metastásicas, lo que coincide con la disminución observada en la expresión de la proteína SFMBT2 en estos tejidos. Además, no se detectaron diferencias significativas en los niveles de SFMBT2 entre 27 pares de tejidos de CCRC y sus correspondientes metástasis hepáticas (p > 0,05). Un análisis adicional utilizando datos de TCGA confirmó que la expresión de SFMBT2 era significativamente mayor en la mucosa intestinal normal en comparación con los tejidos de CCRC, mientras que los niveles de metilación del promotor eran notablemente más bajos en los tejidos normales (Figuras 2C y 2D). Estos hallazgos demuestran una fuerte correlación inversa entre la metilación del promotor de SFMBT2 y la expresión génica, lo que apoya la hipótesis de que la hipermetilación del ADN puede inhibir la expresión de SFMBT2 en el CCRC.

Detección de los niveles de metilación de SFMBT2 en el plasma de pacientes con cáncer colorrectal

La secuenciación de metilación dirigida de muestras de plasma reveló que los niveles de metilación de SFMBT2 eran muy bajos en individuos normales. Los pacientes con AA y CCRC en estadio I/II presentaron niveles de metilación en plasma significativamente más altos en comparación con los controles normales (p < 0,05), aunque los niveles generales de metilación siguieron siendo relativamente bajos. Sin embargo, los pacientes con CCRC en estadio IV y un subconjunto de pacientes con CCRC en estadio III mostraron niveles de señal de metilación de SFMBT2 notablemente elevados, que fueron significativamente más altos que los observados en los controles normales, las AA y el CCRC en estadio temprano (p < 0,001; Figuras 3A y 3B). Construimos un modelo de bosque aleatorio para explorar la eficacia de la metilación de SFMBT2 en el diagnóstico de AA y CCRC en estadio temprano. El área bajo la curva ROC (AUC) fue de 0,4 para AA y de 0,61 para CCRC en estadio temprano, ambas inferiores a las del antígeno carcinoembrionario (CEA), que tuvo valores de AUC de 0,66 para AA y de 0,61 para CCRC en estadio temprano. Específicamente, la metilación de SFMBT2 logró una sensibilidad del 12,2% y una especificidad del 94,8% para la detección de AA, y una sensibilidad del 34,4% y una especificidad del 89,7% para la detección de CCRC en estadio temprano. Cuando la metilación de SFMBT2 se combinó con el CEA para distinguir entre los controles normales y las AA y el CCRC en estadio temprano, los valores de AUC se mantuvieron en 0,65 para AA y en 0,69 para CCRC en estadio temprano (Figuras 3C y 3D). Dado que ya se han establecido varios modelos de metilación no invasivos para la detección temprana del CCRC, que son significativamente superiores a los de SFMBT2.^[21],^[22] Estos resultados sugieren que los niveles de metilación de SFMBT2 en plasma pueden no ser ideales para el cribado temprano del CCRC. Dado que la metilación de SFMBT2 en plasma aumenta en el CCRC en estadio III y está más significativamente elevada en el CCRC en estadio IV, especulamos que puede reflejar potencialmente la carga tumoral en pacientes con CCRC. Por lo tanto, se exploró aún más el potencial de la metilación de SFMBT2 en la evaluación del riesgo de recurrencia y el pronóstico en pacientes con CCRC en estadio avanzado.

La metilación de SFMBT2 en plasma como predictor del riesgo de recurrencia en pacientes con CCRC en estadio III y el pronóstico en pacientes con CCRC en estadio IV

Se evaluaron los niveles de metilación de SFMBT2 en plasma en pacientes con CCRC en estadio III y IV. Los pacientes en estadio III que experimentaron recurrencia o progresión de la enfermedad en un plazo de 5 años mostraron niveles de metilación significativamente más altos que aquellos con enfermedad estable (p = 0,001, Figura 4A). Por el contrario, no se observaron diferencias significativas en los niveles de CEA y CA19-9 en suero entre los dos grupos (p > 0,05, Figuras 4B y 4C). El análisis de la curva ROC reveló que la metilación de SFMBT2 en plasma superó al CEA y al CA19-9 en la predicción de la recurrencia o la progresión en el CCRC en estadio III, con un AUC de 0,74 en comparación con 0,64 y 0,53 para el CEA y el CA19-9, respectivamente (Figura 4D). Entre los pacientes con CCRC en estadio IV, aquellos que desarrollaron recurrencia o progresión en un plazo de 12 meses después del tratamiento (definidos como progresores rápidos) mostraron niveles de metilación de SFMBT2 notablemente elevados en comparación con aquellos que experimentaron recurrencia después de ≥ 12 meses (progresores lentos) (p = 3,6 × 10-7, Figura 4E). Además, los pacientes con metástasis hepáticas presentaban niveles de metilación significativamente más altos que aquellos con metástasis extrahepáticas (por ejemplo, peritoneales, pulmonares) (p = 0,0016, Figura 4F), y los pacientes con múltiples sitios metastásicos presentaban niveles de metilación más altos que aquellos con un único sitio metastásico (p = 7,3 × 10-5, Figura 4G). En conjunto, estos hallazgos indican que la metilación de SFMBT2 en plasma es un biomarcador prometedor para predecir la recurrencia en pacientes con CCRC en estadio III y puede servir como un valioso indicador pronóstico en pacientes con CCRC en estadio IV.

La metilación de SFMBT2 en plasma refleja dinámicamente los cambios de la enfermedad en pacientes con cáncer colorrectal

Se recogieron muestras de plasma seriadas de cuatro pacientes con CCRC en tres puntos temporales: preoperatorio, postoperatorio y durante el seguimiento del tratamiento (Tabla S3), para investigar el potencial de la metilación de SFMBT2 como biomarcador dinámico para el seguimiento de la enfermedad. Los resultados demostraron que los niveles de metilación de SFMBT2 en plasma reflejaban la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento. En particular, en el paciente 1, se produjo un aumento brusco de los niveles de metilación 12 meses antes de la detección por CEA en suero y radiología (Figura 5). En los pacientes 2 y 3, los niveles de metilación aumentaron en paralelo con la progresión del tumor, mientras que en el paciente 4, los niveles de metilación estables correspondieron con la estabilidad de la enfermedad. Sin embargo, el tamaño de la muestra es limitado; estos hallazgos solo reflejan la observación preliminar. Es necesario realizar más estudios con muestras consecutivas para determinar si la metilación de SFMBT2 puede servir como una herramienta complementaria al CEA en suero para el seguimiento del estado de la enfermedad.

El papel de SFMBT2 en el microambiente inmunitario y la regulación metabólica del cáncer colorrectal basado en el análisis de bases de datos

En pacientes con CCRC con alta expresión de SFMBT2, los niveles de infiltración de células B ingenuas, células T de memoria CD4+ activadas y células T auxiliares foliculares (Tfh) aumentan significativamente (Figura 6A). La relación M1/M2 y la relación CD8/Treg en el grupo de alta expresión de SFMBT2 fueron significativamente más altas que en el grupo de baja expresión (ambas p < 0,05) (Figura 6B), lo que sugiere que la alta expresión de SFMBT2 puede estar asociada con un estado inmunitario antitumoral más fuerte. Un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier adicional mostró que los pacientes con alta expresión de SFMBT2 tenían una supervivencia general significativamente mejor que aquellos con baja expresión (p < 0,05) (Figura 6C), lo que indica que SFMBT2 puede influir en el pronóstico al modular el microambiente inmunitario tumoral. El análisis de enriquecimiento funcional muestra que los genes regulados al alza en los pacientes con alta expresión de SFMBT2 están implicados principalmente en la actividad del receptor inmunitario, la adhesión célula-célula de los leucocitos, la inmunidad mediada por los leucocitos y la interacción receptor-ligando de las citocinas (Figura 6D). En los pacientes con cáncer colorrectal con alta expresión de SFMBT2, los genes regulados a la baja están enriquecidos principalmente en las vías relacionadas con las proteasas y los reguladores de proteasas (Figura 6E). Esto sugiere que SFMBT2 puede moldear el microambiente inmunitario del CCRC al influir en la infiltración de células inmunitarias, regular las vías de señalización relacionadas con la inmunidad y los mecanismos de degradación de proteínas, participando así en la evasión inmunitaria o la inmunidad antitumoral. El análisis GSEA mostró que varias vías de activación inmunitaria, como la respuesta inmunitaria adaptativa, la interacción célula-célula inmunitaria y la activación de las células B, se enriquecieron en los pacientes con alta expresión de SFMBT2 (Figura 6F). Además, las vías relacionadas con la respuesta de inanición de aminoácidos y la traducción eucariota se suprimieron significativamente en el grupo de alta expresión de SFMBT2 (Figura 6G), lo que sugiere que SFMBT2 puede estar implicado en la detección del estrés nutricional y la regulación de la síntesis de proteínas.

Se realizó inmunohistoquímica para evaluar la expresión de la proteína SFMBT2 en muestras de tejido fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE),^[20] incluyendo 111 casos primarios de CCRC, 44 adenomas avanzados (AA), 127 muestras de mucosa intestinal normal emparejadas, 54 metástasis en ganglios linfáticos y 36 metástasis hepáticas. Los resultados indicaron que la proteína SFMBT2 se expresaba abundantemente en la mucosa intestinal normal, pero se encontraba marcadamente disminuida o ausente en los AA, los tejidos primarios de CCRC y las lesiones metastásicas (Figuras 1A y 1B). El análisis cuantitativo reveló que la expresión de SFMBT2 en la mucosa normal era significativamente mayor que en los AA, el CCRC primario y las metástasis (Tabla S1). Por el contrario, no se detectaron diferencias significativas en la expresión de SFMBT2 entre los AA, el CCRC primario, las metástasis en ganglios linfáticos y las metástasis hepáticas (p > 0,05). Además, la expresión de SFMBT2 no mostró asociaciones significativas con la edad, el sexo, la diferenciación tumoral, el estadio clínico o la ubicación del tumor del paciente (Tabla S2).

El análisis RT-qPCR reveló que el ARNm de SFMBT2 se expresaba en gran medida en las líneas celulares de CCRC con baja capacidad metastásica (HT29 y SW480), así como en las células FHC, pero se expresaba en niveles más bajos en las líneas celulares con alta capacidad metastásica (Lovo y SW620) (Figura 1C). Tras el tratamiento con 5-aza-dC, la expresión del ARNm de SFMBT2 se incrementó en todas las líneas celulares de CCRC, siendo el aumento más pronunciado en las células SW480 y HT29 (Figura 1D). Estos resultados sugieren que la expresión de SFMBT2 está regulada por la metilación del ADN, y su disminución en las células de CCRC con alta capacidad metastásica puede contribuir a la progresión tumoral, lo que indica un posible papel supresor tumoral de SFMBT2 en el CCRC.

Los niveles de metilación del gen SFMBT2 en los tejidos de cáncer colorrectal

Se realizó una secuenciación de metilación dirigida en 65 muestras de mucosa normal, 40 AA, 134 muestras de CCRC y 40 metástasis distantes (Tabla 1). La detección de la metilación dirigida de SFMBT2 abarca 18 sitios CG situados dentro de la región genómica que va desde 7.452.763 hasta 7.452.895 en el cromosoma 10. Los resultados revelaron que el gen SFMBT2 estaba hipometilado en la mucosa normal, pero significativamente hipermetilado en los AA, los tejidos de CCRC y las metástasis distantes (Figuras 2A y 2B). En particular, no se observaron diferencias significativas en los niveles de metilación entre los AA, el CCRC y las lesiones metastásicas, lo que coincide con la disminución observada en la expresión de la proteína SFMBT2 en estos tejidos. Además, no se detectaron diferencias significativas en los niveles de SFMBT2 entre 27 pares de tejidos de CCRC y sus correspondientes metástasis hepáticas (p > 0,05). Un análisis adicional utilizando datos de TCGA confirmó que la expresión de SFMBT2 era significativamente mayor en la mucosa intestinal normal en comparación con los tejidos de CCRC, mientras que los niveles de metilación del promotor eran marcadamente más bajos en los tejidos normales (Figuras 2C y 2D). Estos hallazgos demuestran una fuerte correlación inversa entre la metilación del promotor de SFMBT2 y la expresión génica, lo que apoya la hipótesis de que la hipermetilación del ADN puede inhibir la expresión de SFMBT2 en el CCRC.

Detección de los niveles de metilación de SFMBT2 en el plasma de pacientes con cáncer colorrectal

La secuenciación de metilación dirigida de muestras de plasma reveló que los niveles de metilación de SFMBT2 eran muy bajos en individuos normales. Los pacientes con AA y CCRC en estadio temprano (estadio I/II) mostraron niveles de metilación plasmática significativamente más altos en comparación con los controles normales (p < 0,05), aunque los niveles generales de metilación siguieron siendo relativamente bajos. Sin embargo, los pacientes con CCRC en estadio IV y un subconjunto de pacientes en estadio III mostraron niveles de señal de metilación de SFMBT2 marcadamente elevados, que fueron significativamente más altos que los observados en los controles normales, los AA y el CCRC en estadio temprano (p < 0,001; Figuras 3A y 3B). Construimos un modelo de bosque aleatorio para explorar la eficacia de la metilación de SFMBT2 en el diagnóstico de AA y CCRC en estadio temprano. El área bajo la curva ROC (AUC) fue de 0,4 para AA y de 0,61 para CCRC en estadio temprano, ambos valores inferiores a los del antígeno carcinoembrionario (CEA), que tuvo valores de AUC de 0,66 para AA y de 0,61 para CCRC en estadio temprano. Específicamente, la metilación de SFMBT2 logró una sensibilidad del 12,2% y una especificidad del 94,8% para la detección de AA, y una sensibilidad del 34,4% y una especificidad del 89,7% para la detección de CCRC en estadio temprano. Cuando la metilación de SFMBT2 se combinó con el CEA para distinguir entre los controles normales y los AA y el CCRC en estadio temprano, los valores de AUC se mantuvieron en 0,65 para AA y en 0,69 para CCRC en estadio temprano, respectivamente (Figuras 3C y 3D). Dado que ya se han establecido varios modelos de metilación no invasivos para la detección temprana del CCRC, que son significativamente superiores a los de SFMBT2^[21],^[22], estos resultados sugieren que los niveles de metilación de SFMBT2 en el plasma pueden no ser ideales para el cribado temprano del CCRC. Dado que la metilación de SFMBT2 en el plasma aumenta en el CCRC en estadio III y se eleva de forma más significativa en el estadio IV, especulamos que puede reflejar potencialmente la carga tumoral en pacientes con CCRC. Por lo tanto, se exploró aún más el potencial de la metilación de SFMBT2 en la evaluación del riesgo de recurrencia y el pronóstico en pacientes con CCRC avanzado.

La metilación de SFMBT2 en el plasma como predictor del riesgo de recurrencia en pacientes con CCRC en estadio III y el pronóstico en pacientes con CCRC en estadio IV

Se evaluaron los niveles de metilación de SFMBT2 en el plasma en pacientes con CCRC en estadio III y IV. Los pacientes en estadio III que experimentaron recurrencia o progresión de la enfermedad en un plazo de 5 años mostraron niveles de metilación significativamente más altos que aquellos con enfermedad estable (p = 0,001, Figura 4A). Por el contrario, no se observaron diferencias significativas en los niveles de CEA y CA19-9 en suero entre los dos grupos (p > 0,05, Figuras 4B y 4C). El análisis de la curva ROC reveló que la metilación de SFMBT2 en el plasma superó al CEA y al CA19-9 en la predicción de la recurrencia o la progresión en el CCRC en estadio III, con un AUC de 0,74 en comparación con 0,64 y 0,53 para el CEA y el CA19-9, respectivamente (Figura 4D). Entre los pacientes con CCRC en estadio IV, aquellos que desarrollaron recurrencia o progresión en un plazo de 12 meses después del tratamiento (definidos como progresores rápidos) mostraron niveles de metilación de SFMBT2 marcadamente elevados en comparación con aquellos con recurrencia después de ≥12 meses (progresores lentos) (p = 3,6 × 10-7, Figura 4E). Además, los pacientes con metástasis hepáticas tenían niveles de metilación significativamente más altos que aquellos con metástasis extrahepáticas (por ejemplo, peritoneales, pulmonares) (p = 0,0016, Figura 4F), y los pacientes con múltiples sitios metastásicos mostraron niveles de metilación más altos que aquellos con un único sitio metastásico (p = 7,3 × 10-5, Figura 4G). En conjunto, estos hallazgos indican que la metilación de SFMBT2 en el plasma es un biomarcador prometedor para predecir la recurrencia en pacientes con CCRC en estadio III y puede servir como un valioso indicador pronóstico en pacientes con CCRC en estadio IV.

La metilación de SFMBT2 en el plasma refleja dinámicamente los cambios de la enfermedad en pacientes con cáncer colorrectal

Se recogieron muestras de plasma seriadas de cuatro pacientes con CCRC en tres momentos: preoperatorio, postoperatorio y durante el seguimiento (Tabla S3), para investigar el potencial de la metilación de SFMBT2 como un biomarcador dinámico para el seguimiento de la enfermedad. Los resultados demostraron que los niveles de metilación de SFMBT2 en el plasma reflejaron la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento. En particular, en el paciente 1, se produjo un aumento brusco en los niveles de metilación 12 meses antes de la detección por CEA en suero y radiología (Figura 5). En los pacientes 2 y 3, los niveles de metilación aumentaron en paralelo con la progresión tumoral, mientras que en el paciente 4, los niveles de metilación estables correspondieron con la estabilidad de la enfermedad. Sin embargo, el tamaño de la muestra es limitado; estos hallazgos solo reflejan la observación preliminar. Es necesario realizar más estudios con muestras consecutivas para determinar si la metilación de SFMBT2 puede servir como una herramienta complementaria al CEA en suero para el seguimiento del estado de la enfermedad.

El papel de SFMBT2 en el microentorno inmunitario y la regulación metabólica del cáncer colorrectal basándose en el análisis de bases de datos

En pacientes con CCRC con alta expresión de SFMBT2, los niveles de infiltración de células B naive, células T de memoria CD4+ activadas y células T helper foliculares (Tfh) aumentan significativamente (Figura 6A). La relación M1/M2 y la relación CD8/Treg en el grupo con alta expresión de SFMBT2 fueron significativamente más altas que en el grupo con baja expresión (ambos p < 0,05) (Figura 6B), lo que sugiere que la alta expresión de SFMBT2 puede estar asociada con un estado inmunitario antitumoral más fuerte. Un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier adicional mostró que los pacientes con alta expresión de SFMBT2 tenían una supervivencia general significativamente mejor que aquellos con baja expresión (p < 0,05) (Figura 6C), lo que indica que SFMBT2 puede influir en el pronóstico mediante la modulación del microentorno inmunitario tumoral. El análisis de enriquecimiento funcional muestra que los genes regulados al alza en los pacientes con alta expresión de SFMBT2 están implicados principalmente en la actividad del receptor inmunitario, la adhesión célula-célula de los leucocitos, la inmunidad mediada por los leucocitos y la interacción receptor-citoquina (Figura 6D). En los pacientes con cáncer colorrectal con alta expresión de SFMBT2, los genes regulados a la baja están enriquecidos principalmente en vías relacionadas con las proteasas y los reguladores de proteasas (Figura 6E). Esto sugiere que SFMBT2 puede moldear el microentorno inmunitario del CCRC al influir en la infiltración de células inmunitarias, regular las vías de señalización relacionadas con la inmunidad y los mecanismos de degradación de proteínas, participando así en la evasión inmunitaria o la inmunidad antitumoral. El análisis GSEA mostró que varias vías de activación inmunitaria, como la respuesta inmunitaria adaptativa, la interacción célula-célula de los leucocitos y la activación de las células B, se enriquecieron en los pacientes con alta expresión de SFMBT2 (Figura 6F). Además, las vías relacionadas con la respuesta a la privación de aminoácidos y la traducción eucariota se suprimieron significativamente en el grupo con alta expresión de SFMBT2 (Figura 6G), lo que sugiere que SFMBT2 puede estar implicado en la detección del estrés nutricional y la regulación de la síntesis de proteínas.

Discusión

Múltiples estudios han explorado la utilidad de los biomarcadores de metilación de un solo gen o de múltiples genes basados en el plasma para el seguimiento de la carga tumoral y la progresión de la enfermedad en pacientes con cáncer colorrectal metastásico (CCRCm). Por ejemplo, Garrigou et al.^[23] demostraron que la metilación plasmática de WIF1 y NPY detectó el 80% de los casos de CCRCm y el 45% de los CCRC localizados. De manera similar, la metilación sérica de HLTF o HPP1 se ha identificado como un marcador pronóstico independiente en el CCRCm, y la hipermetilación de HLTF también sirve como predictor de la recurrencia del CCRC.^[24],^[25] El gen SFMBT2 surgió como un candidato biomarcador prometedor en dos de nuestros estudios anteriores, que establecieron modelos de metilación basados en el plasma para la detección del CCRC y la evaluación de la recurrencia.^[9],^[10] Jian-Bing Fan et al. también identificó SFMBT2 como parte de un panel de metilación específico del CCRC para la detección temprana del CCRC.^[18] Estos hallazgos en conjunto nos impulsaron a investigar más a fondo la utilidad clínica de la metilación de SFMBT2 en el plasma, así como la función biológica de SFMBT2 en la tumorigénesis del cáncer colorrectal.

Los análisis bioinformáticos identificaron SFMBT2 como un posible gen supresor tumoral. Los estudios mostraron que SFMBT2 podría inhibir el crecimiento tumoral y la metástasis en el cáncer de próstata y el carcinoma de células renales de células claras.^[13],^[17] La validación experimental reveló una alta expresión de ARNm de SFMBT2 en las células epiteliales intestinales normales y en las líneas celulares de CRC con baja capacidad metastásica, mientras que se observó una expresión marcadamente reducida en las líneas celulares con alta capacidad metastásica. Este patrón de expresión es consistente con la inactivación de los genes supresores tumorales clásicos, como APC y TP53, en el CRC.^[26],^[27] El tratamiento con el agente desmetilante del ADN, 5-aza-dC, restauró significativamente la expresión de SFMBT2, particularmente en las células HT29 y SW480, lo que indica que la hipermetilación del promotor puede estar implicada en la regulación transcripcional de SFMBT2. La inmunohistoquímica (IHQ) confirmó además una fuerte expresión de la proteína SFMBT2 en la mucosa intestinal normal, con una disminución significativa en el adenoma avanzado (AA), los CRC primarios y las metástasis distantes. Cabe destacar que no se observaron diferencias significativas en la expresión entre estos tres grupos. De manera consistente, los ensayos de metilación de SFMBT2 a nivel tisular no mostraron diferencias discernibles entre el AA, el CRC primario y las metástasis correspondientes. El análisis de TCGA también demostró que la expresión de SFMBT2 es significativamente mayor en la mucosa normal que en los tejidos de CRC. En contraste, la metilación del promotor de SFMBT2 es baja en los tejidos normales, pero se eleva marcadamente en los tejidos de CRC. Este patrón de expresión génica y su correlación inversa con el estado de metilación de SFMBT2 sugieren que SFMBT2 puede actuar como un gen supresor tumoral, y el silenciamiento mediado por la metilación es probablemente uno de los principales mecanismos de inactivación de SFMBT2 en el desarrollo del CRC. Además, se reconoce ampliamente que el fenotipo de metilador de la isla CpG (CIMP) desempeña un papel importante en el desarrollo y la progresión del CRC.^[28],^[29] Se hipotetiza que SFMBT2 puede contribuir a la formación de CIMP al influir en el estado de metilación de las islas CpG. Sin embargo, se requieren más estudios para analizar sus mecanismos específicos y su importancia clínica.

La investigación sobre SFMBT2 se ha centrado predominantemente en su papel en el desarrollo y la diferenciación de los condrocitos, con una investigación limitada sobre su papel en la biología del cáncer.^[12] Un estudio que identificó las DMR (regiones de metilación diferencial) en el carcinoma de células escamosas orofaríngeo (CCOO) relacionado con el virus del papiloma humano (VPH) reveló que la hipermetilación de SFMBT2 puede promover la migración y la invasión de las células de CCOO al silenciar epigenéticamente su actividad transcripcional.^[30] En el cáncer de próstata, SFMBT2 suprime la metástasis al modular las metaloproteínas de la matriz MMP-9 y MMP-26, y se ha propuesto como un posible biomarcador para la enfermedad metastásica.^[13] Estos hallazgos sugieren colectivamente que SFMBT2 puede servir como un biomarcador diagnóstico o pronóstico en varios tipos de cáncer, lo que justifica una mayor investigación en el CRC.

Por lo tanto, investigamos más a fondo la importancia clínica diagnóstica y pronóstica de la metilación de SFMBT2 utilizando datos de secuenciación plasmática de pacientes con CRC. Cuando se aplicó al plasma de SFMBT2 para el diagnóstico de AA y CRC en estadio temprano (estadios I-II), el AUC (área bajo la curva) fue de solo 0,40 y 0,61, respectivamente. Estos valores fueron inferiores a los del antígeno carcinoembrionario (CEA) sérico, que tuvo valores de AUC de 0,66 y 0,61. Incluso cuando se combinaron el CEA plasmático y la metilación de SFMBT2, el rendimiento diagnóstico no mejoró significativamente. Como es bien sabido, el ensayo Epi proColon SEPT9 arrojó una sensibilidad del 73% con una especificidad del 94,5% para la detección de CRC en un ensayo clínico prospectivo.^[31] Se demostró que un único biomarcador de metilación, cg10673833, es un biomarcador de metilación superior en la detección de CRC, con una sensibilidad y una especificidad del 89,7% y el 86,8%, respectivamente.^[32] Por lo tanto, la metilación de SFMBT2 en el plasma por sí sola no es suficiente para el cribado temprano del CRC; se incorpora con frecuencia en paneles de metilación combinados para una mejor detección.

Sin embargo, los niveles de metilación de SFMBT2 están significativamente elevados en el CRC en estadio avanzado (estadio III/IV). Entre los pacientes con enfermedad en estadio III, el aumento de la metilación de SFMBT2 en el plasma se asoció con un mayor riesgo de recurrencia y un peor pronóstico (AUC = 0,74), lo que supera a los marcadores séricos tradicionales, CEA y CA19-9, lo que indica su potencial para identificar a los pacientes con CRC en estadio III de alto riesgo que necesitan una terapia más intensiva. De manera similar, en los pacientes con CRC en estadio IV, aquellos con enfermedad de progresión rápida mostraron niveles significativamente más altos de metilación de SFMBT2 en el plasma en comparación con aquellos con enfermedad de progresión más lenta. Además, la hipermetilación de SFMBT2 se asoció significativamente con los patrones de metástasis. Específicamente, los pacientes con metástasis hepáticas tenían niveles de metilación más altos que aquellos con metástasis extrahepáticas. Además, el número de metástasis se correlacionó con los niveles de metilación de SFMBT2, y se observaron niveles más altos en los pacientes con múltiples metástasis en comparación con aquellos con lesiones únicas. La metilación de SFMBT2 puede servir como un posible indicador para el seguimiento del riesgo de recurrencia y el pronóstico de los pacientes con CRC avanzado.

Los análisis plasmáticos longitudinales de cuatro pacientes demostraron además que la metilación de SFMBT2 superó a los marcadores séricos convencionales, como el CEA, en el seguimiento de la progresión de la enfermedad. No solo reflejó dinámicamente las respuestas al tratamiento, sino que también predijo la recurrencia hasta 12 meses antes que la prueba de CEA. A pesar del tamaño de muestra relativamente pequeño, nuestros hallazgos sugieren que la metilación de SFMBT2 puede servir como un biomarcador prometedor para el seguimiento dinámico de la enfermedad. De manera similar, el seguimiento dinámico de los niveles de metilación de NPY puede evaluar la eficacia terapéutica en el cáncer colorrectal metastásico (CCRM) y predecir la progresión de la enfermedad. Cabe destacar que se detectó un aumento significativo en los niveles de metilación de NPY 49 días antes que la progresión radiológica.^[33],^[34] Se necesita una mayor verificación para determinar si estos biomarcadores pueden servir como una herramienta complementaria prometedora para el sistema de vigilancia actual.

En el cáncer colorrectal, la alta expresión de SFMBT2 se asocia con el aumento de la infiltración de varias células inmunitarias, incluidas las células T de memoria activadas CD4+, las células B ingenuas, las células Tfh, los macrófagos M1 y M2, las células T CD8+ y los Tregs. A pesar de la presencia de poblaciones celulares tanto pro-tumorales como anti-tumorales, los análisis de proporciones (por ejemplo, las proporciones M1/M2 y CD8/Treg) y el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier indican que la alta expresión de SFMBT2 está relacionada con una respuesta inmunitaria anti-tumoral más fuerte y una mejor supervivencia general. El enriquecimiento funcional y los análisis GSEA respaldaron estas observaciones, mostrando el enriquecimiento de las vías de señalización inmunitaria y la mejora de los procesos de interacción célula-célula en el grupo de alta expresión. En conjunto, estos resultados sugieren que la expresión de SFMBT2 puede estar asociada con la modulación de la actividad inmunitaria en el CRC. Sin embargo, es importante tener en cuenta que estas conclusiones son correlativas y exploratorias, ya que se basan en análisis computacionales en lugar de una validación experimental directa. Se requerirán más estudios, incluida la inmunohistoquímica y la inmunofluorescencia multiplex, para confirmar estas asociaciones y aclarar su base mecanicista.

En resumen, SFMBT2 puede actuar como un gen supresor tumoral en el desarrollo del CRC, y la metilación puede estar implicada en su regulación transcripcional. La detección de la metilación de SFMBT2 en el plasma demuestra un potencial significativo como un biomarcador de biopsia líquida para el seguimiento de la recurrencia y la evaluación pronóstica del CRC avanzado. El potencial de la metilación de SFMBT2 como biomarcador para el seguimiento dinámico de la enfermedad necesita más validación. Su rendimiento superior en la estratificación del riesgo compensa eficazmente las limitaciones de los biomarcadores actuales, lo que lo posiciona como una valiosa herramienta complementaria en la práctica clínica. Además, SFMBT2 puede influir en la biología del CRC a través de la regulación del microambiente inmunitario. Este estudio proporciona información molecular para guiar el diagnóstico de precisión, las intervenciones terapéuticas estratificadas y el desarrollo de inmunoterapia dirigida para los pacientes con CRC avanzado.

Limitaciones del estudio

Las funciones biológicas de SFMBT2 en el CRC requieren más estudios mecanicistas. La eficacia del SFMBT2 plasmático para el seguimiento dinámico del CRC debe verificarse con más muestras consecutivas. Aunque los estudios actuales indican que SFMBT2 no es adecuado para el cribado temprano del CRC, su valor de aplicación combinada con otros marcadores (como el ctDNA y el CEA) debe explorarse.

Limitaciones del estudio

Las funciones biológicas de SFMBT2 en el CRC requieren más estudios mecanicistas. La eficacia del SFMBT2 plasmático para el seguimiento dinámico del CRC debe verificarse con más muestras consecutivas. Aunque los estudios actuales indican que SFMBT2 no es adecuado para el cribado temprano del CRC, su valor de aplicación combinada con otros marcadores (como el ctDNA y el CEA) debe explorarse.

Disponibilidad de recursos

Contacto principal

Para obtener más información y solicitar recursos y reactivos, póngase en contacto con el contacto principal: póngase en contacto con Wei Wang en ricewang79@126.com para solicitar datos.### Disponibilidad de materiales

Este estudio no generó nuevos reactivos únicos.### Disponibilidad de datos y código

Datos

Los datos transcriptómicos disponibles públicamente de pacientes con cáncer colorrectal analizados en este estudio se obtuvieron de la base de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA), incluidos los grupos TCGA-COAD y TCGA-READ (consulte la tabla de recursos clave).

Los datos que se informan en este artículo se han depositado en la base de datos OMIX, China National Center for Bioinformation/Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences (https://ngdc.cncb.ac.cn/omix; número de acceso OMIX014633) (consulte la tabla de recursos clave). De acuerdo con las regulaciones nacionales sobre el intercambio de recursos genéticos humanos, los datos están disponibles bajo acceso controlado. Los investigadores pueden solicitar acceso a través del sistema de solicitud de acceso a datos OMIX siguiendo las directrices oficiales de acceso a datos OMIX, y los datos aprobados se pueden utilizar solo con fines de investigación.### Código

Este estudio no generó código personalizado nuevo. Todos los análisis se realizaron utilizando software y paquetes R disponibles públicamente, que se enumeran en la tabla de recursos clave.### Otros elementos

Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos que se informan en este artículo está disponible en el contacto principal previa solicitud razonable.

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Para obtener más información y solicitar recursos y reactivos, póngase en contacto con el contacto principal: póngase en contacto con Wei Wang en ricewang79@126.com para solicitar datos.

Disponibilidad de materiales

Este estudio no generó nuevos reactivos únicos.

Disponibilidad de datos y código

Datos

Los datos transcriptómicos disponibles públicamente de pacientes con cáncer colorrectal analizados en este estudio se obtuvieron de la base de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA), incluidos los grupos TCGA-COAD y TCGA-READ (consulte la tabla de recursos clave).

Los datos que se informan en este artículo se han depositado en la base de datos OMIX, China National Center for Bioinformation/Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences (https://ngdc.cncb.ac.cn/omix; número de acceso OMIX014633) (consulte la tabla de recursos clave). De acuerdo con las regulaciones nacionales sobre el intercambio de recursos genéticos humanos, los datos están disponibles bajo acceso controlado. Los investigadores pueden solicitar acceso a través del sistema de solicitud de acceso a datos OMIX siguiendo las directrices oficiales de acceso a datos OMIX, y los datos aprobados se pueden utilizar solo con fines de investigación.### Código

Este estudio no generó código personalizado nuevo. Todos los análisis se realizaron utilizando software y paquetes R disponibles públicamente, que se enumeran en la tabla de recursos clave.### Otros elementos

Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos que se informan en este artículo está disponible en el contacto principal previa solicitud razonable.

Datos

Los datos transcriptómicos de pacientes con cáncer colorrectal, disponibles públicamente y analizados en este estudio, se obtuvieron de la base de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA), incluyendo las cohortes TCGA-COAD y TCGA-READ (ver tabla de recursos clave).

Los datos presentados en este artículo se han depositado en la base de datos OMIX, China National Center for Bioinformation/Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences (https://ngdc.cncb.ac.cn/omix; número de acceso OMIX014633) (ver tabla de recursos clave). De acuerdo con las regulaciones nacionales sobre el intercambio de recursos genéticos humanos, los datos están disponibles bajo acceso controlado. Los investigadores pueden solicitar acceso a través del sistema de solicitud de acceso a datos OMIX, siguiendo las directrices oficiales de acceso a datos OMIX, y los datos aprobados solo podrán utilizarse con fines de investigación.

Código

Este estudio no generó código nuevo. Todos los análisis se realizaron utilizando software y paquetes R de acceso público, que se enumeran en la tabla de recursos clave.

Otros elementos

Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos presentados en este artículo está disponible a través del investigador principal, previa solicitud razonable.

Agradecimientos

Los autores agradecen a todos los pacientes que participaron en este estudio.

Este trabajo fue financiado por la Natural Science Foundation of Guangdong Province of China (NO. 2023A1515012384) y el Science and Technology Planning Project de Guangzhou (NO. 2023A03J0169) (10.13039/501100003453).

Contribuciones de los autores

W.W. y L.Y. llevaron a cabo los experimentos. J.W. y Y.L. realizaron el análisis estadístico y elaboraron los diagramas esquemáticos. W.C., W.H. y J.Z. ayudaron en la recolección de muestras de tejido y plasma y en el seguimiento de los casos. X.L. y D.Y. ayudaron a realizar algunos experimentos. C.L. concibió los experimentos y redactó el artículo. Todos los autores participaron en la redacción del artículo y dieron su aprobación final a las versiones enviadas y publicadas.

Declaración de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Métodos STAR

Tabla de recursos clave

Detalles del modelo experimental y de los participantes del estudio

Sujetos humanos

Las muestras de tejido y plasma se obtuvieron de pacientes con CRC en el General Hospital of the Southern Theater Command y el Southern Hospital of Southern Medical University. Los criterios de inclusión fueron los siguientes: (1) diagnóstico primario de CRC confirmado por patología; (2) pacientes con CRC en estadio IV que se habían sometido a metástasis con intención curativa para metástasis hepáticas, pulmonares o peritoneales; (3) disponibilidad de muestras de tejido y/o plasma analizables; y (4) una proporción de células tumorales de no menos del 30% en las muestras de FFPE. Los criterios de exclusión fueron: (1) antecedentes de tratamientos preoperatorios; (2) datos clínicos incompletos; y (3) antecedentes personales de otras neoplasias malignas. Los adenomas avanzados se definieron como adenomas con un tamaño de 1 cm, displasia de alto grado o histología vellosa o tubulovellosa. Se recolectaron muestras de mucosa normal adyacente de sitios ubicados a más de 5 cm del margen del tumor primario.

Este estudio empleó un enfoque de doble cohorte utilizando muestras de tejido FFPE para investigar sistemáticamente la expresión y los patrones de metilación de SFMBT2 en diferentes etapas de CRC, así como en tejidos normales y metastásicos. Para la detección inmunohistoquímica, se recolectaron un total de 372 muestras de tejido FFPE, incluyendo 44 AA, 111 tumores primarios, 127 muestras de mucosa normal emparejadas, 54 metástasis de ganglios linfáticos y 36 metástasis hepáticas. Además, se realizó una secuenciación de metilación dirigida en una cohorte de 239 muestras de tejido FFPE que incluyó 65 mucosas normales, 40 casos de AA, 22 muestras de CRC en estadio I, 19 muestras de CRC en estadio II y 19 muestras de CRC en estadio III, 34 CRC en estadio IV y 40 lesiones metastásicas distantes (27 pares de tejidos de CRC en estadio? y su metástasis hepática). Esta cohorte incluyó 75 pacientes con AA y 263 pacientes con CRC en diferentes estadios TNM. Los controles sanos (n=58) se definieron como individuos mayores de 18 años sin antecedentes de cáncer o enfermedades crónicas. Las muestras de FFPE y las muestras de plasma se derivaron de diferentes pacientes. Los datos clínicos detallados de las muestras de tejido y plasma se resumen en la Tabla 1.

Ética

Los participantes fueron incluidos en el Southern Hospital y el General Hospital of Southern Theater Command y el Southern Hospital of Southern Medical University, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de la recolección de muestras de tejido y sangre. Todos los participantes fueron informados sobre el uso de los tejidos y el plasma y los resultados de las pruebas. El presente estudio fue aprobado por el comité de ética del Southern Hospital (No. 2020-010) y el General Hospital of Southern Theater Command (No. 2024GJJ036).

Detalles del método

Cultivo de líneas celulares

Las células de CRC humanas (HT29, SW480, SW620 y Lovo) y las células de colon fetal humano (FHC) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). HT29 pertenece a las líneas celulares CIMP-positivas^[35]. Se sembraron 2,5 × 106 células en placas de 6 pocillos en medio RPMI-1640 (Gibco) suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina estreptomicina. Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 95% de aire y 5% de CO2. Todas las líneas celulares se cultivaron durante no más de 20 pasajes, se verificó que fueran negativas para la contaminación por micoplasma utilizando el MycoAlert Mycoplasma Detection Kit (Lonza Bioscience) y se autenticaron mediante análisis de genotipado STR. Se generaron perfiles STR para todas las líneas celulares y se alinearon con las bases de datos estándar de ATCC y DSMZ, y se confirmó que cada línea celular tenía un grado de coincidencia de ≥ 95%.

Extracción de ARN

Para el tratamiento de desmetilación, las células se trataron con 10 μM de 5-aza-2'-desoxicitidina^[36] (5-aza-dC) durante 72 horas, seguido de la extracción de ARN. Se aisló el ARN total de las células de CRC humanas utilizando el método de extracción de Trizol-cloroformo según las instrucciones del fabricante. El ARN complementario total se transcibió utilizando el kit Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, EE. UU.).

PCR cuantitativa en tiempo real

Los cebadores específicos para SFMBT2 que se utilizaron en la PCR cuantitativa en tiempo real se diseñaron utilizando Primer Premier 5.0 y se produjeron por Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghái, China). GAPDH se utilizó como gen de referencia. Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: SFMBT2 sentido, 5'-AAAAGTGTCTCGGCTCAGCTA-3' y reverso, 5'-ACGTGTCCGG GTTGTTCTTAT-3' GAPDH sentido, 5'-ATGCTGGAAAACCTTGAGCTT-3' y reverso, 5'-TGGAAGGATCTGCATTAGGGA 3’. La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó en un sistema de PCR en tiempo real 7500 Fast con la mezcla maestra SYBR GreenqRT-PCR (TaKaRa).

Inmunohistoquímica

El anticuerpo policlonal anti-humano SFMBT2 (dilución final 1:400) se compró a Proteintech. Los especímenes de FFPE se cortaron en secciones de 4 μm de espesor. La tinción inmunohistoquímica de SFMBT2 se realizó en un instrumento automático de inmunohistoquímica Dako siguiendo las instrucciones del fabricante, que incluyen brevemente la eliminación del peroxidasa endógena, la adición del anticuerpo primario, el lavado de las secciones, la adición de IgG anti-conejo (Dako), la detección cromogénica, la contratinción, la deshidratación y la aclaración. Las secciones de control negativo se incubaron con PBS en lugar del anticuerpo primario. Dos patólogos con más de 15 años de experiencia examinaron las secciones de forma independiente y a ciegas con respecto a la información clinicopatológica. La tinción inmunohistoquímica de SFMBT2 se localizó en el citoplasma y la membrana de las células, y los criterios de cuantificación de la tinción se realizaron de la siguiente manera: con: las células con 5 se clasificaron como positivas.

Procesamiento del plasma

Se recolectaron muestras de sangre (10 mL) utilizando tubos de recolección de sangre acelu

Todos los análisis estadísticos (incluyendo la prueba de Chi-cuadrado y la prueba de Wilcoxon) se realizaron utilizando R (versión 3.6.0), SPSS 25.0 (IBM SPSS Statistics 25, IBM, Somers, IL, USA) y Graphpad Prism (Graphpad Prism 9.5). La significación se determinó con un umbral de p 0,5 y tasa de descubrimiento falso (FDR) < 0,05. Se realizaron análisis de enriquecimiento de la Ontología Génica (GO) y de las vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) en los DEG significativamente alterados. Se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) utilizando el software GSEA^[40] (Broad Institute) para evaluar las diferencias en las vías relacionadas con la inmunidad y el metabolismo entre los grupos. Los conjuntos de genes Hallmark y KEGG se obtuvieron de la Base de datos de firmas moleculares (MSigDB)^[41], y se consideraron significativamente enriquecidos los conjuntos de genes con una FDR < 0,25.

Cultivo de líneas celulares

Las células humanas de CCR (HT29, SW480, SW620 y Lovo) y las células de colon fetal humano (FHC) se obtuvieron de la Colección de Cultivos Celulares Estadounidense (ATCC). HT29 pertenece a las líneas celulares CIMP-positivas^[35]. Se sembraron 2,5 × 106 células en placas de 6 pocillos en medio RPMI-1640 (Gibco) suplementado con 10 % de FBS y 1 % de penicilina estreptomicina. Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 95 % de aire y 5 % de CO2. Todas las líneas celulares se cultivaron durante un máximo de 20 pasajes, se verificó que fueran negativas para la contaminación por micoplasma utilizando el kit de detección de micoplasma MycoAlert (Lonza Bioscience) y se autenticaron mediante análisis de genotipado de repeticiones cortas en tándem (STR). Se generaron perfiles STR para todas las líneas celulares y se alinearon con las bases de datos estándar de ATCC y DSMZ, y se confirmó un grado de coincidencia de ≥ 95 % para cada línea celular.

Extracción de ARN

Para el tratamiento de desmetilación, las células se trataron con 10 μM de 5-aza-2'-desoxicitidina^[36] (5-aza-dC) durante 72 h, seguido de la extracción de ARN. Se aisló el ARN total de las células de CCR humanas utilizando el método de extracción con Trizol-cloroformo, según lo descrito por los fabricantes. El cDNA total se transcibió inversamente utilizando el kit de síntesis de cDNA de primera hebra Revertaid (Thermo Scientific, EE. UU.).

PCR cuantitativa en tiempo real

Los primers específicos para SFMBT2 que se utilizaron en la PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) se diseñaron utilizando Primer Premier 5.0 y se produjeron por Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghái, China). GAPDH se utilizó como gen de referencia. Las secuencias de los primers fueron las siguientes: SFMBT2 sentido, 5'-AAAAGTGTCTCGGCTCAGCTA-3' y antisentido, 5'-ACGTGTCCGG GTTGTTCTTAT-3'; GAPDH sentido, 5'-ATGCTGGAAAACCTTGAGCTT-3' y antisentido, 5'-TGGAAGGATCTGCATTAGGGA-3'. La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó en un sistema de PCR en tiempo real 7500 Fast con la mezcla maestra SYBR Green para PCR cuantitativa en tiempo real (TaKaRa).

Inmunohistoquímica

El anticuerpo policlonal anti-humano SFMBT2 (dilución final 1:400) se compró a Proteintech. Los especímenes de parafina se cortaron en secciones de 4 μm de espesor. La tinción inmunohistoquímica de SFMBT2 se realizó en un instrumento automático de inmunohistoquímica Dako, siguiendo las instrucciones del fabricante, que incluían brevemente la inhibición de la peroxidasa endógena, la adición del anticuerpo primario, el lavado de las láminas, la adición de anti-IgG de conejo (Dako), la detección cromogénica, la contratinción, la deshidratación y la eliminación. Las secciones de control negativo se incubaron con PBS en lugar del anticuerpo primario. Las secciones fueron examinadas de forma independiente por dos patólogos con más de 15 años de experiencia, que desconocían la información clinicopatológica. La tinción inmunohistoquímica de SFMBT2 se localizó en el citoplasma y la membrana de las células, y los criterios de cuantificación de la tinción se realizaron de la siguiente manera: con: las células con 5 se clasificaron como positivas.

Procesamiento del plasma

Se recolectaron muestras de sangre (10 mL) utilizando tubos de recolección de sangre BCT® para ADN acelular (Streck, catálogo 218962) y se separaron por centrifugación a 1600 rpm durante 10 min a 4 °C (Beckman Xllegra X-12R), seguida de una segunda centrifugación a 16000 rpm durante 10 min a 4 °C (GeneSpeed GS-1730R), y se almacenaron a -80 °C hasta la separación del ADN.

Secuenciación de metilación dirigida de alto rendimiento

La conversión de bisulfito^[37] del ADN genómico se llevó a cabo utilizando el kit EZ DNA Methylation-Lightning (Zymo Research, Cat# D5031) según las instrucciones del fabricante. El perfilado de metilación dirigido se realizó utilizando la tecnología patentada AnchorIRIS™ (AnchorDx).^[22] Para las muestras de plasma, se utilizaron 10 ng de ADN libre en plasma (cfDNA) para la construcción de la biblioteca. Las bibliotecas se prepararon utilizando el kit de preparación de bibliotecas de metilación EpiVisio™ (AnchorDx, Cat# A0UX00019) y el kit de PCR de indexación EpiVisio™ (AnchorDx, Cat# A2DX00025). Las bibliotecas pre-hibridación con una cantidad total de ADN superior a 400 ng se consideraron cualificadas para el enriquecimiento del objetivo. El enriquecimiento del objetivo se realizó utilizando el kit de enriquecimiento del objetivo EpiVisio™ (AnchorDx, Cat# A0UX00031) junto con un panel de metilación del cáncer diseñado a medida. Para cada reacción de enriquecimiento, se agruparon hasta cuatro bibliotecas de pre-hibridación (con un total de 1.000 ng de ADN) y se capturaron utilizando el panel de metilación PanMet V2, que tiene como objetivo 12.624 regiones CpG preseleccionadas enriquecidas con eventos de metilación específicos del cáncer. Las bibliotecas enriquecidas se secuenciaron en una plataforma Illumina HiSeq X Ten (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) utilizando la secuenciación de apareamiento final. Tanto las bibliotecas de ADN derivadas de tejido como las bibliotecas de cfDNA derivadas de plasma se secuenciaron hasta una profundidad objetivo media de aproximadamente 5.000×, con aproximadamente 20 millones de lecturas de apareamiento final generadas por muestra.

Bioinformática y análisis transcriptómico

Los datos transcriptómicos de pacientes con cáncer colorrectal (CCR) se obtuvieron de la base de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA), incluidos los datos de secuenciación de ARN de los cohortes TCGA-COAD y TCGA-READ. Los datos de expresión génica se descargaron en formato TPM y se transformaron logarítmicamente (log2) antes del análisis. Los pacientes se estratificaron en grupos de alta y baja expresión en función del nivel de expresión medio de SFMBT2. La infiltración de células inmunitarias en los tejidos tumorales se estimó utilizando el algoritmo CIBERSORT^[38] con la matriz de firma génica LM22 y 1.000 permutaciones. Solo se incluyeron en los análisis posteriores las muestras con un valor de p < 0,05 en la salida de CIBERSORT. Los genes expresados diferencialmente (DEG) entre los grupos de alta y baja expresión de SFMBT2 se identificaron utilizando el paquete R “limma”^[39], con umbrales de |cambio de pliegue log2| > 0,5 y tasa de descubrimiento falso (FDR) < 0,05. Se realizaron análisis de enriquecimiento de la Ontología Génica (GO) y de las vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) en los DEG significativamente alterados. Se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) utilizando el software GSEA^[40] (Broad Institute) para evaluar las diferencias en las vías relacionadas con la inmunidad y el metabolismo entre los grupos. Los conjuntos de genes Hallmark y KEGG se obtuvieron de la Base de datos de firmas moleculares (MSigDB)^[41], y se consideraron significativamente enriquecidos los conjuntos de genes con una FDR < 0,25.

Cuantificación y análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos (incluidos la prueba de Chi-cuadrado y la prueba de Wilcoxon) se realizaron utilizando R (versión 3.6.0), SPSS 25.0 (IBM SPSS Statistics 25, IBM, Somers, IL, EE. UU.) y Graphpad Prism (Graphpad Prism 9.5). La significación se determinó con un umbral de p < 0,05. Las curvas de características operativas del receptor (ROC) se generaron con el paquete R pROC^[42] (versión 1.15.3) para evaluar el rendimiento de la metilación de SFMBT2 y la cuantificación de CEA en el diagnóstico precoz y la predicción del pronóstico. La prueba de Chi-cuadrado se utilizó para comparar la relación entre la expresión de SFMBT2 y las características clinicopatológicas en el CCR. La prueba de rango de Wilcoxon se utilizó para comparar el nivel de metilación y la expresión de ARNm de SFMBT2 entre los diferentes grupos. También se calcularon la sensibilidad, la especificidad y los correspondientes intervalos de confianza del 95 % utilizando el paquete “pROC”. Los gráficos de barras, los diagramas de dispersión y otras visualizaciones se generaron utilizando el paquete “ggplot2” (versión 3.4.2). Los mapas de calor se crearon utilizando el paquete “Complex Heatmap” (versión 2.14.0). Los datos se presentan como media ± DE. La significación estadística se determinó mediante una prueba t de Student de dos colas no pareada. *p < 0,05; p < 0,01; *p < 0,001; ****p < 0,0001.