Detección de mutaciones del ADN mitocondrial en células T después de la exposición a 5-FU o cisplatino.

Las células T han sido protagonistas de la inmunoterapia contra el cáncer debido a su papel en las inmunoterapias basadas en el bloqueo de puntos de control, las terapias adoptivas con células T y las vacunas neoantigénicas. A pesar de los éxitos iniciales, la inmunoterapia sigue siendo ineficaz para la mayoría de los pacientes con tumores sólidos. Se ha considerado que la disfunción de las células T es una de las principales barreras para el éxito de la inmunoterapia, y los estudios han demostrado una asociación entre la disminución de la eficacia de las inmunoterapias contra el cáncer y la disfunción de las células T.^[1],^[2],^[3],^[4] Identificar las causas de la disfunción de las células T es crucial para abordar las limitaciones actuales de la inmunoterapia contra el cáncer. Además de la estimulación antigénica crónica y el microambiente tumoral, que conducen a la disfunción de las células T, estudios recientes en ratones sugieren que la función mitocondrial podría estar relacionada con la disfunción de las células T.^[5] Por ejemplo, un estudio demostró que la estimulación antigénica persistente puede afectar la fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) en las células T de ratón, lo que provoca la expresión de genes asociados con la disfunción de las células T.^[6] Otro estudio encontró que la estimulación crónica combinada con la hipoxia interrumpió aún más la integridad mitocondrial, lo que llevó a la disfunción de las células T en ratones.^[7] Las mitocondrias disfuncionales generaron niveles intolerables de especies reactivas de oxígeno (ROS) y promovieron el agotamiento de las células T. Por último, el daño oxidativo mitocondrial se relacionó con la disfunción de las células T reguladoras, lo que a su vez provocó una mayor respuesta autoinmune en un modelo experimental de encefalitis autoinmune.^[8] Sin embargo, las causas específicas de la disfunción mitocondrial que dan como resultado la disfunción de las células T siguen siendo desconocidas.

El ADN mitocondrial (ADNmt) de los mamíferos contiene una densidad muy alta de genes y codifica 22 ARN de transferencia (ARNt), dos ARN ribosómicos (ARNr) y 13 proteínas que son necesarias para la OXPHOS.^[9] Sin embargo, se estima que el ADNmt tiene una tasa de mutación 20 veces mayor que el ADN genómico.^[10] A diferencia del genoma nuclear, el ADNmt carece de histonas protectoras. Además, a diferencia de la ADN polimerasa nuclear, se ha comprobado que la ADN polimerasa del ADNmt carece de eficiencia y capacidad de corrección de pruebas. Aunque las mutaciones individuales del ADNmt pueden ser insignificantes, pueden acumularse con el tiempo en las células y sus células hijas. Como resultado, puede estar presente una mezcla de ADNmt de tipo salvaje y mutado en las células individuales. Esta observación se conoce como heteroplasmia mitocondrial.^[11] Una técnica de célula única desarrollada recientemente permite la detección de mutaciones del ADNmt y la heteroplasmia en células individuales.^[12],^[13],^[14],^[15]

Se seleccionaron dos agentes quimioterapéuticos comunes para la investigación en este estudio. El 5-fluorouracilo (5-FU) es un inhibidor de la timidilato sintasa y se ha utilizado para tratar el cáncer de mama, cabeza y cuello y colorrectal, así como varios otros tipos de cáncer. El 5-FU actúa inhibiendo la síntesis de nucleótidos e incorporando sus metabolitos en la cadena de ADN o ARN en crecimiento para inhibir la síntesis.^[16] El 5-FU actúa sobre las células que se replican activamente, por lo que también daña el ADN celular sano, lo que se supone que causa los efectos secundarios asociados con el tratamiento con 5-FU.^[17] Otro fármaco común a base de platino, el cisplatino, se utiliza para tratar el cáncer de pulmón, ovario, vejiga y varios otros cánceres. La citotoxicidad del cisplatino se debe a su capacidad para entrecruzar las purinas para inhibir la síntesis de ADN e inducir la apoptosis de las células tumorales.^[18] El cisplatino, al igual que el 5-FU, está diseñado para atacar las células tumorales, pero también daña las células sanas para causar efectos secundarios.^[19] Por lo tanto, el 5-FU y el cisplatino atacan indiscriminadamente el ADN para inducir estrés celular.

La integridad mitocondrial es fundamental para el metabolismo y la función de las células T, pero el impacto de las mutaciones del ADNmt inducidas por la quimioterapia en la eficacia de la inmunoterapia sigue siendo poco conocido. Aquí, nuestro objetivo fue estudiar el impacto de los agentes quimioterapéuticos en las células T, además de las propiedades antiproliferativas de estos agentes. Dado que el ADNmt es más susceptible a las mutaciones que el ADN genómico, planteamos la hipótesis de que el 5-FU y el cisplatino pueden inducir mutaciones del ADNmt en las células T y afectar la función de las células T. En este estudio, expusimos células T sanas al 5-FU y al cisplatino y utilizamos una técnica de secuenciación de célula única sensible para detectar las mutaciones del ADNmt. Descubrimos que los agentes quimioterapéuticos comunes, el 5-FU y el cisplatino, inducen mutaciones del ADNmt en las células T, con posibles consecuencias para la actividad mitocondrial y los fenotipos de las células T.

Resultados

El 5-FU inhibe la proliferación y la supervivencia de las células T en dosis altas, pero tiene un impacto mínimo en los perfiles de transcriptoma de las células T

Para investigar el posible impacto del 5-FU en las células T, se estimularon las células T de sangre periférica de cuatro donantes sanos con cuentas anti-CD3/CD28 el día 0. A continuación, las células T proliferantes se trataron con 5-FU a varias concentraciones del día 3 al día 7. Las células T tratadas recibieron una segunda ronda de estimulación con CD3/CD28 el día 10, seguida del tratamiento con 5-FU. Se realizaron un total de tres rondas de tratamientos con 5-FU (Figura 1A). Se contaron los números totales de células T al final de cada ciclo y se normalizaron antes de la siguiente estimulación con CD3/CD28 (Figura 1B). Como se esperaba, los resultados indicaron que el 5-FU inhibió fuertemente la proliferación y la supervivencia de las células T en dosis altas. Después de tres ciclos, las células T no pudieron sobrevivir más allá de la dosis de 1,56 μM.

Además de la proliferación de las células T, buscamos comprender el impacto del 5-FU en los perfiles de expresión génica de las células T a nivel de célula única. Las células T tratadas con tres ciclos de 5-FU (1,56 μM), junto con el control vehículo negativo, se sometieron a un análisis de secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq), seguido de análisis de agrupamiento y trayectoria. Las células T tratadas con 5-FU y las no tratadas de tres donantes se integraron para el análisis de agrupamiento en función de los perfiles de expresión génica (Figura 1C). El análisis de agrupamiento identificó 10 grupos en los donantes y tratamientos (Figura 1D). Para el donante D2008, encontramos que el grupo 7 tenía más células T no tratadas en comparación con las células T tratadas con 5-FU (7,48% frente a 2,77%) (Figura 1D). Por otro lado, para el donante D6053, los grupos 3, 9 y 10 tenían más células T tratadas con 5-FU en comparación con las células T no tratadas (15,10% frente a 6,47%, 3,20% frente a 0,50%, 3,39% frente a 1,27%, respectivamente) (Figura 1D). El donante D1007 no mostró diferencias significativas en el tamaño del grupo entre los dos grupos de tratamiento. Por lo tanto, no encontramos ningún efecto consistente del 5-FU en los tres donantes en el análisis de agrupamiento. De manera similar, identificamos múltiples genes relacionados con las células T, MAL, OX40 y RUNX3, que se expresaron de manera diferente en las células T tratadas con 5-FU, en comparación con el control negativo (Figura S1). Sin embargo, estas diferencias no se observaron en los tres donantes. Por último, se realizó un análisis de trayectoria para estudiar la diferenciación de las células T en estas muestras (Figura 1E). No se encontró ninguna diferencia cuando se compararon las muestras tratadas y no tratadas de donantes individuales, pero se encontraron diferencias entre los donantes (Figura 1E). Al examinar la expresión de los genes MKI67, TIGIT y CCR6 en el pseudotiempo inferido, tampoco se encontró ninguna diferencia en la expresión entre las células tratadas con 5-FU y las células no tratadas en ningún donante (Figura S2). En conjunto, el 5-FU inhibe la proliferación y la supervivencia de las células T de forma dependiente de la dosis. Sin embargo, no observamos ninguna diferencia significativa entre las células T tratadas con 5-FU y el control negativo en todos los donantes en función del análisis de scRNA-seq y el análisis de trayectoria.

Una técnica de secuenciación de ADNmt de célula única revela que el 5-FU induce mutaciones del ADNmt en las células T

Dado que el ADNmt es más susceptible a las mutaciones en comparación con el ADN genómico, planteamos la hipótesis de que el 5-FU puede inducir mutaciones del ADNmt en las células T. Para probar esto, utilizamos una técnica de célula única para secuenciar el ADNmt y realizar ATAC-seq (ensayo para la cromatina accesible a la transposasa mediante secuenciación) simultáneamente (Figura 2A).^[12],^[13],^[14],^[15] En esta técnica, las células se fijaron antes de ser lisadas, por lo que las mitocondrias y el ADNmt se conservaron antes de la preparación de la muestra de ATAC-seq de célula única. Esto nos permitió obtener una biblioteca de ADNmt, así como una biblioteca de accesibilidad de la cromatina para el análisis de agrupamiento. Es importante destacar que este enfoque de célula única fue significativamente más sensible que la secuenciación convencional a granel, ya que podría ayudarnos a detectar diferencias sutiles en el ADNmt a nivel de célula única. Aquí, las mismas muestras de células T tratadas con 5-FU descritas en la Figura 1 se sometieron a secuenciación de ADNmt/ATAC-seq de célula única (Figura 2A).

Para el donante D1007, se obtuvieron 4566 células de alta calidad de la muestra tratada con 5-FU. De manera similar, se obtuvieron 5586 células de alta calidad de la muestra no tratada. Las células tratadas con 5-FU y las no tratadas se fusionaron e integraron para el análisis de agrupamiento en función de la accesibilidad de la cromatina (Figura 2B). Se obtuvieron 21 grupos distintos de células (Figura 2C). A continuación, intentamos identificar las mutaciones del ADNmt inducidas por el 5-FU. Teniendo en cuenta la complejidad de la heteroplasmia mitocondrial, el análisis se simplificó y se centró únicamente en las mutaciones del ADNmt que se encontraron en las células T tratadas con 5-FU, pero que estaban ausentes de las células T no tratadas, de forma similar al enfoque anterior para identificar las mutaciones del ADNmt específicas del tumor.^[20] A diferencia de la heteroplasmia del ADNmt, estas mutaciones de novo fueron inducidas por el tratamiento con 5-FU. En este par de muestras, se detectaron un total de 1000 mutaciones del ADNmt en la muestra de 5-FU, pero no en el control negativo (Figura 2D). A continuación, seguimos la publicación original y aplicamos los parámetros de control de calidad restringidos para filtrar las mutaciones del ADNmt de baja calidad.^[14] Se identificaron un total de 78 mutaciones del ADNmt después del filtrado. Por último, nos centramos en las mutaciones del ADNmt que inducían sustituciones no sinónimas y que se detectaban en 10 o más células con un 10% o más de heteroplasmia del ADNmt. Se identificaron un total de cinco mutaciones del ADNmt en las células T tratadas con 5-FU (Figura 2D; Tabla S1). Las principales mutaciones no sinónimas del ADNmt con el mayor número de células que portan mutaciones del ADNmt se muestran (Figuras 2E–2G). Las células T con mutaciones del ADNmt se resaltan en rojo en los gráficos UMAP.

Las células T tratadas con 5-FU con la mutación 10775G>A (ND4:V6I) se agruparon predominantemente en el grupo #14, un grupo al que contribuyeron principalmente las células T tratadas con 5-FU (Figuras 2B y 2E). En particular, se encontró una elevación del marcador de agotamiento de las células T, EOMES, en el grupo #14, seguido de otro marcador de agotamiento, TIGIT (Figuras S3A y S3B).^[21] Además, se encontró un mínimo de señal de IL-7R en el grupo #14, lo que sugiere una falta de capacidad de autorrenovación y memoria^[21] (Figura S3C). Además, el grupo #14 también muestra una disminución significativa en la accesibilidad de CXCR6 (Figura S3D). Por último, el análisis de enriquecimiento de la ontología génica (GO) sugirió que los 100 genes regulados a la baja estaban asociados con la regulación de las respuestas de las células T (Figura S3E). Por lo tanto, el perfil genético del grupo #14 sugirió que este grupo estaba asociado con un fenotipo de agotamiento de las células T. También detectamos otras mutaciones únicas de las células T expuestas al 5-FU, incluidas 9047T>C (ATPase6:I174T) y 11592G>A (ND4:R278Q), pero no se concentraron en los grupos (Figuras 2F y 2G). Para investigar si estas mutaciones del ADNmt fueron portadas por células T CD4+ o CD8+, las células T tratadas con 5-FU del donante D1007 se dividieron posteriormente en subpoblaciones CD4+ y CD8+, en función de la accesibilidad de la cromatina de CD4 y CD8A. Después de la división, se realizó un análisis de agrupamiento por separado (Figuras S4A y S4B). Se encontró que las células con estas tres mutaciones del ADNmt estaban en las poblaciones de células T CD8+, pero no en las poblaciones de células T CD4+ (Figuras S4C y S4D).

Utilizando el mismo enfoque, se analizaron muestras del donante D6053 mediante secuenciación de ADN mitocondrial (ADNmt) de una sola célula. Se obtuvieron 2.942 células de alta calidad de la muestra tratada con 5-FU y 3.475 células de alta calidad de la muestra no tratada. Las células T tratadas y no tratadas con 5-FU se fusionaron e integraron para el análisis de agrupamiento (Figura S5A). Se identificaron diecinueve grupos distintos de células T (Figura S5B). Se identificó un total de ocho mutaciones únicas de ADNmt en las células T tratadas con 5-FU mediante análisis de genotipado de ADNmt (Figura S5C). Las mutaciones no sinónimas de ADNmt 4632G>A (ND2:A55T), 7785T>C (COII:I67T) y 8154G>A (COII:G190E) se resaltan en rojo en los gráficos UMAP (Figura S5D). Aunque se detectaron mutaciones no sinónimas de ADNmt, estas mutaciones no se concentraron en ningún grupo. El análisis de D2008 y D0010 también reveló que las mutaciones no sinónimas de ADNmt específicas de 5-FU estaban presentes en algunas células, pero estaban dispersas en los gráficos UMAP (Figuras S6 y S7). Al igual que las mutaciones identificadas en D1007, estas mutaciones se encontraron en el subconjunto de células T CD8+. En conjunto, estos resultados indican que el tratamiento con 5-FU puede inducir mutaciones de ADNmt en las células T de cuatro de cuatro donantes, lo que puede detectarse mediante el enfoque de secuenciación de ADNmt de una sola célula (Tabla S1). Sin embargo, una limitación es que las mutaciones de ADNmt podrían inducir daños graves, lo que provocaría la muerte de las células T, lo que no se puede detectar con este enfoque experimental.

El cisplatino induce un gran número de mutaciones de ADNmt en las células T

Dado que observamos que el 5-FU podía inducir mutaciones de ADNmt en las células T, probamos además si el cisplatino, otro agente quimioterapéutico común, también podía inducir mutaciones de ADNmt en las células T. Siguiendo el mismo enfoque, las células T de sangre periférica aisladas de tres donantes sanos se estimularon con cuentas anti-CD3/CD28 durante tres ciclos y se trataron con cisplatino a varias concentraciones (Figura 3A). De manera similar al 5-FU, los resultados mostraron que el cisplatino inhibió fuertemente la proliferación y la supervivencia de las células T a dosis más altas (Figura 3B). Las células T no pudieron sobrevivir a una dosis superior a 0,313 µM al final del ciclo 3. Las células T tratadas con cisplatino (0,313 µM), junto con el control negativo, se sometieron a la misma secuenciación de ADNmt/ATAC de una sola célula. Se aplicaron los mismos criterios restrictivos para identificar las mutaciones no sinónimas de ADNmt.

Del donante D1007, se obtuvieron 10.353 células de alta calidad de la muestra tratada con cisplatino. De manera similar, se obtuvieron 8.900 células de alta calidad de la muestra no tratada. Las células T tratadas y no tratadas con cisplatino se fusionaron e integraron para el análisis posterior. El análisis de agrupamiento de los datos de accesibilidad de la cromatina identificó 24 grupos en las células T analizadas (Figuras 3C y 3D). Se detectó un total de 36 mutaciones de ADNmt únicas de las células T tratadas con cisplatino después de los criterios de control de calidad y filtrado (Figura 3E). Las principales mutaciones de ADNmt identificadas se resaltan en rojo en los gráficos UMAP (Figura 3F). Además, 6451T>C (COI:L183P), 7378T>C (COI:L492P) y 8584G>A (ATPase6:A20T) se asociaron con el grupo n.º 20, que se caracterizó por una mayor accesibilidad de EOMES y una menor accesibilidad de CCR5 y CTLA4 (Figuras S8A–S8C). Las células T que contenían la mutación 3850G>A (ND1:A182T) se asociaron parcialmente con el grupo n.º 14, que se caracterizó por la falta de SELL (CD62L) y una mayor accesibilidad de TNFSF11 (ligando RANK) y TIGIT (Figuras S8A y S8B). Además, el grupo n.º 14 es el único grupo con falta de accesibilidad de SELL (Figura S8D). Las mutaciones 12359C>T (ND5:T8I) y 5382C>T (ND2:L305F) se concentraron en unos pocos grupos (Figura 3F). Por último, las células T tratadas con cisplatino de D1007 se dividieron posteriormente en subconjuntos CD4+ y CD8+ (Figuras S9A y S9B), y las seis mutaciones de ADNmt descritas anteriormente se encontraron en el subconjunto CD8+, pero no en el subconjunto CD4+ (Figuras S9C y S9D).

Utilizando el mismo enfoque, también se identificaron mutaciones de ADNmt específicas de las células T tratadas con cisplatino en el donante D2008. En esta muestra, se obtuvieron 8.040 células de alta calidad de la muestra tratada con cisplatino y se fusionaron e integraron con las células T no tratadas (Figura S10A). El análisis de agrupamiento de las muestras integradas identificó 23 grupos distintos de células T expuestas al cisplatino (Figura S10B). Después de los flujos de trabajo de filtrado, se detectaron un total de 31 mutaciones no sinónimas de ADNmt inducidas por el cisplatino (Figura S10C). Una de las principales mutaciones del análisis de genotipado de ADNmt fue 3413G>C (ND1:G36A), que no se detectó en las células T no tratadas (Figura S10D). Dos mutaciones más únicas de las células T tratadas con cisplatino, 10753T>C (ND4L:L95P) y 15698C>A (Cytb:R318S), también se muestran en la Figura S10D. De manera similar al método anterior, las células T tratadas con cisplatino de D2008 también se dividieron en subconjuntos CD4+ y CD8+ y se agruparon por separado (Figuras S11A y S11B). En contraste con D1007, se detectaron dos mutaciones para D2008, 13552G>A y 13808T>C, que se encontraron principalmente en la población de células T CD4+ (Figura S11C). La mutación 3413G>C se encontró en la población de células T CD8+ (Figura S11D). El análisis de D6053 también condujo a la detección de 16 mutaciones no sinónimas de ADNmt que no estaban presentes en las células T no tratadas, pero las mutaciones no se concentraron en ningún grupo (Figura S12). En conjunto, los resultados indican que el cisplatino puede inducir mutaciones de ADNmt en las células T de tres de tres donantes.

Se detectan mutaciones de ADNmt distintas en la fracción de células T con actividad mitocondrial reducida

El potencial de membrana mitocondrial es un indicador clave de la actividad mitocondrial,^[22] y se puede medir directamente mediante un tinte fluorescente, TMRM (tetrametilrodamina, éster metílico). TMRM se ha utilizado previamente para enriquecer poblaciones de células T con diferentes potenciales de membrana mitocondrial.^[23] Para probar si las mutaciones de ADNmt podrían dañar la actividad mitocondrial, las células T tratadas con cisplatino se tiñeron con TMRM y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos para medir la actividad mitocondrial. Las fracciones de TMRM bajo y alto, aproximadamente del 10% al 15% de las poblaciones de células T, se clasificaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), seguida del análisis de una sola célula (Figura 4A). Comenzamos el análisis con las células T tratadas con cisplatino de D1007 debido al gran número de células con mutaciones. La fracción de TMRM bajo, el 12,5% de las células T tratadas con cisplatino del donante D1007, se clasificó para el análisis de secuenciación de ADNmt/ATAC de una sola célula (Figura 4B). También se obtuvo la población de células T de TMRM alto (11,0%). Para identificar las mutaciones de ADNmt relacionadas con la disfunción mitocondrial, buscamos mutaciones presentes tanto en la fracción de TMRM bajo como en las células T tratadas con cisplatino originales. Se obtuvieron un total de 5.808 células de alta calidad de esta fracción de TMRM bajo. De manera similar, se obtuvieron 4.762 células de alta calidad de la fracción de TMRM alto. La fracción de TMRM bajo se fusionó e integró con las células T tratadas con cisplatino originales y las células T no tratadas para el análisis posterior. El análisis de agrupamiento del conjunto de datos combinado identificó 29 grupos distintos (Figuras 4C y 4D).

A continuación, se resaltaron las mutaciones de ADNmt detectadas en rojo para las células T tratadas con cisplatino originales y en púrpura para la fracción de TMRM bajo en los gráficos UMAP, respectivamente (Figuras 4E y 4F). Se detectaron seis mutaciones de ADNmt detectadas en las células T tratadas con cisplatino originales también en la fracción de TMRM bajo de las células T tratadas (Figuras 3F, 4E y 4F). Cinco de las seis mutaciones detectadas originalmente se detectaron solo en la fracción de TMRM bajo y no en la fracción de TMRM alto. Se detectaron y agruparon las células T tratadas con cisplatino que contenían la mutación 3850G>A (ND1:A182T) en la fracción de TMRM bajo. Once células (0,01%) en la fracción de TMRM alto contenían la mutación 3850G>A (ND1:A182T) (Tabla S1). Las mutaciones 5382C>T (ND2:L305F) y 12359C>T (ND5:T8I) se detectaron exclusivamente en las células T tratadas con cisplatino originales y en la fracción de TMRM bajo de las células T tratadas con cisplatino. Las otras tres mutaciones detectadas originalmente, 6451T>C (COI:L183P), 7378T>C (COI:L492P) y 8584G>A (ATPase6:A20T), también se detectaron en la fracción de TMRM bajo, pero no en la fracción de TMRM alto (Tabla S1). A continuación, utilizamos el mismo enfoque para estudiar la fracción de TMRM alto. Los conjuntos de datos de las fracciones de TMRM alto y bajo se fusionaron con los conjuntos de datos de las células T tratadas con cisplatino originales y las células T no tratadas (Figuras S13A y S13B). Se identificaron tres mutaciones únicas de ADNmt en la fracción de TMRM alto que no se detectaron en la fracción de TMRM bajo (Figuras S13C–S13E; Tabla S1).

De manera similar, se realizó la tinción y clasificación de TMRM para otro donante tratado con cisplatino, D2008. Se obtuvieron un total de 3.004 células de alta calidad de la fracción de TMRM bajo (12,8%). De manera similar, se obtuvieron 2.409 células de alta calidad de la fracción de TMRM alto (12,5%). Las células T tratadas con cisplatino originales y las células T no tratadas se fusionaron e integraron con la fracción de células T de TMRM bajo para el análisis posterior (Figura S14A). El análisis de agrupamiento del conjunto de datos scATAC-seq fusionado produjo 25 grupos (Figura S14B). Tres de las mutaciones de ADNmt inducidas por cisplatino detectadas originalmente también se detectaron en las fracciones de células T de TMRM bajo (Figuras S14C y S14D). A continuación, los conjuntos de datos de las fracciones de TMRM alto y bajo se fusionaron con los conjuntos de datos de las células T tratadas con cisplatino originales y las células T no tratadas de D2008 (Figura S15A). El análisis de agrupamiento del conjunto de datos combinado identificó 28 grupos de células (Figura S15B). Se detectaron ocho mutaciones únicas tanto en las células T tratadas con cisplatino originales como en la fracción de TMRM alto, pero no en la fracción de TMRM bajo (Tabla S1). Tres de ellas se muestran en las Figuras S15C–S15E. Se detectó la mutación 14087T>C (ND5:I584T) tanto en las fracciones de TMRM alto como bajo, lo que sugiere que no tuvo ningún impacto en la actividad mitocondrial. En conjunto, al utilizar la tinción de TMRM para clasificar las células T de TMRM bajo, identificamos varias mutaciones asociadas con una disminución de la actividad mitocondrial. Estos resultados sugieren que algunas mutaciones de ADNmt inducidas por el cisplatino podrían reducir la actividad mitocondrial en las células T. Por el contrario, las mutaciones que solo se encontraron en la fracción de TMRM alto podrían mejorar potencialmente la salud mitocondrial.

Las mutaciones de ADNmt en las células T con actividad mitocondrial reducida también se detectan en las células T con masa mitocondrial reducida

Para estudiar más a fondo la relación entre las mutaciones del ADN mitocondrial (ADNmt) inducidas por cisplatino y la función mitocondrial, utilizamos un colorante fluorescente, MitoTracker Green FM, como indicador de la masa mitocondrial. De manera similar a la tinción con TMRM, las células T tratadas con cisplatino del donante D1007 se tiñeron con MitoTracker Green FM. Las fracciones de baja y alta masa mitocondrial, que representan aproximadamente el 10-15% de las poblaciones de células T, se clasificaron mediante citometría de flujo (FACS), seguida de un análisis de secuenciación de ADNmt/ATAC-seq a nivel de célula única (Figura 5A). Se obtuvieron un total de 7427 células de alta calidad de la fracción de baja masa mitocondrial, y un total de 3474 células de la fracción de alta masa mitocondrial. Para los fines de este análisis, las células originales no tratadas y las células tratadas con cisplatino, junto con la fracción de baja masa mitocondrial y la fracción de baja TMRM, se combinaron e integraron, como se muestra en la Figura 5B. El análisis de agrupamiento basado en la accesibilidad de la cromatina identificó un total de 34 grupos (Figura 5C). Las mutaciones de ADNmt detectadas se resaltan en rojo para las células T originales tratadas con cisplatino, en púrpura para la fracción de baja TMRM y en verde para la fracción de baja masa mitocondrial (Figuras 5D–5F). Cabe destacar que cuatro de las seis mutaciones de ADNmt tanto en las células T originales tratadas con cisplatino como en la fracción de baja TMRM también se detectaron en la fracción de baja masa mitocondrial, que incluyó 3850G>A, 5382C>T, 12359C>T y 6451T>C (Figura 5F). Las mutaciones 3850G>A, 12359C>T y 6451T>C se detectaron en la fracción de baja masa mitocondrial, pero no en la fracción de alta masa mitocondrial. La mutación 5382C>T se detectó en 15 células (0,03%) en la fracción de alta masa mitocondrial. De las seis mutaciones originales identificadas en las células tratadas con cisplatino, 7378T>C y 8584G>A no se detectaron en absoluto en la fracción de masa mitocondrial. Estos resultados sugieren que estas cuatro mutaciones de ADNmt están asociadas tanto con una baja masa mitocondrial como con una baja actividad mitocondrial.

Por último, las fracciones de alta y baja masa mitocondrial se combinaron e integraron con las fracciones de alta y baja TMRM, junto con las células T originales tratadas con cisplatino y las células T no tratadas, seguidas de un análisis de agrupamiento (Figuras S16A y S16B). Las tres mutaciones de alta TMRM identificadas previamente también se detectaron en la fracción de alta masa mitocondrial, pero no se encontraron en las fracciones de baja TMRM o de baja masa mitocondrial (Figuras S16C–S16E). Esto sugiere una vez más que algunas de las mutaciones de ADNmt inducidas por cisplatino podrían no dañar la función mitocondrial.

Se detectan mutaciones de ADNmt en las células T infiltrantes tumorales de pacientes con cáncer colorrectal después de la exposición a agentes quimioterapéuticos

Nuestros resultados mostraron que el 5-FU y el cisplatino pueden inducir mutaciones de ADNmt en las células T. Luego, hipotetizamos que las células T que residen en los tumores podrían contener mutaciones de ADNmt después de que los pacientes fueran tratados con quimioterapia. Para probar esto, utilizamos la misma técnica de secuenciación de ADNmt/ATAC-seq a nivel de célula única para estudiar tres tumores de pacientes con cáncer colorrectal metastásico que habían sido expuestos a la quimioterapia FOLFOX (5-FU y oxaliplatino) antes de la cirugía para extirpar sus tumores recurrentes. En resumen, después de la resección, las muestras tumorales se disociaron y se crioconservaron. El día del experimento, las muestras tumorales se descongelaron y las células TIL CD3+ se clasificaron y se sometieron a la secuenciación de ADNmt/ATAC-seq a nivel de célula única (Figura 6A).

Un paciente con cáncer colorrectal recibió 12 ciclos de terapia FOLFOX y radioterapia 3 meses antes de la resección de la metástasis hepática. Después de la clasificación y la secuenciación a nivel de célula única, se obtuvieron 6413 células TIL de alta calidad de la muestra tumoral. El análisis de agrupamiento de las células TIL identificó 10 grupos distintos de células T (Figura 6B). Además, se obtuvieron 4849 células de alta calidad de la muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), que también se sometieron a un análisis de agrupamiento (Figura 6C). En total, se detectaron 701 mutaciones en la muestra de células TIL que no se encontraron en la muestra de PBMC (Figura 6D). Después de aplicar parámetros de control de calidad restringidos y otros criterios, se detectaron un total de 24 mutaciones de ADNmt no sinónimas en la muestra de células TIL. La mutación de ADNmt predominante identificada en la muestra de células TIL fue 6516G>A (COI:G250S), que se concentró en el grupo #3, seguida de los grupos #1 y #5 (Figura 6E); las mutaciones 12014>T (ND4:L419F) y 4675T>C (ND2:I69T) se encontraron principalmente en el grupo #1. Se muestra una mutación de ADNmt 9554G>A que se detectó tanto en las PBMC como en las células TIL como control (Figuras 6F y 6G). Para identificar marcadores genéticos, dado que los grupos #1, #3 y #5 se agruparon cerca unos de otros en el UMAP, los perfiles genéticos de estos grupos fueron similares. Luego, comparamos los marcadores genéticos entre el grupo #3 y el grupo #2 (también #3 frente a #4 y #3 frente a #6). Varios marcadores de agotamiento de las células T, ENTPD1 (CD39), CXCL13, PDCD1 (PD-1), TOX, LAG3 y CTLA4, se elevaron en el grupo #3, en comparación con el #2 (Figura S17). Los datos para el análisis estadístico se muestran en la Tabla S2. También encontramos marcadores de células T citotóxicas/efectoras elevados, que incluyen PFR1 (perforina 1), GZMA (granzima A), IFNG (interferón gamma [IFN-γ]) y ZNF683 (Hobit). Además, el grupo 3 se asoció con una disminución de los marcadores de células T correlacionados con células T más jóvenes (naïve/memoria), como IL-7R y el factor de transcripción 7 (TCF7) (Figura S17). Se observaron observaciones similares también en los grupos #1 y #5 (Figura S17; Tabla S2). En conjunto, se identificaron mutaciones de ADNmt en las células TIL asociadas con un aumento del agotamiento, la citotoxicidad y una disminución de los fenotipos de células T más jóvenes.

Para caracterizar aún más los fenotipos de las células TIL que contienen mutaciones de ADNmt, realizamos un análisis de proyección utilizando grupos de referencia de scATAC-seq, que se establecieron previamente por Satpathy et al. utilizando células TIL aisladas de biopsias de tumores de carcinoma de células basales (Figura 6H).^[24] La proyección de las células TIL en los grupos de referencia condujo a una gran población de células TIL que se agruparon dentro de los grupos de células T CD8+ agotadas (Tex) intermedias y terminales (Figura 6H). Las células T con las tres mutaciones de ADNmt identificadas también se agruparon dentro de los grupos de células CD8+ Tex (Figura 6J). La mutación 6516G>A se agrupó predominantemente dentro del grupo Tex terminal. Este análisis validó aún más los fenotipos de agotamiento de las células TIL con las mutaciones de ADNmt seleccionadas.

De manera similar, el segundo paciente con cáncer colorrectal se había sometido a cuatro ciclos de quimioterapia FOLFOX y radioterapia. Se obtuvo una muestra tumoral de la metástasis hepática y muestras de sangre aproximadamente 6 meses después de la quimioterapia y la radioterapia. Se obtuvieron un total de 2873 células de alta calidad de las células TIL, y se identificaron 19 grupos principales (Figura S18A). Además, se obtuvieron 5968 células de alta calidad de las PBMC (Figura S18B). Después del filtrado, se identificaron un total de nueve mutaciones de ADNmt específicas de las células TIL (Figura S18C). Se muestran tres mutaciones de ADNmt específicas de las células TIL (Figura S18D). El tercer paciente con cáncer colorrectal fue tratado con 12 ciclos de terapia FOLFOX. Se obtuvo una muestra tumoral de la metástasis hepática recurrente, junto con una muestra de sangre, 15 meses después de la finalización de la terapia FOLFOX. Se obtuvieron un total de 2870 células de alta calidad de las células TIL, y el agrupamiento de la accesibilidad de la cromatina identificó 14 grupos distintos de células TIL (Figura S18E). Del mismo modo, se obtuvieron 4681 células de alta calidad de las PBMC (Figura S18F). Después del filtrado, se identificaron un total de cinco mutaciones específicas de las células TIL (Figura S18G). Las mutaciones de ADNmt detectadas incluyeron 3424G>A (ND1:V40M), 9229A>G (COII:Y8C) y 14093T>C (ND5:L586), pero encontramos menos células que contenían mutaciones de ADNmt no sinónimas en comparación con los otros dos donantes (Figura S18H). En resumen, detectamos células TIL con mutaciones de ADNmt en los tres pacientes con cáncer colorrectal que se habían sometido a quimioterapia FOLFOX antes del análisis. Se detectó un mayor número de células TIL con mutaciones de ADNmt en el paciente 1, pero menos en el paciente 2 e incluso menos en el paciente 3. Esta observación se correlacionó vagamente con el tiempo entre la quimioterapia y el momento del muestreo del tumor, ya que los tumores se obtuvieron 3, 6 y 15 meses después de la última dosis de quimioterapia, respectivamente. Hipotetizamos que las células TIL eventualmente fueron reemplazadas por células T frescas de la sangre periférica, y por lo tanto, se identificaron muy pocas células TIL que contenían mutaciones de ADNmt del tercer paciente. Es importante destacar que se requiere una gran cohorte de pacientes con varios puntos de tiempo posteriores a la quimioterapia para estudiar la posible correlación entre ellos.

El 5-FU inhibe la proliferación y la supervivencia de las células T en dosis altas, pero tiene un impacto mínimo en los perfiles de transcriptoma de las células T

Para investigar el posible impacto del 5-FU en las células T, las células T de sangre periférica de cuatro donantes sanos se estimularon con cuentas anti-CD3/CD28 el día 0. Luego, las células T proliferantes se trataron con 5-FU a varias concentraciones del día 3 al día 7. Las células T tratadas recibieron una segunda ronda de estimulación con CD3/CD28 el día 10, seguida del tratamiento con 5-FU. Se realizaron un total de tres rondas de tratamientos con 5-FU (Figura 1A). Se contaron los números totales de células T al final de cada ciclo y se normalizaron antes de la siguiente estimulación con CD3/CD28 (Figura 1B). Como se esperaba, los resultados indicaron que el 5-FU inhibió fuertemente la proliferación y la supervivencia de las células T en dosis altas. Después de tres ciclos, las células T no pudieron sobrevivir más allá de la dosis de 1,56 μM.

Además de la proliferación de las células T, buscamos comprender el impacto del 5-FU en los perfiles de expresión génica de las células T a nivel de célula única. Las células T tratadas con tres ciclos de 5-FU (1,56 μM), junto con el control vehículo negativo, se sometieron a un análisis de secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq), seguido de un análisis de agrupamiento y trayectoria (Figura 1C). Las células T tratadas con 5-FU y las células T no tratadas de tres donantes se integraron para el análisis de agrupamiento basado en los perfiles de expresión génica (Figura 1D). El análisis de agrupamiento identificó 10 grupos en los donantes y tratamientos (Figura 1D). Para el donante D2008, encontramos que el grupo 7 tenía más células T no tratadas en comparación con las células T tratadas con 5-FU (7,48% frente a 2,77%) (Figura 1D). Por otro lado, para el donante D6053, los grupos 3, 9 y 10 tenían más células T tratadas con 5-FU en comparación con las células T no tratadas (15,10% frente a 6,47%, 3,20% frente a 0,50%, 3,39% frente a 1,27%, respectivamente) (Figura 1D). El donante D1007 no mostró una diferencia significativa en el tamaño del grupo entre los dos grupos de tratamiento. Por lo tanto, no encontramos un efecto consistente del 5-FU en los tres donantes en el análisis de agrupamiento. De manera similar, identificamos múltiples genes relacionados con las células T, MAL, OX40 y RUNX3, que se expresaron de manera diferente en las células T tratadas con 5-FU, en comparación con el control negativo (Figura S1). Sin embargo, esas diferencias no se observaron en los tres donantes. Por último, se realizó un análisis de trayectoria para estudiar la diferenciación de las células T en estas muestras (Figura 1E). No se encontró ninguna diferencia cuando comparamos las muestras tratadas frente a las no tratadas de donantes individuales, pero se encontraron diferencias entre los donantes (Figura 1E). Al examinar la expresión de los genes MKI67, TIGIT y CCR6 en el pseudotiempo inferido, nuevamente, no se encontró ninguna diferencia en la expresión entre las células tratadas con 5-FU y las células no tratadas en ningún donante (Figura S2). En conjunto, el 5-FU inhibe la proliferación y la supervivencia de las células T de manera dependiente de la dosis. Sin embargo, no observamos ninguna diferencia significativa entre las células T tratadas con 5-FU y el control negativo en los tres donantes según el análisis de scRNA-seq y el análisis de trayectoria.

Una técnica de secuenciación de ADNmt a nivel de célula única revela que el 5-FU induce mutaciones de ADNmt en las células T

Dado que el ADNmt es más susceptible a las mutaciones en comparación con el ADN genómico, planteamos la hipótesis de que el 5-FU puede inducir mutaciones en el ADNmt de las células T. Para probar esto, utilizamos una técnica de célula única para secuenciar el ADNmt y realizar ATAC-seq (ensayo para la cromatina accesible a la transposasa mediante secuenciación) de forma concurrente (Figura 2A).^[12],^[13],^[14],^[15] En esta técnica, las células se fijaron antes de ser lisadas, por lo que las mitocondrias y el ADNmt se conservaron antes de la preparación de la muestra de ATAC-seq de célula única. Esto nos permitió obtener una biblioteca de ADNmt, así como una biblioteca de accesibilidad de la cromatina para el análisis de agrupamiento. Es importante destacar que este enfoque de célula única fue significativamente más sensible que la secuenciación convencional a granel, ya que podría ayudarnos a detectar diferencias sutiles en el ADNmt a nivel de célula única. Aquí, las mismas muestras de células T tratadas con 5-FU descritas en la Figura 1 se sometieron a secuenciación de ADNmt/ATAC-seq de célula única (Figura 2A).

Para el donante D1007, se obtuvieron 4.566 células de alta calidad de la muestra tratada con 5-FU. De manera similar, se obtuvieron 5.586 células de alta calidad de la muestra no tratada. Las células tratadas y no tratadas con 5-FU se fusionaron e integraron para el análisis de agrupamiento basado en la accesibilidad de la cromatina (Figura 2B). Se obtuvieron veintiuna agrupaciones distintas de células (Figura 2C). A continuación, intentamos identificar las mutaciones del ADNmt inducidas por el 5-FU. Teniendo en cuenta la complejidad de la heteroplasmia mitocondrial, el análisis se simplificó y se centró únicamente en las mutaciones del ADNmt que se encontraron en las células T tratadas con 5-FU, pero que estaban ausentes en las células T no tratadas, de forma similar al enfoque anterior para identificar las mutaciones del ADNmt específicas del tumor.^[20] A diferencia de la heteroplasmia del ADNmt, estas mutaciones de novo fueron inducidas por el tratamiento con 5-FU. En este par de muestras, se detectaron un total de 1.000 mutaciones del ADNmt en la muestra de 5-FU, pero no en el control negativo (Figura 2D). A continuación, seguimos la publicación original y aplicamos los parámetros de control de calidad restringidos para eliminar las mutaciones del ADNmt de baja calidad.^[14] Se identificaron un total de 78 mutaciones del ADNmt después del filtrado. Por último, nos centramos en la investigación de las mutaciones del ADNmt que inducían sustituciones no sinónimas y que se detectaban en 10 o más células con un 10% o más de heteroplasmia del ADNmt. Se identificaron un total de cinco mutaciones del ADNmt en las células T tratadas con 5-FU (Figura 2D; Tabla S1). Se muestran las principales mutaciones no sinónimas del ADNmt con el mayor número de células que portan mutaciones del ADNmt (Figuras 2E–2G). Las células T con mutaciones del ADNmt se resaltan en rojo en los gráficos UMAP.

Las células T tratadas con 5-FU con la mutación 10775G>A (ND4:V6I) se agruparon predominantemente en la agrupación n.º 14, una agrupación a la que contribuyeron principalmente las células T tratadas con 5-FU (Figuras 2B y 2E). Cabe destacar que se encontró una elevación del marcador de agotamiento de las células T EOMES en la agrupación n.º 14, seguido de otro marcador de agotamiento, TIGIT (Figuras S3A y S3B).^[21] Además, se encontró un mínimo de señal de la interleucina (IL)-7R en la agrupación n.º 14, lo que sugiere una falta de capacidad de autorrenovación y de memoria.^[21] (Figura S3C). Además, la agrupación n.º 14 también muestra una disminución significativa en la accesibilidad de CXCR6 (Figura S3D). Por último, el análisis de enriquecimiento de la ontología génica (GO) sugirió que los 100 genes más regulados a la baja estaban asociados con la regulación de las respuestas de las células T (Figura S3E). Por lo tanto, el perfil genético de la agrupación n.º 14 sugirió que esta agrupación estaba asociada con un fenotipo de agotamiento de las células T. También detectamos otras mutaciones únicas de las células T expuestas al 5-FU, incluidas 9047T>C (ATPase6:I174T) y 11592G>A (ND4:R278Q), pero no se concentraron en las agrupaciones (Figuras 2F y 2G). Para investigar si estas mutaciones del ADNmt eran portadas por células T CD4+ o CD8+, las células T tratadas con 5-FU del donante D1007 se dividieron posteriormente en subpoblaciones CD4+ y CD8+, basándose en la accesibilidad de la cromatina de CD4 y CD8A. Después de la división, se realizó el análisis de agrupamiento por separado (Figuras S4A y S4B). Se encontraron células con estas tres mutaciones del ADNmt en las poblaciones de células T CD8+, pero no en las poblaciones de células T CD4+ (Figuras S4C y S4D).

Utilizando el mismo enfoque, se analizaron las muestras del donante D6053 mediante la secuenciación del ADNmt de célula única. Se obtuvieron 2.942 células de alta calidad de la muestra tratada con 5-FU y 3.475 células de alta calidad de la muestra no tratada. Las células T tratadas y no tratadas con 5-FU se fusionaron e integraron para el análisis de agrupamiento (Figura S5A). Se identificaron diecinueve agrupaciones distintas de células T (Figura S5B). Se identificaron un total de ocho mutaciones únicas del ADNmt en las células T tratadas con 5-FU mediante el análisis de genotipado del ADNmt (Figura S5C). Las mutaciones no sinónimas del ADNmt 4632G>A (ND2:A55T), 7785T>C (COII:I67T) y 8154G>A (COII:G190E) se resaltan en rojo en los gráficos UMAP (Figura S5D). Aunque se detectaron mutaciones no sinónimas del ADNmt, estas mutaciones del ADNmt no se concentraron en ninguna de las agrupaciones. El análisis de D2008 y D0010 también reveló que las mutaciones no sinónimas específicas del 5-FU del ADNmt estaban presentes en algunas células, pero estaban dispersas en los gráficos UMAP (Figuras S6 y S7). Al igual que las mutaciones identificadas en D1007, estas mutaciones se encontraron en el subconjunto de células T CD8+. En conjunto, estos resultados indican que el tratamiento con 5-FU puede inducir mutaciones del ADNmt en las células T de cuatro de cuatro donantes, lo que puede detectarse mediante el enfoque de secuenciación del ADNmt de célula única (Tabla S1). Sin embargo, una limitación es que las mutaciones del ADNmt pueden inducir daños graves, lo que provocaría la muerte de las células T, lo que no se puede detectar mediante este enfoque experimental.

La cisplatina induce un gran número de mutaciones del ADNmt en las células T

Dado que observamos que el 5-FU podía inducir mutaciones del ADNmt en las células T, probamos además si la cisplatina, otro agente quimioterapéutico común, también podía inducir mutaciones del ADNmt en las células T. Siguiendo el mismo enfoque, las células T de sangre periférica aisladas de tres donantes sanos se estimularon con cuentas anti-CD3/CD28 durante tres ciclos y se trataron con cisplatina a varias concentraciones (Figura 3A). De forma similar al 5-FU, los resultados mostraron que la cisplatina inhibió fuertemente la proliferación y la supervivencia de las células T a dosis más altas (Figura 3B). Las células T no pudieron sobrevivir a una dosis superior a 0,313 µM al final del ciclo 3. Las células T tratadas con cisplatina (0,313 µM), junto con el control negativo, se sometieron al mismo análisis de secuenciación del ADNmt/ATAC de célula única. Se aplicaron los mismos criterios restringidos para identificar las mutaciones no sinónimas del ADNmt.

Del donante D1007, se obtuvieron 10.353 células de alta calidad de la muestra tratada con cisplatina. De forma similar, se obtuvieron 8.900 células de alta calidad de la muestra no tratada. Las células T tratadas y no tratadas con cisplatina se fusionaron e integraron para el análisis posterior. El análisis de agrupamiento a partir de los datos de accesibilidad de la cromatina identificó 24 agrupaciones en las células T analizadas (Figuras 3C y 3D). Se detectaron un total de 36 mutaciones del ADNmt únicas de las células T tratadas con cisplatina después del control de calidad y los criterios de filtrado (Figura 3E). Las principales mutaciones del ADNmt identificadas se resaltan en rojo en los gráficos UMAP (Figura 3F). Además, 6451T>C (COI:L183P), 7378T>C (COI:L492P) y 8584G>A (ATPase6:A20T) se asociaron con la agrupación n.º 20, que se caracterizó por una mayor accesibilidad de EOMES y una menor accesibilidad de CCR5 y CTLA4 (Figuras S8A–S8C). Las células T que portaban 3850G>A (ND1:A182T) estaban, en parte, asociadas con la agrupación n.º 14, que se caracterizó por la falta de SELL (CD62L) y una mayor accesibilidad de TNFSF11 (ligando RANK) y TIGIT (Figuras S8A y S8B). Además, la agrupación n.º 14 es la única agrupación con una falta de accesibilidad de SELL (Figura S8D). Las mutaciones 12359C>T (ND5:T8I) y 5382C>T (ND2:L305F) se concentraron en varias agrupaciones (Figura 3F). Por último, las células T tratadas con cisplatina del donante D1007 se dividieron posteriormente en subconjuntos CD4+ y CD8+ (Figuras S9A y S9B), y se descubrió que las seis mutaciones del ADNmt descritas anteriormente se encontraban en el subconjunto de células T CD8+, pero no en el subconjunto de células T CD4+ (Figuras S9C y S9D).

Utilizando el mismo enfoque, también se identificaron las mutaciones del ADNmt específicas de las células T tratadas con cisplatina en el donante D2008. En esta muestra, se obtuvieron 8.040 células de alta calidad de la muestra tratada con cisplatina y se fusionaron e integraron con las células T no tratadas (Figura S10A). El análisis de agrupamiento de las muestras integradas identificó 23 agrupaciones distintas de células T expuestas a la cisplatina (Figura S10B). Después de los flujos de trabajo de filtrado, se detectaron un total de 31 mutaciones no sinónimas del ADNmt inducidas por la cisplatina (Figura S10C). Una de las principales mutaciones del análisis de genotipado del ADNmt fue 3413G>C (ND1:G36A), que no se detectó en las células T no tratadas (Figura S10D). También se muestran dos mutaciones más únicas de las células T tratadas con cisplatina, 10753T>C (ND4L:L95P) y 15698C>A (Cytb:R318S) (Figura S10D). De forma similar al método anterior, las células T tratadas con cisplatina del donante D2008 también se dividieron en subconjuntos CD4+ y CD8+ y se agruparon por separado (Figuras S11A y S11B). En contraste con D1007, se encontraron dos mutaciones para D2008, 13552G>A y 13808T>C, que se encontraron principalmente en la población de células T CD4+ (Figura S11C). La mutación 3413G>C se encontró en la población de células T CD8+ (Figura S11D). El análisis de D6053 también condujo a la detección de 16 mutaciones no sinónimas del ADNmt que no estaban presentes en las células T no tratadas, pero las mutaciones no se concentraron en ninguna de las agrupaciones (Figura S12). En conjunto, los resultados indican que la cisplatina puede inducir mutaciones del ADNmt en las células T de tres de tres donantes.

Se detectan mutaciones distintas del ADNmt en la fracción de células T con una actividad mitocondrial reducida

El potencial de membrana mitocondrial es un indicador clave de la actividad mitocondrial,^[22] y se puede medir directamente mediante un colorante fluorescente, TMRM (tetrametilrodamina, éster metílico). TMRM se ha utilizado previamente para enriquecer las poblaciones de células T con diferentes potenciales de membrana mitocondrial.^[23] Para probar si las mutaciones del ADNmt podrían dañar la actividad mitocondrial, las células T tratadas con cisplatina se tiñeron con TMRM y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos para medir la actividad mitocondrial. Las fracciones de TMRM bajo y alto, aproximadamente del 10% al 15% de las poblaciones de células T, se clasificaron mediante clasificación de células activada por fluorescencia (FACS), seguida del análisis de célula única posterior (Figura 4A). Comenzamos el análisis con las células T tratadas con cisplatina del donante D1007 debido al gran número de células con mutaciones. La fracción de TMRM bajo, el 12,5% de las células T tratadas con cisplatina del donante D1007, se clasificó para el análisis de secuenciación del ADNmt/ATAC de célula única (Figura 4B). También se obtuvo la población de células T de TMRM alto (11,0%). Para identificar las mutaciones del ADNmt relacionadas con la disfunción mitocondrial, buscamos mutaciones presentes tanto en la fracción de TMRM bajo como en las células T tratadas con cisplatina originales. Se obtuvieron un total de 5.808 células de alta calidad de esta fracción de TMRM bajo. De igual manera, se obtuvieron 4.762 células de alta calidad de la fracción de TMRM alto. La fracción de TMRM bajo se fusionó e integró con las células T tratadas con cisplatina originales y las células T no tratadas para el análisis posterior. El análisis de agrupamiento del conjunto de datos combinado identificó 29 agrupaciones distintas (Figuras 4C y 4D).

A continuación, las mutaciones del ADNmt detectadas se resaltaron en rojo para las células T tratadas con cisplatino y en púrpura para la fracción TMRM baja en los gráficos UMAP, respectivamente (Figuras 4E y 4F). Seis de las mutaciones del ADNmt mencionadas anteriormente, detectadas en las células T tratadas con cisplatino, también se detectaron en la fracción TMRM baja de las células T tratadas (Figuras 3F, 4E y 4F). Cinco de las seis mutaciones detectadas originalmente se encontraron solo en la fracción TMRM baja y no en la fracción TMRM alta. Se detectaron y agruparon en la fracción TMRM baja las células T tratadas con cisplatino que presentaban la mutación 3850G>A (ND1:A182T). Once células (0,01%) en la fracción TMRM alta presentaban la mutación 3850G>A (ND1:A182T) (Tabla S1). Las mutaciones 5382C>T (ND2:L305F) y 12359C>T (ND5:T8I) se detectaron exclusivamente en las células tratadas con cisplatino y en la fracción TMRM baja de las células T tratadas con cisplatino. Las otras tres mutaciones detectadas originalmente, 6451T>C (COI:L183P), 7378T>C (COI:L492P) y 8584G>A (ATPase6:A20T), también se detectaron en la fracción TMRM baja, pero no en la fracción TMRM alta (Tabla S1). A continuación, utilizamos el mismo enfoque para estudiar la fracción TMRM alta. Los conjuntos de datos de células individuales de las fracciones TMRM alta y TMRM baja se fusionaron con los conjuntos de datos de células T tratadas y no tratadas con cisplatino (Figuras S13A y S13B). Se identificaron tres mutaciones únicas del ADNmt en la fracción TMRM alta que no se detectaron en la fracción TMRM baja (Figuras S13C–S13E; Tabla S1): 12560A>G (ND5:Q75R), 10158T>C (ND3:S34P) y 15570T>C (Cytb:L275P).

De manera similar, se realizó la tinción y clasificación con TMRM para otro donante tratado con cisplatino, D2008. Se obtuvieron un total de 3004 células de alta calidad de la fracción TMRM baja (12,8%). Asimismo, se obtuvieron 2409 células de alta calidad de la fracción TMRM alta (12,5%). Las células T tratadas y no tratadas con cisplatino se fusionaron e integraron con la fracción de células T TMRM baja para el análisis posterior (Figura S14A). El análisis de agrupamiento del conjunto de datos scATAC-seq fusionado arrojó 25 grupos (Figura S14B). Tres de las mutaciones del ADNmt inducidas por cisplatino detectadas originalmente también se detectaron en las fracciones de células T TMRM baja (Figuras S14C y S14D). A continuación, los conjuntos de datos de las fracciones TMRM alta y baja se fusionaron con los conjuntos de datos de las células T tratadas y no tratadas con cisplatino del donante D2008 (Figura S15A). El análisis de agrupamiento del conjunto de datos combinado identificó 28 grupos de células (Figura S15B). Se detectaron ocho mutaciones únicas tanto en las células tratadas con cisplatino como en la fracción TMRM alta, pero no en la fracción TMRM baja (Tabla S1). Tres de ellas se muestran en las Figuras S15C–S15E. La mutación 14087T>C (ND5:I584T) se detectó tanto en las fracciones TMRM alta como baja, lo que sugiere que no tuvo un impacto en la actividad mitocondrial. En conjunto, al utilizar la tinción con TMRM para clasificar las células T TMRM baja, identificamos varias mutaciones asociadas con una disminución de la actividad mitocondrial. Estos resultados sugieren que algunas mutaciones del ADNmt inducidas por el cisplatino podrían reducir la actividad mitocondrial en las células T. Por el contrario, las mutaciones que solo se encontraron en la fracción TMRM alta podrían mejorar potencialmente la salud mitocondrial.

Las mutaciones del ADNmt en las células T con actividad mitocondrial reducida también se detectan en las células T con masa mitocondrial reducida

Para estudiar más a fondo la relación entre las mutaciones del ADNmt inducidas por el cisplatino y la función mitocondrial, utilizamos un tinte fluorescente, MitoTracker Green FM, como indicador de la masa mitocondrial. De manera similar a la tinción con TMRM, las células T tratadas con cisplatino del donante D1007 se tiñeron con MitoTracker Green FM. Las fracciones de masa mitocondrial baja y alta, que representan aproximadamente el 10–15% de las poblaciones de células T, se clasificaron mediante citometría de flujo, seguida de un análisis de ADNmt/ATAC-seq de células individuales (Figura 5A). Se obtuvieron un total de 7427 células de alta calidad de la fracción de masa mitocondrial baja y un total de 3474 células de la fracción de masa mitocondrial alta. Para los fines de este análisis, las células tratadas y no tratadas con cisplatino, junto con la fracción de masa mitocondrial baja y la fracción TMRM baja, se fusionaron e integraron, como se muestra en la Figura 5B. El análisis de agrupamiento basado en la accesibilidad de la cromatina identificó un total de 34 grupos (Figura 5C). Las mutaciones del ADNmt detectadas se resaltan en rojo para las células T tratadas con cisplatino, en púrpura para la fracción TMRM baja y en verde para la fracción de masa mitocondrial baja (Figuras 5D–5F). En particular, cuatro de las seis mutaciones del ADNmt tanto en las células T tratadas con cisplatino como en la fracción TMRM baja también se detectaron en la fracción de masa mitocondrial baja, que incluyó 3850G>A, 5382C>T, 12359C>T y 6451T>C (Figura 5F). Las mutaciones 3850G>A, 12359C>T y 6451T>C se detectaron en la fracción de masa mitocondrial baja, pero no en la fracción de masa mitocondrial alta. La mutación 5382C>T se detectó en 15 células (0,03%) en la fracción de masa mitocondrial alta. De las seis mutaciones identificadas originalmente en las células tratadas con cisplatino, 7378T>C y 8584G>A no se detectaron en absoluto en la fracción de masa mitocondrial. Estos resultados sugieren que estas cuatro mutaciones del ADNmt están asociadas tanto con una baja masa mitocondrial como con una baja actividad mitocondrial.

Por último, las fracciones de masa mitocondrial alta y baja se fusionaron e integraron con las fracciones TMRM alta y baja, junto con las células T tratadas y no tratadas con cisplatino, seguidas de un análisis de agrupamiento (Figuras S16A y S16B). Las tres mutaciones TMRM alta identificadas previamente también se detectaron en la fracción de masa mitocondrial alta, pero no se encontraron en las fracciones TMRM baja o de masa mitocondrial baja (Figuras S16C–S16E). Esto sugiere una vez más que algunas mutaciones del ADNmt inducidas por el cisplatino podrían no dañar la función mitocondrial.

Se detectan mutaciones del ADNmt en las células T infiltrantes tumorales de pacientes con cáncer colorrectal después de la exposición a agentes quimioterapéuticos

Nuestros resultados mostraron que el 5-FU y el cisplatino pueden inducir mutaciones del ADNmt en las células T. Luego, hipotetizamos que las células T que residen en los tumores podrían presentar mutaciones del ADNmt después de que los pacientes fueran tratados con quimioterapia. Para probar esto, utilizamos la misma técnica de secuenciación de ADNmt/ATAC-seq de células individuales para estudiar tres tumores de pacientes con cáncer colorrectal metastásico que habían sido expuestos a la quimioterapia FOLFOX (5-FU y oxaliplatino) antes de la cirugía para extirpar sus tumores recurrentes. En resumen, después de la resección, las muestras tumorales se disociaron y se crioconservaron. El día del experimento, las muestras tumorales se descongelaron y las células TIL CD3+ se clasificaron y se sometieron a la secuenciación de ADNmt/ATAC-seq de células individuales (Figura 6A).

Un paciente con cáncer colorrectal recibió 12 ciclos de terapia FOLFOX y radioterapia 3 meses antes de la resección de la metástasis hepática. Después de la clasificación y la secuenciación de células individuales, se obtuvieron 6413 células TIL de alta calidad de la muestra tumoral. El análisis de agrupamiento de las células TIL identificó 10 grupos distintos de células T (Figura 6B). Además, se obtuvieron 4849 células de alta calidad de la muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), que también se sometieron a un análisis de agrupamiento (Figura 6C). En total, se detectaron 701 mutaciones en la muestra de TIL que no se encontraron en la muestra de PBMC (Figura 6D). Después de aplicar parámetros de control de calidad restringidos y otros criterios, se detectaron un total de 24 mutaciones no sinónimas del ADNmt en la muestra de TIL. La mutación del ADNmt predominante identificada en la muestra de TIL fue 6516G>A (COI:G250S), que se concentró en el grupo #3, seguida de los grupos #1 y #5 (Figura 6E); las mutaciones 12014>T (ND4:L419F) y 4675T>C (ND2:I69T) se encontraron principalmente en el grupo #1. Se muestra una mutación del ADNmt 9554G>A que se detectó tanto en las PBMC como en las TIL como control (Figuras 6F y 6G). Para identificar marcadores genéticos, dado que los grupos #1, #3 y #5 estaban agrupados cerca uno del otro en el mapa UMAP, los perfiles genéticos de estos grupos fueron similares. Luego, comparamos los marcadores genéticos entre el grupo #3 y el grupo #2 (también #3 frente a #4 y #3 frente a #6). Varios marcadores de agotamiento de las células T, ENTPD1 (CD39), CXCL13, PDCD1 (PD-1), TOX, LAG3 y CTLA4, estaban elevados en el grupo #3, en comparación con el #2 (Figura S17). Los datos para el análisis estadístico se muestran en la Tabla S2. También encontramos marcadores de células T citotóxicas/efectoras elevados, que incluyen PFR1 (perforina 1), GZMA (granzima A), IFNG (interferón gamma [IFN-γ]) y ZNF683 (Hobit). Además, el grupo 3 se asoció con marcadores de células T disminuidos correlacionados con células T más jóvenes (naivas/de memoria), como IL-7R y el factor de transcripción 7 (TCF7) (Figura S17). Se observaron observaciones similares también en los grupos #1 y #5 (Figura S17; Tabla S2). En conjunto, se identificaron mutaciones del ADNmt en las TIL asociadas con un aumento del agotamiento, la citotoxicidad y una disminución de los fenotipos de células T más jóvenes.

Para caracterizar aún más los fenotipos de las TIL que presentaban mutaciones del ADNmt, realizamos un análisis de proyección utilizando grupos de referencia scATAC-seq, que fueron establecidos previamente por Satpathy et al. utilizando TIL aisladas de biopsias de tumores de carcinoma de células basales (Figura 6H).^[24] La proyección de las TIL en los grupos de referencia condujo a una gran población de TIL que se agrupó dentro de los grupos de células T CD8+ agotadas (Tex) intermedias y terminales (Figura 6H). Las células T con las tres mutaciones del ADNmt identificadas también se agruparon dentro de los grupos de células T CD8+ Tex (Figura 6J). La mutación 6516G>A se agrupó predominantemente dentro del grupo Tex terminal. Este análisis validó aún más los fenotipos de agotamiento de las TIL con las mutaciones del ADNmt seleccionadas.

De manera similar, el segundo paciente con cáncer colorrectal se había sometido a cuatro ciclos de quimioterapia FOLFOX y radioterapia. Se obtuvo una muestra tumoral de la metástasis hepática y muestras de sangre aproximadamente 6 meses después de la quimioterapia y la radioterapia. Se obtuvieron un total de 2873 células de alta calidad de las TIL y se identificaron 19 grupos principales (Figura S18A). Además, se obtuvieron 5968 células de alta calidad de las PBMC (Figura S18B). Después del filtrado, se identificaron un total de nueve mutaciones del ADNmt específicas de TIL (Figura S18C). Se muestran tres mutaciones del ADNmt específicas de TIL (Figura S18D). El tercer paciente con cáncer colorrectal fue tratado con 12 ciclos de terapia FOLFOX. Se obtuvo una muestra tumoral de la metástasis hepática recurrente, junto con una muestra de sangre, 15 meses después de la finalización de la terapia FOLFOX. Se obtuvieron un total de 2870 células de alta calidad de las TIL y el agrupamiento de la accesibilidad de la cromatina identificó 14 grupos distintos de TIL (Figura S18E). Asimismo, se obtuvieron 4681 células de alta calidad de las PBMC (Figura S18F). Se identificaron un total de cinco mutaciones después del filtrado (Figura S18G). Las mutaciones del ADNmt detectadas incluyeron 3424G>A (ND1:V40M), 9229A>G (COII:Y8C) y 14093T>C (ND5:L586), pero encontramos menos células que presentaban mutaciones no sinónimas del ADNmt en comparación con los otros dos donantes (Figura S18H). En resumen, detectamos TIL con mutaciones del ADNmt en los tres pacientes con cáncer colorrectal que se habían sometido a quimioterapia FOLFOX antes del análisis. Se detectó un mayor número de TIL con mutaciones del ADNmt en el paciente 1, pero menos en el paciente 2 e incluso menos en el paciente 3. Esta observación se correlacionó vagamente con el tiempo entre la quimioterapia y el momento del muestreo del tumor, ya que los tumores se obtuvieron 3, 6 y 15 meses después de la última dosis de quimioterapia, respectivamente. Hipotetizamos que las TIL fueron reemplazadas eventualmente por células T frescas de la sangre periférica y, por lo tanto, se identificaron muy pocas TIL que presentaban mutaciones del ADNmt del tercer paciente. Es importante destacar que se requiere una gran cohorte de pacientes con varios puntos de tiempo posteriores a la quimioterapia para estudiar la posible correlación entre ellos.

Discusión

La dependencia intrínseca de la activación de las células T y su función efectora en la bioenergética metabólica de la célula está bien establecida. Sin embargo, aún no está claro cómo la salud mitocondrial puede conducir a una inmunoterapia contra el cáncer exitosa. Se han realizado estudios para investigar las mitocondrias con el fin de eliminar posibles obstáculos y mejorar la función de las células T.^[25],^[26],^[27] En un estudio mencionado anteriormente, se generaron células T Rho0 tratando células T OT-I con etidio bromuro a baja dosis, lo que provocó el agotamiento del ADNmt.^[7] Las células T Rho0 presentaban altos niveles de ROS y altos niveles de expresión de los marcadores de agotamiento PD-1, Tim-3 y TIGIT. En otro estudio, Baldwin JG y colaboradores demostraron que las células T podían recibir mitocondrias sanas de las células del estroma de la médula ósea a través de conexiones nanotubulares. Las células T con mitocondrias donadas mostraron respuestas antitumorales más fuertes y menos fenotipos de agotamiento, lo que proporciona un nuevo enfoque para revitalizar las células T envejecidas para su uso en la terapia celular adoptiva.^[28] En un estudio paralelo, se identificó una mutación en el ADNmt en tRNA-Leu (UUA/G) (3290T>C) a partir de una línea celular TIL generada a partir de una muestra de melanoma. La mutación 3290T>C en las mitocondrias podría transferirse desde la línea celular tumoral de melanoma a las células TIL. Es importante destacar que las células TIL con mitocondrias transferidas mostraron reducciones significativas de las funciones de las células T in vitro e in vivo.^[29] En el presente estudio, encontramos que la exposición de las células T a 5-FU y cisplatino podía inducir mutaciones en el ADNmt. Además, varias mutaciones en el ADNmt en las células T se asociaron con una baja actividad mitocondrial o cambios en los marcadores genéticos relacionados con las funciones de las células T. Es fundamental validar estas mutaciones identificadas en el ADNmt mediante ensayos funcionales. Sin embargo, la edición genética del ADNmt sigue siendo técnicamente desafiante, ya que presenta una baja eficiencia y una baja especificidad.^[30] Cuando la técnica de edición del ADNmt se perfeccione y esté ampliamente disponible, será interesante estudiar estas mutaciones identificadas en el ADNmt en las células T.

Se emplean quimioterapias por su capacidad para interrumpir la replicación e inducir la apoptosis de las células tumorales, y los agentes quimioterapéuticos pueden inducir firmas mutacionales características en el ADN genómico (ADNg) de las células tumorales.^[31] Por ejemplo, tanto las vías de reparación por escisión de bases como las vías de reparación de errores de emparejamiento se han relacionado con la resistencia de las células tumorales al 5-FU,^[32] lo que indica que el 5-FU actúa directamente sobre el ADNg. Al igual que el 5-FU, el efecto del cisplatino sobre el ADNg se demuestra a través de las vías de resistencia que se han identificado en las células tumorales expuestas al cisplatino. La reparación por escisión de nucleótidos es la vía de reparación más utilizada en las células tumorales tratadas con cisplatino, además de la reparación de errores de emparejamiento y la reparación por escisión de bases.^[33] Es importante destacar que, dado que el ADNmt es más susceptible a las mutaciones que el ADNg, es plausible que el 5-FU y el cisplatino también se dirijan al ADNmt para inducir defectos en el ADN.

Aunque el 5-FU está diseñado para atacar las células tumorales, el 5-FU también puede dañar las células sanas. Los pacientes tratados con 5-FU presentaban niveles más altos de roturas de cadena simple y doble en el ADN de sus linfocitos periféricos sanguíneos sanos después del tratamiento con 5-FU.^[34] Un estudio más reciente encontró que el 5-FU inducía mutaciones en el ADNg en cultivos de organoides del intestino delgado, que se podían detectar mediante una técnica de secuenciación del genoma completo.^[35] Además, en un análisis de mutaciones a nivel del genoma de pacientes con cáncer tratados con 5-FU, se encontró que un paciente con cáncer colorrectal tenía células madre del colon sanas que presentaban una huella mutacional específica del 5-FU.^[36] Dado que el 5-FU puede inducir daño en el ADNg, es posible que también afecte al ADNmt, que es más vulnerable. Nuestros hallazgos de que las células T tratadas con 5-FU albergan mutaciones en el ADNmt que no se encuentran en las células no expuestas se alinean con los hallazgos previos de que el 5-FU induce mutaciones específicas en el ADNg. Un estudio similar que realizó una secuenciación de ARN de célula única de organoides intestinales encontró que una de las vías más prominentes afectadas por el tratamiento con 5-FU fue la síntesis de ATP mitocondrial.^[37] Nuestros hallazgos sugieren la participación de mutaciones en el ADNmt en la vía OXPHOS, por ejemplo, la deshidrogenasa de NADH, la citocromo c oxidasa y la ATP sintasa, y sus posibles efectos en las células T tratadas con quimioterapia. Sin embargo, con los datos y las publicaciones disponibles actualmente, no pudimos descartar la posibilidad de que el 5-FU y el cisplatino puedan reducir la OXPHOS a través de otras vías, independientemente de las mutaciones en el ADNmt.

En este estudio, identificamos numerosas mutaciones en el ADNmt que solo se encontraron en las células T tratadas con 5-FU o cisplatino. Esto indicó que algunos agentes quimioterapéuticos podrían inducir mutaciones en el ADNmt y afectar las actividades de las células T. Es posible que el 5-FU o el cisplatino indujeran una mutación en el ADNmt en una sola célula T, y que esta célula T se expandiera y se convirtiera en una población clonal que contuviera esta mutación específica en el ADNmt. Como resultado, los clonotipos de TCR podrían estar relacionados con las mutaciones en el ADNmt identificadas en este estudio. Sin embargo, ninguna de las técnicas actuales de célula única nos permite investigar esta posibilidad. Para abordar esto, planeamos desarrollar una técnica de célula única que nos permita obtener el clonotipo de TCR, los datos de ATAC y la secuencia de ADNmt de la misma célula.^[38],^[39] Alternativamente, también es posible que las células T agotadas sean más sensibles al daño del ADNmt. Esta hipótesis también debe probarse en el futuro. Además, para comprender el impacto de las mutaciones en el ADNmt en las células, un estudio que examinó los cambios heteroplásmicos en una población de células epiteliales encontró que la presión de selección para una mutación no sinónima en el ADNmt dependía del entorno celular, ya sea la privación de nutrientes, la hipoxia o la inhibición de la ATP sintasa.^[40] Por lo tanto, el efecto de una mutación en el ADNmt, ya sea perjudicial, neutro o beneficioso para la célula, dependía de su entorno. De manera similar, otro estudio propuso que las células T podrían someterse a una selección purificadora y reducir la heteroplasmia para ciertas mutaciones no sinónimas en el ADNmt.^[41] Además, la subpoblación de células T y el estado metabólico podrían influir en la selección purificadora de mutaciones no sinónimas en el ADNmt.^[42]

Para mejorar la eficacia de la inmunoterapia, se ha desarrollado en los últimos años la combinación de quimioterapia o radioterapia con inmunoterapia.^[43] La Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) ha aprobado el uso de nivolumab con quimioterapia de doble platino como tratamiento neoadyuvante para el CPN, basándose en los resultados del estudio de fase III CHECKMATE-77T (NCT04025879).^[44] Además, se ha aprobado el uso de pembrolizumab en combinación con quimioterapia, paclitaxel más carboplatino, como terapia para el cáncer de endometrio avanzado, basándose en un ensayo clínico que mostró una supervivencia libre de progresión significativamente más larga en comparación con la quimioterapia sola (13,1 frente a 8,7 meses).^[45] En este ensayo, la quimioterapia y el pembrolizumab se administraron de forma concurrente el día 1 de un ciclo de 21 días, durante un máximo de seis ciclos de tratamiento, seguido de un tratamiento de mantenimiento con pembrolizumab solo. De manera similar, la FDA ha aprobado dos inhibidores de PD-L1, atezolizumab y durvalumab, más quimioterapia para el tratamiento de primera línea del cáncer de pulmón de células pequeñas en etapa avanzada.^[46],^[47] En ambos estudios, la quimioterapia se administró el día 1 de forma concurrente con la inhibición de PD-L1, seguida de un tratamiento de mantenimiento con inhibición de PD-L1 solo. Es importante destacar que, aunque el atezolizumab más carboplatino y la quimioterapia con etopósido mostraron una supervivencia general estadísticamente significativa en comparación con la quimioterapia sola, la mejora fue de solo 2 meses.^[46] Por último, un ensayo clínico evaluó la eficacia del pembrolizumab más etopósido y platino (carboplatino o cisplatino) en comparación con la quimioterapia sola como terapia de primera línea para el cáncer de pulmón de células pequeñas en etapa avanzada.^[48] De manera similar a los estudios descritos anteriormente, la quimioterapia se administró de forma concurrente con el pembrolizumab durante cuatro ciclos de tratamiento, seguida de ciclos de mantenimiento con pembrolizumab solo. Se observó una mejora significativa en la supervivencia libre de progresión a los 12 meses (13,6% frente a 3,1%); sin embargo, no hubo una diferencia significativa en la supervivencia general mediana (10,8 frente a 9,7 meses). Estos aumentos moderados en la supervivencia general sugieren el potencial de mejora en la terapia combinada.

En todos los estudios mencionados anteriormente, la quimioterapia y la terapia ICB se administraron de forma concurrente, seguida de un régimen de tratamiento de mantenimiento con terapia ICB sola. Se demostró cierta evidencia de eficacia clínica, lo que condujo a las aprobaciones de la FDA. Sin embargo, aún se desconoce en gran medida el impacto de la quimioterapia en la terapia ICB, más allá de los efectos aditivos sobre las respuestas antitumorales. Múltiples estudios han planteado preocupaciones sobre que la quimioterapia pueda dañar las respuestas mediadas por las células T. Por ejemplo, Mariniello y colaboradores demostraron que la quimioterapia (cisplatino + pemetrexed) podía atenuar las respuestas de las células CD8+ al bloqueo concomitante de PD-1 en un modelo de infección crónica por LCMV.^[49] Los resultados experimentales sugirieron que la administración secuencial de quimioterapia y bloqueo de PD-1 podría ser beneficiosa para el control viral in vivo. Además, un estudio previo mostró que las células T expuestas a los agentes quimioterapéuticos, ciclofosfamida, doxorrubicina o citarabina, podían tener efectos persistentes en las células T, como una proliferación alterada y funciones mitocondriales. Estos resultados sugieren el posible impacto en la fabricación de células T y la eficacia clínica para la terapia celular adoptiva.^[50] En este estudio, demostramos que los agentes quimioterapéuticos comunes, el 5-FU y el cisplatino, pueden tener un efecto directo sobre el ADNmt, lo que podría afectar la función de las células T y alterar potencialmente la eficacia de la inmunoterapia. Nuestros hallazgos sugieren que se debe tener precaución al administrar ciertos agentes quimioterapéuticos junto con la inmunoterapia de punto de control. Evitar la quimioterapia antes de la inmunoterapia puede optimizar la eficacia de la inmunoterapia como una vía para mejorar los resultados clínicos. En conjunto, nuestros resultados subrayan una consecuencia poco apreciada de la quimioterapia en el ADNmt de las células T, con implicaciones para el diseño de terapias combinadas. Los estudios futuros deberían evaluar si los programas de dosificación alternativos o los protectores dirigidos a las mitocondrias podrían mitigar estos efectos, mejorando en última instancia la eficacia de la inmunoterapia.

Limitaciones del estudio

Este estudio tiene múltiples limitaciones debido a las barreras biológicas y técnicas. Primero, aunque la heteroplasmia mitocondrial es un fenómeno fascinante en la biología mitocondrial, crea complejidades y desafíos significativos para el análisis e interpretación estandarizados de los datos. En segundo lugar, no se pueden realizar estudios funcionales directos de las mutaciones en el ADNmt porque la edición directa del ADNmt en las células T no está disponible actualmente. Se necesitarán estudios futuros para validar los impactos de estas mutaciones en el ADNmt en las células T. En tercer lugar, es posible que ciertos fenotipos de células T, como el agotamiento, sean más sensibles al daño del ADNmt. Se requerirán investigaciones futuras para estudiar más a fondo la relación entre las mutaciones en el ADNmt y los fenotipos de las células T. En cuarto lugar, la relación entre las mutaciones en el ADNmt y los clonotipos de TCR no se puede investigar debido a la falta de una técnica de célula única adecuada. Una vez que la técnica esté disponible, se deberá estudiar y validar la relación entre ellas. Por último, se requiere un estudio a gran escala para estudiar la correlación entre el momento de los tratamientos de quimioterapia y la cantidad de mutaciones en el ADNmt en las células TIL.

Limitaciones del estudio

Este estudio presenta múltiples limitaciones debido a las barreras biológicas y técnicas. En primer lugar, aunque la heteroplasmia mitocondrial es un fenómeno fascinante en la biología mitocondrial, crea complejidades y desafíos significativos para el análisis e interpretación estandarizados de los datos. En segundo lugar, no se pueden realizar estudios funcionales directos de las mutaciones del ADNmt, ya que la edición directa del ADNmt en las células T no está disponible actualmente. Serán necesarios estudios futuros para validar los efectos de estas mutaciones del ADNmt en las células T. En tercer lugar, es posible que ciertos fenotipos de células T, como el agotamiento, sean más sensibles al daño del ADNmt. Se requerirán investigaciones futuras para estudiar más a fondo la relación entre las mutaciones del ADNmt y los fenotipos de las células T. En cuarto lugar, la relación entre las mutaciones del ADNmt y los clonotipos de los receptores de células T (TCR) no se puede investigar debido a la falta de una técnica adecuada a nivel de una sola célula. Una vez que la técnica esté disponible, se deberá estudiar y validar la relación entre ellas. Por último, se requiere un estudio a gran escala para analizar la correlación entre el momento de los tratamientos de quimioterapia y la cantidad de mutaciones del ADNmt en las células infiltrantes del tumor (TIL).

Disponibilidad de recursos

Contacto principal

Las solicitudes de información o recursos adicionales deben dirigirse al contacto principal, Yong-Chen William Lu (ylu@uams.edu).

Disponibilidad de materiales

Este estudio no generó nuevos reactivos únicos.

Disponibilidad de datos y código

•Los datos de secuenciación de ARN de una sola célula y los datos de secuenciación de ADNmt/ATAC-seq están disponibles públicamente en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) con el número GSE (GSE310683).•Este artículo no presenta código original. La bioinformática para los datos de una sola célula se realizó utilizando herramientas de código abierto, como se indica en la tabla de recursos clave.•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos presentados en este trabajo está disponible del contacto principal a petición.

Contacto principal

Las solicitudes de información o recursos adicionales deben dirigirse al contacto principal, Yong-Chen William Lu (ylu@uams.edu).

Disponibilidad de materiales

Este estudio no generó nuevos reactivos únicos.

Disponibilidad de datos y código

•Los datos de secuenciación de ARN de una sola célula y los datos de secuenciación de ADNmt/ATAC-seq están disponibles públicamente en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) con el número GSE (GSE310683).•Este artículo no presenta código original. La bioinformática para los datos de una sola célula se realizó utilizando herramientas de código abierto, como se indica en la tabla de recursos clave.•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos presentados en este trabajo está disponible del contacto principal a petición.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Bing Guan, Andrea Harris, Sue L Johnson, Donald J Johann Jr. y Emilio Murillo por sus sugerencias y apoyo técnico. La secuenciación de nueva generación se llevó a cabo en el UAMS Genomics Core y fue analizada por los recursos computacionales del clúster de computación de alto rendimiento de UAMS. Este trabajo fue apoyado por el Winthrop P. Rockefeller Cancer Institute. C.K. también recibió apoyo del programa UAMS MD/PhD 10.13039/100008519. R.P.M.D. recibió apoyo del 10.13039/100000054 National Cancer Institute, 10.13039/100000002 NIH, Estados Unidos (R01 CA245083). Y.L. también recibió apoyo del Arkansas Breast Cancer Research Program (ABCRP), Estados Unidos; el 10.13039/100015317 Translational Research Institute, 10.13039/100008519 UAMS, Estados Unidos (UL1 TR003107 y KL2 TR003108); y el 10.13039/100000054 National Cancer Institute, NIH, Estados Unidos (R01 CA143130).

Contribuciones de los autores

Conceptualización, C.K. y Y.-C.W.L.; curación de datos, C.K.; análisis formal, C.K. y Y.-C.W.L.; adquisición de financiación, Y.-C.W.L.; investigación, C.K. y Y.-C.W.L.; metodología, C.K., Y.-K.L., R.P.M.D. y C.M.P.; administración del proyecto, Y.-C.W.L.; recursos, C.M.Q., S.R.P., Y.-K.L., R.P.M.D., C.M.P. y L.B.; supervisión, Y.-C.W.L.; validación, C.K. y Y.-C.W.L.; visualización, C.K.; redacción (borrador original, revisión y edición), C.K., C.M.P. y Y.-C.W.L.

Declaración de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Declaración sobre el uso de IA generativa y tecnologías de asistencia con IA en el proceso de redacción

No se han utilizado tecnologías de asistencia con IA en este estudio.

Métodos STAR

Tabla de recursos clave

Detalles del modelo experimental y de los participantes del estudio

Células de donantes humanos sanos

Las células mononucleares periféricas (PBMC) de cuatro donantes humanos sanos se compraron a Stemcell Technologies. El rango de edad de los donantes fue de 23 a 34 años, con una edad media de 28,5 años. Hubo 2 donantes mujeres y 2 donantes hombres. No se dispone de información sobre el estado de salud, el estado inmunitario o los tratamientos previos de los donantes sanos.

Muestras de pacientes con cáncer colorrectal

Las muestras de tumor y sangre de pacientes con cáncer colorrectal metastásico se obtuvieron a través del Servicio de Biobancos y Adquisición de Tejidos de la Universidad de Arkansas para las Ciencias Médicas (TBAPS), con la determinación de la Junta de Revisión Institucional de que no se trata de investigación en seres humanos (IRB#262500 y 273430). Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes. También se siguieron las directrices de la OMS y la Declaración de Helsinki. Se obtuvieron tres muestras de pacientes, de 1 mujer y 2 hombres. Las edades de los pacientes fueron 49, 61 y 65 años, respectivamente. Todos los pacientes habían recibido ciclos de tratamiento con quimioterapia con el régimen FOLFOX antes de la resección quirúrgica de las muestras de tumor. Dado que no se trata de un estudio a gran escala, no se discute la generalizabilidad en cuanto al género, lo que forma parte de las limitaciones del alcance de este estudio.

Detalles del método

Inducción de mutaciones del ADNmt en las células T con agentes quimioterapéuticos

Se descongelaron 2 x 106 PBMC y se estimularon con 25 µL de Dynabeads human T-activator CD3/CD28 (Gibco) en 1 mL de medio RPMI que contiene un 5% de suero humano e IL-2 (600 UI/mL) en una placa de 24 pocillos, según el protocolo del fabricante. El día 3, se añadió 1 mL de medio RPMI-5 que contiene 600 UI/mL de IL-2 y varias concentraciones de 5-FU o cisplatino a la cultura hasta el día 7. Si es necesario, se alimentaron y dividieron las células T proliferantes con medio RPMI que contiene IL-2 y 5-FU o cisplatino. El día 7, se retiró cuidadosamente el medio de cultivo y se reemplazó por medio RPMI fresco que contiene IL-2, sin 5-FU ni cisplatino. El día 10, se cosecharon las células T y se contaron. Se reestimularon 1 × 106 células T con Dynabeads CD3/CD28, seguido del mismo tratamiento con 5-FU o cisplatino del día 13 al día 17. El día 20, se cosecharon las células T tratadas y se reestimularon. La estimulación de las células T y los tratamientos con 5-FU/cisplatino se realizaron durante un total de 3 ciclos. Las células T se crioconservaron para el análisis posterior.

Preparación de bibliotecas para la secuenciación de ADNmt y ATAC de una sola célula

Las células T tratadas se descongelaron y se tiñeron con 7-AAD (BD Bioscience), seguido de la clasificación por FACS para las células T viables (FACSAria II, BD Bioscience). Para el tinte de TMRM y MitoTracker, las células T tratadas se descongelaron y se recuperaron durante dos días en medio RPMI que contiene un 5% de suero humano e IL-2 (600 UI/mL). Las células T se tiñeron con TMRM (20 nM de concentración final) o MitoTracker Green (50 nM) durante 30 minutos a 37 °C, según el protocolo del fabricante (Molecular Probes/Invitrogen). Después del lavado, las células teñidas se tiñeron con 7-AAD, seguido de la clasificación por FACS para las fracciones de TMRM o MitoTracker Green FM altas y bajas (aproximadamente el 10-15% de las poblaciones de células T). Después de la clasificación, las células T se fijaron y lisaron, para la preparación de la secuenciación de ATAC y ADNmt de una sola célula. Este método ha sido establecido por Lareau CA et al. y publicado anteriormente,^[14] con modificaciones menores en nuestro laboratorio.^[20] Brevemente, para modificar el protocolo scATAC-seq para incluir el ADNmt, las células T se fijaron con formaldehído/PBS al 1% durante 10 minutos. Las células fijadas se lisaron, lavaron y contaron, seguido de la realización de la preparación estándar de la muestra scATAC-seq (10X Genomics). En el último paso, las bibliotecas de ADNmt/ATAC se enriquecieron en función del tamaño del ADN de 180 pares de bases a 600 pares de bases (instrumento Pippin Prep, Sage Science). Las bibliotecas finales se sometieron a una secuenciación profunda (NovaSeq 6000, Illumina).

Preparación de bibliotecas para la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq)

Las células T tratadas se descongelaron y se tiñeron con 7-AAD (BD Bioscience), seguido de la clasificación por FACS para las células T viables (FACSAria II, BD Bioscience). Después de la clasificación, las células T se prepararon para el análisis y la secuenciación de una sola célula. Se utilizó un kit de reactivos de 5' de una sola célula siguiendo el protocolo del fabricante (10X Genomics). Brevemente, se cargaron 10 000 células T por canal en el controlador de cromio, con un objetivo de recuperación de 6000 células individuales. Las muestras de cDNA de una sola célula agrupadas se amplificaron universalmente primero mediante una reacción de PCR de 15 ciclos, seguida de la fragmentación y el etiquetado. Las bibliotecas de expresión génica se secuenciaron luego mediante un secuenciador Illumina Novaseq 6000.

Aislamiento de las células T infiltrantes del tumor

Las muestras de tumor se disociaron mediante un disociador gentleMACS (Miltenyi Biotec) y se crioconservaron.^[52] Brevemente, las muestras de tumor, de aproximadamente 1-3 g, se cortaron en pequeños trozos (2-3 mm) y se transfirieron a tubos gentleMACS C (Miltenyi Biotec, Alemania). El medio de digestión contenía 10 mL de medio RPMI, un 5% de suero humano, 0,13 U/mL de Liberase TM (Roche/Sigma-Aldrich) y 600 U/mL de DNasa I (Roche/Sigma-Aldrich). Las muestras de tumor se disociaron seleccionando los siguientes programas: htumor01, htumor02 y htumor03. Los tubos C se incubaron a 37 °C durante 30 minutos entre cada programa. Al final de los programas, las suspensiones de células individuales se pasaron a través de un filtro de células de 40 µm y se lavaron una vez con PBS que contiene 5 mM de EDTA y luego se crioconservaron. El día del experimento, las muestras de tumor se descongelaron y se tiñeron con bloqueo Fc y 7-AAD, seguido del tinte con anticuerpo anti-CD3 y anti-CD8 (BD Biosciences). Se incluyó el tinte de CD8 para garantizar la correcta selección de las células T CD3+. Se clasificaron las células T CD3+ totales, incluidas las células CD8+ y CD8-, y se sometieron al mismo análisis de secuenciación de ADNmt/ATAC de una sola célula.

Cuantificación y análisis estadístico

Secuenciación de ADNmt/ATAC de una sola célula

La combinación de datos de secuenciación del genoma mitocondrial y de accesibilidad de la cromatina se procesó primero mediante una canalización Cell Ranger (CellRanger-ATAC, v2.1.0; 10X Genomics). Los datos de secuenciación de accesibilidad de la cromatina se asignaron a una base de datos de referencia con máscara dura modificada (GRCh38-r107) con el fin de enmascarar las regiones del genoma nuclear que comparten una homología consistente con el ADNmt, siguiendo las instrucciones proporcionadas por mgatk.^[15] En algunos conjuntos de datos, se utilizó el comando opcional "force-cells" para eliminar las células de baja calidad. En promedio, se obtuvieron 669.865.207 pares de lecturas secuenciadas (rango de 182.592.167 a 1.503.707.473), con 16.897 fragmentos de alta calidad medianos por célula (rango de 4.213 a 32.095). La complejidad media de la biblioteca fue del 66% (porcentaje de duplicados, rango del 44,9% al 84,6%).

Los datos de genotipado de ADNmt y heteroplasmia de una sola célula se analizaron mediante mgatk (v0.6.6). Teniendo en cuenta la complejidad de la heteroplasmia del ADNmt, simplificamos el análisis y definimos las mutaciones del ADNmt inducidas por el tratamiento como las detectadas en las muestras tratadas pero no en los controles negativos no tratados (Figura 2D).^[20] De manera similar, las mutaciones del ADNmt específicas de las TIL se definieron como las detectadas en las TIL, pero no en las muestras de PBMC autólogas. A continuación, se aplicaron parámetros de control de calidad restringidos, los mismos que en el estudio de Lareau CA, para eliminar las mutaciones del ADNmt de baja calidad y los posibles artefactos de secuenciación.^[14] Por ejemplo, se eliminaron las mutaciones del ADNmt con valores de concordancia de cadena 2, profundidad de mtDNA ≥ 10. El filtro para nCount_peaks se estableció en 4 para TILs (P1, P2, P3). La cobertura media de mtDNA después del filtrado fue de aproximadamente 60 (rango 30–100). A continuación, se utilizó el flujo de trabajo estándar de fusión de objetos en Signac para fusionar e integrar múltiples muestras. Se crearon conjuntos de picos unificados utilizando la función Reduce del paquete GenomicRanges. Los conjuntos de datos combinados se normalizaron y se agruparon para obtener gráficos UMAP y gráficos de violín. El análisis de agrupamiento se realizó con la resolución fija de 2.0 para todos los conjuntos de datos combinados. La resolución se estableció en 0.5 para los conjuntos de datos de TIL y PBL de los pacientes. Los grupos con menos de 100 células se excluyeron de los análisis. Debido al mayor número de células, los grupos con