Distribución y valor pronóstico de los macrófagos en el cáncer colorrectal y la mucosa adyacente en pacientes con estadios I-III frente a IV.

El cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad relacionadas con el cáncer en todo el mundo, siendo el hígado el sitio más común y clínicamente significativo de metástasis a distancia [^[1]-^[4]]. Aproximadamente el 20-25% de los pacientes presentan metástasis hepáticas sincrónicas (MH) en el momento del diagnóstico de CCR, mientras que otro 20-30% desarrollará metástasis metacrónicas durante el seguimiento [^[5]-^[7]]. Los mecanismos biológicos e inmunológicos que subyacen a estas distintas trayectorias metastásicas aún no se comprenden completamente [^[6]-^[9]], y existe un interés creciente en el papel del microambiente inmunitario tumoral (MIT) en la configuración de la progresión de la enfermedad y los resultados en los pacientes [^[10]].

En el MIT del CCR y otros cánceres, los macrófagos se reconocen a menudo como el grupo más numeroso de células inmunitarias infiltrantes tumorales [^[11],^[12]]. Los macrófagos demuestran una notable plasticidad fenotípica en respuesta a las señales locales, y, en función de su estado de activación, los macrófagos colónicos se clasifican ampliamente en M0 (no polarizados), M1, activados clásicamente por el interferón gamma, y M2, activados alternativamente por la interleucina-4 [^[11],^[13],^[14]]. Los macrófagos M1 son altamente fagocíticos, citotóxicos para las células tumorales, proinflamatorios y, por lo tanto, antitumorales, mientras que los macrófagos M2 son inmunosupresores y promueven el crecimiento tumoral, la angiogénesis, la activación del estroma y la metástasis [^[11],^[14]-^[16]]. El equilibrio entre los macrófagos M1 y M2 en el MIT desempeña un papel fundamental en la progresión y el tratamiento del cáncer, como se revisa en [^[15]-^[18]].

Los marcadores inmunohistoquímicos que se utilizan habitualmente para distinguir estos subconjuntos incluyen CD68 (glucoproteína de membrana asociada a lisosomas/endosomas) para los macrófagos M0, CD80 (una molécula coestimuladora) para los macrófagos M1, CD206 (un receptor de manosa) y CD163 (un receptor de eliminación) para los macrófagos M2 [^[13],^[14],^[17]-^[19]].

En general, se ha asociado a los macrófagos con un mal pronóstico en la mayoría de los tumores sólidos [^[10],^[11]]; sin embargo, en el CCR, el impacto pronóstico parece ser más complejo, con hallazgos discrepantes notificados para diferentes subconjuntos de macrófagos [^[13],^[14],^[16]-^[18]].

Es importante destacar que la mayoría de los estudios previos de macrófagos infiltrantes tumorales en el CCR se han centrado principalmente en el núcleo tumoral o el borde invasor [^[11],^[13],^[20],^[21]], mientras que se ha prestado menos atención a la mucosa adyacente no tumoral (MAT), que puede albergar alteraciones inmunológicas tempranas que preceden o acompañan a la diseminación metastásica [^[22],^[23]]. El paisaje inmunitario de la MAT adyacente al tumor puede servir como un nicho crítico, pero poco explorado, que refleja la vigilancia inmunitaria sistémica y puede influir en el comportamiento tumoral y la diseminación. Cabe destacar que los macrófagos constituyen el 10-20% de las células mononucleares en la mucosa intestinal [^[11],^[14],^[19],^[24],^[25]], donde desempeñan un papel importante en la eliminación de patógenos, la regulación de las respuestas inflamatorias y el mantenimiento de la homeostasis. Sin embargo, solo unos pocos estudios han explorado la distribución de los macrófagos en la MAT en el CCR [^[13],^[22],^[23]].

Dados estos vacíos en el conocimiento, planteamos la hipótesis de que la cuantificación y el análisis comparativo de los macrófagos CD68+, CD80+, CD206+ y CD163+ tanto en el centro tumoral (CT) del CCR primario (CCRp) como en la MAT pueden proporcionar información pronóstica en los pacientes con CCR en estadio IV con MH sincrónicas y en los pacientes en estadio I-III que desarrollaron MH metacrónicas más adelante.

MATERIALES Y MÉTODOS

Pacientes

Se identificaron todos los pacientes que se sometieron a una resección con intención curativa tanto del CCRp como de la MH en el Hospital Universitario de Pilsen entre 1999 y 2021 a partir de los archivos de patología y se incluyeron en el presente estudio de cohorte retrospectivo. Se recogieron de forma retrospectiva pares de muestras de CCRp y MAT fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE) de pacientes en estadio IV (n = 80), que presentaban MH sincrónicas en el momento de la cirugía del tumor primario, y de pacientes en estadio I-III (n = 100) que desarrollaron MH metacrónicas en un plazo de 1 a 59 meses después de la resección del CCRp (mediana, 17 meses).

Se aplicaron los siguientes criterios de inclusión de pacientes en el presente estudio: (1) Solo metástasis hepáticas iniciales; (2) Disponibilidad de datos clínicos y de supervivencia completos; y (3) Disponibilidad de tejido FFPE tanto de la MAT como del CCRp de calidad suficiente. Se excluyeron del estudio los pacientes con múltiples neoplasias primarias, con presencia de metástasis extrahepáticas preoperatorias, antecedentes de resecciones hepáticas previas, aquellos que recibieron quimiorradioterapia neoadyuvante antes de la cirugía del CCRp y aquellos que se sometieron a cirugía de emergencia. Noventa y nueve pacientes cumplieron todos los criterios (44 en estadio I-III y 55 en estadio IV).

Se extrajo información seleccionada sobre datos demográficos, patológicos y clínicos de los registros médicos de los pacientes. Se registró la localización del tumor primario, su tamaño, la clasificación TNM, el estadio, el tipo histológico y el grado, el estado de KRAS, BRAF, la inestabilidad de microsatélites (MSI) y el nivel de antígeno carcinoembrionario en sangre (Tabla 1). Los tumores se clasificaron como de lado derecho o izquierdo con respecto a la flexura esplénica del colon y se clasificaron según los criterios de la American Joint Committee on Cancer (8ª edición). Los dos grupos diferían solo en términos de tamaño de la MH, que era mayor en el grupo metacrónico, y en la frecuencia de pacientes que recibieron quimioterapia FOLFOX, que fue mayor en el estadio IV (Tabla 1). Este estudio retrospectivo se llevó a cabo de acuerdo con los principios éticos de la Declaración de Helsinki (versión de 2013) y fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina y el Hospital Universitario de Pilsen.

Patología e inmunohistoquímica

Se recuperaron los tejidos FFPE del CCRp y la MAT adyacente al tumor de cada paciente y se seccionaron con un grosor de 4 μm. Las muestras de MAT se obtuvieron del borde de resección oral o aboral más cercano al tumor, con una distancia mediana de 34 mm (rango: 4-200 mm) desde el borde del tumor, y se confirmó patológicamente que estaban libres de infiltración tumoral.

Se montaron una o dos secciones de tejido en portaobjetos BOND Plus (Cat 00270, Leica Biosystems Newcastle Ltd., Newcastle, Reino Unido). A continuación, se realizó la tinción inmunohistoquímica utilizando el sistema totalmente automatizado BOND RXm, Leica Biosystems. Se utilizaron anticuerpos primarios monoclonales listos para usar para CD68 (clon 514H12, Bond) y CD163 (clon 10D6, Bond) de Leica Biosystems (Newcastle Ltd., Reino Unido), anticuerpos monoclonales para CD80 (clon 37711, dilución 1:100) de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos) y anticuerpos policlonales para CD206 en dilución 1:1000 (Abcam Ltd., Reino Unido). La unión de los anticuerpos primarios a sus objetivos se visualizó utilizando un sistema conjugado de enlace de peroxidasa de rábano picante (Leica Biosystems). Las secciones se contrateñieron con hematoxilina de Mayer y se incluyeron en un medio de montaje Micromount (Leica Biosystems Newcastle Ltd., Reino Unido). Se utilizaron muestras de control de tejido positivo (amígdalas) y negativo adecuadas durante todo el proceso.

Análisis de imágenes

Se obtuvieron exploraciones de portaobjetos completos de la MAT y el CCRp utilizando el escáner Olympus VS200 (Olympus, Shinjuku, Japón). Las anotaciones de las regiones de interés y la estimación de las densidades de las células inmunitarias se realizaron utilizando un software de análisis de imágenes de código abierto (QuPath v.0.4.3). La MAT se anotó como una única región por encima de la muscularis mucosa, que abarca el epitelio superficial, las criptas intestinales y la lámina propia. Los folículos linfoides que se encontraban por encima o que atravesaban la muscularis mucosa también se incluyeron. Se excluyeron los focos de displasia, los lúmenes de las criptas y los artefactos. El tumor se anotó a lo largo del borde que separaba los nidos de células malignas y el tejido no tumoral adyacente. Tras la exclusión de un margen de 500 μm de ancho, el área tumoral restante representó el CT. Limitamos el análisis de los macrófagos en el CCRp a la región del CT para realizar comparaciones válidas con la MAT porque ambas regiones están compuestas principalmente por epitelio colónico; además, la reacción desmoplásica es menos prominente en el CT. La superficie luminal del tumor, los grandes vasos, la mucosa normal, el epitelio displásico, la muscularis propia y el estroma de soporte > 2 mm de diámetro, la mucina extracelular, la grasa, las necrosis, los abscesos, las hemorragias y los artefactos se excluyeron antes del análisis.

La densidad de las células inmunitarias en la MAT y el CT se estimó como el número de perfiles de células inmunopositivas nucleadas dividido por el área total de la región. Para eliminar la asimetría en la distribución, para el análisis de supervivencia posterior, convertimos los datos brutos en los valores percentiles correspondientes y los categorizamos en bajo (por debajo del 25%) vs alto (25%-100%). Para obtener información sobre la eficacia con la que el tumor excluye, recluta o reprograma las células inmunitarias, también calculamos la relación CT/MAT para cada tipo de célula y los categorizamos como altos y bajos utilizando la mediana como punto de corte.

Seguimiento

Se realizó un seguimiento de los pacientes hasta diciembre de 2023, con un tiempo de observación medio de 61 meses después de la resección de la MH metacrónica y de 84 meses después de la resección de la MH sincrónica. El tratamiento postoperatorio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones generalmente aceptadas.

Resultados

La fecha de la cirugía hepática se eligió como punto de referencia para el análisis de supervivencia. El punto final primario del estudio fue la supervivencia global (SG), que se definió como el intervalo desde la fecha de la resección hepática hasta la fecha de la muerte por cualquier causa. Los resultados secundarios fueron el tiempo hasta la recurrencia (TTR) y la supervivencia libre de enfermedad (SLE). El TTR se definió como el intervalo desde la fecha de la metástasis hepática hasta la fecha del diagnóstico de cualquier sitio de recurrencia. La SLE se consideró como el tiempo desde la resección de la MH hasta el diagnóstico de la recurrencia o la muerte por cualquier causa. Las probabilidades de SG a los 5 años después de la cirugía de la MH fueron del 34,8% en el grupo en estadio I-III y del 31,3% en el grupo en estadio IV (Tabla suplementaria 1).

Análisis estadístico

Los datos continuos no distribuidos normalmente se expresan como mediana (mínimo-máximo); su comparación se realizó mediante la prueba U de Mann-Whitney para comparar las densidades celulares entre el estadio IV vs el estadio I-III o mediante el análisis de varianza de Friedman, seguido de la prueba de Dunn para comparar las densidades de los 4 tipos de células, ya sea en la MAT o en el CT. Se utilizó la prueba de Wilcoxon para las comparaciones entre la MAT y el CT del CCRp. Las proporciones se expresan como datos brutos (%). Las asociaciones entre pares de variables ordinales o cuantitativas se evaluaron utilizando la correlación de Spearman debido a la distribución no paramétrica de la mayoría de las variables. Para estos análisis, se utilizó GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software LLC). El análisis de supervivencia se realizó en el entorno R. Utilizando el paquete Finalfit [^[26]], realizamos un análisis de regresión de Cox univariado para determinar el valor pronóstico de los predictores individuales para la SG, seguido de un análisis multivariado paso a paso hacia atrás. Se calcularon las razones de riesgo que muestran el riesgo relativo en comparación con 1 para el "grupo bajo". Teniendo en cuenta el número de pacientes en ambos grupos y los supuestos para un análisis multivariado correcto, probamos las asociaciones pronósticas de los macrófagos CD80+ y CD163+ en 3 modelos multivariados ajustados para: (1) el estadio N y el grado del CCRp; (2) el número, el tamaño y el grado de la MH; y (3) el régimen de quimioterapia (otro vs FOLFOX y el uso de terapia dirigida). Debido a la muy baja frecuencia de mutaciones BRAF y al estado de "alta" inestabilidad de MSI, así como a la falta de datos para una proporción significativa de pacientes, el estado de MSI y la presencia de mutaciones KRAS y BRAF no se incluyeron en los modelos multivariados. La SG se estimó utilizando el método de Kaplan-Meier y se comparó entre los grupos mediante la prueba de rango logarítmico. Los análisis de Kaplan-Meier se realizaron utilizando el paquete de supervivencia y las curvas de supervivencia se visualizaron con el paquete survminer [^[27],^[28]]. Se consideró que un valor de p bilateral < 0,05 era estadísticamente significativo.

Pacientes

Todos los pacientes que se sometieron a una resección con intención curativa tanto del cCRC como de las metástasis hepáticas (MH) en el Hospital Universitario de Pilsen entre 1999 y 2021 fueron identificados a partir de los archivos de patología e incluidos en el presente estudio de cohorte retrospectivo. Se recogieron de forma retrospectiva pares de muestras fijadas en formalina y embebidas en parafina (FFPE) de cCRC y MH de pacientes en estadio IV (n = 80), que presentaban MH sincrónicas en el momento de la cirugía del tumor primario, y de pacientes en estadio I-III (n = 100) que desarrollaron MH metacrónicas en un plazo de 1 a 59 meses después de la resección del cCRC (mediana, 17 meses).

Se aplicaron los siguientes criterios de inclusión de pacientes en el presente estudio: (1) solo metástasis hepáticas iniciales; (2) datos clínicos y de supervivencia completos disponibles; y (3) tejido FFPE disponible tanto de la MH como del cCRC con calidad suficiente. Se excluyeron del estudio los pacientes con múltiples neoplasias primarias, con presencia de metástasis extrahepáticas preoperatorias, antecedentes de resecciones hepáticas previas, aquellos que recibieron quimiorradioterapia neoadyuvante antes de la cirugía del cCRC y aquellos que se sometieron a cirugía de emergencia. Noventa y nueve pacientes cumplieron todos los criterios (44 en estadio I-III y 55 en estadio IV).

Se extrajo información seleccionada sobre datos demográficos, patológicos y clínicos de los registros médicos de los pacientes. Se registró la localización del tumor primario, su tamaño, la clasificación TNM, el estadio, el tipo histológico y el grado, el estado de KRAS, BRAF, la inestabilidad de microsatélites (MSI) y el nivel de antígeno carcinoembrionario en sangre (Tabla 1). Los tumores se clasificaron como de lado derecho o izquierdo con respecto a la flexura esplénica del colon y se clasificaron según los criterios del Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer (8ª edición). Los dos grupos diferían solo en términos de tamaño de la MH, que era mayor en el grupo metacrónico, y en la frecuencia de pacientes que recibieron quimioterapia FOLFOX, que era mayor en el estadio IV (Tabla 1). Este estudio retrospectivo se llevó a cabo de acuerdo con los principios éticos de la Declaración de Helsinki (versión de 2013) y fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina y el Hospital Universitario de Pilsen.

Patología e inmunohistoquímica

Se recuperaron los tejidos FFPE de cCRC y de la MH adyacente al tumor para cada paciente y se seccionaron con un grosor de 4 μm. Las muestras de MH se obtuvieron del margen de resección oral o aboral más cercano al tumor, con una distancia mediana de 34 mm (rango: 4-200 mm) desde el borde del tumor, y se confirmó patológicamente que estaban libres de infiltración tumoral.

Se montaron una o dos secciones de tejido en portaobjetos para microscopio BOND Plus (Cat 00270, Leica Biosystems Newcastle Ltd., Newcastle, Reino Unido). A continuación, se realizó la tinción inmunohistoquímica utilizando el sistema BOND RXm totalmente automatizado de Leica Biosystems. Se utilizaron anticuerpos primarios monoclonales listos para usar para CD68 (clon 514H12, Bond) y CD163 (clon 10D6, Bond) de Leica Biosystems (Newcastle Ltd., Reino Unido), anticuerpos monoclonales contra CD80 (clon 37711, dilución 1:100) de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos) y anticuerpos policlonales contra CD206 en dilución 1:1000 (Abcam Ltd., Reino Unido). La unión de los anticuerpos primarios con sus objetivos se visualizó utilizando un sistema conjugado de anticuerpos enlazados a la peroxidasa de rábano picante (Leica Biosystems). Las secciones se contrateñeron con hematoxilina de Mayer y se incluyeron en un medio de montaje Micromount (Leica Biosystems Newcastle Ltd., Reino Unido). Se utilizaron muestras de control de tejidos positivos (amígdalas) y negativos adecuadas durante todo el proceso.

Análisis de imágenes

Se obtuvieron escaneos de portaobjetos completos de la MH y del cCRC utilizando el escáner Olympus VS200 (Olympus, Shinjuku, Japón). Las anotaciones de las regiones de interés y la estimación de las densidades de las células inmunitarias se realizaron utilizando un software de código abierto para el análisis de imágenes (QuPath v.0.4.3). La MH se anotó como una única región por encima de la muscularis mucosa, que abarca el epitelio superficial, las criptas intestinales y la lámina propia. Los folículos linfoides, si se encontraban por encima o se seccionaban por la muscularis mucosa, también se incluyeron. Se excluyeron los focos de displasia, los lúmenes de las criptas y los artefactos. El tumor se anotó a lo largo del borde que separa los nidos de células malignas y el tejido no tumoral adyacente. Después de la exclusión de un margen de 500 μm de ancho, el área tumoral restante representó el TC. Limitamos el análisis de los macrófagos en el cCRC a la región TC para realizar comparaciones válidas con la MH, porque ambas regiones están compuestas principalmente por epitelio colónico; además, la reacción desmoplásica es menos prominente en el TC. Se excluyeron la superficie luminal del tumor, los vasos grandes, la mucosa normal, el epitelio displásico, la muscularis propia y el estroma de soporte de > 2 mm de diámetro, la mucina extracelular, la grasa, las necrosis, los abscesos, las hemorragias y los artefactos antes del análisis.

La densidad de las células inmunitarias en la MH y el TC se estimó como el número de perfiles de células inmunopositivas nucleadas dividido por el área total de la región. Para eliminar la asimetría en la distribución, para el análisis de supervivencia posterior, convertimos los datos brutos en los valores percentiles correspondientes y los categorizamos en bajo (por debajo del 25%) vs alto (25%-100%). Para obtener información sobre la eficacia con la que el tumor excluye, recluta o reprograma las células inmunitarias, también calculamos la relación TC/MH para cada tipo de célula y los categorizamos como alto y bajo utilizando la mediana como punto de corte.

Seguimiento

Se realizó un seguimiento de los pacientes hasta diciembre de 2023, con un tiempo de observación medio de 61 meses después de la resección de la MH metacrónica y de 84 meses después de la resección de la MH sincrónica. El tratamiento postoperatorio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones generalmente aceptadas.

Resultados

La fecha de la cirugía hepática se eligió como punto de referencia para el análisis de supervivencia. El punto final primario del estudio fue la supervivencia global (SG), que se definió como el intervalo desde la fecha de la resección hepática hasta la fecha de la muerte por cualquier causa. Los resultados secundarios fueron el tiempo hasta la recurrencia (TTR) y la supervivencia libre de enfermedad (SLE). El TTR se definió como el intervalo desde la fecha de la metástasis hepática hasta la fecha del diagnóstico de cualquier sitio de recurrencia. La SLE se consideró como el tiempo desde la resección de la MH hasta la fecha del diagnóstico de la recurrencia o la muerte por cualquier causa. Las probabilidades de SG a los 5 años después de la cirugía de la MH fueron del 34,8% en el grupo en estadio I-III y del 31,3% en el grupo en estadio IV (Tabla suplementaria 1).

Análisis estadístico

Los datos continuos no distribuidos normalmente se expresan como mediana (mínimo-máximo); su comparación se realizó mediante la prueba U de Mann-Whitney para comparar las densidades de las células entre el estadio IV vs I-III o mediante el análisis de varianza de Friedman, seguido de la prueba de Dunn para comparar las densidades de los 4 tipos de células en la MH o en el TC. Se utilizó la prueba de Wilcoxon para las comparaciones entre la MH y el TC del cCRC. Las proporciones se expresan como datos brutos (%). Las asociaciones entre pares de variables ordinales o cuantitativas se evaluaron utilizando la correlación de Spearman debido a la distribución no paramétrica de la mayoría de las variables. Para estos análisis se utilizó GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software LLC). El análisis de supervivencia se realizó en el entorno R. Utilizando el paquete Finalfit[^[26]], realizamos un análisis de regresión de Cox univariado para determinar el valor pronóstico de los predictores individuales para la SG, seguido de un análisis multivariado paso a paso hacia atrás. Se calcularon las razones de riesgo que muestran el riesgo relativo en comparación con 1 para el "grupo bajo". Teniendo en cuenta el número de pacientes en ambos grupos y los supuestos para un análisis multivariado correcto, probamos las asociaciones pronósticas de los macrófagos CD80+ y CD163+ en 3 modelos multivariados ajustados para: (1) el estadio N y el grado del cCRC; (2) el número, el tamaño y el grado de la MH; y (3) el régimen de quimioterapia (otro vs FOLFOX y el uso de terapia dirigida). Debido a la muy baja frecuencia de las mutaciones BRAF y al estado de inestabilidad MSI "alto", así como a la falta de datos para una proporción significativa de pacientes, el estado de MSI y la presencia de mutaciones KRAS y BRAF no se incluyeron en los modelos multivariados. La SG se estimó utilizando el método de Kaplan-Meier y se comparó entre los grupos mediante la prueba de registro de rangos. Los análisis de Kaplan-Meier se realizaron utilizando el paquete de supervivencia, y las curvas de supervivencia se visualizaron con el paquete survminer[^[27],^[28]]. Se consideró que un valor de P bilateral < 0,05 era estadísticamente significativo.

RESULTADOS

Distribución de los macrófagos en la MH y el cCRC: morfología y localización de los macrófagos en la MH y el TC del cCRC

En la MH, todos los tipos de macrófagos se ubicaron exclusivamente en la lámina propia, sin células observadas dentro de las criptas o el epitelio superficial. En la mayoría de los casos, los macrófagos CD163+, CD68+ y CD206+ se encontraron dispersos a lo largo del grosor de la mucosa, con una predominancia obvia en la capa superficial, mientras que las células CD80+ se ubicaron con mayor frecuencia en el tercio medio de la mucosa (Figura 1A-D). Los macrófagos CD163+ y CD206+ eran los de mayor tamaño, con formas que variaban desde redondeadas/poligonales hasta fusiformes o estrelladas. Los macrófagos CD68+ y CD80+ eran más frecuentemente redondeados o poligonales, y los CD80+ también eran algo más pequeños. Los antígenos putativos CD163, CD206 y CD80 tenían una expresión más membranosa que citoplasmática, mientras que el CD68 se expresaba en gránulos citoplasmáticos.

También se encontraron macrófagos en los folículos linfoideos asociados a la mucosa, donde las células CD163+ superaban en número a las células CD206+ en la zona del manto, mientras que las células CD68+ se ubicaban en los centros germinativos de los folículos linfoides secundarios.

La gran mayoría de los macrófagos en el TC del cCRC se ubicaron en el compartimento del estroma (Figura 1E-H). Se observaron algunas células en los lúmenes de las glándulas tumorales o en los pseudo-lúmenes y pocas células de cada tipo estaban en contacto directo con las células tumorales.

No observamos ninguna correlación entre las densidades de macrófagos en la MH y la distancia desde el tumor, excepto por una correlación negativa con las células CD206+ (Tabla suplementaria 2).

Distribución comparativa de los macrófagos

Las densidades de los macrófagos dentro de la MH y el TC del cCRC siguieron el orden: CD163+ > CD206+ = CD68+ > CD80+ (P < 0,05 para las diferencias; Figura 2) en ambos grupos. Se observó una tendencia similar en los folículos linfoides. Además, las densidades de los 4 tipos de células fueron significativamente menores en el TC del cCRC en comparación con la MH (P < 0,0001).

La única diferencia entre los pacientes en estadio IV vs I-III fue una mayor densidad de células CD80+ observada en la MH en el cCRC en estadio I-III: 309 (24-1143) células/mm2 vs 208 (3-1084) células/mm2 [mediana (mínimo-máximo)], P = 0,04.

Asociaciones entre los subconjuntos de macrófagos dentro y entre la MH y el cCRC

En la MH, las densidades de las células CD68+ se correlacionaron positivamente con las de las células CD163+ y CD80+ en ambos grupos (Tabla suplementaria 3). En el TC, las densidades de las células CD68+ se correlacionaron con las de los macrófagos CD163+ y, además, con las de las células CD206+ en el estadio I-III.

Asociaciones pronósticas de los macrófagos y las variables clínicas y patológicas

En el cCRC en estadio I-III, las altas densidades de macrófagos CD80+ en la MH y una mayor relación de células CD68+ entre el TC y la MH se asociaron con un menor riesgo de muerte después de la resección de la MH en el análisis de regresión de Cox univariado (Tabla 2), lo que se confirmó mediante una mayor SG en el análisis de Kaplan-Meier (Figura 3A y Figura suplementaria 1). Solo los macrófagos CD80+ en la MH siguieron siendo predictivos para la SG en el análisis multivariado después del ajuste para la relación TC/MH de CD68: razón de riesgo = 0,31 (IC del 95%: 0,14-0,71), P = 0,006.

En los pacientes en estadio IV, las altas densidades de macrófagos CD163+ en la MH se asociaron con un menor riesgo de muerte en el análisis de regresión de Cox univariado (Tabla 2) y una mayor SG en el análisis de Kaplan-Meier (Figura 3B). Se observaron asociaciones concordantes para la SLE y el TTR (Tablas suplementarias 4 y 5). En particular, las relaciones entre los marcadores putativos M1 y M2 (CD80+/CD206+, CD80+/CD163+) ni en la MH ni en el TC del cCRC no se asociaron con la SG (los datos no se muestran).

Los pacientes en estadio I-III que recibieron el régimen FOLFOX de quimioterapia adyuvante mostraron una mayor supervivencia global (SG) después de la resección de metástasis hepáticas (MH), mientras que otras variables clínicas o patológicas no se asociaron con la SG (Tabla suplementaria 6).

Tanto las células CD163+ en el margen de resección (MR) de los pacientes en estadio IV como las células CD80+ en el MR de los pacientes en estadio I-III mantuvieron sus asociaciones significativas con la SG en modelos multivariables después del ajuste por variables de confusión clínicamente relevantes (Tabla suplementaria 7).

Asociaciones de las variables clínicas y patológicas con las densidades de macrófagos

Las densidades de las células CD80+ fueron menores en el MR de las pacientes en estadio IV y en el tumor primario (TP) de los tumores más grandes en los pacientes en estadio I-III. Además, en los pacientes en estadio I-III, las densidades de las células CD68+ en el MR fueron mayores en el estadio N2 en comparación con el N1 y fueron mayores en el TP de los pacientes con múltiples MH. Las densidades de las células CD163+ fueron mayores en el TP de los tumores localizados en el lado derecho en el estadio IV (Tabla suplementaria 8 para todos los hallazgos en este párrafo).

Distribución de los macrófagos en el MR y el CRC: morfología y localización de los macrófagos en el MR y el TP del CRC

En el MR, todos los tipos de macrófagos se localizaron exclusivamente en la lámina propia, sin que se observaran células dentro de las criptas o del epitelio superficial. En la mayoría de los casos, los macrófagos CD163+, CD68+ y CD206+ se encontraron dispersos a lo largo del espesor de la mucosa, con una predominancia evidente en la capa superficial, mientras que las células CD80+ se localizaron con mayor frecuencia en el tercio medio de la mucosa (Figura 1A-D). Los macrófagos CD163+ y CD206+ fueron los de mayor tamaño, con formas que variaron desde redondeadas/poligonales hasta fusiformes o estrelladas. Los macrófagos CD68+ y CD80+ fueron más frecuentemente redondeados o poligonales, y los CD80+ también fueron algo más pequeños. Los antígenos putativos CD163, CD206 y CD80 tuvieron una expresión más membranosa que citoplasmática, mientras que el CD68 se expresó en gránulos citoplasmáticos.

También se encontraron macrófagos en los folículos linfoides asociados a la mucosa, donde las células CD163+ superaron en número a las células CD206+ en la zona del manto, mientras que las células CD68+ se localizaron en los centros germinativos de los folículos linfoides secundarios.

La gran mayoría de los macrófagos en el TP del CRC se localizaron en el compartimento estromal (Figura 1E-H). Se observaron algunas células en el lumen de las glándulas tumorales o en espacios pseudo-lumenales y pocas células de cada tipo estaban en contacto directo con las células tumorales.

No observamos ninguna correlación entre las densidades de macrófagos en el MR y la distancia del tumor, excepto por una correlación negativa con las células CD206+ (Tabla suplementaria 2).

Distribución comparativa de los macrófagos

Las densidades de macrófagos dentro del MR y el TP del CRC siguieron el orden: CD163+ > CD206+ = CD68+ > CD80+ (p < 0,05 para las diferencias; Figura 2) en ambos grupos. Se observó una tendencia similar en los folículos linfoides. Además, las densidades de los 4 tipos de células fueron significativamente menores en el TP del CRC en comparación con el MR (p < 0,0001).

La única diferencia entre los pacientes en estadio IV y I-III fue una mayor densidad de células CD80+ observada en el MR en el CRC en estadio I-III: 309 (24-1143) células/mm2 frente a 208 (3-1084) células/mm2 [mediana (mínimo-máximo)], p = 0,04.

Asociaciones entre los subconjuntos de macrófagos dentro y entre el MR y el CRC

En el MR, las densidades de las células CD68+ se correlacionaron positivamente con las de las células CD163+ y CD80+ en ambos grupos (Tabla suplementaria 3). En el TP, las densidades de las células CD68+ se correlacionaron con las de los macrófagos CD163+ y, además, con las células CD206+ en el estadio I-III.

Asociaciones pronósticas de los macrófagos y las variables clínicas y patológicas

En el CRC en estadio I-III, las altas densidades de macrófagos CD80+ en el MR y una mayor proporción de células CD68+ entre el TP y el MR se asociaron con un menor riesgo de muerte después de la resección de las MH en el análisis de Cox univariado (Tabla 2), lo que se confirmó mediante una mayor SG en el análisis de Kaplan-Meier (Figura 3A y Figura suplementaria 1). Solo los macrófagos CD80+ en el MR siguieron siendo predictivos para la SG en el análisis multivariado después del ajuste por la proporción de CD68 TP/MR: razón de riesgo = 0,31 (IC del 95%: 0,14-0,71), p = 0,006.

En los pacientes en estadio IV, las altas densidades de macrófagos CD163+ en el MR se asociaron con un menor riesgo de muerte en el análisis de Cox univariado (Tabla 2) y una mayor SG en el análisis de Kaplan-Meier (Figura 3B). Se observaron asociaciones concordantes para la supervivencia libre de progresión (SLP) y el tiempo hasta la progresión (TTP) (Tablas suplementarias 4 y 5). Cabe destacar que las proporciones entre los marcadores putativos M1 y M2 (CD80+/CD206+, CD80+/CD163+) ni en el MR ni en el TP del CRC no se asociaron con la SG (los datos no se muestran).

Los pacientes en estadio I-III que recibieron el régimen FOLFOX de quimioterapia adyuvante mostraron una mayor SG después de la resección de las MH, mientras que otras variables clínicas o patológicas no se asociaron con la SG (Tabla suplementaria 6).

Tanto las células CD163+ en el MR de los pacientes en estadio IV como las células CD80+ en el MR de los pacientes en estadio I-III mantuvieron sus asociaciones significativas con la SG en modelos multivariables después del ajuste por variables de confusión clínicamente relevantes (Tabla suplementaria 7).

Asociaciones de las variables clínicas y patológicas con las densidades de macrófagos

Las densidades de las células CD80+ fueron menores en el MR de las pacientes en estadio IV y en el TP de los tumores más grandes en los pacientes en estadio I-III. Además, en los pacientes en estadio I-III, las densidades de las células CD68+ en el MR fueron mayores en el estadio N2 en comparación con el N1 y fueron mayores en el TP de los pacientes con múltiples MH. Las densidades de las células CD163+ fueron mayores en el TP de los tumores localizados en el lado derecho en el estadio IV (Tabla suplementaria 8 para todos los hallazgos en este párrafo).

DISCUSIÓN

Este estudio proporciona nuevos conocimientos sobre la distribución espacial y la importancia pronóstica de los principales fenotipos de macrófagos en el MR y el TP del CRC, con respecto al estadio metastásico o no metastásico del CRC. Los resultados demuestran una distribución espacial y una densidad diferenciales de los subtipos de macrófagos, lo que apoya la hipótesis de que el microambiente inmunitario, en particular la polarización de los macrófagos, puede influir en el patrón metastásico y los resultados de supervivencia en el CRC.

Patrones de distribución y fenotipos de los macrófagos en el MR y el CRC

Según los resultados presentados anteriormente, los macrófagos CD163+, CD68+ y CD206+ predominaron en las capas superficiales de la mucosa, con densidades que disminuyeron desde CD163+ hasta CD80+, lo que sugiere un perfil de polarización similar a M2 [^[11], ^[14], ^[19], ^[24]]. La prevalencia de macrófagos M2 y macrófagos M0 en la mucosa del colon sano, especialmente por debajo del epitelio apical, se describió anteriormente y permite que los macrófagos sirvan como primera línea de defensa contra los microorganismos y patógenos comensales [^[14], ^[19], ^[20], ^[24], ^[25]]. La baja prevalencia de macrófagos M1 CD80+ en el MR está en línea con la regulación a la baja previamente informada de la molécula costimuladora CD80 y otras moléculas potencialmente proinflamatorias en los macrófagos intestinales, lo que les impide exhibir la respuesta transcripcional potencialmente peligrosa y proinflamatoria [^[24]].

Las densidades de macrófagos cuantificadas en nuestro estudio fueron consistentes con las informadas por Hernández et al [^[29]] en la mucosa normal adyacente a los tumores colorrectales, a saber, 480/mm2 para las células CD68+ y 228/mm2 para los macrófagos CD206+. Además, examinamos la relación entre las densidades de macrófagos en el MR y la distancia del tumor y no encontramos ninguna asociación, excepto por una correlación negativa con las células CD206+. En conjunto, estos hallazgos sugieren que las densidades de macrófagos observadas en el MR en nuestra cohorte probablemente representan un estado basal "normal"; sin embargo, se necesitan más estudios para confirmarlo.

De manera similar al MR, el TP del CRC mostró densidades de macrófagos que siguieron una tendencia decreciente desde CD163+ hasta CD80+. Esto se alinea con análisis inmunohistoquímicos previos que informan que los macrófagos M2 superan en número a los M1 en el CRC y otras neoplasias gastrointestinales [^[11], ^[13], ^[20], ^[21], ^[24]]. En contraste con el MR, las densidades de los macrófagos M0 se asociaron solo con los macrófagos M2, pero no con los macrófagos M1 en el TP. La mayoría de los pacientes en nuestra cohorte se encontraban en estadios avanzados (IV y III) de CRC, cuando las células tumorales inducen la polarización de los macrófagos M0 y la conversión de los macrófagos M1 proinflamatorios en un fenotipo M2 antiinflamatorio y promotor del cáncer [^[11]].

Densidades de macrófagos reducidas en el TP del CRC

De manera sorprendente, tanto en el estadio IV como en el I-III, las densidades de todos los subtipos de macrófagos fueron significativamente menores en el TP en comparación con la mucosa adyacente al tumor. Esto puede reflejar un fenómeno de exclusión inmune dentro del núcleo tumoral, posiblemente impulsado por factores derivados del tumor que pueden suprimir el reclutamiento de macrófagos y polarizarlos hacia el fenotipo M2 [^[30]]. El estroma que rodea el tumor puede impedir el tráfico de monocitos, lo que puede explicar la relativa escasez de macrófagos en el núcleo tumoral [^[31]]. Nuestros hallazgos están respaldados por datos de otros grupos que mostraron una menor expresión de macrófagos M2 en el CRC vs el MR adyacente utilizando inmunohistoquímica [^[22], ^[23]], citometría de flujo [^[32]] y análisis de expresión génica [^[23], ^[33]].

Implicaciones pronósticas diferenciales en los pacientes en estadio IV frente a I-III

En los pacientes en estadio IV, una alta densidad de macrófagos CD163+ en el MR adyacente se asoció significativamente con una mejor SG después de la resección de las MH. Por lo tanto, es posible hipotetizar que un subconjunto de macrófagos CD163+ en el MR conserva funciones fagocíticas y de presentación de antígenos, que, junto con su capacidad antiinflamatoria y reparadora, pueden restringir la diseminación tumoral [^[34]]. Además, los macrófagos similares a M2 que secretan interleucina-10 contribuyen a la reparación del tejido intestinal y son esenciales para mantener la integridad del epitelio [^[35]]. El efecto antitumoral de los macrófagos M2 también puede atribuirse a su papel en la maduración vascular, es decir, la cobertura completa de la vasculatura por las células pericíticas, lo que puede prevenir la invasión de las células tumorales y limitar la propagación metastásica en los pacientes con CRC [^[36], ^[37]]. Además, estos macrófagos M2 pueden ser repolarizados por la terapia o las señales sistémicas en fenotipos que promuevan aún más la inmunidad antitumoral, mejorando así el control postoperatorio de las células tumorales residuales [^[38]]. En particular, algunos otros autores también han asociado una mayor densidad de células CD163+ dentro del CRC [^[39], ^[40]] y las MH del CRC con mejores resultados [^[41]].

En los pacientes en estadio I-III, una mayor densidad de células CD80+ en el MR adyacente se asoció con una mayor SG, lo que se alinea con el papel protector de los macrófagos M1 en el CRC [^[11], ^[13], ^[14], ^[42]] y el cáncer en general [^[15]]. Específicamente, Pinto et al [^[13]] demostraron la asociación entre una mayor expresión de macrófagos CD80+ en el margen tumoral y una mejor SG en el CRC en estadio III. Una explicación plausible para este efecto puede ser el reclutamiento inducido por los macrófagos M1 de las células T CD8+ y las células asesinas naturales en el tumor, con una mejora paralela de su capacidad para eliminar las células tumorales [^[11], ^[14], ^[15], ^[43]]. La asociación de los macrófagos en el MR con la SG después de la resección de las MH también sugiere su papel en el tono inflamatorio sistémico, la competencia inmunitaria basal y la capacidad del paciente para tolerar o responder a los tratamientos posteriores [^[44], ^[45]]. No obstante, los macrófagos CD80+ en el MR no se asociaron con el TTP o la SLP. Creemos que esto se debe a que la recurrencia después de la resección de las MH del CRC está impulsada principalmente por las características biológicas de las propias MH y por los factores de riesgo clínicos establecidos, particularmente en el caso de las MH metacrónicas [^[46]].

Cabe destacar que el régimen FOLFOX también se asoció con una mayor supervivencia global (OS) tras la resección de metástasis sincrónicas. Su característica distintiva clave es la inclusión de oxaliplatino, que induce la muerte celular inmunogénica y polariza los macrófagos hacia un fenotipo M1 proinflamatorio y antitumoral [^[47]-^[50]]. Además, se ha demostrado que los macrófagos M1 ejercen un efecto sinérgico con el oxaliplatino en la terapia contra el cáncer al mejorar la fagocitosis de las células tumorales [^[51]]. Por lo tanto, nuestros hallazgos proporcionan evidencia indirecta de una posible sinergia entre los macrófagos de tipo M1 en el tejido no metastásico (NM) y el régimen de quimioterapia FOLFOX, una relación que merece una mayor investigación en estudios futuros.

Es importante señalar que la mayor densidad de macrófagos M1 CD80+ en el NM en las etapas I-III en comparación con la etapa IV apoya aún más la hipótesis de que la vigilancia inmunitaria puede ser más eficaz o estar mejor conservada en pacientes con metástasis que aparecen en etapas más avanzadas [^[12]]. Los macrófagos M1, marcados por CD80, secretan citocinas proinflamatorias como la interleucina-12 y el factor de necrosis tumoral alfa, y mejoran la activación de las células T citotóxicas, lo que puede retrasar la aparición de metástasis hepáticas [^[52],^[53]]. Se informó previamente sobre una mayor prevalencia de macrófagos M1 en el cáncer colorrectal primario (pCRC) no metastásico [^[33]] y de macrófagos M2 en el pCRC en etapa IV [^[54]]. En consecuencia, la disminución de las densidades de macrófagos CD80+ en el NM puede definir un subgrupo de pacientes con un mayor riesgo de metástasis a distancia, que podrían beneficiarse de una vigilancia más intensiva y de estrategias inmunoterapéuticas dirigidas a los macrófagos [^[12],^[13],^[21],^[55]].

Nuestro análisis multivariable confirmó que los indicadores basados en el sistema inmunitario, específicamente los macrófagos CD163+ y CD80+ en el NM, superaron a las variables clínicas y patológicas como factores pronósticos para la supervivencia global (OS). Estos hallazgos son consistentes con los resultados de un gran estudio internacional en pCRC, donde el puntaje inmunológico basado en células T contribuyó más a la predicción de la recurrencia y la mortalidad que cualquier parámetro clínico, incluida la clasificación TNM [^[56]].

Implicaciones pronósticas diferenciales en el NM frente al pCRC

En contraste con la mayoría de los estudios anteriores, destacamos las asociaciones pronósticas de los macrófagos en el tejido no metastásico (NM) adyacente al tumor, o entre el tejido tumoral (TC) y el NM, pero no en el propio TC. La misma molécula de CD puede marcar diferentes programas de macrófagos dependiendo del contexto tisular [^[57]]. Por lo tanto, es posible que, en contraste con la falta de impacto pronóstico de los macrófagos CD163+ en el pCRC en nuestro estudio, o las asociaciones pro-tumorales informadas por otros [^[58]-^[60]], los macrófagos CD163+ en el NM, en cambio, lleven a cabo funciones homeostáticas. Como se muestra en el estudio de Strasser et al [^[22]], los macrófagos en el tumor, en comparación con los que se encuentran en el tejido normal distante del tumor, parecen tener un fenotipo alterado, presumiblemente debido a una maduración y polarización alteradas. Los macrófagos M2 en el NM pueden ser reprogramados más fácilmente por las señales sistémicas perioperatorias (quimioterapia, citocinas) en fenotipos antitumorales que los macrófagos incrustados en el tumor, que están arraigados en un nicho inmunosupresor. Podemos hipotetizar que las señales derivadas del tumor pueden "educar" la mucosa adyacente, por ejemplo, alterando la polarización de los macrófagos, incluso antes de que se produzcan cambios histológicos evidentes. Estas señales pueden ser proteínas, factores de crecimiento, citocinas, lípidos, microARN, ARNm y ADN cargados en exosomas [^[61],^[62]], así como quimiocinas y factores de crecimiento solubles o metabolitos impulsados por la hipoxia [^[63]-^[66]]. El NM adyacente es un compartimento que a menudo se pasa por alto en la investigación del cáncer; sin embargo, nuestros hallazgos en conjunto subrayan que el panorama inmunitario del NM puede servir como un sustituto de las interacciones inmunitarias huésped-tumor que no siempre son aparentes en el núcleo del tumor. Esto apoya el concepto cada vez mayor de "cancerización inmunológica del campo", en el que las alteraciones de las células inmunitarias en los tejidos histológicamente normales adyacentes a los tumores reflejan las interacciones huésped-tumor y pueden influir en los resultados de la enfermedad [^[22],^[67],^[68]]. Comprender los cambios en el NM adyacente al tumor puede ayudar a explicar por qué algunos tejidos de aspecto normal dan lugar a lesiones sincrónicas incluso después de la resección del tumor.

Implicaciones teóricas y clínicas

La identificación de marcadores ideales proinflamatorios y antiinflamatorios de macrófagos ha sido un desafío [^[13]]. Contrariamente a CD163, el otro marcador M2, CD206, no mostró ninguna asociación pronóstica en nuestro estudio. Esto implica que CD163 y CD206 son expresados por diferentes subconjuntos de macrófagos, lo que está respaldado por la ausencia de correlación entre estos marcadores en nuestro estudio, y está en línea con los hallazgos de otro estudio [^[32]]. El aprovechamiento de los marcadores de macrófagos como CD80 y CD163 como biomarcadores pronósticos basados en tejidos puede complementar los modelos pronósticos actuales basados en la histopatología.

Las diferencias en los perfiles pronósticos de los macrófagos entre las etapas metastásicas y no metastásicas del cáncer colorrectal enfatizan diferentes trayectorias inmunológicas de la enfermedad metastásica y pueden informar el desarrollo de estrategias de vigilancia o inmunoterapia estratificadas. Por ejemplo, mejorar la polarización M1 o reprogramar los macrófagos M2 podría representar un enfoque viable para mejorar los resultados [^[11]-^[13],^[21]].

Junto con nuestros hallazgos anteriores sobre el mismo grupo de pacientes con respecto a los efectos antitumorales de las células T CD8+ [^[53]], sugerimos que las densidades absolutas y relativas de macrófagos deben interpretarse en conjunto con las células inmunitarias adaptativas para un modelado pronóstico preciso. En general, nuestros hallazgos tienen el potencial de estratificar el riesgo de cáncer, adaptar la vigilancia o diseñar intervenciones preventivas tempranas.

Hallazgos discordantes en la literatura

Algunos estudios de inmunoperfilado del cáncer colorrectal, incluidos varios a gran escala, informaron resultados discordantes con los nuestros, que, sin embargo, proporcionan un contexto importante para nuestros hallazgos. Väyrynen et al [^[69]] realizaron un estudio de inmunofluorescencia multiplex de macrófagos asociados al tumor (TAM) en 931 muestras de cáncer colorrectal, de las cuales el 16% correspondían a la etapa IV, con una evaluación de la supervivencia desde el diagnóstico del cáncer colorrectal. Asociaron una mayor cantidad de macrófagos M2 similares al estroma con una peor supervivencia específica del cáncer [^[69]]. Es importante destacar que su estudio se basó en un microarreglo de tejidos, que puede no capturar completamente la heterogeneidad del tumor; además, se utilizaron CD206 y MAF como marcadores M2. Pinto et al [^[13]] informaron una mayor expresión de CD68 en comparación con CD80 y CD163 en el NM, sin embargo, la abundancia de células inmunitarias se cuantificó utilizando el área inmunoreactiva derivada de campos de visión microscópicos seleccionados en lugar de recuentos de células en todo el portaobjetos. Koelzer y sus colaboradores observaron una predominancia de macrófagos M1 sobre macrófagos M2 en el pCRC, pero el análisis se realizó en microarreglos de tejidos utilizando un marcador M1 diferente (óxido nítrico sintasa inducible), lo que puede explicar las diferencias [^[40]]. Feng y sus colegas encontraron una mayor expresión de CD163 en el pCRC vs NM en una gran cohorte de 984 pacientes con cáncer colorrectal, aunque sus muestras de NM se tomaron a 3-5 cm del borde del tumor y la evaluación se realizó de forma semicuantitativa en cinco campos de visión [^[54]]. Usando CIBERSORT, Zhong et al encontraron una mayor expresión de macrófagos M2 en los tejidos normales, junto con una mayor expresión de macrófagos M0 y M1 en los tumores [^[33]]; este análisis se basó en perfiles de expresión génica a granel de las bases de datos GEO y TCGA. Ma et al [^[23]] no observaron ninguna asociación entre la expresión del gen CD163 en el NM adyacente al tumor y la supervivencia, basándose exclusivamente en los datos transcriptómicos de TCGA/GEO. Además, varios estudios han descrito asociaciones pro-tumorales de los macrófagos CD163+ en el cáncer colorrectal [^[58]-^[60]], aunque estas investigaciones variaron ampliamente en la composición de las cohortes, el tratamiento de fondo y la metodología. En general, las discrepancias entre los estudios probablemente reflejen diferencias en la composición de la cohorte, la etapa del tumor, el estado mutacional y los regímenes de tratamiento, así como una variación metodológica sustancial en la selección de muestras, los paneles de marcadores de macrófagos y los enfoques de cuantificación.

Fortalezas y limitaciones del estudio

Las fortalezas de este estudio incluyen la cuantificación exhaustiva, lado a lado, de cuatro marcadores clave de macrófagos en el tumor y el NM adyacente en pacientes con cáncer colorrectal en etapa IV vs etapa I-III. Las densidades de macrófagos se evaluaron de forma objetiva y cuantitativa utilizando imágenes de alta resolución digitalizadas en combinación con software especializado, lo que minimizó el sesgo del observador.

Este estudio está limitado por su diseño retrospectivo, lo que introduce posibles sesgos de selección y restringe la capacidad de establecer relaciones causales. Además, la fuente de datos de una sola institución y el tamaño de muestra moderado reducen la potencia estadística y pueden limitar la generalizabilidad de los hallazgos. Omitimos del análisis otras regiones del pCRC y del LM porque creemos que el TC es la región más relevante para compararla con el NM. Además, la abundancia y las asociaciones pronósticas de los macrófagos dentro de las diferentes ROI del pCRC y del LM en la misma cohorte son el objetivo de nuestra investigación en curso. De manera similar, un artículo que explore las asociaciones entre los macrófagos y los diferentes subconjuntos de células inmunitarias adaptativas en el NM, el pCRC y el LM está en preparación.

Aunque los marcadores inmunohistoquímicos se utilizan ampliamente, no capturan completamente el espectro funcional dinámico de los macrófagos, lo que requiere técnicas más avanzadas (por ejemplo, imagen multiplex, transcriptómica espacial) en el trabajo futuro. Los ensayos funcionales sobre macrófagos mucosos aislados podrían ayudar a validar nuestras hipótesis sobre su papel en la presentación de antígenos, la activación de las células T y la reparación de tejidos.

Además, la heterogeneidad de las terapias antineoplásicas adyuvantes impidió una evaluación confiable de las relaciones entre los efectos del tratamiento y los macrófagos. La disponibilidad limitada de datos moleculares y de mutación en una proporción sustancial de pacientes limitó la solidez de nuestros análisis con respecto a las asociaciones entre variables específicas y los resultados de la supervivencia. No obstante, los datos de densidad celular se integrarán con los resultados de secuenciación del exoma completo publicados recientemente de la misma cohorte [^[70]], lo que proporcionará un marco valioso para obtener más información sobre los mecanismos.

Patrones de distribución y fenotipos de los macrófagos en el NM y el pCRC

Según los resultados presentados anteriormente, los macrófagos CD163+, CD68+ y CD206+ predominaron en las capas superficiales de la mucosa, con densidades que disminuyeron de CD163+ a CD80+, lo que sugiere un perfil de polarización similar a M2 [^[11],^[14],^[19],^[24]]. La prevalencia de macrófagos M2 y macrófagos M0 en la mucosa del colon sano, especialmente por debajo del epitelio apical, se ha descrito anteriormente y permite que los macrófagos sirvan como la primera línea de defensa contra los microorganismos y patógenos comensales [^[14],^[19],^[20],^[24],^[25]]. La baja prevalencia de macrófagos M1 CD80+ en el NM es consistente con la regulación a la baja previamente informada de la molécula costimuladora CD80 y otras moléculas potencialmente proinflamatorias en los macrófagos intestinales, lo que les impide exhibir la respuesta transcripcional proinflamatoria potencialmente mortal [^[24]].

Las densidades de macrófagos cuantificadas en nuestro estudio fueron consistentes con las informadas por Hernández et al [^[29]] en la mucosa normal adyacente a los tumores colorrectales, a saber, 480/mm2 para las células CD68+ y 228/mm2 para los macrófagos CD206+. Además, examinamos la relación entre las densidades de macrófagos en el NM y la distancia del tumor y no encontramos ninguna asociación, excepto por una correlación negativa con las células CD206+. En conjunto, estos hallazgos sugieren que las densidades de macrófagos observadas en el NM en nuestra cohorte probablemente representan un estado basal "normal"; sin embargo, se necesitan más estudios para confirmarlo.

De manera similar al NM, la TC del CRCp mostró densidades de macrófagos que siguieron una tendencia decreciente, desde las células CD163+ hasta las células CD80+. Esto coincide con análisis inmunohistoquímicos previos que informaron que los macrófagos M2 superan en número a los macrófagos M1 en el CRC y otros tumores malignos gastrointestinales[^[11],^[13],^[20],^[21],^[24]]. A diferencia del NM, las densidades de macrófagos M0 se asociaron solo con M2, pero no con macrófagos M1 en la TC. La mayoría de los pacientes de nuestra cohorte se encontraban en estadios avanzados (IV y III) de CRC, cuando las células tumorales inducen la polarización de los macrófagos M0 y la conversión de los macrófagos proinflamatorios M1 en un fenotipo M2 antiinflamatorio y promotor del cáncer[^[11]].

Densidades reducidas de macrófagos en la TC del CRCp

Sorprendentemente, tanto en el estadio IV como en el I-III, las densidades de todos los subtipos de macrófagos fueron significativamente menores en la TC en comparación con la mucosa adyacente al tumor. Esto puede reflejar un fenómeno de exclusión inmune dentro del núcleo tumoral, posiblemente impulsado por factores derivados del tumor que pueden suprimir el reclutamiento de macrófagos y polarizarlos hacia el fenotipo M2[^[30]]. El estroma que rodea el tumor puede impedir el tráfico de monocitos, lo que puede explicar la relativa escasez de macrófagos en el núcleo tumoral[^[31]]. Nuestros hallazgos están respaldados por datos de otros grupos que mostraron una menor expresión de macrófagos M2 en el CRCp en comparación con el NM adyacente, utilizando inmunohistoquímica[^[22],^[23]], citometría de flujo[^[32]] y análisis de expresión génica[^[23],^[33]].

Implicaciones pronósticas diferenciales en el estadio IV frente al estadio I-III

En los pacientes en estadio IV, una alta densidad de macrófagos CD163+ en el NM adyacente se asoció significativamente con una mejor supervivencia global (SG) después de la resección de metástasis hepáticas (MH). Por lo tanto, es posible hipotetizar que un subconjunto de macrófagos CD163+ en el NM conserva funciones fagocíticas y de presentación de antígenos, que, junto con su capacidad antiinflamatoria y reparadora, pueden restringir la diseminación tumoral[^[34]]. Además, los macrófagos M2 secretores de interleucina-10 contribuyen a la reparación del tejido intestinal y son esenciales para mantener la integridad epitelial[^[35]]. El efecto antitumoral de los macrófagos M2 también podría atribuirse a su papel en la maduración vascular, es decir, la cobertura completa de la vasculatura por pericitos, lo que puede prevenir la extravasación de células tumorales y limitar la propagación metastásica en pacientes con CRC[^[36],^[37]]. Además, estos macrófagos M2 pueden ser repolarizados por la terapia o las señales sistémicas en fenotipos que promueven aún más la inmunidad antitumoral, mejorando así el control postoperatorio de las posibles células tumorales residuales[^[38]]. Cabe destacar que otros autores también han asociado una mayor densidad de células CD163+ dentro del CRCp[^[39],^[40]] y de las MH del CRC con mejores resultados[^[41]].

En los pacientes en estadio I-III, una mayor densidad de células CD80+ en el NM adyacente se asoció con una mayor SG, lo que coincide con el papel protector de los macrófagos M1 en el CRC[^[11],^[13],^[14],^[42]] y el cáncer en general[^[15]]. Específicamente, Pinto et al[^[13]] demostraron la asociación entre una mayor expresión de macrófagos CD80+ en el margen tumoral y una mejor SG en el CRC en estadio III. Una explicación plausible de este efecto puede ser el reclutamiento de células T CD8+ y células asesinas naturales en el tumor inducido por los macrófagos M1, junto con una mejora paralela de su capacidad para eliminar las células tumorales[^[11],^[14],^[15],^[43]]. La asociación de macrófagos en el NM con la SG después de la resección de MH también sugiere su papel en el tono inflamatorio sistémico, la competencia inmunitaria basal y la capacidad del paciente para tolerar o responder a tratamientos posteriores[^[44],^[45]]. No obstante, los macrófagos CD80+ en el NM no se asociaron con el tiempo hasta la progresión (TTP) o la supervivencia libre de enfermedad (SLE). Creemos que esto se debe a que la recurrencia después de la resección de las MH del CRC está impulsada principalmente por las características biológicas de las propias MH y por los factores de riesgo clínicos establecidos, particularmente en el caso de las MH metacrónicas[^[46]].

Cabe destacar que el régimen FOLFOX también se asoció con una mayor SG después de la resección de las MH metacrónicas. Su característica distintiva clave es la inclusión de oxaliplatino, que induce la muerte celular inmunogénica y desvía a los macrófagos hacia un fenotipo M1 proinflamatorio y antitumoral[^[47]-^[50]]. Además, se ha demostrado que los macrófagos M1 se sinergizan con el oxaliplatino en la terapia contra el cáncer al mejorar la fagocitosis de las células tumorales[^[51]]. Por lo tanto, nuestros hallazgos proporcionan evidencia indirecta de una posible sinergia entre los macrófagos M1 en el NM y el régimen de quimioterapia FOLFOX, una relación que merece una mayor investigación en estudios futuros.

Cabe destacar que la mayor densidad de macrófagos M1 CD80+ en el NM en el estadio I-III en comparación con el estadio IV apoya aún más la hipótesis de que la vigilancia inmunitaria puede ser más eficaz o estar más preservada en los pacientes con metástasis que aparecen más tarde[^[12]]. Los macrófagos M1, marcados por CD80, secretan citocinas proinflamatorias como la interleucina-12 y el factor de necrosis tumoral alfa, y mejoran la activación de las células T citotóxicas, lo que puede retrasar la aparición de metástasis hepáticas[^[52],^[53]]. Se informó anteriormente sobre una mayor prevalencia de macrófagos M1 en el CRC no metastásico[^[33]] y de macrófagos M2 en el CRC en estadio IV[^[54]]. En consecuencia, las densidades disminuidas de macrófagos CD80+ en el NM pueden delinear un subgrupo de pacientes con un mayor riesgo de metástasis a distancia, que podrían beneficiarse de una vigilancia intensificada y estrategias inmunoterapéuticas dirigidas a los macrófagos[^[12],^[13],^[21],^[55]].

Nuestro análisis multivariable confirmó que los indicadores basados en el sistema inmunitario, específicamente los macrófagos CD163+ y CD80+ en el NM, superaron a las variables clínicas y patológicas como factores pronósticos para la SG. Estos hallazgos son consistentes con los resultados de un gran estudio internacional en el CRCp, donde el puntaje inmunológico basado en células T contribuyó más a la predicción de la recurrencia y la mortalidad que cualquier parámetro clínico, incluida la clasificación TNM[^[56]].

Implicaciones pronósticas diferenciales en el NM frente al CRCp

En contraste con la mayoría de los estudios anteriores, destacamos las asociaciones pronósticas de los macrófagos en la mucosa adyacente al tumor (NM) o entre la TC y el NM, pero no en la TC en sí. La misma molécula de CD puede marcar diferentes programas de macrófagos según el contexto tisular[^[57]]. Por lo tanto, es posible que, en contraste con la falta de impacto pronóstico de los macrófagos CD163+ en el CRCp en nuestro estudio, o las asociaciones pro-tumorales informadas por otros[^[58]-^[60]], los macrófagos CD163+ en el NM en cambio realicen funciones homeostáticas. Como lo demostró Strasser et al[^[22]], los macrófagos en el tumor en comparación con los de los tejidos normales distantes del tumor parecen tener un fenotipo alterado, presumiblemente debido a una maduración y polarización alteradas. Los macrófagos M2 en el NM pueden ser reprogramados más fácilmente por las señales sistémicas perioperatorias (quimioterapia, citocinas) en fenotipos antitumorales que los macrófagos incrustados en el tumor que están arraigados en un nicho inmunosupresor. Podemos hipotetizar que las señales derivadas del tumor pueden "educar" la mucosa adyacente, por ejemplo, alterando la polarización de los macrófagos, incluso antes de que se produzcan cambios histológicos evidentes. Estas señales pueden ser proteínas, factores de crecimiento, citocinas, lípidos, microARN, ARNm y ADN cargados en exosomas[^[61],^[62]], así como quimiocinas y factores de crecimiento solubles o metabolitos impulsados por la hipoxia[^[63]-^[66]]. La NM adyacente es un compartimento que a menudo se pasa por alto en la investigación del cáncer; sin embargo, nuestros hallazgos en conjunto subrayan que el paisaje inmunitario del NM puede servir como un sustituto de las interacciones inmunitarias huésped-tumor que no siempre son aparentes en el núcleo tumoral. Esto apoya el concepto cada vez mayor de la "cancerización inmunológica del campo", en la que las alteraciones de las células inmunitarias en los tejidos histológicamente normales adyacentes a los tumores reflejan las interacciones huésped-tumor y pueden influir en los resultados de la enfermedad[^[22],^[67],^[68]]. Comprender los cambios en la NM adyacente al tumor puede ayudar a explicar por qué algunos tejidos de aspecto normal dan lugar a lesiones metacrónicas incluso después de la resección del tumor.

Implicaciones teóricas y clínicas

La identificación de marcadores ideales proinflamatorios y antiinflamatorios de macrófagos ha sido un desafío[^[13]]. Contrariamente a CD163, el otro marcador M2, CD206, no mostró ninguna asociación pronóstica en nuestro estudio. Esto implica que CD163 y CD206 son expresados por subconjuntos distintos de macrófagos, lo que está respaldado por la ausencia de correlación entre estos marcadores en nuestro estudio, y está en línea con los hallazgos de otro estudio[^[32]]. El aprovechamiento de los marcadores de macrófagos como CD80 y CD163 como biomarcadores pronósticos basados en tejidos puede complementar los modelos pronósticos actuales basados en la histopatología.

Las diferencias en los perfiles pronósticos de los macrófagos entre las etapas metastásicas y no metastásicas del CRC enfatizan diferentes trayectorias inmunológicas de la enfermedad metastásica y pueden informar el desarrollo de estrategias de vigilancia o inmunoterapia estratificadas. Por ejemplo, mejorar la polarización M1 o reprogramar los macrófagos M2 podría representar un enfoque viable para mejorar los resultados[^[11]-^[13],^[21]].

Junto con nuestros hallazgos anteriores sobre los mismos cohortes con respecto a los efectos antitumorales de las células T CD8+[^[53]], sugerimos que las densidades absolutas y relativas de macrófagos deben interpretarse en conjunto con las células inmunitarias adaptativas para un modelado pronóstico preciso. En general, nuestros hallazgos tienen el potencial de estratificar el riesgo de cáncer, adaptar la vigilancia o diseñar intervenciones preventivas tempranas.

Hallazgos discordantes en la literatura

Algunos estudios de inmunoperfilado del CRC, incluidos varios a gran escala, informaron resultados discordantes con los nuestros, que sin embargo proporcionan un contexto importante para nuestros hallazgos. Väyrynen et al[^[69]] realizaron un estudio de inmunofluorescencia multiplex de macrófagos asociados al tumor (MAT) en 931 muestras de CRC, de las cuales el 16% correspondieron al estadio IV, con una supervivencia evaluada desde el diagnóstico del CRC. Asociaron una mayor cantidad de macrófagos M2 similares al estroma con una peor supervivencia específica del cáncer[^[69]]. Cabe destacar que su estudio se basó en un microarreglo de tejidos, que puede no capturar completamente la heterogeneidad tumoral, además, se utilizaron CD206 y MAF como marcadores M2. Pinto et al[^[13]] informaron una mayor expresión de CD68 en comparación con CD80 y CD163 en el NM, sin embargo, la abundancia de células inmunitarias se cuantificó utilizando el área inmunoreactiva derivada de campos de visión microscópicos seleccionados en lugar de recuentos de células en todo el portaobjetos. Koelzer y sus colaboradores observaron una predominancia de macrófagos M1 sobre macrófagos M2 en el CRCp, pero el análisis se realizó en microarreglos de tejidos utilizando un marcador M1 diferente (sintasa inducible del óxido nítrico), lo que puede explicar las diferencias[^[40]]. Feng y sus colegas encontraron una mayor expresión de CD163 en el CRCp en comparación con el NM en una gran cohorte de 984 pacientes con CRC, aunque sus muestras de NM se tomaron a 3-5 cm del margen tumoral y la evaluación se realizó de forma semicuantitativa en cinco campos de visión[^[54]]. Utilizando CIBERSORT, Zhong et al encontraron una mayor expresión de macrófagos M2 en los tejidos normales, junto con una mayor expresión de macrófagos M0 y M1 en los tumores[^[33]]; este análisis se basó en perfiles de expresión génica masiva de las bases de datos GEO y TCGA. Ma et al[^[23]] no observaron ninguna asociación entre la expresión del gen CD163 en el NM adyacente al tumor y la supervivencia, basándose exclusivamente en los datos transcriptómicos de TCGA/GEO. Además, varios estudios han descrito asociaciones pro-tumorales de los macrófagos CD163+ en el CRC[^[58]-^[60]], aunque estas investigaciones variaron ampliamente en la composición de las cohortes, el tratamiento de fondo y la metodología. En general, las discrepancias entre los estudios probablemente reflejen diferencias en la composición de la cohorte, el estadio tumoral, el estado mutacional y los regímenes de tratamiento, así como una variación metodológica sustancial en la selección de muestras, los paneles de marcadores de macrófagos y los enfoques de cuantificación.

Fortalezas y limitaciones del estudio

Las fortalezas de este estudio incluyen la cuantificación exhaustiva, lado a lado, de cuatro marcadores clave de macrófagos en el tumor y el NM adyacente en pacientes con CRC en estadio IV frente a estadio I-III. Las densidades de macrófagos se evaluaron de forma objetiva y cuantitativa utilizando imágenes de alta resolución digitalizadas en combinación con software especializado, lo que minimizó el sesgo del observador.

Este estudio tiene limitaciones debido a su diseño retrospectivo, lo que introduce posibles sesgos de selección y restringe la capacidad de establecer relaciones causales. Además, el hecho de que los datos provengan de un único centro y el tamaño de muestra moderado reducen el poder estadístico y pueden limitar la generalización de los resultados. Hemos omitido del análisis otras regiones de pCRC y LM porque creemos que TC es la región más relevante para compararla con NM. Además, la abundancia y las asociaciones pronósticas de los macrófagos dentro de diferentes regiones de interés (ROI) de pCRC y LM en la misma cohorte son el objeto de nuestra investigación en curso. De manera similar, estamos preparando un artículo que explora las asociaciones entre los macrófagos y los diferentes subconjuntos de células inmunitarias adaptativas en NM, pCRC y LM.

Aunque los marcadores inmunohistoquímicos se utilizan ampliamente, no capturan completamente el espectro funcional dinámico de los macrófagos, lo que hace necesario el uso de técnicas más avanzadas (por ejemplo, imagen multiplexada, transcriptómica espacial) en futuros estudios. Los ensayos funcionales sobre macrófagos mucosos aislados podrían ayudar a validar nuestras hipótesis sobre su papel en la presentación de antígenos, la activación de las células T y la reparación de los tejidos.

Además, la heterogeneidad de las terapias adyuvantes contra el cáncer impidió una evaluación fiable de las relaciones entre los efectos del tratamiento y los macrófagos. La disponibilidad limitada de datos moleculares y mutacionales en una proporción importante de pacientes limitó la solidez de nuestros análisis con respecto a las asociaciones entre variables específicas y los resultados de supervivencia. No obstante, los datos de densidad celular se integrarán con los resultados de la secuenciación del exoma completo publicados recientemente de la misma cohorte[^[70]], lo que proporcionará un marco valioso para obtener más información sobre los mecanismos.

CONCLUSIÓN

Nuestro estudio demuestra la prevalencia de los macrófagos M2 sobre los fenotipos M1 y M0 tanto en pCRC como en NM, con densidades celulares significativamente menores en el tumor, probablemente en concordancia con la exclusión inmune. Contrariamente a lo que ocurre en TC de pCRC, encontramos implicaciones pronósticas de los macrófagos en NM, que fueron distintas entre el estadio IV y el estadio I-III de CRC. El beneficio para la supervivencia se asoció con altas densidades de macrófagos CD163+ M2 en NM en el estadio IV y de macrófagos CD80+ M1 en NM en el estadio I-III. Además, una alta densidad de células CD80+ en NM de pacientes en estadio I-III puede proporcionar una base mecánica para el retraso de la diseminación metastásica. Estos hallazgos subrayan la importancia de evaluar el microambiente tumoral más allá del propio tumor para el descubrimiento de biomarcadores pronósticos en CRC. Una vez validados, estos marcadores pronósticos basados en macrófagos prometen integrarse en la toma de decisiones clínicas tanto para pacientes en estadio IV como en estadio I-III de CRC.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece a los técnicos de histología Jan Javurek y Jana Dosoudilova su excelente asistencia técnica.