La polarización de los macrófagos infiltrados en el tumor predice respuesta completa al tratamiento neoadiyuno en pacientes con cáncer de recto.

El cáncer de recto es uno de los tumores malignos más comunes, con una estimación de 700.000 nuevos casos y 300.000 muertes a nivel mundial cada año.^[1] La cirugía es el tratamiento primario, aunque el tratamiento preoperatorio (neoadyuvante) reduce las tasas de recurrencia local.^[2] Los pacientes muestran niveles variables de respuesta al tratamiento neoadyuvante. Si bien algunos pacientes muestran muy poca reducción de la carga tumoral, casi el 20% de los pacientes con cáncer de recto avanzado logran una respuesta patológica completa (pRC) en la que no se pueden detectar células tumorales viables después del tratamiento.^[2-4] Estos pacientes podrían beneficiarse de evitar la cirugía, con el riesgo asociado de complicaciones postoperatorias significativas, y en su lugar se les trata según el enfoque de "observación y espera", donde se les controla para detectar la recurrencia de la enfermedad. Sería beneficioso en un entorno clínico identificar a los pacientes que probablemente lograrán una RC. A pesar de esto, actualmente no existen métodos eficaces para identificar a los pacientes que responden completamente.

El microambiente tumoral (MET) ha surgido recientemente como un candidato prometedor para comprender la respuesta al tratamiento.^[5] Los macrófagos asociados al tumor (MAT) son una de las células inmunitarias más abundantes presentes en el MET en varios cánceres humanos, incluido el cáncer colorrectal.^[6] Los MAT exhiben plasticidad en respuesta a los estímulos ambientales y puede producirse una polarización de los macrófagos entre los fenotipos de MAT.^[7],^[8] Los MAT pueden polarizarse hacia un estado proinflamatorio similar a M1 y un estado antiinflamatorio similar a M2, aunque sus fenotipos frecuentemente abarcan estos extremos y existen en un espectro de estados de activación dirigidos por el entorno local.^[7-11] Varios estudios han investigado el papel pronóstico de los MAT en el cáncer colorrectal, y algunos han demostrado una asociación entre una mayor densidad de macrófagos y una mejor supervivencia.^[12-14] Sin embargo, existen pruebas contradictorias sobre el papel pronóstico de los MAT en el cáncer colorrectal, con estudios que también muestran una asociación con una peor supervivencia o ninguna asociación significativa con la supervivencia.^[15-17] Además, la evaluación de los MAT a menudo se realiza utilizando un único marcador de polarización,^[12-15],^[17], lo que proporciona una evaluación limitada de la diversidad de los fenotipos de macrófagos. Los estudios han demostrado una extensa heterogeneidad entre los macrófagos mediante el análisis de tejidos con secuenciación de ARN de una sola célula, particularmente en condiciones inflamatorias como el cáncer.^[11],^[18] Sin embargo, estos estudios no pueden definir la distribución espacial de las subpoblaciones de MAT fenotípicamente distintas. Por lo tanto, la inmunofluorescencia multiplex (IFM) se ha utilizado para estudiar los MAT en pacientes con cáncer colorrectal para determinar su estado de polarización M1/M2 y cuantificar la prevalencia de subconjuntos en las regiones estromales y epiteliales del tumor.^[19]

El posible papel predictivo del espectro de polarización M1/M2 de los MAT en relación con la respuesta al tratamiento neoadyuvante en el cáncer de recto aún no se ha abordado. Por lo tanto, utilizamos dos marcadores (CD86 y el factor regulador de interferón 5 (IRF5)) asociados con el fenotipo M1 y dos marcadores (el factor de transcripción cMaf (MAF) y el receptor de manosa tipo C 1 (CD206)) asociados con el fenotipo M2, que se utilizaron previamente en relación con la supervivencia a largo plazo en el cáncer colorrectal.^[19] Entre estos marcadores, el CD86 se ha asociado con el fenotipo M1 y desempeña un papel importante como señal coestimuladora para la presentación de antígenos a las células T.^[20-22] El IRF5 es un factor de transcripción que promueve la polarización de macrófagos M1 a través de la inducción de IL-12A e IL-12B y la represión de IL-10 en los macrófagos.^[23] El cMaf es un factor de transcripción que se asocia con el fenotipo M2 y se reduce en los macrófagos M1 impulsados por IFN-γ.^[24] El CD206 es un receptor de eliminación que promueve varias funciones celulares, incluida la endocitosis de glicoproteínas inflamatorias manosiladas^[25] y a menudo se expresa en gran medida en los macrófagos M2.^[26]

Demostramos que una mayor densidad del subconjunto de MAT completamente polarizado M1 (que expresa CD86 e IRF5 pero no cMaf ni CD206) y una menor densidad del subconjunto de MAT completamente polarizado M2 (que expresa cMaf y CD206 pero no CD86 ni IRF5) están presentes en pacientes con una respuesta patológica completa al tratamiento neoadyuvante. Nuestros hallazgos ilustran que revelar el espectro de polarización de los fenotipos de MAT se puede aprovechar para predecir la respuesta del paciente al tratamiento neoadyuvante en el cáncer de recto.

Materiales y métodos

Diseño del estudio y participantes

En total, se diagnosticaron 1774 pacientes con adenocarcinoma de recto entre 2007 y 2019 en el Hospital Universitario de Sahlgrenska (Gotemburgo, Suecia) y se identificaron en el Registro Sueco de Cáncer Colorrectal. Se incluyeron los pacientes que presentaban un intervalo después del tratamiento neoadyuvante suficiente para esperar la regresión tumoral. El valor medio (rango) desde el inicio del tratamiento hasta la cirugía fue de 104 días (28-594 días) (4 pacientes con datos faltantes). En total, 128 pacientes cumplieron los criterios de inclusión y contaban con biopsias diagnósticas disponibles (Figura 1). Se obtuvieron muestras de biopsia anonimizadas del Departamento de Patología del Hospital Universitario de Sahlgrenska. El consentimiento informado fue dispensado por la Autoridad Sueca de Revisión Ética (número de registro 2019-04748), ya que las muestras estaban anonimizadas y no se podían rastrear hasta los pacientes individuales. Los datos clínicos de la población del estudio se recopilaron del Registro Sueco de Cáncer Colorrectal, así como de las historias clínicas de los pacientes. Las características del paciente y del tumor en la población del estudio se presentan en la Tabla S1.

Tinción con hematoxilina y eosina (H&E)

La tinción con H&E de las muestras se realizó como se describió en otro lugar.^[27] Brevemente, las láminas desparafinizadas se tiñeron con solución de hematoxilina (Histolab) durante 5 minutos, seguida de un lavado en agua durante 3 minutos y luego se tiñeron con eosina (Histolab) durante 30 segundos. Luego, las láminas se colocaron en una serie de gradiente de etanol [70%, 95%, 99,5% (dos veces)] durante diez inmersiones rápidas, seguidas de dos incubaciones de 5 minutos en xileno antes de montarlas con Pertex (Histolab).

Evaluación de la respuesta tumoral

Se recuperaron los especímenes quirúrgicos teñidos con H&E para todos los pacientes, y la respuesta al tratamiento según el grado de regresión tumoral (GRT) de la AJCC (Comité Conjunto Estadounidense sobre Cáncer)^[28] fue determinada por un patólogo (G.D.). El GRT se clasifica de 0 a 3, donde 0 indica una respuesta patológica completa y 3 indica ausencia de respuesta/ausencia de regresión al tratamiento neoadyuvante.

Las incertidumbres con respecto a la regresión tumoral se resolvieron mediante un patólogo gastroenterólogo consultor. Los investigadores involucrados en la preparación y el análisis de las láminas de tejido preoperatorio permanecieron ciegos al GRT hasta que se completaron todos los análisis de tinción de inmunofluorescencia multiplex y los análisis estadísticos se iniciaron.

Tinción de inmunofluorescencia multiplex

Se diseñó un panel de inmunofluorescencia multiplex para caracterizar la polarización de los macrófagos utilizando la técnica de amplificación de la señal de tiramida para maximizar la sensibilidad.^[29] Basado en datos previos,^[19], se utilizaron dos marcadores del fenotipo M1 (CD86 e IRF5) y dos marcadores del fenotipo M2 (CD206 y cMaf) junto con el marcador pan-macrófago CD68 y el marcador pan-epitelial/células tumorales citoceratina (KRT), como se indica en la Tabla S2. Se prepararon 4 secciones de formaldehído fijado e incrustado en parafina (FFPE) de las biopsias preoperatorias y se fijaron en láminas de microscopio Superfrost Plus (Thermo Fisher Scientific). Las láminas se mantuvieron a 37 °C durante 1 hora y luego se incubaron a 60 °C durante 1 hora. La desparafinizacion de las láminas antes de la tinción se realizó en xileno (dos veces) durante 5 minutos, seguida de una serie de gradiente de etanol [99,5% (dos veces), 95% y 70%] y agua destilada. La recuperación del antígeno se realizó en láminas desparafinizadas sumergidas en tampón de citrato 1× (pH 6) utilizando una olla a presión 2100 Retriever (Aptum Biologics). Se aplicaron dos rondas de calentamiento y las láminas se mantuvieron en una olla a presión para que se enfriaran. Posteriormente, las láminas se enjuagaron dos veces con PBS 1×. La humedad alrededor de las secciones se secó con pañuelos y las secciones se delimitaron con un bolígrafo hidrófobo (Histolab) para el proceso de tinción.

Antes de la primera tinción, las láminas se incubaron con solución de peróxido de hidrógeno al 3% (Honeywell, Fluka) enfriada en hielo durante 10 minutos, seguida de dos lavados con PBS 1× durante 3 minutos cada uno. El resto del protocolo de tinción para cada marcador comenzó con una incubación de 10 minutos con solución de albúmina sérica bovina al 0,1% (Sigma Aldrich) en tampón fosfato salino (PBS) 1×. Las secciones se tiñeron secuencialmente con anticuerpos y reactivos de amplificación de la señal de tiramida (TSA), como se indica en la Tabla S2. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios a temperatura ambiente durante 1 hora y se lavaron dos veces con PBS 1× durante 3 minutos. Luego, las láminas se incubaron con el reactivo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (Dako, EnVision FLEX/HRP) durante 10 minutos y se lavaron dos veces con PBS 1× durante 3 minutos. Después del lavado, las láminas se incubaron con los reactivos TSA durante 10 minutos según el protocolo del fabricante. Para eliminar los anticuerpos primarios y secundarios para cada tinción posterior, las láminas se sumergieron en tampón de citrato 1×, seguido de calentamiento en un horno de microondas a máxima potencia hasta que el tampón comenzara a hervir y a mínima potencia durante 10 minutos. Las láminas se colocaron en la oscuridad para que se enfriaran y luego se enjuagaron con PBS 1× antes del siguiente procedimiento de tinción de marcadores. Este proceso se repitió hasta la última tinción de marcadores. Para la última tinción de marcadores (CD206), se utilizó el fluorocromo Opal 780 como fluoróforo, por lo que se siguió el protocolo del fabricante. Brevemente, después del lavado del reactivo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante, las láminas se incubaron con TSA-DIG (dilución 1:100) en tampón TSA durante 10 minutos. Luego, las láminas se sumergieron en tampón de citrato 1×, seguido de calentamiento en un horno de microondas a máxima potencia hasta que el tampón comenzara a hervir y a mínima potencia durante 10 minutos. Las láminas se colocaron en la oscuridad para que se enfriaran y luego se enjuagaron con PBS 1×. Para la detección, las láminas se incubaron con el reactivo Opal 780 (anti-DIG conjugado con el fluoróforo Opal 780; dilución 1:25 en BSA al 0,1%; Akoya Biosciences) durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Las láminas se lavaron una vez con PBS 1× durante 3 minutos y los núcleos de las células de cada sección se etiquetaron con 4',6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI; Sigma Aldrich) durante 10 minutos. Finalmente, las láminas se enjuagaron dos veces con PBS 1× y una vez con agua MilliQ y se montaron con ProLong™ Gold Antifade Mountant (Invitrogen).

Análisis de imágenes

Todos los especímenes teñidos con H&E se examinaron mediante un patólogo (GD), quien también marcó las áreas de tumor invasivo. Las áreas correspondientes se localizaron en las secciones teñidas con inmunofluorescencia (Figura S1). Las láminas teñidas con inmunofluorescencia se escanearon con TissueFAXS (TissueGnostics) equipadas con conjuntos de filtros SpectraSplit7 de 7 canales (Kromnigon) y una cámara digital Hamamatsu C13440-20CU con una ampliación de 20× (Hamamatsu Photonics). Las láminas escaneadas se analizaron con el software StrataQuest (v. 7.0.1.189 y v. 7.1.1.129; TissueGnostics). El algoritmo de segmentación de tejidos se procesó manualmente en función de la expresión de citoceratina para definir el epitelio, el estroma y el fondo (Figura 2A). Se realizó una corrección manual de la segmentación de tejidos si la tinción de citoceratina era débil. Las áreas de eritrocitos altos, autofluorescencia, pliegues de tejido y regiones necróticas se marcaron manualmente y se excluyeron del análisis de imágenes. El DAPI se utilizó para definir los núcleos de las células. Todas las imágenes se inspeccionaron manualmente en la pestaña de revisión.

La intensidad de la tinción de los marcadores varió ligeramente entre las secciones. Por lo tanto, el umbral específico del marcador se definió mediante los niveles de intensidad de las células positivas y negativas de cada marcador. Esto se estableció como (1) el valor de intensidad más bajo de las células positivas para el marcador y el valor de intensidad más alto de las células negativas para el marcador y, si las intensidades de las células positivas y negativas no se superponían, o (2) como el valor de intensidad que minimizó el error en el recuento de células falsas positivas, basándose en las distribuciones de densidad, si hubiera superposición. Después de establecer el umbral de intensidad de cada marcador por separado para la región de interés, se definieron grupos de rangos de umbrales de intensidad que se categorizaron como niveles de intensidad bajos, bajos a intermedios, intermedios, intermedios a altos y altos (Tabla S3). A continuación, el valor del umbral de intensidad para cada marcador se estableció como el valor medio de los umbrales de intensidad de los valores del marcador incluidos en cada uno de los cinco grupos de rangos. Finalmente, toda la cohorte se analizó utilizando el valor del umbral de intensidad establecido, basándose en los grupos de rangos de umbrales específicos del marcador (Tabla S3). El rendimiento de la cuantificación de subconjuntos celulares mediante el software StrataQuest, utilizando el umbral de intensidad establecido para cada marcador dentro del grupo de rangos, se verificó mediante la selección aleatoria de secciones teñidas en el grupo de rangos, seguida de un recuento manual realizado por un investigador (A.A.).

Evaluación de la fenotipificación y polarización de los macrófagos

Se utilizaron células CD68+ para definir los TAM (macrófagos asociados al tumor). La densidad de las poblaciones de TAM se determinó en el MET (microambiente tumoral) de cada paciente dividiendo el número de TAM detectados en el estroma por el área del tejido estromal (en mm2) de la región de interés (ROI) individual. A continuación, los TAM se asignaron a 16 fenotipos específicos utilizando CD86, IRF5, cMaf y CD206. Se definió un fenotipo M1 completamente polarizado como CD68+IRF5+CD86+cMaf+CD206-, mientras que se definió un fenotipo M2 completamente polarizado como CD68+IRF5-CD86-cMaf+CD206+. Se definió un fenotipo mixto como TAM con marcadores tanto M1 como M2 (CD68+IRF5+CD86+cMaf+CD206+), y los TAM M0 se definieron como TAM sin marcadores M1 y M2 (CD68+IRF5-CD86-cMaf-CD206-).

Análisis estadísticos

Las comparaciones de subconjuntos de TAM, que se definieron a priori, se realizaron comparando cada categoría de TRG con la unión de las tres categorías restantes utilizando la prueba t de Welch para dos muestras con varianza desigual (bilateral). Para controlar la tasa de error familiar dentro de cada población, los valores p se ajustaron utilizando el procedimiento de paso descendente de Holm (α = 0,05). Para realizar un cribado imparcial en los 16 fenotipos completos, primero se realizó una prueba para detectar cualquier efecto de TRG utilizando ANOVA de una vía de Welch. Los valores p resultantes se controlaron en los fenotipos utilizando la tasa de descubrimiento falso de Benjamini-Hochberg (FDR; q = 0,05). Solo los fenotipos que superaron este cribado se sometieron a pruebas post hoc de la siguiente manera: cuatro pruebas a priori de uno frente al resto (para cada categoría de puntuación de TRG) de Welch para dos muestras con varianza desigual con ajuste de Holm dentro del fenotipo (α = 0,05). Se consideró significativo un contraste post hoc solo si su fenotipo superó el cribado ajustado por FDR y su valor p ajustado por Holm fue ≤0,05.

Se utilizaron modelos de regresión logística LASSO (Bolasso)^[30] con remuestreo (bootstrap) (500 ejecuciones de bootstrap) para investigar las asociaciones entre los 16 fenotipos de macrófagos y la etapa de TRG. Se utilizaron puntuaciones de Brier corregidas por optimismo^[31] para comparar el rendimiento de los diferentes modelos, y se utilizaron valores de AUC corregidos por optimismo para una mayor ilustración. La corrección del optimismo es un método basado en el remuestreo para reducir el sesgo en las estadísticas de rendimiento predictivo debido al sobreajuste.^[31]

Se generaron inmunopuntuaciones basadas en mapas de calor según lo descrito anteriormente^[27] y se compararon utilizando pruebas de rango-suma de Wilcoxon unilaterales. Se realizó un análisis ROC en R (pROC), y se evaluó la discriminación binaria de TRG para los predictores CD3+CD8, CD8+MxA, M1+M2 y el compuesto CD8+MxA+M1+M2, con AUC calculadas en la dirección = "