Identificación de proteínas plasmáticas asociadas con el riesgo de cánceres sólidos: un análisis prospectivo de 25 años de 4.712 proteínas circulantes en el estudio ARIC.

El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, y se estima que aproximadamente una de cada tres personas será diagnosticada con la enfermedad en algún momento de su vida. En 2026, se calcula que se diagnosticarán más de 2 millones de nuevos casos de cáncer a nivel nacional.^[1] Las estrategias de salud pública para reducir la carga del cáncer en las poblaciones incluyen la identificación de biomarcadores para la detección temprana, los factores de riesgo que pueden ayudar a definir las intervenciones preventivas y las poblaciones en riesgo que se beneficiarán más de ciertas intervenciones. Los estudios epidemiológicos realizados a lo largo de muchas décadas han investigado la asociación de los factores de estilo de vida y ambientales, así como los antecedentes familiares y médicos, con el riesgo de diferentes tipos de cáncer. Los estudios genómicos a gran escala realizados en las últimas dos décadas han identificado cientos de loci de susceptibilidad al cáncer en diferentes tipos de cáncer, lo que ha llevado al desarrollo de puntajes de riesgo poligénicos para la estratificación del riesgo de cáncer.^[2]–^[10] Los avances recientes en las tecnologías proteómicas ahora ofrecen oportunidades complementarias para caracterizar las proteínas, que capturan la influencia combinada de la genética y el medio ambiente, como factores de riesgo de cáncer y biomarcadores para la detección temprana.

Dos plataformas líderes que actualmente están implementando estudios a escala poblacional son Olink y SomaScan. Diferentes plataformas se dirigen a diferentes conjuntos de proteínas, pero incluso para las proteínas comunes, existen diferencias conocidas en las mediciones entre las dos plataformas debido a las diferencias en las tecnologías.^[11]–^[13] Por lo tanto, se necesitan estudios basados en plataformas alternativas para la identificación sólida de factores de riesgo y biomarcadores proteómicos para el cáncer. Múltiples estudios^[14]–^[16] han informado sobre asociaciones entre una variedad de proteínas y el riesgo de cáncer, basándose en el gran estudio del UK Biobank, que ha determinado los niveles plasmáticos de casi 3.000 proteínas utilizando la plataforma Olink basada en anticuerpos. Recientemente, utilizamos datos de la plataforma SomaScan disponibles para el estudio Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) para identificar que el nivel plasmático de la proteína LEG1 homolog y la glucocinasa dependiente de adenosina difosfato (ADP) están asociados con el riesgo de cáncer de mama posmenopáusico^[17] y confirmamos estas asociaciones en el European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC), que también implementó la plataforma SomaScan. De manera similar, un estudio en la cohorte EPIC descubrió cientos de proteínas asociadas con cánceres linfoides, y los resultados más significativos se confirmaron en gran medida en los estudios ARIC y UK Biobank.^[18] La identificación sólida de las asociaciones proteómicas con el cáncer con una utilidad amplia para la salud pública requiere estudios que involucren a individuos de diversos orígenes étnicos. Sin embargo, los grandes estudios como el UK Biobank y EPIC han incluido predominantemente a individuos de ascendencia europea. El objetivo de nuestro estudio actual es proporcionar una caracterización exhaustiva de la asociación de las proteínas plasmáticas medidas por SomaScan con el riesgo de cánceres sólidos entre los participantes blancos y negros en el estudio ARIC, y realizar análisis de confirmación en el estudio EPIC, una cohorte independiente.

Realizamos un perfilaje proteómico de alto rendimiento de 4.712 proteínas (4.955 aptámeros) cuantificadas utilizando el ensayo SomaScan® 5K y sus asociaciones con el riesgo futuro de 7 cánceres sólidos, independientemente de los factores de riesgo conocidos (Fig. 1). Este análisis incluyó un seguimiento máximo de 25,9 años, que involucró a 9.391 participantes blancos y negros, hombres y mujeres, del estudio ARIC. Las proteínas que siguieron siendo significativas después de la corrección para pruebas múltiples se evaluaron posteriormente en el estudio EPIC, que incluyó datos proteómicos basados en aptámeros comparables y ajustes de modelo. Además, aprovechamos el largo seguimiento del estudio ARIC para investigar cómo la fuerza de la asociación proteína-cáncer varía con el tiempo desde la medición, y los cambios longitudinales en los niveles de proteínas en 3 puntos de tiempo de estudio entre individuos sin cáncer durante un período de observación de 21 años para comprender la estabilidad intraindividual de las mediciones de proteínas a lo largo del tiempo. Finalmente, se realizaron análisis de enriquecimiento de vías para investigar los posibles mecanismos biológicos subyacentes a las proteínas asociadas con el riesgo de cáncer de hígado.

Métodos

Población de estudio

Este estudio se basa en el ARIC (RRID:SCR_021769), una cohorte prospectiva comunitaria de 15.792 participantes reclutados de Forsyth County, Carolina del Norte; Jackson, Mississippi; suburbios de Minneapolis, Minnesota; y Washington County, Maryland, en los EE. UU.^[19]. De ellos, el 55% eran mujeres y el 73% eran blancos. Los participantes fueron reclutados para la Visita 1 entre 1987 y 1989. Incluimos en la cohorte analítica a 11.798 participantes que tenían proteínas plasmáticas medidas utilizando sangre recolectada en 1990-1992 (Visita 2), la visita más temprana con datos de proteómica. Luego, excluimos a los participantes que no proporcionaron consentimiento para la investigación de enfermedades no cardiovasculares o el uso de información genética, que no se identifican como negros o blancos, o que tenían antecedentes de cáncer prevalente antes de la Visita 1, o la fecha de censura o el diagnóstico de cáncer ocurrió antes de la Visita 2, o que tenían datos faltantes de covariables (Visita 1, Visita 2). Después de estas exclusiones, la cohorte de análisis incluyó a 9.391 participantes (Tabla S1).

Determinación de casos incidentes de cáncer sólido

Este estudio incluyó 7 cánceres sólidos: vejiga, colorrectal, riñón, hígado, pulmón, páncreas y próstata. Se incluyó el cáncer primario de hígado porque el hígado es el principal productor de proteínas en el plasma, mientras que los otros 6 cánceres se eligieron debido a que tienen las tasas de incidencia más altas en la cohorte en comparación con otros cánceres. El cáncer de mama femenino no se incluye en este trabajo, ya que los resultados para este sitio se informaron recientemente.^[17] Los casos incidentes de cáncer primario se determinaron entre 1987 y 2015 mediante el enlace con los registros de cáncer en Maryland, Minnesota, Mississippi y Carolina del Norte.^[20]. Los casos también se determinaron después de un informe del participante sobre un nuevo diagnóstico de cáncer en una llamada anual o semianual (desde 2012) y se confirmó mediante la revisión de los registros médicos. Otros casos se identificaron mediante la extracción de resúmenes de alta hospitalaria y registros médicos recopilados de forma rutinaria, y certificados de defunción (cáncer como causa subyacente). Los cánceres incluidos en este análisis se identificaron utilizando los siguientes códigos CIE: cáncer de vejiga (CIE-O-1: 188.0–188.9; CIE-O-2: 67.0–67.9; CIE-O-3: C67.0-C67.9; CIE-8 y 9: 188.0–188.9; CIE-10: 67.0–67.9), cáncer colorrectal (CIE-O-1: 153.0–153.4, 153.6–153.8, 154.0–154.1; CIE-O-2: 18.0, 18.2–18.9, 19.9, 20.9; CIE-O-3: C18.0, C18.2-C18.9, C19.9, C20.9; CIE-8 y 9: 153.0–153.4, 153.6–153.8, 154.0–154.1; CIE-10: 18.0, 18.2–18.9, 19.9, 20.9), cáncer de riñón (CIE-O-1: 189; CIE-O-2: 64–66, 68; CIE-O-3: C64–66, 68; CIE-8 y 9: 189; CIE-10: 64–66, 68), cáncer de hígado (CIE-O-1: 155.0; CIE-O-2: 22.0; CIE-O-3: C22.0; CIE-8 y 9: 155.0; CIE-10: 22.0, 22.9), cáncer de pulmón (CIE-O-1: 162.0–162.9; CIE-O-2: 34.0–34.9; CIE-O-3: C34.0-C34.9; CIE-8 y 9: 162.0–162.9; CIE-10: 34.0–34.9), cáncer de páncreas (CIE-O-1: 157.0–9; CIE-O-2: 25.0–9; CIE-O-3: C25.0–9; CIE-8: 157.0–9; CIE-9: 157.0–9; CIE-10: 25.0–9), cáncer de próstata (CIE-O-1: 185; CIE-O-2: 61.9; CIE-O-3: C61.9; CIE-8: 185; CIE-9: 185; CIE-10: 61.9). Los años persona de seguimiento se calcularon desde la Visita 2 hasta el primer diagnóstico de cáncer primario incidente, la muerte o la fecha de censura (31 de diciembre de 2015), lo que ocurriera primero.

Medición de proteínas plasmáticas, preprocesamiento y normalización

En la Visita 2, se recolectaron muestras de sangre y el plasma se dividió en alícuotas utilizando un protocolo estandarizado, se congeló a −80 °C y se transfirió al laboratorio central de ARIC. Para el ensayo de proteómica, el plasma se descongeló, se dividió en alícuotas en placas de microtitulación codificadas por barras y se envió a SomaLogic, donde se midió la unidad de fluorescencia relativa (RFU) para cada proteína o complejo de proteínas para un volumen estándar de plasma por participante con el ensayo SomaScan® 5K (SomaLogic). El ensayo, el control de calidad de SomaLogic y los procedimientos de control de calidad implementados por los investigadores de ARIC se han descrito.^[21] Las RFU de proteínas se transformaron log2 y se preprocesaron utilizando la normalización adaptativa de máxima verosimilitud (ANML).^[21] En los análisis principales, utilizamos los niveles de proteínas de la Visita 2 (1990-1992). Los mismos procedimientos se realizaron para la recolección de sangre y las mediciones de proteínas en la Visita 3 (1993-1995) y la Visita 5 (2011-2013); los datos de estas visitas junto con la Visita 2 se utilizaron para investigar la variación intraindividual de los niveles a lo largo del tiempo.

El perfilaje proteómico produjo 4.955 aptámeros que pasaron el control de calidad (de 5.284), que representan 4.712 proteínas o complejos de proteínas plasmáticas. Luego, realizamos una regresión lineal de los valores de RFU log2 de los aptámeros sobre el centro de estudio, los 10 principales componentes principales genéticos (PC) y 10 factores de estimación probabilística de residuos (PEER).^[22] Los factores PEER ajustan las variaciones latentes asociadas con la variación técnica, incluidos los efectos de lote no corregidos. Los residuos de esta regresión lineal se normalizaron a continuación mediante la normalización de rango inverso para evitar la influencia de los valores extremos, y se utilizaron como la cuantificación de proteínas corregida en el análisis.^[23] Los valores de RFU log2 de proteínas preprocesados para los análisis posteriores siguen aproximadamente una media de 0 y una desviación estándar (DE) de 1.

La genotipificación en ARIC se realizó utilizando el conjunto de chips de ADN de genoma completo Affymetrix Human SNP Array 6.0, con imputación basada en el panel de referencia TOPMed.^[24] Los PC genéticos para los participantes de ARIC se calcularon proyectando sobre los ejes de PC derivados de un conjunto de datos de referencia multiétnico de alta calidad, el 1000 Genomes (1000G) + HGDP Project.^[25],^[26]

Evaluación de covariables

Seleccionamos factores de riesgo demográficos, antropométricos y de estilo de vida conocidos y sospechosos para cada cáncer en la Visita 2 (a menos que se especifique lo contrario) como covariables. La edad (años), el sexo (mujer u hombre; Visita 1), la raza (negro o blanco; Visita 1), el estado de tabaquismo (actual, exfumador, nunca fumador), los paquetes-año y el estado de consumo de alcohol (actual, exfumador, nunca) se evaluaron mediante una entrevista. La altura y el peso, a partir de los cuales se calculó el índice de masa corporal (IMC, kg/m2), y la circunferencia de la cintura y la cadera, a partir de las cuales se calculó la relación cintura-cadera, se midieron mediante técnicos capacitados. La actividad física (disponible solo en la Visita 1) se evaluó utilizando el cuestionario de Baecke^[27] para deportes, ocio y trabajo. La diabetes diagnosticada (sí, no) se definió por el informe del paciente de un diagnóstico médico o el uso de medicamentos para la diabetes. Entre los participantes sin un diagnóstico de diabetes, la prediabetes (sí, no) se definió como glucosa en ayunas de 100-125 mg/dL (no en ayunas 140-199 mg/dL) o HbA1c de 5,7-6,4%; la diabetes no diagnosticada (sí, no) se definió como glucosa en ayunas ≥126 mg/dL (no en ayunas ≥200 mg/dL) o HbA1c ≥6,5%; los niveles de sangre se midieron bajo los protocolos de estudio de ARIC. También seleccionamos una puntuación de proteínas plasmáticas relacionadas con el tabaquismo, que desarrollamos previamente.^[28]

Análisis estadístico

Estimamos las razones de riesgo (RR) y los intervalos de confianza del 95% (IC) para cada tipo de cáncer, utilizando modelos de regresión de riesgos proporcionales de Cox,^[29] con el tiempo transcurrido desde la Visita 2 como escala de tiempo base. Dado que nuestro objetivo era identificar las proteínas plasmáticas asociadas con el riesgo de cáncer más allá de los factores de riesgo conocidos, en el Modelo 1, ajustamos por los factores de riesgo comunes, incluyendo la edad basal, una variable combinada de raza y centro (todos los participantes reclutados en Jackson, MS, son afroamericanos), sexo, estado de tabaquismo, años-paquete, IMC y los 10 principales componentes principales (CP) genéticos. Para el cáncer de próstata, se excluyó el sexo del modelo. En el Modelo 2, ajustamos adicionalmente por los factores de riesgo específicos del sitio descritos en la Tabla S2 y por los 10 principales factores PEER. Los factores de riesgo específicos del sitio se identificaron mediante una revisión exhaustiva de la literatura y se limitaron a las variables accesibles dentro del estudio ARIC. El ajuste por los factores de riesgo conocidos del cáncer minimiza el sesgo de confusión debido a las exposiciones ambientales que difieren entre los casos incidentes y la población general. Además, los factores PEER pueden detectar artefactos latentes, como los efectos de lote. En conjunto, estos ajustes producen estimaciones de riesgo más precisas y asociaciones proteína-cáncer más sólidas para cada sitio. Se aplicó una corrección de la tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamin-Hochberg^[30] para las pruebas múltiples (FDR < 0,05).

Realizamos análisis de sensibilidad utilizando modelos estratificados por tiempo para evaluar cómo las asociaciones proteína-cáncer variaban con el tiempo hasta el diagnóstico y para confirmar si las proteínas identificadas en el Modelo 2 reflejan con mayor probabilidad la etiología del cáncer y el riesgo a largo plazo en lugar de la presencia de enfermedad no diagnosticada. Para estos análisis, comenzamos el seguimiento >5 años después de la Visita 2, pero utilizamos las proteínas de la Visita 2 (desfasadas) o comenzamos el seguimiento en la Visita 2 y truncamos (censuramos) el tiempo de seguimiento a 10 años. Las proteínas que siguen asociadas con el riesgo en el análisis desfasado tienen menos probabilidades de representar los efectos del cáncer preclínico o no diagnosticado. En el contexto del riesgo, truncar el tiempo de seguimiento puede reducir el error de medición relacionado con el uso de proteínas medidas una sola vez en el contexto de la variabilidad intraindividual en los niveles de proteína a largo plazo. Para evaluar la magnitud de cualquier variabilidad intraindividual, examinamos las correlaciones temporales de las proteínas identificadas en ambos modelos (Modelos 1 y 2) en múltiples visitas de estudio. Se calcularon las correlaciones de Pearson y las correlaciones intraclas (ICC(3,1)^[31]) de dos vías, utilizando una puntuación única, para los niveles de proteína log2RFU estandarizados de ANML entre la Visita 2 basal (1990-1992), la Visita 3 (1993-1995) y la Visita 5 (2011-2013) en los participantes sin cáncer prevalente al inicio, sin cáncer incidente durante el seguimiento y con datos proteómicos completos en las 3 visitas [N=3.014; N(Masculino)=1.198; N(Femenino)=1.816)].

Todos los análisis se realizaron utilizando R versión 4.2.1 y todas las pruebas se realizaron como pruebas de dos colas.

Análisis de enriquecimiento de vías para las proteínas relacionadas con el riesgo de cáncer de hígado primario

Para el cáncer de hígado primario, realizamos análisis de enriquecimiento para comprender sus funciones biológicas. Se identificaron los procesos biológicos, los componentes celulares y las funciones moleculares sobre-representados de la Ontología Genética (GO) utilizando el paquete R clusterProfiler (v4.4.4).^[32] El enriquecimiento de la vía Reactome se realizó utilizando el paquete ReactomePA (v1.40.0).^[33] Los análisis de enriquecimiento de vías se realizaron utilizando pruebas hipergeométricas unilaterales, con una corrección de pruebas múltiples aplicada mediante el método FDR de Benjamini-Hochberg. No realizamos análisis de enriquecimiento de vías para los otros 6 cánceres porque el número de proteínas identificadas en los modelos completos (Modelo 2) fue insuficiente para un análisis significativo.

Cohorte de confirmación: el Estudio Europeo Prospectivo sobre el Cáncer y la Nutrición (EPIC)

Buscamos confirmar las proteínas asociadas con los cánceres específicos del sitio después de la corrección FDR identificadas en ARIC en un estudio prospectivo independiente, la cohorte EPIC. El estudio proteómico en EPIC utiliza un diseño de cohorte de casos e incluye participantes de 4 países EPIC (Reino Unido, Países Bajos, España, Italia).^[34],^[35] Los casos de cáncer se identificaron durante 20 años (10 años de seguimiento medio para los casos de cáncer). Las proteínas plasmáticas se midieron utilizando el ensayo SomaScan® 7K Assay v4.1 en sangre recolectada antes de los diagnósticos de cáncer. Todas las proteínas en el estudio ARIC (ensayo 5K) están disponibles en el estudio EPIC (ensayo 7K). Las asociaciones en EPIC se evaluaron utilizando la regresión de Cox ponderada por Prentice^[36] con la edad como escala de tiempo, ajustando por los factores de riesgo comunes y específicos del sitio (Modelo 2) como en ARIC. Tenga en cuenta que los CP genéticos y los factores PEER no se ajustaron en los modelos EPIC debido a que la cohorte consta solo de participantes blancos y diferentes procedimientos de medición y procesamiento de proteínas.

Población de estudio

Este estudio se basa en la cohorte prospectiva comunitaria ARIC (RRID:SCR_021769) de 15.792 participantes reclutados de Forsyth County, Carolina del Norte; Jackson, Mississippi; suburbios de Minneapolis, Minnesota; y Washington County, Maryland en los EE. UU.^[19]. De ellos, el 55% eran mujeres y el 73% eran blancos. Los participantes fueron reclutados para la Visita 1 entre 1987 y 1989. Incluimos en la cohorte analítica a 11.798 participantes que tenían proteínas plasmáticas medidas utilizando sangre recolectada en 1990-1992 (Visita 2), la visita más temprana con datos de proteómica. Luego, excluimos a los participantes que no dieron su consentimiento para la investigación de enfermedades no cardiovasculares o el uso de información genética, que no se identifican como afroamericanos o blancos, o que tenían antecedentes de cáncer prevalente antes de la Visita 1, o la fecha de censura o el diagnóstico de cáncer ocurrió antes de la Visita 2, o que tenían datos faltantes de covariables (Visita 1, Visita 2). Después de estas exclusiones, la cohorte de análisis incluyó a 9.391 participantes (Tabla S1).

Identificación de casos incidentes de cáncer sólido

Este estudio incluyó 7 cánceres sólidos: vejiga, colorrectal, riñón, hígado, pulmón, páncreas y próstata. Se incluyó el cáncer de hígado primario porque el hígado es el principal productor de proteínas en el plasma, mientras que los otros 6 cánceres se eligieron debido a que tienen las tasas de incidencia más altas en la cohorte en comparación con otros cánceres. El cáncer de mama femenino no se incluye en este trabajo, ya que los resultados para este sitio se informaron recientemente.^[17] Los casos de cáncer primario incidentes se identificaron entre 1987 y 2015 mediante el enlace con los registros de cáncer en Maryland, Minnesota, Mississippi y Carolina del Norte.^[20]. Los casos también se identificaron después de que un participante informara sobre un nuevo diagnóstico de cáncer en una llamada anual o semianual (desde 2012) y se confirmó mediante una revisión de los registros médicos. Otros casos se identificaron mediante la extracción de resúmenes de alta hospitalaria y registros médicos recopilados de forma rutinaria, y certificados de defunción (cáncer como causa subyacente). Los cánceres incluidos en este análisis se identificaron utilizando los siguientes códigos CIE: cáncer de vejiga (CIE-O-1: 188.0-188.9; CIE-O-2: 67.0-67.9; CIE-O-3: C67.0-C67.9; CIE-8 y 9: 188.0-188.9; CIE-10: 67.0-67.9), cáncer colorrectal (CIE-O-1: 153.0-153.4, 153.6-153.8, 154.0-154.1; CIE-O-2: 18.0, 18.2-18.9, 19.9, 20.9; CIE-O-3: C18.0, C18.2-C18.9, C19.9, C20.9; CIE-8 y 9: 153.0-153.4, 153.6-153.8, 154.0-154.1; CIE-10: 18.0, 18.2-18.9, 19.9, 20.9), cáncer de riñón (CIE-O-1: 189; CIE-O-2: 64-66, 68; CIE-O-3: C64-66, 68; CIE-8 y 9: 189; CIE-10: 64-66, 68), cáncer de hígado (CIE-O-1: 155.0; CIE-O-2: 22.0; CIE-O-3: C22.0; CIE-8 y 9: 155.0; CIE-10: 22.0, 22.9), cáncer de pulmón (CIE-O-1: 162.0-162.9; CIE-O-2: 34.0-34.9; CIE-O-3: C34.0-C34.9; CIE-8 y 9: 162.0-162.9; CIE-10: 34.0-34.9), cáncer de páncreas (CIE-O-1: 157.0-9; CIE-O-2: 25.0-9; CIE-O-3: C25.0-9; CIE-8: 157.0-9; CIE-9: 157.0-9; CIE-10: 25.0-9), cáncer de próstata (CIE-O-1: 185; CIE-O-2: 61.9; CIE-O-3: C61.9; CIE-8: 185; CIE-9: 185; CIE-10: 61.9). Los años persona de seguimiento se calcularon desde la Visita 2 hasta el primer diagnóstico de cáncer primario incidente, la muerte o la fecha de censura (31 de diciembre de 2015), lo que ocurriera primero.

Medición, preprocesamiento y normalización de proteínas plasmáticas

En la Visita 2, se recolectaron muestras de sangre y el plasma se dividió en alícuotas utilizando un protocolo estandarizado, se congeló a -80 °C y se transfirió al laboratorio central de ARIC. Para el ensayo de proteómica, el plasma se descongeló, se dividió en alícuotas en placas de microtitulación codificadas por barras y se envió a SomaLogic, donde se midió la unidad de fluorescencia relativa (RFU) de cada proteína o complejo de proteínas para un volumen plasmático estándar por participante con el ensayo SomaScan® 5K (SomaLogic). El ensayo, el control de calidad de SomaLogic y los procedimientos de control de calidad implementados por los investigadores de ARIC se han descrito.^[21] Las RFU de las proteínas se transformaron log2 y se preprocesaron utilizando la normalización adaptativa de máxima verosimilitud (ANML).^[21] En los análisis principales, utilizamos los niveles de proteína de la Visita 2 (1990-1992). Se realizaron los mismos procedimientos para la recolección de sangre y las mediciones de proteínas en la Visita 3 (1993-1995) y la Visita 5 (2011-2013); los datos de estas visitas junto con la Visita 2 se utilizaron para investigar la variación intraindividual en los niveles a lo largo del tiempo.

El perfil proteómico produjo 4.955 aptámeros que pasaron el control de calidad (de 5.284), que representan 4.712 proteínas o complejos de proteínas plasmáticas. Luego, regresionamos linealmente los valores de log2RFU de los aptámeros en el centro de estudio, los 10 principales componentes principales (CP) genéticos y los 10 principales factores de estimación probabilística de residuos (PEER).^[22] Los factores PEER ajustan por los patrones latentes asociados con la variación técnica, incluidos los efectos de lote no corregidos. Los residuos de esta regresión lineal se normalizaron a continuación mediante la normalización de rango inverso para evitar la influencia de los valores extremos y se utilizaron como la cuantificación de proteínas corregida en el análisis.^[23] Los valores de log2RFU de proteínas preprocesados para los análisis posteriores siguen aproximadamente una media de 0 y una desviación estándar (DE) de 1.

La genotipificación en ARIC se realizó utilizando el conjunto de chips Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0, con imputación basada en el panel de referencia TOPMed.^[24] Los CP genéticos para los participantes de ARIC se calcularon proyectándolos en los ejes de CP derivados de un conjunto de datos de referencia multiétnico de alta calidad, el 1000 Genomes (1000G) + HGDP Project.^[25],^[26]

Evaluación de covariables

Seleccionamos los factores de riesgo demográficos, antropométricos y de estilo de vida conocidos y sospechosos para cada cáncer en la Visita 2 (a menos que se especifique lo contrario) como covariables. La edad (años), el sexo (femenino o masculino; Visita 1), la raza (afroamericano o blanco; Visita 1), el estado de tabaquismo (actual, exfumador, nunca fumador), los años-paquete y el estado de consumo de alcohol (actual, exfumador, nunca) se evaluaron mediante una entrevista. La altura y el peso, a partir de los cuales se calculó el índice de masa corporal (IMC, kg/m2), y la circunferencia de la cintura y las caderas, a partir de las cuales se calculó la relación cintura-cadera, se midieron mediante técnicos capacitados. La actividad física (disponible solo en la Visita 1) se evaluó utilizando el cuestionario de Baecke^[27] para deportes, ocio y trabajo. La diabetes diagnosticada (sí, no) se definió por el informe de un diagnóstico médico o el uso de medicamentos para la diabetes. Entre los participantes sin diagnóstico de diabetes, la prediabetes (sí, no) se definió como glucosa en ayunas de 100-125 mg/dL (no en ayunas de 140-199 mg/dL) o HbA1c de 5,7-6,4%; la diabetes no diagnosticada (sí, no) se definió como glucosa en ayunas ≥126 mg/dL (no en ayunas ≥200 mg/dL) o HbA1c ≥6,5%; los niveles de sangre se midieron bajo los protocolos de estudio de ARIC. También seleccionamos una puntuación de proteínas plasmáticas relacionadas con el tabaquismo, que desarrollamos previamente.^[28]

Análisis estadístico

Estimamos las razones de riesgo (RR) y los intervalos de confianza del 95% (IC) para cada tipo de cáncer, utilizando modelos de regresión de riesgos proporcionales de Cox,^[29] con el tiempo transcurrido desde la visita 2 como la escala de tiempo subyacente. Dado que nuestro objetivo era identificar las proteínas plasmáticas asociadas con el riesgo de cáncer más allá de los factores de riesgo conocidos, en el Modelo 1, ajustamos por los factores de riesgo comunes, incluido el nivel basal de edad, una variable combinada de raza y centro (todos los participantes reclutados en Jackson, MS, son afroamericanos), sexo, estado de tabaquismo, paquetes-año, IMC y los 10 principales componentes principales genéticos (CPG). Para el cáncer de próstata, se excluyó el sexo del modelo. En el Modelo 2, ajustamos adicionalmente por los factores de riesgo específicos del sitio descritos en la Tabla S2 y por los 10 principales factores PEER. Los factores de riesgo específicos del sitio se identificaron mediante una revisión exhaustiva de la literatura y se limitaron a las variables accesibles dentro del estudio ARIC. El ajuste por los factores de riesgo conocidos del cáncer minimiza el sesgo de confusión debido a las exposiciones ambientales que difieren entre los casos incidentes y la población general. Además, los factores PEER pueden detectar artefactos latentes, como los efectos de lote. En conjunto, estos ajustes producen estimaciones de riesgo más precisas y asociaciones proteína-cáncer más sólidas para cada sitio. Se aplicó una corrección de la tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamin-Hochberg^[30] para las pruebas múltiples (FDR < 0,05).

Realizamos análisis de sensibilidad utilizando modelos estratificados por tiempo para evaluar cómo las asociaciones proteína-cáncer variaban con el tiempo hasta el diagnóstico y para confirmar si las proteínas identificadas en el Modelo 2 tienen más probabilidades de reflejar la etiología del cáncer y el riesgo a largo plazo en lugar de la presencia de una enfermedad no diagnosticada. Para estos análisis, comenzamos el seguimiento >5 años después de la visita 2, pero utilizamos las proteínas de la visita 2 (desfasadas) o comenzamos el seguimiento en la visita 2 y truncamos (censuramos) el tiempo de seguimiento a 10 años. Las proteínas que siguen asociadas con el riesgo en el análisis desfasado tienen menos probabilidades de representar los efectos del cáncer preclínico o no diagnosticado. En el contexto del riesgo, truncar el tiempo de seguimiento puede reducir el error de medición relacionado con el uso de proteínas medidas una sola vez en el contexto de la variabilidad intraindividual en los niveles de proteína a largo plazo. Para evaluar la magnitud de cualquier variabilidad intraindividual, examinamos las correlaciones temporales de las proteínas identificadas en ambos modelos (Modelos 1 y 2) en múltiples visitas de estudio. Se calcularon las correlaciones de Pearson y las correlaciones intraclasicas de puntaje único mixto de dos vías ICC(3,1)^[31] para los niveles de proteína log2RFU estandarizados de ANML entre la visita basal 2 (1990-1992), la visita 3 (1993-1995) y la visita 5 (2011-2013) en los participantes sin cáncer prevalente en el nivel basal, sin cáncer incidente durante el seguimiento y con datos proteómicos completos en las 3 visitas [N=3.014; N(Masculino)=1.198; N(Femenino)=1.816)].

Todos los análisis se realizaron utilizando R versión 4.2.1 y todas las pruebas se realizaron como pruebas de dos colas.

Análisis de enriquecimiento de vías para las proteínas relacionadas con el riesgo de cáncer de hígado primario

Para el cáncer de hígado primario, realizamos análisis de enriquecimiento para comprender sus funciones biológicas. Se identificaron los procesos biológicos, los componentes celulares y las funciones moleculares sobre-representados de la Ontología Gen (GO) utilizando el paquete R clusterProfiler (v4.4.4).^[32] El enriquecimiento de la vía Reactome se realizó utilizando el paquete ReactomePA (v1.40.0).^[33] Los análisis de enriquecimiento de vías se realizaron utilizando pruebas hipergeométricas de una cola, con una corrección de pruebas múltiples aplicada mediante el método FDR de Benjamini-Hochberg. No realizamos análisis de enriquecimiento de vías para los otros 6 cánceres porque el número de proteínas identificadas en los modelos completos (Modelo 2) fue insuficiente para un análisis significativo.

Cohorte de confirmación: el Estudio Europeo Prospectivo sobre el Cáncer y la Nutrición (EPIC)

Buscamos confirmar las proteínas asociadas con los cánceres específicos del sitio después de la corrección FDR identificadas en ARIC en un estudio prospectivo independiente, la cohorte EPIC. El estudio proteómico en EPIC utiliza un diseño de cohorte de casos e incluye participantes de 4 países EPIC (Reino Unido, Países Bajos, España, Italia).^[34],^[35] Los casos de cáncer se identificaron durante 20 años (10 años de seguimiento medio para los casos de cáncer). Las proteínas plasmáticas se midieron utilizando el ensayo SomaScan® 7K Assay v4.1 en sangre recolectada antes de los diagnósticos de cáncer. Todas las proteínas en el estudio ARIC (ensayo 5K) están disponibles en el estudio EPIC (ensayo 7K). Las asociaciones en EPIC se evaluaron utilizando la regresión de Cox ponderada por Prentice^[36] con la edad como la escala de tiempo, ajustando por los factores de riesgo comunes y específicos del sitio (Modelo 2) como en ARIC. Tenga en cuenta que los CPG y los factores PEER no se ajustaron en los modelos EPIC debido a que la cohorte consta solo de participantes blancos y diferentes procedimientos de medición y procesamiento de proteínas.

Resultados

Descripción de la cohorte

La cohorte analítica incluyó a 9.391 participantes de ARIC seguidos durante un tiempo medio de 22,6 años (rango 0,1-25,9 años). Las características basales se muestran en la Tabla 1 y la Tabla Suplementaria S1. Se diagnosticaron un total de 1.617 casos incidentes de estos 7 cánceres durante un tiempo medio de 12,1 años (rango 0,1-25,2 años). La edad media en la visita 2 fue de 57 años (DE 5,7). La población del estudio fue 54,8% femenina y 23,3% afroamericana. En comparación con toda la cohorte analítica, los participantes que desarrollaron posteriormente cáncer de vejiga, hígado, pulmón o próstata eran con mayor frecuencia exfumadores o fumadores actuales y presentaban una mayor exposición acumulada al tabaco, medida en paquetes-año (comparaciones no ajustadas).

Asociaciones proteómicas con cánceres sólidos

De las 4.955 aptámeros evaluados, 40 proteínas únicas (40 aptámeros) se asociaron significativamente con el riesgo de al menos un sitio de cáncer después de la corrección de pruebas múltiples dentro del sitio (FDR < 0,05), lo que resultó en un total de 41 asociaciones proteína-cáncer en el Modelo 2 (ajustado por factores de riesgo comunes y específicos del sitio) (Fig. 2a, Tabla 2). En el Modelo 1 (ajustado solo por factores de riesgo comunes), 139 proteínas únicas (140 aptámeros) se asociaron significativamente con el riesgo de al menos un sitio de cáncer después de la corrección para pruebas múltiples, con un total de 144 asociaciones proteína-cáncer (Fig. 2b, Tabla Suplementaria S3).

Para el riesgo de cáncer de hígado, identificamos 33 asociaciones proteicas únicas en el Modelo 2, que incluyen IGFBP3, IGF2, IGF1, IL18BP y MMP7 con RR por duplicación (IC del 95%): 0,3 (0,2, 0,5), 0,3 (0,2, 0,5), 0,4 (0,2, 0,6), 3,0 (1,8, 4,9) y 2,5 (1,6, 3,9), respectivamente (Tabla 2, Fig. 3a). Dado que IGFBP3 funciona como una proteína transportadora de IGF1 en la circulación, construimos un modelo conjunto que incluye ambas proteínas junto con todos los factores de riesgo. IGFBP3, pero no IGF1, siguió asociado con el riesgo de cáncer de hígado [RR (IC del 95%): IGFBP3, 0,4 (0,2, 1,0); IGF1, 0,8 (0,3, 1,8)]. Hay 2 aptámeros dirigidos a IGF1 presentes en SomaScan (ID de secuencia de SomaScan: 2952-75 y 8406-17). Solo 1 aptámero (ID de secuencia de SomaScan: 2952-75) demostró asociaciones con el cáncer. Estos 2 aptámeros de IGF1 estaban mínimamente correlacionados (r = -0,06) en los participantes sin cáncer en la visita 2. Se observaron resultados similares en el modelo conjunto de IGFBP3 e IGF2. Si bien ambos tamaños de efecto se atenuaron [RR (IC del 95%): IGFBP3, 0,5 (0,2, 1,0); IGF2, 0,6 (0,3, 1,3)], IGFBP3 siguió siendo más robustamente asociado con el riesgo de cáncer de hígado. Para evaluar la influencia de la función hepática en estos hallazgos, realizamos un análisis de sensibilidad excluyendo a los individuos con una posible función hepática alterada, definidos como aquellos con concentraciones de AST (ID de secuencia de SomaScan: 4912-17) o ALT (ID de secuencia de SomaScan: 16015-19) en los extremos de la distribución (>95.º percentil o 5 años después de la extracción de sangre en la Visita 2 (es decir, excluimos los casos diagnosticados o los individuos censurados ≤5 años después de la extracción de sangre), y un análisis truncado de 10 años, en el que censuramos administrativamente el seguimiento a los 10 años después de la extracción de sangre. La mayoría de las asociaciones observadas en el análisis con un retraso de 5 años fueron consistentes con el Modelo 2 en los 7 sitios de cáncer (Fig. 5); 37 de las 41 asociaciones proteína-cáncer siguieron siendo significativas según el FDR, y las razones de riesgo (HR) se mantuvieron similares a las observadas en el análisis que comenzó el seguimiento en la Visita 2. Para el cáncer de próstata, la proteína ACP3, también conocida como fosfatasa ácida prostática (PAP, un marcador conocido del cáncer de próstata metastásico basado en sangre), la HR se atenuó y solo fue marginalmente significativa en el análisis con retraso, lo que indica que es probable que esta proteína sea un indicador de la presencia de un cáncer no diagnosticado en lugar de un riesgo a largo plazo. En el análisis con un retraso de 5 años, una proteína adicional, MGA [HR (IC del 95 %): 0,7 (0,6, 0,8)], cumplió con los umbrales de FDR para el riesgo de cáncer colorrectal, específicamente, cáncer de colon, a pesar de no ser significativa según el FDR en el análisis de seguimiento completo para el Modelo 2. Para el cáncer de hígado, todos los casos ocurrieron después de 5 años desde la línea de base en la Visita 2, por lo que los resultados se mantuvieron iguales en comparación con el modelo de seguimiento completo.

En el análisis truncado de 10 años, observamos cambios en la magnitud de la HR para varias proteínas, incluidas ACP3 y KLK3 para el cáncer de próstata, y HAVCR1 para el cáncer de riñón, para las cuales las asociaciones fueron más fuertes en comparación con el análisis general. Una proteína adicional, SLCO5A1 [HR (IC del 95 %): 0,4 (0,2, 0,6)], cumplió con los umbrales de FDR en el análisis truncado de 10 años para el cáncer de riñón. Sin embargo, para el cáncer de pulmón, las HR para todas las proteínas identificadas se mantuvieron similares en el análisis truncado en comparación con el análisis general, lo que indica que estas proteínas contienen información sobre el riesgo más allá de los 10 años. Los resultados completos para todos los cánceres en los análisis estratificados por tiempo se encuentran en las Tablas suplementarias S9 y S10.

Variación temporal de los niveles de proteína

Para fundamentar los análisis estratificados por tiempo que utilizaron proteínas medidas una sola vez, evaluamos la variabilidad a largo plazo en los niveles de proteína mediante la estimación de correlaciones por pares y correlaciones intraclase (ICC) de las proteínas identificadas en ambos modelos (Modelos 1 y 2) en la Visita 2 (1990-1992), la Visita 3 (1993-1995) y la Visita 5 (2011-2013) entre los individuos sin cáncer prevalente ni incidente durante todo el período de estudio hasta 2015. Entre las 40 proteínas identificadas en el Modelo 2 (ajustado por factores de riesgo comunes y específicos del sitio), la correlación de los valores de proteína entre las visitas 2 y 3 (Mediana [Q1, Q3]: 0,6 [0,5, 0,7]) es solo ligeramente mayor que las correlaciones entre las visitas 2 y 5 (Mediana [Q1, Q3]: 0,5 [0,4, 0,6]) (Figura suplementaria 1), a pesar de que las visitas 2 y 3 están separadas por solo 3 años, mientras que las visitas 2 y 5 están separadas por 21 años. Las ICC entre las 3 visitas de estas 40 proteínas mostraron un resultado similar (Mediana [Q1, Q3]: 0,5 [0,4, 0,6]). Las trayectorias de proteína individuales en las visitas del estudio revelaron que la mayoría de las proteínas exhibieron tendencias temporales, con niveles que aumentaban o disminuían con el tiempo (Figura suplementaria 2). La mayor estabilidad temporal se observó para PLAUR (r = 0,8 entre las visitas 2 y 5; ICC = 0,7 entre las visitas 2, 3 y 5), el 60 % (24/40) de las proteínas mostraron una correlación mayor que 0,5 entre las visitas 2 y 5, y el 58 % (23/40) de las proteínas mostraron una ICC mayor que 0,5 entre las 3 visitas, lo que indica consistencia durante el período de observación de 21 años. Los resultados detallados de las correlaciones temporales y las ICC de las principales proteínas identificadas en los Modelos 1 y 2 en las visitas se encuentran en la Tabla suplementaria S11.

Análisis de enriquecimiento de vías para el cáncer primario de hígado

El análisis de enriquecimiento de vías de las 33 proteínas asociadas con el riesgo de cáncer primario de hígado en el Modelo 2 (FDR < 0,05) reveló una sobrerrepresentación significativa de las vías (Fig. 3c) relacionadas con la señalización del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), el remodelamiento de la matriz extracelular y la activación de las plaquetas. La vía más significativamente enriquecida fue la regulación del transporte y la captación de IGF por las proteínas de unión al IGF (FDR = 1,01 × 10−5), que involucra proteínas clave como IGFBP3, IGFBP7, IGF1, IGF2, TIMP1 e IGFALS. Otras vías enriquecidas incluyeron la activación de las metaloproteinasas de la matriz, la desgranulación de las plaquetas y la degradación de la matriz extracelular, lo que implica proteínas como MMP7, TIMP1 y A2M.

El análisis de red de las vías Reactome enriquecidas entre las 33 proteínas asociadas con el riesgo de cáncer de hígado reveló tres módulos funcionales principales (Fig. 3d). El Módulo 1, que fue el grupo más grande, incluyó la señalización de IGF, el remodelamiento de la matriz extracelular y la activación de las plaquetas, lo que sugiere el papel de estas vías en la etiología del cáncer de hígado. Esto se corroboró con el enriquecimiento de GO en la regulación negativa de la migración celular, la actividad peptidasa, la unión al factor de crecimiento y los gránulos alfa de las plaquetas. El Módulo 2 comprendió vías relacionadas con el metabolismo de los lípidos y las vitaminas, incluido el enlace y la captación de ligandos por los receptores de eliminación, el metabolismo de los retinoides y el transporte, y el metabolismo de las vitaminas liposolubles, lo que implica una desregulación metabólica en la etiología del cáncer de hígado. Esto también se corroboró con el enriquecimiento de GO para el transporte de lipoproteínas, el transporte de colesterol/esteroles y la localización en partículas de lipoproteínas. El Módulo 3 incluyó las neurexinas y las neuroliginas y las interacciones proteína-proteína en las sinapsis, lo que se alinea con los términos de GO como la adhesión célula-célula de las neuronas y la unión al péptido amiloide, lo que indica posibles vínculos entre los mecanismos de adhesión similares a los sinápticos y la tumorigénesis hepática. En conjunto, estos resultados resaltan los roles integrados de la señalización del crecimiento, el remodelamiento de los tejidos, la hemostasia y el metabolismo en el riesgo de cáncer de hígado. Todas las vías Reactome y GO significativamente enriquecidas (FDR < 0,05) se informan en la Tabla suplementaria S12.

Descripción de la cohorte

La cohorte analítica incluyó a 9391 participantes de ARIC seguidos durante una mediana de 22,6 años (rango 0,1–25,9 años). Las características de la línea de base se muestran en la Tabla 1 y la Tabla suplementaria S1. Se diagnosticaron un total de 1617 casos incidentes de estos 7 cánceres durante una mediana de 12,1 años (rango 0,1–25,2 años). La edad media en la Visita 2 fue de 57 años (DE 5,7). La población del estudio fue 54,8 % mujeres y 23,3 % afroamericanas. En comparación con toda la cohorte analítica, los participantes que desarrollaron posteriormente cáncer de vejiga, hígado, pulmón o próstata fueron con mayor frecuencia exfumadores o fumadores actuales y exhibieron una mayor exposición acumulada al tabaco, medida en paquetes-año (comparaciones no ajustadas).

Asociaciones proteómicas con cánceres sólidos

De las 4955 aptámeros evaluados, 40 proteínas únicas (40 aptámeros) se asociaron significativamente con el riesgo de al menos un sitio de cáncer después de la corrección de pruebas múltiples dentro del sitio (FDR < 0,05), lo que resultó en un total de 41 asociaciones proteína-cáncer en el Modelo 2 (ajustado por factores de riesgo comunes y específicos del sitio) (Fig. 2a, Tabla 2). En el Modelo 1 (ajustado solo por factores de riesgo comunes), 139 proteínas únicas (140 aptámeros) se asociaron significativamente con el riesgo de al menos un sitio de cáncer después de la corrección para pruebas múltiples, con un total de 144 asociaciones proteína-cáncer (Fig. 2b, Tabla suplementaria S3).

Para el riesgo de cáncer de hígado, identificamos 33 asociaciones de proteínas únicas en el Modelo 2, que incluyen IGFBP3, IGF2, IGF1, IL18BP y MMP7 con HR por duplicación (IC del 95 %): 0,3 (0,2, 0,5), 0,3 (0,2, 0,5), 0,4 (0,2, 0,6), 3,0 (1,8, 4,9) y 2,5 (1,6, 3,9), respectivamente (Tabla 2, Fig. 3a). Dado que IGFBP3 funciona como una proteína transportadora de IGF1 en la circulación, construimos un modelo conjunto que incluye ambas proteínas junto con todos los factores de riesgo. IGFBP3, pero no IGF1, siguió asociado con el riesgo de cáncer de hígado [HR (IC del 95 %): IGFBP3, 0,4 (0,2, 1,0); IGF1, 0,8 (0,3, 1,8)]. Hay dos aptámeros dirigidos a IGF1 presentes en SomaScan (ID de secuencia de SomaScan: 2952-75 y 8406-17). Solo 1 aptámero (ID de secuencia de SomaScan: 2952-75) demostró asociaciones con el cáncer. Estos 2 aptámeros de IGF1 estaban mínimamente correlacionados (r = -0,06) en los participantes sin cáncer en la Visita 2. Se observaron resultados similares en el modelo conjunto de IGFBP3 e IGF2. Si bien ambos tamaños del efecto se atenuaron [HR (IC del 95 %): IGFBP3, 0,5 (0,2, 1,0); IGF2, 0,6 (0,3, 1,3)], IGFBP3 siguió siendo más robustamente asociado con el riesgo de cáncer de hígado. Para evaluar la influencia de la función hepática en estos hallazgos, realizamos un análisis de sensibilidad excluyendo a los individuos con una posible función hepática alterada, definidos como aquellos con concentraciones de AST (ID de secuencia de SomaScan: 4912-17) o ALT (ID de secuencia de SomaScan: 16015-19) en los extremos de la distribución (>95.º percentil o 5 años después de la extracción de sangre en la Visita 2 (es decir, excluimos los casos diagnosticados o los individuos censurados ≤5 años después de la extracción de sangre), y un análisis truncado de 10 años, en el cual censuramos administrativamente el seguimiento a los 10 años después de la extracción de sangre. La mayoría de las asociaciones observadas en el análisis con un retraso de 5 años fueron consistentes con el Modelo 2 en los 7 tipos de cáncer (Fig. 5); 37 de las 41 asociaciones proteína-cáncer siguieron siendo significativas según el FDR, y las HRs se mantuvieron similares a las observadas en el análisis que comenzó el seguimiento en la Visita 2. Para la proteína ACP3 del cáncer de próstata, también conocida como fosfatasa ácida prostática (PAP, un marcador conocido del cáncer de próstata metastásico en sangre), la HR se atenuó y fue solo marginalmente significativa en el análisis con un retraso, lo que indica que esta proteína es probablemente un indicador de la presencia de un cáncer no diagnosticado en lugar de un riesgo a largo plazo. En el análisis con un retraso de 5 años, una proteína adicional, MGA [HR (IC del 95 %): 0,7 (0,6, 0,8)], cumplió con los umbrales de FDR para el riesgo de cáncer colorrectal, específicamente, cáncer de colon, a pesar de no ser significativa según el FDR en el análisis de seguimiento completo para el Modelo 2. Para el cáncer de hígado, todos los casos ocurrieron después de 5 años desde la línea de base en la Visita 2, por lo que los resultados se mantuvieron iguales en comparación con el modelo de seguimiento completo.

En el análisis truncado de 10 años, observamos cambios en la magnitud de la HR para varias proteínas, incluyendo ACP3 y KLK3 para el cáncer de próstata, y HAVCR1 para el cáncer de riñón, para las cuales las asociaciones fueron más fuertes en comparación con el análisis general. Una proteína adicional, SLCO5A1 [HR (IC del 95 %): 0,4 (0,2, 0,6)], cumplió con los umbrales de FDR en el análisis truncado de 10 años para el cáncer de riñón. Sin embargo, para el cáncer de pulmón, las HRs para todas las proteínas identificadas se mantuvieron similares en el análisis truncado en comparación con el análisis general, lo que indica que estas proteínas contienen información sobre el riesgo más allá de los 10 años. Los resultados completos para todos los cánceres para los análisis estratificados por tiempo se encuentran en las Tablas Suplementarias S9 y S10.

Variación temporal de los niveles de proteína

Para fundamentar los análisis estratificados por tiempo que utilizaron proteínas que se midieron una sola vez, evaluamos la variabilidad a largo plazo en los niveles de proteína estimando las correlaciones por pares y las correlaciones intraclase (ICC) de las proteínas identificadas en ambos modelos (Modelos 1 y 2) en la Visita 2 (1990-1992), la Visita 3 (1993-1995) y la Visita 5 (2011-2013) entre los individuos libres de cáncer prevalente e incidente durante todo el período de estudio hasta 2015. Entre las 40 proteínas identificadas en el Modelo 2 (ajustado por factores de riesgo comunes y específicos del sitio), la correlación de los valores de proteína entre las Visitas 2 y 3 (Mediana [Q1, Q3]: 0,6 [0,5, 0,7]) es solo ligeramente mayor que las correlaciones entre las Visitas 2 y 5 (Mediana [Q1, Q3]: 0,5 [0,4, 0,6]) (Fig. S1), a pesar de que las Visitas 2 y 3 están separadas por solo 3 años, mientras que las Visitas 2 y 5 están separadas por 21 años. Las ICC entre las 3 visitas de estas 40 proteínas mostraron un resultado similar (Mediana [Q1, Q3]: 0,5 [0,4, 0,6]). Las trayectorias de proteína individuales en las visitas del estudio revelaron que la mayoría de las proteínas exhibieron tendencias temporales, con niveles que aumentaban o disminuían con el tiempo (Fig. S2). La mayor estabilidad temporal se observó para PLAUR (r = 0,8 entre las Visitas 2 y 5; ICC = 0,7 entre las Visitas 2, 3 y 5), el 60 % (24/40) de las proteínas mostraron una correlación mayor que 0,5 entre las Visitas 2 y 5, y el 58 % (23/40) de las proteínas mostraron una ICC mayor que 0,5 entre las 3 visitas, lo que indica consistencia durante el período de observación de 21 años. Los resultados detallados de las correlaciones temporales y las ICC de las principales proteínas identificadas en ambos Modelos 1 y 2 en las visitas se encuentran en la Tabla Suplementaria S11.

Análisis de enriquecimiento de vías para el cáncer primario de hígado

El análisis de enriquecimiento de vías de las 33 proteínas asociadas con el riesgo de cáncer primario de hígado en el Modelo 2 (FDR < 0,05) reveló una sobrerrepresentación significativa de las vías (Fig. 3c) relacionadas con la señalización del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), el remodelamiento de la matriz extracelular y la activación de plaquetas. La vía más significativamente enriquecida fue la regulación del transporte y la captación de IGF por las IGFBP (FDR = 1,01 × 10−5), que involucra proteínas clave como IGFBP3, IGFBP7, IGF1, IGF2, TIMP1 e IGFALS. Otras vías enriquecidas incluyeron la activación de metaloproteinasas de matriz, la desgranulación de plaquetas y la degradación de la matriz extracelular, lo que implica proteínas como MMP7, TIMP1 y A2M.

El análisis de red de las vías Reactome enriquecidas entre las 33 proteínas asociadas con el riesgo de cáncer de hígado reveló tres módulos funcionales principales (Fig. 3d). El Módulo 1, que fue el clúster más grande, incluyó la señalización de IGF, el remodelamiento de la matriz extracelular y la activación de plaquetas, lo que sugiere el papel de estas vías en la etiología del cáncer de hígado. Esto fue respaldado por el enriquecimiento de GO en la regulación negativa de la migración celular, la actividad peptidasa, la unión al factor de crecimiento y los gránulos alfa de las plaquetas. El Módulo 2 comprendió vías relacionadas con el metabolismo de lípidos y vitaminas, incluyendo la unión y captación de ligandos por receptores de eliminación, el metabolismo y el transporte de retinoides y el metabolismo de vitaminas liposolubles, lo que implica una desregulación metabólica en la etiología del cáncer de hígado. Esto también fue respaldado por el enriquecimiento de GO para el transporte de lipoproteínas, el transporte de colesterol/esteroles y la localización en partículas de lipoproteínas. El Módulo 3 incluyó neurexinas y neuroliginas e interacciones proteína-proteína en las sinapsis, lo que se alinea con los términos de GO como la adhesión célula-célula de neuronas y la unión al amiloide-beta, lo que indica posibles vínculos entre los mecanismos de adhesión similares a los sinápticos y la tumorigénesis hepática. En conjunto, estos resultados resaltan los roles integrados de la señalización del crecimiento, el remodelamiento de los tejidos, la hemostasia y el metabolismo en el riesgo de cáncer de hígado. Todas las vías Reactome y GO significativamente enriquecidas (FDR < 0,05) se informan en la Tabla Suplementaria S12.

Discusión

Presentamos un análisis proteómico integral con un seguimiento extenso (25 años) en una cohorte estadounidense de participantes blancos y negros para evaluar las asociaciones entre 4712 proteínas circulantes (4955 aptámeros), medidas en la plataforma SomaScan® 5K, y el riesgo de 7 tipos de cáncer específicos del sitio. Utilizando un enfoque conservador con una consideración detallada de los factores de riesgo conocidos del cáncer y específicos del sitio, identificamos 41 proteínas plasmáticas significativamente asociadas con el riesgo de cáncer, de las cuales 39 se relacionaron con cánceres diagnosticados más de 5 años después de la extracción de sangre. La mayoría de estas asociaciones fueron respaldadas por los hallazgos de una cohorte independiente que utilizó la misma plataforma proteómica (EPIC, SomaScan). Los análisis de sensibilidad adicionales mostraron que 4 proteínas se asociaron fuertemente con cánceres diagnosticados dentro de los 10 años posteriores a la extracción de sangre: 2 proteínas para el riesgo de cáncer de riñón, HAVCR1 y SLCO5A1, son nuevos marcadores plasmáticos; y las 2 proteínas para el riesgo de cáncer de próstata, KLK3 (PSA) y ACP3 (PAP), son biomarcadores conocidos en sangre. KLK3, un marcador establecido para la detección temprana del cáncer de próstata cuando se mide utilizando inmunoensayos,^[37] mostró una asociación robusta con el riesgo de cáncer de próstata cuando se midió mediante SomaScan en nuestro análisis. ACP3 no se utiliza actualmente para la detección temprana, pero sirve como un biomarcador plasmático para el cáncer de próstata metastásico.^[38]

Nuestro enfoque nos permitió identificar biomarcadores proteicos circulantes del riesgo de cáncer que proporcionan información más allá de los factores de riesgo establecidos, incluyendo datos demográficos, mediciones antropométricas (por ejemplo, IMC) y variables de estilo de vida autoinformadas (por ejemplo, historial de tabaquismo). Los modelos ajustados para los factores de riesgo comunes del cáncer identificaron sustancialmente más proteínas para los cánceres de hígado y pulmón que los modelos ajustados además para los factores de riesgo específicos del sitio, lo que sugiere una confusión por la diabetes y la ingesta de alcohol para el cáncer de hígado, y una confusión residual por el comportamiento del tabaquismo para el cáncer de pulmón. En contraste, para el cáncer de riñón y el cáncer de próstata, las proteínas identificadas fueron las mismas en ambos modelos, y las HRs para estas proteínas se mantuvieron sin cambios entre los modelos, lo que indica asociaciones robustas independientes de los factores de riesgo específicos del sitio conocidos. Las proteínas que se asociaron con el riesgo después de ajustar por los factores de riesgo comunes y específicos del sitio pueden reflejar la exposición a factores de riesgo desconocidos, factores de riesgo genéticos y epigenéticos, o que estas proteínas pueden capturar mejor la dosis biológicamente efectiva de exposición a los factores de riesgo conocidos que otras mediciones convencionales, como lo documentamos previamente para el tabaquismo versus las proteínas relacionadas con el tabaquismo y el riesgo de cáncer de pulmón.^[28]

A pesar del pequeño número de casos de cáncer primario de hígado en ARIC, este sitio tuvo el mayor número de asociaciones proteicas. El hígado es una fuente importante de proteínas circulantes,^[39] y los análisis de enriquecimiento de vías integrados de estas proteínas significativas señalan tres módulos moleculares interconectados que podrían estar involucrados en el desarrollo del cáncer de hígado. El Módulo 1 refuerza los sellos distintivos del cáncer conocidos, integrando la señalización de IGF, el remodelamiento de la matriz extracelular (ECM) y la coagulación, con anotaciones funcionales que resaltan la supresión de la motilidad celular, la inhibición de la peptidasa y el enriquecimiento en gránulos de plaquetas. Informamos previamente que IGFBP7, que ahora se ha identificado como asociado con el riesgo de cáncer de hígado en el estudio actual, se asoció positivamente con la mortalidad general por cáncer, particularmente la mortalidad por cáncer de pulmón, en el estudio ARIC^[40]. El Módulo 2 enfatiza la contribución del metabolismo alterado de lípidos y vitaminas, respaldado tanto por las vías Reactome como por GO, que involucra receptores de eliminación y lipoproteínas plasmáticas, lo que puede influir en la inflamación y el estrés metabólico que promueven el tumor. El módulo relacionado con las sinapsis (Módulo 3), que tradicionalmente se asocia con la función neuronal, puede reflejar mecanismos de adhesión célula-célula aberrantes mediados por neurexinas y neuroliginas que tienen funciones emergentes en la homeostasis de los tejidos no neuronales y el cáncer. En conjunto, estos resultados resaltan los roles integrados de la señalización del crecimiento, el remodelamiento de los tejidos, la hemostasia y el metabolismo en el riesgo de cáncer de hígado. Todas las vías Reactome y GO significativamente enriquecidas (FDR < 0,05) se informan en la Tabla Suplementaria S12.

Discusión

Presentamos un análisis proteómico integral con un seguimiento extenso (25 años) en una cohorte estadounidense de participantes blancos y negros para evaluar las asociaciones entre 4712 proteínas circulantes (4955 aptámeros), medidas en la plataforma SomaScan® 5K, y el riesgo de 7 tipos de cáncer específicos del sitio. Utilizando un enfoque conservador con una consideración detallada de los factores de riesgo conocidos del cáncer y específicos del sitio, identificamos 41 proteínas plasmáticas significativamente asociadas con el riesgo de cáncer, de las cuales 39 se relacionaron con cánceres diagnosticados más de 5 años después de la extracción de sangre. La mayoría de estas asociaciones fueron respaldadas por los hallazgos de una cohorte independiente que utilizó la misma plataforma proteómica (EPIC, SomaScan). Los análisis de sensibilidad adicionales mostraron que 4 proteínas se asociaron fuertemente con cánceres diagnosticados dentro de los 10 años posteriores a la extracción de sangre: 2 proteínas para el riesgo de cáncer de riñón, HAVCR1 y SLCO5A1, son nuevos marcadores plasmáticos; y las 2 proteínas para el riesgo de cáncer de próstata, KLK3 (PSA) y ACP3 (PAP), son biomarcadores conocidos en sangre. KLK3, un marcador establecido para la detección temprana del cáncer de próstata cuando se mide utilizando inmunoensayos,^[37] mostró una asociación robusta con el riesgo de cáncer de próstata cuando se midió mediante SomaScan en nuestro análisis. ACP3 no se utiliza actualmente para la detección temprana, pero sirve como un biomarcador plasmático para el cáncer de próstata metastásico.^[38]

Nuestro enfoque nos permitió identificar biomarcadores proteicos circulantes del riesgo de cáncer que proporcionan información más allá de los factores de riesgo establecidos, incluyendo datos demográficos, mediciones antropométricas (por ejemplo, IMC) y variables de estilo de vida autoinformadas (por ejemplo, historial de tabaquismo). Los modelos ajustados para los factores de riesgo comunes del cáncer identificaron sustancialmente más proteínas para los cánceres de hígado y pulmón que los modelos ajustados además para los factores de riesgo específicos del sitio, lo que sugiere una confusión por la diabetes y la ingesta de alcohol para el cáncer de hígado, y una confusión residual por el comportamiento del tabaquismo para el cáncer de pulmón. En contraste, para el cáncer de riñón y el cáncer de próstata, las proteínas identificadas fueron las mismas en ambos modelos, y las HRs para estas proteínas se mantuvieron sin cambios entre los modelos, lo que indica asociaciones robustas independientes de los factores de riesgo específicos del sitio conocidos. Las proteínas que se asociaron con el riesgo después de ajustar por los factores de riesgo comunes y específicos del sitio pueden reflejar la exposición a factores de riesgo desconocidos, factores de riesgo genéticos y epigenéticos, o que estas proteínas pueden capturar mejor la dosis biológicamente efectiva de exposición a los factores de riesgo conocidos que otras mediciones convencionales, como lo documentamos previamente para el tabaquismo versus las proteínas relacionadas con el tabaquismo y el riesgo de cáncer de pulmón.^[28]

A pesar del pequeño número de casos de cáncer primario de hígado en ARIC, este sitio tuvo el mayor número de asociaciones proteicas. El hígado es una fuente importante de proteínas circulantes,^[39] y los análisis de enriquecimiento de vías integrados de estas proteínas significativas señalan tres módulos moleculares interconectados que podrían estar involucrados en el desarrollo del cáncer de hígado. El Módulo 1 refuerza los sellos distintivos del cáncer conocidos, integrando la señalización de IGF, el remodelamiento de la matriz extracelular (ECM) y la coagulación, con anotaciones funcionales que resaltan la supresión de la motilidad celular, la inhibición de la peptidasa y el enriquecimiento en gránulos de plaquetas. Informamos previamente que IGFBP7, que ahora se ha identificado como asociado con el riesgo de cáncer de hígado en el estudio actual, se asoció positivamente con la mortalidad general por cáncer, particularmente la mortalidad por cáncer de pulmón, en el estudio ARIC^[40]. El Módulo 2 enfatiza la contribución del metabolismo alterado de lípidos y vitaminas, respaldado tanto por las vías Reactome como por GO, que involucra receptores de eliminación y lipoproteínas plasmáticas, lo que puede influir en la inflamación y el estrés metabólico que promueven el tumor. El módulo relacionado con las sinapsis (Módulo 3), que tradicionalmente se asocia con la función neuronal, puede reflejar mecanismos de adhesión célula-célula aberrantes mediados por neurexinas y neuroliginas que tienen funciones emergentes en la homeostasis de los tejidos no neuronales y el cáncer. En conjunto, estos resultados resaltan los roles integrados de la señalización del crecimiento, el remodelamiento de los tejidos, la hemostasia y el metabolismo en el riesgo de cáncer de hígado. Todas las vías Reactome y GO significativamente enriquecidas (FDR < 0,05) se informan en la Tabla Suplementaria S12.

Aunque la mayoría de las asociaciones proteína-cáncer identificadas fueron específicas del sitio del cáncer, identificamos algunas proteínas que marcan procesos comunes en todos los sitios de cáncer y otras proteínas con asociaciones específicas de un sitio de cáncer en particular. MMP7, una enzima involucrada en la descomposición de la matriz extracelular, que desempeña un papel en el remodelamiento normal de los tejidos y los procesos patológicos, se asoció con un mayor riesgo de cáncer de hígado y riñón tanto en el Modelo 1 (ajustado solo por factores de riesgo comunes) como en el Modelo 2 (ajustado por factores de riesgo comunes y específicos del sitio). Además, en el Modelo 1, TREM2 y ALCAM se asociaron con el riesgo de cáncer de hígado y pulmón (FDR