HMGB1 reduce el daño del ADN al unirse a KU70 para activar la vía de reparación por unión hueca en células de cáncer colorrectal después de la radiación

El daño al ADN inducido por la radioterapia es un factor crítico para promover la muerte de las células del cáncer colorrectal (CCR). Aunque se ha informado que la proteína de alta movilidad del grupo 1 (HMGB1) desempeña un papel vital en la radioresistencia tumoral al modular la reparación del daño al ADN, los mecanismos precisos aún no están claros. En este estudio, la reducción de la expresión de HMGB1 mejoró notablemente la apoptosis celular después de la irradiación. La disminución de la expresión de HMGB1 inhibió significativamente la reparación del daño al ADN y la homeostasis redox mediada por especies reactivas de oxígeno (ROS) después de la irradiación en las células de CCR. Mecánicamente, HMGB1 interactúa con KU70 a través de su región que abarca los residuos 95-163. Esta interacción activa posteriormente la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ) para facilitar la reparación del daño al ADN, lo que finalmente conduce a una reducción de la apoptosis celular inducida por la radiación. El silenciamiento de KU70 mostró el mismo efecto que la depleción de HMGB1, mediando la apoptosis celular y la respuesta al daño del ADN, tanto in vitro como in vivo. Además, HMGB1 y KU70 se sobreexpresaron en los tejidos de CCR. El análisis de la base de datos GEPIA indicó que los niveles elevados de ambos genes mostraron una tendencia a asociarse con un mal pronóstico del paciente, aunque esto no alcanzó significación estadística. El estudio actual reveló que HMGB1 puede promover la reparación del daño al ADN a través de KU70 y su vía NHEJ mediada para afectar la apoptosis en las células de CCR después de la irradiación. Por lo tanto, dirigir el eje HMGB1/KU70/NHEJ puede ser un objetivo terapéutico potencial para promover la respuesta del CCR a la radioterapia, y un estudio en profundidad del mecanismo específico de este eje en la radioresistencia del CCR ayudará a desarrollar estrategias de tratamiento más eficaces.

Citación: Liu X, Han Y, Kuang R, Sheng W, Zhang Y, Jia X, et al. (2026) HMGB1 reduce el daño al ADN al unirse a KU70 para activar la vía NHEJ en las células de cáncer colorrectal después de la radiación. PLoS One 21(3): e0345635.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0345635

Recibido: 29 de diciembre de 2025; Aceptado: 7 de marzo de 2026; Publicado: 24 de marzo de 2026

Derechos de autor: © 2026 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution, que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se cite al autor original y la fuente.

Disponibilidad de datos: Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y en sus archivos de información complementaria.

Financiación: Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82203543), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (No. ZR2022QH267 y ZR2023LZL008), el Proyecto de Inicio de la Universidad Médica de Binzhou (No. BY2021KYQD08) y el Proyecto de Desarrollo de Ciencia y Tecnología Médica y de la Salud de la Provincia de Shandong (No. 202309030619). Los financiadores no participaron en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Conflictos de intereses: Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses.

Abreviaturas:
Co-IP, co-inmunoprecipitación; CCR, cáncer colorrectal; DSBs, roturas de doble cadena; FBS, suero bovino fetal; HMGB1, proteína de alta movilidad del grupo 1; HR, recombinación homóloga; IHC, inmunohistoquímica; IR, radiación ionizante; NC, control negativo; NHEJ, unión de extremos no homólogos; P/S, penicilina-estreptomicina; PBS, solución salina tamponada con fosfato; PI, yoduro de propidio; PLA, ensayo de ligación de proximidad; ROS, especies reactivas de oxígeno; si-ARN, ARN de interferencia pequeño

El cáncer colorrectal (CCR) es el cáncer más diagnosticado y una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer a nivel mundial, tanto en hombres como en mujeres ^[1]. La quimiorradioterapia postoperatoria ha demostrado ser eficaz para reducir la recurrencia local y mejorar la supervivencia general en pacientes con CCR ^[2]. Sin embargo, la aparición de radioresistencia en las células de CCR compromete significativamente la eficacia de la radioterapia, lo que a menudo resulta en una erradicación tumoral incompleta y un mayor riesgo de recurrencia. Entre los diversos tipos de daño al ADN inducido por la radiación ionizante (IR), las roturas de doble cadena (DSBs) se reconocen como las lesiones más citotóxicas. El destino de las células irradiadas está influenciado críticamente por las DSBs no reparadas o mal reparadas, lo que contribuye tanto a la muerte celular como a la carcinogénesis ^[3]. En consecuencia, dirigir los mecanismos de reparación de DSB, en particular la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ) propensa a errores, representa una estrategia fundamental para la radiosensibilización.

La proteína de alta movilidad del grupo 1 (HMGB1) es una proteína nuclear no histona altamente conservada que contribuye a la estabilidad genómica al unirse al ADN y a las histonas para estabilizar la estructura de los nucleosomas, protegiendo así contra las agresiones genotóxicas de los mutágenos y la radiación. También modula las interacciones histona-ADN para influir en la compactación de la cromatina ^[4]. HMGB1 se expresa de forma aberrante en varios cánceres, incluido el CCR, y su expresión se asocia con la resistencia a la radioterapia, la resistencia a la quimioterapia y el daño al ADN en los tumores ^[5]. Estudios previos han demostrado que la inhibición de HMGB1 sensibiliza el carcinoma de células escamosas esofágico a la radiación al alterar la reparación del daño al ADN ^[6]. En el contexto del CCR, hemos demostrado recientemente que la supresión mediada por la glicirricina de HMGB1 atenúa la progresión tumoral a través de la modulación de NHEJ ^[7]. Sin embargo, el mecanismo molecular por el cual HMGB1 regula la actividad de NHEJ en las células de CCR irradiadas aún no se ha dilucidado por completo.

La maquinaria central de NHEJ se inicia con el heterodímero KU70/KU80, que se une a los extremos de DSB y recluta efectores posteriores, incluidos XRCC4 y la ligasa de ADN IV ^[8]. Es importante destacar que HMGB1 interactúa con KU70 en contextos como el carcinoma nasofaríngeo, lo que influye en la resistencia a la irradiación y al cisplatino ^[9]. Nuestros estudios previos indican que la radiación induce tanto la expresión de HMGB1 como su translocación al citoplasma ^[10]. Sin embargo, una fracción de HMGB1 permanece dentro del núcleo celular después de la irradiación, lo que plantea la pregunta de si participa en la reparación del daño al ADN y, por lo tanto, media la radioresistencia en el CCR. En este estudio, investigamos la interacción funcional y molecular entre HMGB1 y KU70 en la respuesta al daño del ADN del CCR. Probamos la hipótesis de que HMGB1 promueve la radioresistencia al servir como andamio para el ensamblaje del complejo de reparación NHEJ dependiente de KU70 y evaluamos su relevancia pronóstica en especímenes clínicos basados en la base de datos GPEIA.

Las líneas celulares humanas de CCR HT29 (RRID: CVCL0320) y HCT116 (CVCL0291), obtenidas de Procell (Wuhan, China), se cultivaron en DMEM (CellMax, Beijing, China) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS; Vistech, Nanjing, China) y 1% de penicilina-estreptomicina (Solarbio, Beijing, China) a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2. Se realizó un análisis de repeticiones tándem cortas (para la identificación celular) y una detección de micoplasma antes del experimento (2024.06).

Se establecieron líneas celulares de reducción estable de la expresión de HMGB1 según lo descrito anteriormente ^[10]. El siKU70 (RIBOBIO, Guangzhou, China) y su control negativo se transfectaron en las células utilizando Lipo2000 (Vazyme, Nanjing, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En los experimentos in vitro, se utilizó una dosis única de radiación de 4 Gy administrada mediante un irradiador de gabinete X-RAD 320 (Precision X-Ray, EE. UU.) a una tasa de dosis de 2 Gy/min. Para los experimentos in vivo, los ratones recibieron una dosis única de radiación tumoral localizada de 10 Gy.

Se extrajo el ARN total utilizando el reactivo RNA-Easy (Vazyme). Posteriormente, se transcribió 1 µg de ARN en reverso con el kit HiScript II One-Step RT-PCR (Vazyme) y se sometió a análisis de PCR en triplicado en un sistema ABI 7500 (Applied Biosystems, MA, EE. UU.) utilizando el master mix ChamQ SYBR qPCR (Vazyme). Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla S1.

Las células se lisaron utilizando un tampón de lisis RIPA (Solarbio, Beijing, China) suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas. Se separaron 30 µg de proteínas mediante SDS-PAGE al 12%, se transfirieron a una membrana de PVDF (Merck Millipore, Darmstadt, Alemania) y se bloquearon con leche descremada al 5%. Posteriormente, las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios. Se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con HRP para la detección con un sustrato ECL (Tacan, Beijing, China) y se cuantificaron las intensidades de la señal utilizando el software ImageJ. Se proporciona información detallada de todos los anticuerpos primarios utilizados en este estudio en la Tabla S2.

Se evaluó el daño al ADN utilizando el kit de detección de cometas KeyGen (Jiangsu, China). En resumen, se ajustaron las células a una densidad de 1 × 106 células/ml y se incorporaron en un 0,7% de agarosa de bajo punto de fusión. Las células incorporadas se lisaron luego durante 2 h a 4 °C, seguidas de un tampón de electroforesis alcalina (0,186 g de Na2EDTA, 6 g de NaOH disueltos en 500 ml de agua) durante 1 h. La electroforesis se realizó a 25 V/cm durante 30 min. Posteriormente, las muestras se neutralizaron con 0,4 M de Tris-HCl (pH 7,5) y se tiñeron con yoduro de propidio (PI). Para cada grupo experimental, se seleccionaron y analizaron aleatoriamente 100 núcleos para el momento de la cola utilizando el software CASP.

Se recogieron 1 mg de lisado celular total, se pre-limpiaron y luego se incubaron durante la noche a 4 °C con 4 µg de anti-HMGB1, anti-KU70 o IgG de control, junto con cuentas magnéticas de proteína A/G (Absin, Shanghai, China). Finalmente, las cuentas se lavaron, se eluyeron y se analizaron mediante Western blot.

Las células cultivadas en portaobjetos de vidrio se fijaron con 4% de paraformaldehído (PFA) durante 15 min, se permeabilizaron con 0,2% de Triton X 100 durante 10 min y se bloquearon durante 1 h (utilizando 1% de BSA para inmunofluorescencia o tampón de bloqueo Duolink® para el ensayo de ligación de proximidad). Se aplicaron anticuerpos primarios (enumerados en la Tabla S2) y se incubaron durante la noche a 4 °C. Posteriormente, las muestras se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor (1:500, 1 h) para inmunofluorescencia o con los reactivos Duolink® PLA (#DUO92101, Sigma Aldrich, NJ, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las señales de fluorescencia se capturaron utilizando un microscopio confocal Leica y se cuantificó la intensidad media de fluorescencia con ImageJ. Para la cuantificación de los focos de γH2A.x, las imágenes se analizaron en ImageJ utilizando el umbral automático y el análisis de partículas. Las células que contenían más de cinco focos nucleares distintos se puntuaron como positivas, mientras que las que mostraban tinción difusa pan-nuclear o carecían de focos claros se excluyeron. Se evaluaron al menos 300 células seleccionadas aleatoriamente por condición experimental y los resultados se expresaron como el porcentaje de células positivas.

Las estructuras 3D de HMGB1 y KU70 se obtuvieron de la base de datos UniProt (https://www.uniprot.org/). Se realizó el acoplamiento molecular utilizando el servidor HDOCK con los parámetros predeterminados. El complejo resultante con la energía de enlace más baja se seleccionó y se visualizó utilizando PyMOL versión 2.5.5.

Las células se recogieron 24 h después de la irradiación (0 o 4 Gy) y la actividad de la caspasa-3 se ensayó utilizando un kit colorimétrico (Beyotime, Shanghai, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las células se cultivaron durante 24 h después de la irradiación y luego se incubaron con 10 µM de DHE (#CA1420, Solarbio) durante 30 min a 37 °C. La intensidad de fluorescencia de DHE en las células de CCR se midió posteriormente utilizando un lector de microplacas de 96 pocillos con excitación a 488 nm y emisión a 525 nm.

Se utilizaron ratones BALB/c hembras, desnudos (n = 30, de 6 a 8 semanas de edad, adquiridos de PengYue, Jinan), que se alojaron en condiciones SPF con un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad y se aclimataron durante 1 semana. Un total de 5 × 10⁵ células HT29 suspendidas en 100 µL de PBS se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho de cada ratón. Cuando el volumen tumoral alcanzó aproximadamente 20 mm³, los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos (n = 5 por grupo) y se les inyectó intratumoralmente si-KU70 (0,8 nmol por cada 20 g de peso corporal) o se les irradió el tumor de forma localizada a una dosis de 10 Gy. Los ratones se anestesiaron mediante inhalación de 3% de isoflurano inmediatamente antes de la irradiación. Se monitorizó la salud general a diario y se midieron las dimensiones del tumor cada dos días para calcular el volumen utilizando la fórmula: (longitud × anchura²)/2. En el punto final del experimento (24 días), se extrajeron los tumores xenógenos, se fotografiaron y se pesaron. Se observaron estrictamente los criterios de bienestar animal, y cualquier ratón que desarrollara un tumor que superara los 1000 mm³ fue rápidamente sacrificado. Al finalizar el estudio, todos los ratones fueron sacrificados por asfixia con CO₂. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices ARRIVE y fueron aprobados por el Comité de Ética Experimental con Animales de la Universidad Médica de Binzhou (Número de Aprobación: 2022 121).

Las muestras tumorales se fijaron en formaldehído al 10% durante 24 horas, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 5 µm de espesor. Tras la recuperación del antígeno en tampón de citrato (pH 6,0) y el bloqueo con 3% de H₂O₂ y 10% de suero de cabra, las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra γH2A.x o Ki67. Después de la incubación con un anticuerpo secundario de polímero HRP (Vazyme), las señales se desarrollaron utilizando DAB. La apoptosis se evaluó mediante tinción TUNEL realizada con un kit comercial de un solo paso (Elabscience, Hubei, China) según las instrucciones del fabricante, y los núcleos se contrateñeron con DAPI. Las células positivas se contaron a ciegas en cinco campos de alto poder seleccionados aleatoriamente por sección.

La expresión de KU70 y los datos de supervivencia correspondientes se obtuvieron de la base de datos GEPIA2. La correlación de HMGB1 y KU70 en el CRC se analizó utilizando TIMER2.0. La asociación con el estadio patológico se examinó mediante el módulo "Stage Plot", y se generaron curvas de supervivencia mediante análisis de Kaplan-Meier, con la significación estadística evaluada mediante la prueba de log-rank.

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 9.0 (RRID: SCR_002798). Los datos se presentan como la media ± DE de al menos tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. Las diferencias entre dos grupos se evaluaron utilizando una prueba t de Student de dos colas. Para las comparaciones que involucran a más de dos grupos, se empleó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía. La significación estadística se definió de la siguiente manera: *P < 0,05, **P < 0,01; n.s. indica que no es significativo.

Nuestros hallazgos previos demostraron que HMGB1 se encuentra frecuentemente sobreexpresado en líneas celulares de CRC, particularmente en las células HCT116 y HT29 ^[10]. En el presente estudio, la inhibición mediada por lentivirus de HMGB1 disminuyó significativamente su expresión tanto a nivel de ARNm como de proteína en las líneas celulares HCT116 y HT29 (Fig. 1a). Como se muestra en la Fig. 1b, la inhibición de HMGB1 condujo a un aumento significativo de la actividad de la caspasa 3, lo que indica una mayor apoptosis, lo que coincide con la validación mediante la tinción de anexina V informada previamente ^[10]. Para investigar si la apoptosis inducida por la radiación asociada a HMGB1 está relacionada con la respuesta al daño del ADN, examinamos la formación de focos de γH2A.x, un marcador de roturas de doble cadena (RDC). La tinción IF reveló que los focos de γH2A.x se acumularon rápidamente a las 0,25 horas después de la irradiación con rayos X, y la inhibición de HMGB1 elevó aún más el número de focos de γH2A.x en las células de CRC (Fig. 1c). En consonancia con estas observaciones, el nivel de proteína de γH2A.x aumentó tras la irradiación de 4 Gy, y este aumento fue más pronunciado en las células con HMGB1 reducido en comparación con los controles (Fig. 1d). Además, los resultados del ensayo cometa mostraron que la inhibición de HMGB1 resultó en una longitud de cola significativamente mayor después de la irradiación, lo que refleja un mayor daño al ADN (Fig. 1e). En conjunto, estos datos demostraron que HMGB1 atenúa la apoptosis inducida por la radiación en las células de CRC al promover la reparación del daño del ADN.

a. Los niveles de expresión de ARNm y proteína de HMGB1 en las células HCT116 y HT29 se evaluaron mediante qPCR y western blot después de la transfección con shRNA dirigida a HMGB1 (sh-HMGB1) o un shRNA de control negativo (sh-NC). ?-actina se utilizó como control de carga. b. Actividad de la caspasa-3 en las células de CRC con HMGB1 inhibido después de la exposición a la irradiación con rayos X. c. Tinción IF de γH2A.x en las células de CRC con HMGB1 inhibido en los puntos de tiempo indicados después de la irradiación con rayos X de 4 Gy (escala: 50 µm). d. Análisis de western blot de los niveles de proteína de γH2A.x en las células de CRC con HMGB1 inhibido después de la irradiación de 4 Gy, con ?-actina como control de carga. e. El daño del ADN se evaluó mediante el ensayo cometa en las células de CRC con HMGB1 inhibido a las 24 horas después de la irradiación con rayos X de 4 Gy (escala: 20 µm). La longitud de la cola por célula se cuantificó en 100 células por grupo. Los datos se presentan como la media ± SEM de tres experimentos. **P < 0,01, *P < 0,05.

La IR induce daño al ADN no solo directamente a través de las roturas de la cadena de ADN inducidas por la radiación, sino también indirectamente a través de la generación de radicales libres, incluidos las especies reactivas del oxígeno (ERO), las especies reactivas del nitrógeno y el H₂O₂ ^[11]. Por lo tanto, investigamos más a fondo si HMGB1 influye en los niveles de ERO en las células de CRC irradiadas. Como se muestra en la Fig. 2a, la irradiación promovió significativamente la producción de ERO, y la inhibición de HMGB1 elevó aún más los niveles basales de ERO en las células de CRC. Además, 8-OHdG, un marcador primario del daño oxidativo del ADN, estaba presente en niveles significativamente más altos en el grupo con HMGB1 inhibido en comparación con el grupo de control negativo (NC) después de la irradiación con rayos X (Fig. 2b). Estos hallazgos indican que los niveles elevados de ERO en las células con HMGB1 inhibido las sensibilizan a las lesiones oxidativas inducidas por la radiación.

a. Producción de ERO en las células de CRC con HMGB1 inhibido después de la irradiación de 4 Gy. b. Expresión de 8-OHdG en las células de CRC con HMGB1 inhibido después de la irradiación de 4 Gy, con la intensidad media de fluorescencia correspondiente mostrada (escala: 10 µm). **P < 0,01, *P < 0,05.

Para investigar más a fondo el mecanismo por el cual HMGB1 influye en la reparación del daño del ADN inducido por la radiación, cuantificamos los niveles de expresión de los genes clave asociados con las vías de reparación principales, la recombinación homóloga (RH) y la unión de extremos no homólogos (UEN) en las células de CRC después de la irradiación utilizando qPCR. Los resultados revelaron que la depleción de HMGB1 redujo significativamente la expresión de los genes relacionados con la UEN KU70, KU80, XRCC4, después de la irradiación, mientras que la expresión del gen asociado a la RH RAD51 permaneció inalterada (Fig. 3a). Posteriormente, encontramos que la irradiación aumentó los niveles de proteína de KU70, KU80, XRCC4 y LIG4, mientras que la inhibición de HMGB1 suprimió su expresión (Fig. 3b y Fig. S1a complementaria en la Fig. S1). Estudios previos han indicado que HMGB1 facilita la resistencia a la radiación al unirse a KU70 en el carcinoma nasofaríngeo ^[9]. Por lo tanto, hipotetizamos que HMGB1 activa la vía UEN a través de su interacción entre HMGB1 y KU70, el factor principal de la vía UEN, y demostramos que esta interacción se mejoró después de la exposición a la radiación (Fig. 3c). Además, los resultados del ensayo PLA mostraron una mayor colocalización nuclear de HMGB1 y KU70 en las células de CRC después de la irradiación con rayos X de 4 Gy (Fig. 3d). Para evaluar la afinidad de unión entre KU70 y HMGB1, realizamos un análisis de acoplamiento molecular, que arrojó una energía de unión de -221,94 kcal/mol e indicó que la interfaz de interacción principal reside dentro de los residuos de aminoácidos 95-163 de HMGB1 (Fig. 3e). En conjunto, estos hallazgos indican que HMGB1 se une directamente a KU70 en las células de CRC irradiadas, activando así la vía UEN para facilitar la reparación del daño del ADN.

a. Análisis de qPCR del gen clave de la vía RH (RAD51) y los genes UEN (KU70, KU80, XRCC4) en las células de CRC con HMGB1 inhibido después de la irradiación con rayos X de 4 Gy. b. Análisis de western blot de las proteínas relacionadas con la UEN (KU70, KU80, XRCC4, LIG4) en las células de CRC con HMGB1 inhibido irradiadas a 4 Gy; ?-actina sirvió como control de carga. c. Ensayo de co-inmunoprecipitación que detecta la formación del complejo inmunitario HMGB1-KU70 en las células de CRC después de la irradiación de 4 Gy. d. PLA que muestra la formación y la localización subcelular del complejo HMGB1-KU70 en las células de CRC después de la irradiación. e. Modelo de acoplamiento molecular de HMGB1 y KU70; el recuadro destaca la interacción entre HMGB1 y los residuos de aminoácidos cerca del sitio de unión. **P < 0,01, *P < 0,05.

Para investigar más a fondo si HMGB1 regula la reparación del daño del ADN a través de KU70, utilizamos tres secuencias de siRNA distintas dirigidas a KU70 en un ensayo de transfección transitoria para evaluar si HMGB1 influye en la radiosensibilidad de las células de CRC de forma dependiente de KU70. Los análisis de qPCR y western blot mostraron que tanto los niveles de ARNm de KU70 como los niveles de proteína se redujeron significativamente, siendo el siRNA2 el que exhibió la mayor eficiencia de interferencia (Fig. 1b-1c). Para validar aún más la interacción funcional entre HMGB1 y KU70 en las células de CRC, se realizaron experimentos de rescate mediante la transfección con si-KU70. Como se muestra en la Fig. 4a, la apoptosis aumentó significativamente tanto en las células de CRC con HMGB1 inhibido como en las células con KU70 interferido después de la irradiación. El análisis de western blot reveló además una disminución de la acumulación de las proteínas KU70, KU80, XRCC4 y LIG4 en las células de CRC con HMGB1 inhibido o KU70 interferido expuestas a la irradiación con rayos X de 4 Gy (Fig. 4b). Estos resultados sugieren que HMGB1 contribuye a la disminución de la radiosensibilidad al mejorar la vía UEN en las células de CRC. Además, la evaluación de la formación de focos de γH2A.x mostró que la interferencia de KU70 aumentó eficazmente el número de roturas de doble cadena del ADN, lo que es consistente con la situación observada en las células de CRC que carecen de HMGB1 después de la irradiación (Fig. 4c). El análisis de western blot mostró un aumento notable de γH2A.x en las células de CRC con HMGB1 inhibido o KU70 interferido después de la exposición a la irradiación con rayos X de 4 Gy (Fig. 4d). De manera similar, los resultados del ensayo cometa indicaron que la inhibición de HMGB1 combinada con la interferencia de KU70 promovió un aumento de la longitud de la cola en las células de CRC irradiadas (Fig. 4e). En conjunto, estos resultados indican que la vía HMGB1/KU70/UEN desempeña un papel fundamental en la radioresistencia mediada por la reparación del daño del ADN del CRC.

a. Se midió la actividad de la caspasa-3 en las células de CRC con HMGB1 inhibido o KU70 interferido después de la irradiación de 4 Gy. b. Tras la irradiación de 4 Gy, se analizaron por western blot la expresión de las proteínas relacionadas con la UEN en las células de CRC con HMGB1 inhibido o KU70 interferido, utilizando ?-actina como control de carga. Se cuantificó el cambio de pliegue relativo en la expresión de la proteína. c. Se evaluó la formación de focos de γH2A.x en los puntos de tiempo indicados en las células de CRC con KU70 inhibido después de la irradiación (escala: 20 µm). d. Se detectó el nivel de proteína de γH2A.x en las células de CRC con HMGB1 inhibido o KU70 interferido mediante western blot después de la irradiación de 4 Gy, con ?-actina como control de carga. Se cuantificó el cambio de pliegue relativo de γH2A.x. e. El daño del ADN se evaluó mediante el ensayo cometa en las células de CRC con HMGB1 inhibido o KU70 interferido a las 24 horas después de la irradiación con rayos X de 4 Gy (escala: 20 µm). Se calculó la longitud del ADN de la cola a partir de 100 células. Los datos se presentan como la media ± SEM de los tres experimentos. **P < 0,01, *P < 0,05.

Para investigar más a fondo si HMGB1 facilita que KU70 mantenga la homeostasis redox, se evaluaron los niveles celulares de ERO y la formación de 8-OHdG utilizando ensayos de detección de ERO y IF, respectivamente. El si-KU70 solo imitó la inhibición de HMGB1, elevando la acumulación basal de ERO después de la irradiación (Fig. 5a). El análisis IF de 8-OHdG reveló que tanto la disminución de HMGB1 como la interferencia de KU70 aumentaron significativamente los niveles de 8-OHdG en las células de CRC después de la irradiación (Fig. 5b). Estos datos respaldan aún más la conclusión de que HMGB1 se une a KU70 y lo secuestra dentro del núcleo para mantener la homeostasis redox y proteger contra el daño oxidativo del ADN.

a. Producción de ERO en las células de CRC con HMGB1 inhibido después de la irradiación de 4 Gy. b. Expresión de 8-OHdG en las células de CRC con HMGB1 inhibido después de la irradiación de 4 Gy, con la intensidad media de fluorescencia correspondiente mostrada (escala: 10 µm). **P < 0,01, *P < 0,05.

a. Niveles intracelulares de ROS en células de CRC después de la irradiación, tras la transfección con siRNA de KU70 o vectores de silenciamiento de HMGB1. b. Expresión de 8-OHdG en células de CRC a los 4 Gy de irradiación después de la transfección con siRNA de KU70 o vectores de silenciamiento de HMGB1 (barras de escala: 20 µm). **P < 0,01, *P < 0,05.

Dado el efecto inhibidor del eje HMGB1/KU70 sobre la radiosensibilidad de las células de CRC in vitro, este estudio validó aún más su función in vivo utilizando un modelo de xenoinjerto subcutáneo en ratones. Las células HT29, transfectadas con un plásmido shRNA de HMGB1 o un plásmido shRNA aleatorio (grupo control), se inocularon subcutáneamente en ratones desnudos, seguido de un tratamiento con o sin 10 Gy de irradiación local o inyección intratumoral de si-KU70. Los resultados mostraron que tanto el crecimiento tumoral como el peso en los ratones inoculados con células sh-HMGB1 fueron significativamente menores que en el grupo control. Después de 10 Gy de irradiación, el tamaño y el peso del tumor también se redujeron notablemente en el grupo de silenciamiento de HMGB1 en comparación con el control. En consonancia con los efectos del silenciamiento de HMGB1, la inyección intratumoral de si-KU70 suprimió de manera similar el crecimiento tumoral en xenoinjertos ectópicos, lo que apoya que la supresión de HMGB1/KU70 inhibe la tumorigenicidad de las células de CRC in vivo (Fig. 6a–c). Además, el análisis de inmunohistoquímica reveló una disminución significativa de las células Ki67 positivas después de la irradiación, tanto en los tumores con silenciamiento de HMGB1 como en los tumores con interferencia de KU70 (Fig. 6d y Fig. s1d en la Fig. S1). Por el contrario, el silenciamiento de HMGB1 o el tratamiento con si-KU70 aumentaron la proporción de células ?H2A.x positivas en los tejidos de xenoinjerto irradiados (Fig. 6e y Fig. s1e en la Fig. S1). Además, en comparación con el control shRNA aleatorio, tanto el silenciamiento de HMGB1 como el tratamiento con si-KU70 condujeron a niveles elevados de células TUNEL positivas (Fig. 6f y Fig. s1f en la Fig. S1). En conjunto, estos hallazgos in vivo indican que HMGB1 mejora la radioresistencia en CRC a través de la vía NHEJ mediada por KU70.

a. Esquema del diseño experimental e imágenes representativas de tumores de ratones desnudos hembra (n = 5 por grupo) implantados con células sh-NC o sh-HMGB1-HT29, seguido de un tratamiento con o sin si-KU70 y 10 Gy de irradiación con rayos X. b. Pesos tumorales terminales de xenoinjertos en cada grupo de tratamiento. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 5). c. Curvas de crecimiento tumoral de xenoinjertos derivados de las líneas celulares de CRC indicadas bajo el tratamiento descrito. Los datos se muestran como media ± SEM (n = 5). d. Tinción de inmunohistoquímica de Ki67 en secciones de tumores del modelo de xenoinjerto en diferentes condiciones de tratamiento (barra de escala: 50 µm). e. Tinción de inmunohistoquímica de ?H2A.x en tejidos tumorales, que indica roturas de doble cadena del ADN (barra de escala: 50 µm). f. Tinción TUNEL de tejidos tumorales para evaluar la apoptosis (barras de escala: 20 µm). g. Modelo mecanístico propuesto. La radiación ionizante induce roturas de doble cadena del ADN y ROS. HMGB1 recluta a KU70 para facilitar el ensamblaje del complejo de reparación NHEJ (KU70/KU80/XRCC4/LIG4), promoviendo así la reparación de las roturas de doble cadena y suprimiendo la apoptosis. La interrupción de HMGB1 o KU70 perjudica este eje, lo que resulta en un daño persistente del ADN, la activación de la caspasa 3 y la inhibición del crecimiento tumoral. **P < 0,01, *P < 0,05.

Nuestro estudio previo reveló que HMGB1 se expresa de forma anormal y se asocia con un mal pronóstico en pacientes con CRC ^[7]. Para examinar más a fondo la relación entre HMGB1 y KU70 y su relevancia clinicopatológica en CRC, analizamos la expresión de KU70 en tejidos de CRC y tejidos normales utilizando la base de datos GEPIA. Como se muestra en la Fig. s2a en la Fig. S2, KU70 se expresó en gran medida en los tumores de CRC. Además, la expresión aberrante de KU70 se correlacionó con una etapa TNM avanzada (Fig. s2b en la Fig. S2). El análisis de correlación de Pearson basado en la base de datos TIMER indicó una correlación positiva entre la expresión de HMGB1 y KU70 en los tejidos de CRC (Fig. s2c en la Fig. S2). Aunque no fue estadísticamente significativo (P > 0,05), se observó una tendencia hacia una peor supervivencia libre de enfermedad en pacientes con una alta coexpresión de HMGB1 y KU70 (Fig. s2d en la Fig. S2). Estos datos sugieren que la expresión de HMGB1 y KU70 puede servir como un indicador candidato para la estratificación de pacientes, en espera de validación en cohortes prospectivas.

La radioterapia es un tratamiento bien establecido que elimina las células tumorales induciendo daño en el ADN, generando ROS y alterando la integridad estructural celular, lo que conduce a la reducción del tumor y la muerte celular ^[12]. Diferentes tumores exhiben una radiosensibilidad marcadamente variable. Sin embargo, la resistencia a la radiación sigue siendo un obstáculo importante en el tratamiento del CRC. Como proteína evolutivamente conservada, múltiples estudios han informado que HMGB1 está involucrado en la radioresistencia en el carcinoma de células escamosas esofágico ^[13], el cáncer de pulmón de células no pequeñas ^[14] y el glioblastoma ^[15]. En CRC, la mayoría de los estudios se han centrado en los efectos de HMGB1 en la progresión ^[16]; sin embargo, se estudia poco si HMGB1 afecta la radiosensibilidad del CRC. En este estudio, encontramos que el silenciamiento de HMGB1 aumentó los niveles basales de daño en el ADN y la apoptosis, lo que es consistente con su función en el mantenimiento de la arquitectura de la cromatina. Sin embargo, después de la exposición a la radiación, la respuesta al daño se mejoró significativamente, como lo demuestra el aumento de la inducción de ?H2A.x y las roturas de doble cadena persistentes. Esto indica que HMGB1 es específicamente necesario para la reparación eficiente del daño del ADN inducido por la radiación. Este efecto basal no socava nuestra conclusión principal; por el contrario, destaca aún más la importancia de HMGB1 tanto en el mantenimiento de la estabilidad genómica basal como en los procesos de reparación del ADN inducidos por el estrés.

Una estrategia ampliamente estudiada para mejorar la radiosensibilidad tumoral es aumentar el daño inicial del ADN inducido por la radiación al tiempo que se inhibe la reparación celular del daño subletal y letal. La lesión letal más crítica del ADN es la rotura de doble cadena, que activa componentes como DNA-PKcs, KU70 y KU80 para iniciar el proceso de reparación del daño del ADN ^[17]. HMGB1 normalmente funciona como una chaperona del ADN, facilitando la actividad de las enzimas de reparación del ADN y los factores de transcripción ^[18]. Por lo tanto, HMGB1 puede unirse al ADN dañado e influir en la resistencia tumoral a la radiación o la quimioterapia ^[19]. En consecuencia, demostramos que HMGB1 contribuye a la radioresistencia en CRC al promover la reparación del daño del ADN. Dado que la unión de KU al ADN es un paso iniciador en NHEJ, es probable que HMGB1 desempeñe un papel en las etapas tempranas de NHEJ o en la respuesta general al daño del ADN. Una mayor elucidación de los mecanismos moleculares subyacentes reveló que HMGB1 interactúa directamente con KU70 a través de su región de aminoácidos 95-163 para estabilizar el complejo NHEJ y promover la reparación. En particular, el efecto de HMGB1 sobre KU70 depende del contexto. En las neuronas de la enfermedad de Alzheimer, HMGB1 extracelular activa la señalización de TLR4, lo que conduce a la fosforilación de KU70 y a la alteración de la unión al ADN, interrumpiendo así NHEJ ^[20]. Esta dicotomía destaca que el resultado funcional de HMGB1 depende de su localización subcelular y del entorno de señalización específico. Además, se ha relacionado NHEJ con la quimioresistencia o la radioresistencia en una variedad de tumores, incluido el CRC ^[21], el glioma, el cáncer de mama ^[22] y el carcinoma nasofaríngeo ^[23]. Nuestros hallazgos sugieren que HMGB1 contribuye a la resistencia a la radioterapia, posiblemente a través de su participación en NHEJ. En consecuencia, el direccionamiento del eje HMGB1/KU70/NHEJ representa una estrategia prometedora para mejorar los resultados en CRC, particularmente para los pacientes que presentan resistencia a la radioterapia, posiblemente mediante el uso de antagonistas de HMGB1/KU70.

Los estudios han demostrado que la radiación puede elevar los niveles intracelulares de ROS en las células estromales tumorales del ratón, causando así daño en el ADN, promoviendo la destrucción de las células tumorales y, en última instancia, inhibiendo el crecimiento tumoral, y los ROS también modulan las vías de señalización relacionadas con las respuestas de supervivencia o muerte después de la quimioterapia o la radioterapia [24, 25]. Meng et al. informaron que la inhibición de HMGB1 atenúa el asma ocupacional inducida por el tolueno diisocianato al regular la vía ROS/AMPK/autofagia ^[26]. Más allá de su función directa en la regulación de ROS, se ha demostrado que HMGB1 endógeno regula la piroptosis a través de la vía ROS/ERK1/2/caspasa-3/GSDME en el neuroblastoma ^[27]. Nuestros resultados se alinean con estos informes anteriores, lo que indica que HMGB1 regula principalmente el estrés oxidativo basal después de la irradiación, protegiendo aún más contra el daño oxidativo del ADN. Aunque no utilizamos NAC para eliminar los ROS, los estudios han demostrado que NAC puede revertir la formación de focos de ?H2A.x y modular los niveles de proteínas de reparación del daño del ADN [28, 29]. Sin embargo, Zheng et al. mostraron que la acumulación de ROS inducida por 5-FU conduce a la activación de HIF-1?, que se une directamente al promotor de HMGB1 en las células de CRC ^[30]. Estos hallazgos sugieren que HMGB1 y los ROS inducidos por la irradiación pueden formar un bucle de retroalimentación positiva, modulando el comportamiento de las células tumorales y contribuyendo en última instancia a la radioresistencia o la quimioresistencia.

En conclusión, este estudio revela que HMGB1 promueve la reparación del daño del ADN en CRC tanto in vitro como in vivo. Además, demostramos que HMGB1 nuclear interactúa con KU70 y, posteriormente, activa la vía NHEJ, lo que resulta en la inhibición de la apoptosis celular en CRC (Fig. 6g). Por lo tanto, HMGB1 puede servir como un biomarcador predictivo para la respuesta a la radioterapia. La combinación de la radioterapia con inhibidores de la reparación del daño del ADN podría representar una estrategia terapéutica eficaz para superar la radioresistencia en pacientes con CRC con alta expresión de HMGB1.

Este estudio tiene varias limitaciones. Primero, aunque se identificó la región de aminoácidos 95-163 de HMGB1 como el dominio de unión principal para KU70, el mapeo de dominios detallado y la validación experimental de su interacción aún deben completarse, lo que limita la comprensión mecanística de la especificidad de la unión. En segundo lugar, la relación funcional entre HMGB1 y KU70 se evaluó principalmente a través de enfoques de pérdida de función; la falta de experimentos de ganancia de función y de rescate directo impide el establecimiento definitivo de su papel causal en la reparación del daño del ADN inducido por la radiación. En tercer lugar, nuestros hallazgos se derivan únicamente de modelos celulares y animales y aún no se han validado en cohortes clínicas o tejidos humanos, lo que limita su relevancia traslacional para la radioterapia del cáncer colorrectal. Los estudios futuros deben abordar estas lagunas a través del mapeo de dominios dirigido, ensayos funcionales complementarios y la validación utilizando muestras clínicas.

a. Análisis por ImageJ de los niveles de expresión de proteínas de KU70, KU80, XRCC4 y LIG4 en células de CRC con silenciamiento de HMGB1 después de la exposición a 4 Gy de rayos X. b. Expresión de KU70 en células de CRC después de la transfección con siRNA de KU70, según lo determinado por qPCR. c. Detección por Western blot de la expresión de KU70 después de la transfección transitoria con si-KU70; ?-actina sirvió como control de carga. d. Número de células Ki67 positivas en tejidos tumorales de un modelo de xenoinjerto de ratón desnudo tratado con 10 Gy de irradiación combinada con si-KU70. e. Número de células ?H2A.x positivas en tejidos tumorales del mismo modelo después de 10 Gy de irradiación más tratamiento con si-KU70. f. Número de células TUNEL positivas en tejidos tumorales en condiciones de tratamiento idénticas. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 5 ratones por grupo). **P < 0,01, *P < 0,05.

Análisis de correlación de la expresión de HMGB1 y KU70 en muestras de tejido de CRC. a. Alta expresión de KU70 en tumores de CRC. b. Expresión de KU70 en muestras de CRC en diferentes etapas clínicas, según lo analizado utilizando la base de datos GEPIA. c. Análisis de correlación de los niveles de expresión de HMGB1 y KU70 en muestras de CRC, según los datos de la base de datos TIMER. d. Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier que ilustran la supervivencia libre de enfermedad en pacientes con CRC estratificados por los niveles de expresión de HMGB1 y KU70, derivadas de la base de datos GEPIA. **P < 0,01, *P < 0,05.