FlashDeconv permite la desconvolución espacial a escala de atlas y en múltiples resoluciones mediante esquematización que preserva la estructura

Las tecnologías de transcriptómica espacial (TE) [^[1]], como Stereo-seq [^[2]], Xenium [^[3]] y Visium HD, están transformando nuestra comprensión de la arquitectura tisular al mapear la expresión génica a resolución subcelular en campos de visión cada vez mayores. A medida que estas tecnologías escalan a conjuntos de datos de nivel de atlas que comprenden millones de puntos o células, la carga computacional del análisis de dichos datos se ha convertido en un cuello de botella crítico. Una tarea fundamental en el análisis de la TE es la deconvolución de tipos celulares, que infiere la composición proporcional de los tipos celulares dentro de cada unidad de medición espacial aprovechando las referencias de secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq).

Los métodos de deconvolución existentes, que ahora suman más de setenta enfoques distintos [^[4]], pueden distinguirse ampliamente por sus paradigmas de modelado: modelado probabilístico generativo frente a regresión restringida. Los métodos generativos, como Cell2Location [^[5]] y Stereoscope [^[6]], logran una alta precisión al modelar explícitamente las distribuciones de datos de conteo (por ejemplo, Binomial Negativa) mediante inferencia variacional o estimación de máxima verosimilitud a posteriori (MAP), proporcionando una cuantificación rigurosa de la incertidumbre que es particularmente valiosa para estudios a pequeña escala que requieren una cuidadosa inferencia estadística. Sin embargo, estos métodos requieren un entrenamiento iterativo extenso, con tiempos de ejecución que van desde horas hasta días para conjuntos de datos de millones de puntos. En contraste, los enfoques basados en la regresión formulan el problema como una minimización restringida, ofreciendo una inferencia más rápida. Esta categoría incluye NNLS de referencia, variantes ponderadas como MuSiC [^[7]] y SpatialDWLS [^[8]], regresión basada en la verosimilitud (RCTD [^[9]]), descomposición NMF (SPOTlight [^[10]]) y alineación de aprendizaje profundo (Tangram [^[11]]). Los puntos de referencia indican que muchos métodos no logran superar consistentemente a NNLS; solo Cell2Location, RCTD y MuSiC superan el rendimiento de referencia en todas las métricas de evaluación [^[12]]. Sin embargo, la mayoría de los enfoques de regresión tratan los puntos espaciales como observaciones independientes, ignorando la continuidad tisular local. Los métodos que sí incorporan la estructura espacial, como CARD [^[13]] con su prior condicional autorregresivo (CAR), generalmente se basan en matrices de covarianza densas (O(N2) de memoria), lo que impide el análisis de las plataformas de alta resolución emergentes con millones de puntos.

Aquí, presentamos FlashDeconv, un marco de deconvolución que logra precisión, conciencia espacial y escalabilidad lineal simultáneamente. FlashDeconv aprovecha el Álgebra Lineal Numérica Aleatoria (RandNLA) para comprimir el espacio de expresión génica de alta dimensión (G ? 20.000) en un "bosquejo" compacto (d ? 512) utilizando una técnica de bosquejo que preserva la estructura. A diferencia de las proyecciones aleatorias estándar que corren el riesgo de perder señales de tipos celulares raros, nuestro enfoque utiliza el muestreo de importancia de la puntuación de influencia para preservar eficazmente la heterogeneidad biológica. Aquí, "estructura" se refiere a la organización geométrica de los tipos celulares en el espacio de expresión génica, que las puntuaciones de influencia cuantifican midiendo la contribución de cada gen para distinguir las firmas de los tipos celulares. Combinado con una representación de datos Log-CPM y un regularizador de grafo disperso que escala como O(N) en lugar de O(N2), FlashDeconv logra una precisión comparable a los métodos bayesianos de primer nivel en puntos de referencia sintéticos, al tiempo que reduce el tiempo de ejecución en órdenes de magnitud, lo que permite el análisis a escala de atlas en hardware estándar.

Un desafío crítico en la deconvolución es que los métodos tradicionales de reducción de dimensionalidad, como el análisis de componentes principales (PCA) o la selección de genes de alta variabilidad (HVG), se basan en la varianza como un indicador de la información biológica [^[14], ^[15]]. Intuitivamente, la varianza mide lo "fuerte" que es un gen en todo el conjunto de datos, una cantidad naturalmente dominada por los tipos celulares abundantes. En contraste, las puntuaciones de influencia miden la distintividad: si un gen define una dirección única en el espacio transcriptómico, independientemente de cuántas células lo expresen. Esta distinción es biológicamente importante: las poblaciones raras, incluidas las células madre cancerosas que comprenden 0,88 en todas las resoluciones, incluso a 8 µm, donde los grupos contenían una mediana de una célula (Nota suplementaria 7, Figura suplementaria S22). La comparación de las proporciones globales de tipos de células entre las plataformas reveló que, a un nivel de linaje más grueso (6 categorías), tanto FlashDeconv como RCTD concordaban bien con la referencia de Xenium (r = 0,96 y r = 0,94, respectivamente), pero a nivel de tipo de célula individual (38 tipos), FlashDeconv mantuvo una fuerte correspondencia (r = 0,78), mientras que las proporciones derivadas de los grupos de RCTD no mostraron un acuerdo sistemático (r = -0,02), lo que es coherente con la pérdida de información inherente a la reducción de mezclas continuas a etiquetas discretas.

La precisión de FlashDeconv se extiende más allá del CRC: su aplicación al cáncer de ovario humano recupera las diferencias en la composición de los tipos de células entre los grupos de respuesta informadas por Denisenko et al. [^[39]] (Figura suplementaria S21).

Análisis del espacio de escalas de Visium HD revela una pérdida de información dependiente de la resolución

Si bien el análisis anterior del CRC demuestra la utilidad práctica de FlashDeconv para el mapeo del microambiente tumoral a escala de atlas a resolución subcelular, la plataforma Visium HD de 8 µm plantea una pregunta fundamental que va más allá de cualquier aplicación biológica específica: ¿a qué resolución comienza a disminuir la información celular? Aprovechamos la eficiencia computacional de FlashDeconv para realizar un análisis sistemático del espacio de escalas que sería inviable con los métodos existentes: a 350.000 puntos (resolución de 8 µm), los métodos probabilísticos se enfrentan a barreras prohibitivas: Cell2Location no puede manejar conjuntos de datos de más de ~20.000 puntos [^[13]], y el tiempo de ejecución de Stereoscope de >8 horas en 10.000 puntos [^[12]] se extrapolaría a más de 11 días.

Utilizando datos de Visium HD del intestino delgado de ratón (10x Genomics), realizamos la deconvolución de las proporciones de tipos de células en cinco resoluciones (8, 16, 32, 64 y 128 µm) utilizando una referencia de scRNA-seq coincidente [^[40]]. FlashDeconv procesó 351.817 grupos a una resolución de 8 µm en 12,0 segundos, lo que representa un rendimiento de aproximadamente 29.000 grupos por segundo en hardware estándar (Fig. 6a). El análisis completo de las cinco resoluciones (366.975 grupos en total) requirió solo 14 segundos, lo que permitió una exploración sistemática de la relación entre la resolución y la información.

El horizonte de la resolución.

Nuestro análisis reveló una transición pronunciada entre las resoluciones de 8 µm y 16 µm (Fig. 6b). A 8 µm, el 61,5% de los grupos estaban dominados por un solo tipo de célula (proporción >80%), lo que es coherente con una pureza casi a nivel de célula única. Esta fracción disminuyó a 13,3% a 16 µm, lo que representa una reducción del 78%, y continuó disminuyendo a 3,9% a 128 µm. La entropía de Shannon normalizada de la mezcla de tipos de células aumentó en consecuencia, de 0,23 a 8 µm a 0,48 a 16 µm. Esta transición representa el límite más allá del cual la identidad celular se ve fundamentalmente oscurecida por el promedio espacial. La transición de 8 a 16 µm observada en el intestino delgado de ratón se reprodujo de forma independiente en el colon de ratón utilizando la verdad fundamental de Xenium sin deconvolución (Nota suplementaria 4), lo que sugiere que esta escala es una característica robusta del epitelio intestinal. En particular, esta transición coincide con el diámetro característico de las células epiteliales intestinales (~10–15 µm), lo que es coherente con la intuición geométrica de que el horizonte de la resolución se produce cuando los grupos de medición pasan de capturar predominantemente células únicas a promediar múltiples células. Para los tejidos con tamaños de células o patrones de organización espacial sustancialmente diferentes, se espera que el horizonte de la resolución cambie en consecuencia, lo que destaca que este es un parámetro biofísico dependiente del tejido en lugar de una constante universal.

Los tipos de células exhiben diferentes sensibilidades a la resolución.

Diferentes tipos de células mostraron vulnerabilidades marcadamente diferentes a la agregación espacial (Fig. 6c). Las células madre intestinales, localizadas en las bases de las criptas con un tamaño de nicho característico de aproximadamente 10–15 µm, exhibieron la mayor pérdida de información: la autocorrelación espacial (índice de Moran) disminuyó en un 70% de 8 µm a 128 µm. En contraste, las células de Paneth, que forman cúmulos estrechos en las bases de las criptas, mostraron solo una pérdida del 17% de la coherencia espacial en el mismo rango de resolución. Estas diferencias reflejan las escalas espaciales características de la organización tisular de cada tipo de célula.

Validación mediante el análisis del límite cripta-villo.

Para confirmar que los efectos de resolución observados reflejan una estructura biológica genuina, analizamos la nitidez de los límites cripta-villo, la zona de transición entre las criptas ricas en células de Paneth y los vellos cubiertos de enterocitos (Fig. 6d). Trazamos 100 trayectorias lineales desde los núcleos de las criptas (Paneth >50%) hasta las regiones de los vellos (enterocito >70%) y calculamos el gradiente máximo de la proporción de enterocitos a lo largo de cada trayectoria. A 8 µm, la nitidez media del gradiente fue de 0,036 ± 0,029. A 16 µm, esto disminuyó a 0,008 ± 0,003, lo que representa una reducción del 77% en la definición del límite. A 32 µm y resoluciones más gruesas, los núcleos de las criptas que cumplían nuestros criterios ya no pudieron identificarse. Este análisis cuantitativo del límite confirma que la pérdida de información corresponde a un desenfoque anatómico en lugar de artefactos algorítmicos.

El agrupamiento grueso induce una colocalización espuria.

Más allá de la pérdida de señal, la agregación espacial puede distorsionar fundamentalmente la inferencia de las relaciones célula-célula (Fig. 6e). Las células de Paneth y las células caliciformes son ambos tipos de epitelio secretor, pero ocupan nichos espaciales distintos: las células de Paneth residen exclusivamente en las bases de las criptas, mientras que las células caliciformes se distribuyen a lo largo del eje cripta-villo. A una resolución de 8 µm, esta segregación espacial se manifiesta como una correlación negativa débil (r = -0,12, p < 10-100, N = 351.817), lo que refleja su exclusión mutua a escala celular. Sin embargo, a medida que la resolución se vuelve más gruesa, ambos tipos de células se mezclan dentro de los mismos grupos de medición, lo que induce una correlación positiva espuria que alcanza su punto máximo a 64 µm (r = +0,80). Este cambio de signo de la correlación, de negativo a positivo, representa una inversión cualitativa en la relación aparente célula-célula, un ejemplo a escala de tejido del problema de la unidad areal modificable (MAUP) de la estadística espacial [^[41]], que se destacó recientemente en el contexto de la transcriptómica espacial [^[42]]. El mecanismo es geométrico: a una resolución fina, las poblaciones celulares adyacentes pero distintas se resuelven por separado, pero a medida que el tamaño del grupo aumenta más allá de las dimensiones físicas de las células, se promedian en la misma unidad de medición y parecen estar artificialmente colocalizadas. Los investigadores que analizan datos a la resolución convencional de Visium (55 µm) observarían una fuerte colocalización y podrían concluir erróneamente que las células de Paneth y las células caliciformes comparten un microambiente común o responden a las mismas señales espaciales. Para confirmar que este fenómeno refleja la geometría espacial en lugar de la metodología de deconvolución, realizamos una validación de la verdad fundamental utilizando datos de secuenciación in situ de Xenium del colon de ratón, donde se conocen las posiciones exactas de las células sin deconvolución. La propia verdad fundamental exhibe el mismo patrón: los grupos de células adyacentes pero distintos muestran una correlación negativa a 8 µm (r = -0,06) pero una fuerte correlación positiva a 128 µm (r = +0,68), lo que confirma que la inversión del signo observada refleja la geometría del tejido en lugar de la escasez de datos o la metodología de deconvolución (Nota suplementaria 4; Figura suplementaria S15). La capacidad de FlashDeconv para procesar datos de alta resolución de forma eficiente permite la detección de este tipo de artefactos dependientes de la resolución, revelando la verdadera organización espacial que el agrupamiento grueso oscurece.

Las puntuaciones de influencia explican la preservación de las señales de las células raras.

Para verificar la conexión mecánica entre el diseño matemático de FlashDeconv y los hallazgos biológicos anteriores, confirmamos que los genes marcadores de los tipos de células clave exhiben puntuaciones de influencia elevadas en la referencia del intestino (Figura suplementaria S14). El marcador canónico de las células madre, Lgr5, se clasifica entre el 1% superior por influencia (rango n.º 283 de 27.998 genes), a pesar de que solo se clasifica entre el 10% superior por varianza. En general, los marcadores de las células madre tienen una puntuación de influencia media en el percentil 95, y 5 de 6 marcadores se encuentran entre los 5 primeros. Esto confirma que la detección del nicho de células madre a 8 µm demostrada anteriormente es una consecuencia directa del esbozo ponderado por la influencia: las señales de los tipos de células raras se conservan durante la reducción de la dimensionalidad precisamente porque sus marcadores definen direcciones únicas en el espacio de expresión génica, independientemente de su magnitud de expresión general.

FlashDeconv resuelve el nicho quimiosensorial Tuft-Stem.

Más allá de validar la preservación de los marcadores, FlashDeconv permitió la cuantificación a nivel de nicho de la colocalización de tipos celulares directamente a partir de la transcriptómica espacial basada en la captura, recuperando una arquitectura espacial consistente con la biología conocida de las células de Tuft [^[43], ^[44]] mediante la deconvolución de plataformas basadas en el secuenciamiento, sin requerir la segmentación celular basada en imágenes. Las células de Tuft (células ciliadas), que son células epiteliales quimiosensoriales raras y que comprenden solo aproximadamente el 0,4-2% del epitelio intestinal [^[45]], exhibieron el mayor grado de "ceguera de genes altamente variables" (HVG) entre todos los tipos celulares en nuestro análisis (Fig. 7a): sus genes marcadores (incluidos Pik3r5, Ptgs1) obtuvieron una puntuación 21 puntos porcentuales más baja en la selección basada en la varianza que en la clasificación basada en el apalancamiento, lo que las coloca en el mayor riesgo de ser descartadas por los métodos estándar de selección de características. A una resolución de 8 µm, FlashDeconv identificó 2.244 nichos celulares de Tuft focales con proporciones que alcanzaron el 61%, que son esencialmente manchas de células de Tuft puras (Fig. 7b). Estos nichos exhibieron un patrón espacial sorprendente: un enriquecimiento de 15,3 veces para las células madre intestinales y un enriquecimiento de 14,0 veces para las células enteroendocrinas (Fig. 7c, e). Por el contrario, los tipos celulares diferenciados estaban fuertemente disminuidos: enterocitos (0,11×), células caliciformes (0,10×) y células de Paneth (0,22×), todos significativamente no aleatorios (prueba de permutación, p < 10^-4, n = 10.000). Esta colocalización de Tuft y células madre es consistente anatómicamente con la localización conocida de las células de Tuft cerca de la zona de células madre intestinales en la base de las criptas [^[43], ^[44]] y su capacidad recientemente descubierta para funcionar como células madre de reserva después de una lesión epitelial [^[46]]. Cabe destacar que el análisis exploratorio de ligandos y receptores reveló que Il17ra (que codifica una subunidad del receptor de IL-25 a través del cual las células de Tuft señalan a las células vecinas [^[47]]) se expresa 7 veces más en los nichos de Tuft-células madre que en el tejido de fondo (Figura S20 en el material suplementario), lo que sugiere que esta proximidad espacial puede facilitar la comunicación paracrina. La validación del modelo nulo confirma que esta señal es biológica y no un artefacto: conjuntos de genes marcadores independientes muestran patrones espaciales consistentes (r = 0,30, p < 10^-200), la colocalización es específica de las células madre (no de los tipos celulares aleatorios), la distribución de las células de Tuft exhibe una autocorrelación espacial significativa (Índice de Moran = 0,44 frente a la línea de base aleatoria ~0) y la proximidad de Tuft-células madre se recapitula directamente en la expresión génica sin procesar sin deconvolución (Pou2f3–Lgr5 enriquecimiento de vecinos, p < 0,001; Nota 6 en el material suplementario, Figura S19 en el material suplementario). La señal de las células de Tuft depende exquisitamente de la resolución: la proporción máxima de células de Tuft disminuyó del 61% a 8 µm al 4% a 128 µm (Fig. 7d), lo que hace que estos nichos sean indetectables a la resolución convencional de Visium. Este hallazgo ilustra que la resolución de dicha arquitectura de nicho a partir de la transcriptómica espacial basada en la captura requiere superar dos barreras independientes: los marcadores de células raras que se pierden debido a la selección de características basada en la varianza y la señal espacial diluida a resoluciones que exceden la escala característica del nicho (~10-15 µm).### La comparación entre métodos confirma la arquitectura del nicho.

Para evaluar si esta arquitectura espacial refleja una biología tisular genuina o es específica del diseño de FlashDeconv, aplicamos RCTD, un método basado en la probabilidad que trata cada punto de forma independiente, al mismo tejido a una resolución de 16 µm, que es la escala más fina en la que la inferencia por punto de RCTD sigue siendo práctica en este tejido (10.952 puntos; 8 µm requeriría >350.000 regresiones independientes). Ambos métodos detectaron un enriquecimiento de células madre en los puntos calientes de las células de Tuft, lo que confirma que el nicho refleja la arquitectura del tejido en lugar de un artefacto de regularización. Sin embargo, FlashDeconv produjo asignaciones espacialmente mucho más coherentes, consolidando la señal de las células de Tuft en 9 grupos frente a 168 fragmentos dispersos para RCTD, con un enriquecimiento de células madre de 7,7 veces en los puntos calientes en comparación con 3,0 veces (Figura S24 en el material suplementario). Esta diferencia refleja en parte la regularización del laplaciano del gráfico de FlashDeconv, que toma prestada información de los vecinos espaciales para hacer cumplir la continuidad local. Para verificar que esta coherencia corresponde a una biología genuina en lugar de un sobreajuste, examinamos Il17ra (que codifica una subunidad del receptor de IL-25 crítico para la señalización paracrina de Tuft-células madre [^[47]]) como un resultado funcional independiente de ambos métodos de deconvolución. Las zonas de nicho definidas por FlashDeconv mostraron un enriquecimiento de 5,2 veces de Il17ra sobre el fondo frente a 1,5 veces para las zonas definidas por RCTD, lo que indica que las asignaciones espacialmente coherentes delinean con mayor precisión los microambientes de señalización funcional (Nota 8 en el material suplementario).

El marco de trabajo de FlashDeconv

FlashDeconv formula la deconvolución espacial como un problema de optimización restringida en un espacio de características comprimido (Fig. 1). El marco de trabajo consta de tres opciones de diseño clave:

En primer lugar, para abordar la extrema escasez y la dependencia de la media-varianza de los datos de transcriptómica espacial (ST), empleamos una transformación Log-CPM (recuentos por millón). Si bien los residuos de Pearson son estadísticamente válidos para los datos de recuento binomial negativo [^[23]], Log-CPM ofrece ventajas específicas para el esbozo basado en L2: su norma acotada evita que los genes de alta expresión dominen el espacio de esbozo, mientras que su compresión logarítmica estabiliza el rango dinámico extremo de los datos de recuento espacial. Esto representa un compromiso de ingeniería: sacrificar algo de optimalidad estadística para la compatibilidad con la compresión aleatoria (Nota 2 en el material suplementario).

En segundo lugar, abordamos la redundancia computacional de la expresión génica mediante un esbozo aleatorio que preserva la estructura. En lugar de resolver la regresión en todos los genes G, proyectamos los datos en un subespacio de menor dimensión utilizando una matriz de esbozo dispersa ?. A diferencia de PCA, que maximiza la varianza explicada y puede oscurecer los tipos celulares que contribuyen poco a la varianza global, nuestra matriz de esbozo satisface la propiedad de Johnson-Lindenstrauss [^[24]], lo que garantiza que las distancias euclidianas entre las firmas de los tipos celulares se mantengan en el espacio comprimido con alta probabilidad. En esencia, la proyección está ponderada por las puntuaciones de apalancamiento estadístico [^[25], ^[26]] derivadas de la referencia de una sola célula. Esto asegura que los genes marcadores que definen los tipos celulares transcriptómicamente distintos (que a menudo tienen un alto apalancamiento a pesar de tener una baja varianza) se conserven con alta probabilidad, evitando la pérdida de señal que puede ocurrir con el submuestreo uniforme o la selección de características basada en la varianza. Por ejemplo, en los datos de scRNA-seq del hígado, las células endoteliales de la vena central constituyen solo el 2% de las células, pero su gen marcador Rspo3 alcanza la puntuación de apalancamiento más alta (0,0105) entre todos los genes debido a su patrón de expresión único que distingue marcadamente a esta población de todas las demás. En contraste, los marcadores de hepatocitos como Egfr exhiben bajas puntuaciones de apalancamiento (0,0007) a pesar de tener una alta especificidad, porque los hepatocitos comparten programas de genes metabólicos con los colangiocitos, lo que reduce su distinción geométrica en el espacio de referencia. Esto ilustra que el apalancamiento captura la distinción funcional en lugar de la abundancia: los hepatocitos son abundantes pero se superponen transcripcionalmente con otros linajes, mientras que las células endoteliales de la vena central son raras pero tienen una distinción transcripcional única. Los métodos de varianza estándar (PCA, HVG) no muestran ninguna diferencia estadística entre los marcadores funcionalmente distintos y los superpuestos (prueba U de Mann-Whitney, p = 0,97), mientras que la clasificación de la puntuación de apalancamiento identifica con éxito los genes informativos estructuralmente (prueba U de Mann-Whitney, p = 0,0062). Validamos este principio sistemáticamente en la Sección 2. El ponderación basada en el apalancamiento también aborda un segundo desafío algorítmico: durante el paso de hash del CountSketch, los genes de alta abundancia pueden dominar las dimensiones comprimidas y abrumar a los marcadores de células raras asignados al mismo bucket de hash. Al escalar los genes en proporción a sus puntuaciones de apalancamiento antes de la compresión (, donde es la probabilidad de apalancamiento normalizada), FlashDeconv asegura que los marcadores de células raras reciban una amplificación preferencial en relación con su magnitud de línea de base, manteniendo una señal adecuada a pesar de las colisiones de hash aleatorias [^[27]] (consulte Métodos para la derivación formal y la validación empírica en seis tejidos).

En tercer lugar, incorporamos información espacial utilizando un regularizador de laplaciano de gráfico. A diferencia de CARD, que construye y opera sobre una matriz espacial densa N × N con complejidad de memoria O(N2) y complejidad por iteración O(N2 · K) (donde K es el número de tipos celulares), nuestro enfoque impone la suavidad espacial a través de un término de penalización disperso Tr(T L )—una formulación desarrollada originalmente para datos genómicos estructurados [^[28]] y compartida con métodos espaciales recientes como SDePER [^[29]] y FAST [^[30]]—donde L es el laplaciano del gráfico de la red de vecinos espaciales. Esta regularización induce una suavidad local que es matemáticamente equivalente a un campo aleatorio de Markov gaussiano (GMRF) [^[31]] pero requiere solo operaciones de matriz dispersa. Debido a que cada punto se conecta solo a k vecinos (valor predeterminado k = 6), el término espacial se escala como O(N · k) en lugar de O(N2), lo que da como resultado una complejidad de tiempo lineal. Esta formulación permite que FlashDeconv modele la autocorrelación espacial en millones de puntos utilizando un algoritmo de descenso de coordenadas en bloque rápido (BCD), una escala en la que las inversiones de matrices densas son computacionalmente prohibitivas. Biológicamente, esta regularización codifica la intuición de que la composición del tejido varía suavemente: para un punto con una profundidad de secuenciación escasa, el algoritmo toma prestado de sus vecinos espaciales, lo que permite que surjan estructuras de tejido coherentes a partir de mediciones ruidosas.

El apalancamiento separa la identidad biológica de la abundancia de la población

Una premisa fundamental de FlashDeconv es que la varianza estadística confunde la señal biológica con la frecuencia de la población, lo que perjudica sistemáticamente a los tipos celulares raros. Para probar sistemáticamente esta afirmación, diseñamos una serie de experimentos que rastrean la evidencia desde el principio matemático hasta la función molecular y el fenotipo espacial.

Prueba de invariancia de la abundancia.

Realizamos una prueba de estrés in silico utilizando la referencia de scRNA-seq del cerebro de ratón (40.532 células, 59 tipos celulares, 31.053 genes). A partir de la distribución nativa de los tipos celulares, reducimos artificialmente la población dominante de oligodendrocitos del 26,7% al 0,4%, una reducción de 67 veces, manteniendo constantes todas las demás poblaciones. En cada nivel de submuestreo, identificamos los 20 genes marcadores principales (por nivel de expresión en los oligodendrocitos), calculamos las clasificaciones basadas en la varianza (dispersión normalizada [^[32]]) y basadas en el apalancamiento en todos los genes, y rastreamos cómo cambió la clasificación promedio del marcador (Fig. 2a). Los resultados revelan una divergencia sorprendente: la clasificación basada en la varianza se degradó linealmente con la abundancia, con la clasificación del marcador que pasó de 115 a 240 a medida que la población disminuía, una degradación de dos veces. En contraste, la clasificación de la puntuación de apalancamiento se mantuvo estable en aproximadamente 150 durante todo el rango, lo que demuestra que el apalancamiento separa con éxito el poder discriminatorio de un gen de la prevalencia numérica de su tipo celular principal. Cuantitativamente, la estabilidad se puede atribuir al acoplamiento reducido del apalancamiento a la expresión media: si bien la varianza del gen se correlaciona casi perfectamente con la expresión media (Spearman ρ = 0,998), las puntuaciones de apalancamiento muestran una mayor dispersión alrededor de esta relación (ρ = 0,965), lo que permite la identificación de marcadores de baja abundancia pero alta especificidad (Figura S5 en el material suplementario).### El análisis de cuadrantes de genes revela un sesgo sistemático.

Para comprender las implicaciones más amplias de este desacoplamiento, mapeamos los 31.053 genes en un sistema de coordenadas de varianza-influencia (Fig. 2b). Surgieron cuatro cuadrantes distintos, definidos por los valores logarítmicos transformados de la mediana para garantizar una partición equitativa sin una selección de umbrales arbitrarios. El cuadrante “GOLD” (baja varianza, alta influencia) contiene genes que la selección estándar de genes con alta varianza (HVG) descartaría, pero que poseen un alto poder discriminatorio, incluidos los marcadores vasculares clásicos como Cldn5 (claudina-5, proteína de unión estrecha), Rgs5 (marcador de pericitos), Ly6a (antígeno de células madre), Abcb1a (transportador de la barrera hematoencefálica) y Hspb1 (proteína de choque térmico). Estos genes definen poblaciones celulares raras pero anatómicamente críticas: las células endoteliales cerebrales y los pericitos constituyen 0,88 en todas las resoluciones, incluso a 8 m, donde los bins contenían una mediana de una célula (Nota suplementaria 7, Figura suplementaria S22). La comparación de las proporciones globales de tipos de células entre las plataformas reveló que, a un nivel de linaje más grueso (6 categorías), tanto FlashDeconv como RCTD concordaron bien con la referencia de Xenium (r = 0,96 y r = 0,94, respectivamente), pero a nivel de tipo de célula individual (38 tipos), FlashDeconv mantuvo una fuerte correspondencia (r = 0,78) mientras que las proporciones derivadas de singletes de RCTD no mostraron un acuerdo sistemático (r = ?0,02), lo que es consistente con la pérdida de información inherente a la reducción de mezclas continuas a etiquetas discretas.

La precisión de FlashDeconv se extiende más allá del CRC: la aplicación a cáncer de ovario humano recupera las diferencias en la composición de los tipos de células entre los grupos de respuesta informadas por Denisenko et al. [^[39]] (Figura suplementaria S21).

El análisis de espacio-escala de Visium HD revela la pérdida de información dependiente de la resolución

Si bien el análisis de CRC anterior demuestra la utilidad práctica de FlashDeconv para el mapeo del microentorno tumoral a escala de atlas a resolución subcelular, la plataforma Visium HD de 8 m plantea una pregunta fundamental más allá de cualquier aplicación biológica específica: ¿a qué resolución comienza a disminuir la información celular? Aprovechamos la eficiencia computacional de FlashDeconv para realizar un análisis sistemático de espacio-escala que sería inviable con los métodos existentes: a 350.000 puntos (resolución de 8 m), los métodos probabilísticos enfrentan barreras prohibitivas: Cell2Location no puede manejar conjuntos de datos de más de ~20.000 puntos [^[13]], y el tiempo de ejecución de Stereoscope de >8 horas en 10.000 puntos [^[12]] se extrapolaría a más de 11 días.

Utilizando datos de Visium HD del intestino delgado de ratón (10x Genomics), deconvolucionamos las proporciones de tipos de células en cinco resoluciones (8, 16, 32, 64 y 128 m) utilizando una referencia de scRNA-seq coincidente [^[40]]. FlashDeconv procesó 351.817 bins a una resolución de 8 m en 12,0 segundos, lo que representa una velocidad de aproximadamente 29.000 bins por segundo en hardware estándar (Fig. 6a). El análisis completo de las cinco resoluciones (366.975 bins en total) requirió solo 14 segundos, lo que permitió una exploración sistemática de la compensación entre resolución e información.

El horizonte de resolución.

Nuestro análisis reveló una transición pronunciada entre una resolución de 8 µm y 16 µm (Fig. 6b). A 8 µm, el 61,5% de los bins estaban dominados por un solo tipo de célula (proporción >80%), lo que es consistente con una pureza casi unicelular. Esta fracción disminuyó a 13,3% a 16 µm, una reducción del 78%, y continuó disminuyendo a 3,9% a 128 µm. La entropía de Shannon normalizada de la mezcla de tipos de células aumentó en consecuencia, de 0,23 a 8 µm a 0,48 a 16 µm. Esta transición representa el límite más allá del cual la identidad celular se ve fundamentalmente oscurecida por el promedio espacial. La transición de 8 a 16 µm observada en el intestino delgado del ratón se reprodujo de forma independiente en el colon del ratón utilizando datos de referencia de Xenium sin deconvolución (Nota suplementaria 4), lo que sugiere que esta escala es una característica robusta del epitelio intestinal. Cabe destacar que esta transición coincide con el diámetro característico de las células epiteliales intestinales (~10-15 µm), lo que es consistente con la intuición geométrica de que el horizonte de resolución se produce cuando los bins de medición pasan de capturar predominantemente células individuales a promediar múltiples células. Para los tejidos con tamaños de célula o patrones de organización espacial sustancialmente diferentes, se esperaría que el horizonte de resolución cambie en consecuencia, lo que destaca que este es un parámetro biofísico dependiente del tejido en lugar de una constante universal.

Los tipos de células exhiben distintas sensibilidades a la resolución.

Diferentes tipos de células mostraron vulnerabilidades marcadamente diferentes a la agregación espacial (Fig. 6c). Las células madre intestinales, localizadas en las bases de las criptas con un tamaño de nicho característico de aproximadamente 10-15 µm, exhibieron la mayor pérdida de información: la autocorrelación espacial (I de Moran) disminuyó en un 70% de 8 µm a 128 µm. En contraste, las células de Paneth, que forman cúmulos estrechos en las bases de las criptas, mostraron solo una pérdida del 17% de la coherencia espacial en el mismo rango de resolución. Estas diferencias reflejan las escalas espaciales características de la organización tisular de cada tipo de célula.

Validación mediante el análisis del límite cripta-villo.

Para confirmar que los efectos de resolución observados reflejan una estructura biológica genuina, analizamos la nitidez de los límites cripta-villo, la zona de transición entre las criptas ricas en células de Paneth y los vellos cubiertos de enterocitos (Fig. 6d). Trazamos 100 trayectorias lineales desde los núcleos de las criptas (Paneth >50%) hasta las regiones de los vellos (enterocito >70%) y calculamos el gradiente máximo de la proporción de enterocitos a lo largo de cada trayectoria. A 8 µm, la nitidez media del gradiente fue de 0,036 ± 0,029. A 16 µm, esto disminuyó a 0,008 ± 0,003, una reducción del 77% en la definición del límite. A 32 µm y a resoluciones más bajas, los núcleos de las criptas que cumplían nuestros criterios ya no pudieron identificarse. Este análisis cuantitativo del límite confirma que la pérdida de información corresponde a un desenfoque anatómico en lugar de artefactos algorítmicos.

El agrupamiento grueso induce una colocalización espuria.

Más allá de la pérdida de señal, la agregación espacial puede distorsionar fundamentalmente la inferencia de las relaciones célula-célula (Fig. 6e). Las células de Paneth y las células caliciformes son ambos tipos de epitelio secretor, pero ocupan nichos espaciales distintos: las células de Paneth residen exclusivamente en las bases de las criptas, mientras que las células caliciformes se distribuyen a lo largo del eje cripta-villo. A una resolución de 8 µm, esta segregación espacial se manifiesta como una débil correlación negativa (r = -0,12, p < 10-100, N = 351.817), lo que refleja su exclusión mutua a escala celular. Sin embargo, a medida que la resolución disminuye, ambos tipos de células se mezclan dentro de los mismos bins de medición, lo que induce una correlación positiva espuria que alcanza su punto máximo a 64 µm (r = +0,80). Este cambio de signo de la correlación, de negativo a positivo, representa una inversión cualitativa en la relación aparente célula-célula, un ejemplo a escala de tejido del problema de la unidad areal modificable (MAUP) de la estadística espacial [^[41]], que se ha destacado recientemente en el contexto de la transcriptómica espacial [^[42]]. El mecanismo es geométrico: a alta resolución, las poblaciones celulares adyacentes pero distintas se resuelven por separado, pero a medida que el tamaño del bin aumenta más allá de las dimensiones físicas de las células, se promedian en la misma unidad de medición y aparecen artificialmente colocalizadas. Los investigadores que analicen datos a la resolución convencional de Visium (55 µm) observarían una fuerte colocalización y podrían concluir erróneamente que las células de Paneth y las células caliciformes comparten un microentorno común o responden a las mismas señales espaciales. Para confirmar que este fenómeno refleja la geometría espacial en lugar de la metodología de deconvolución, realizamos una validación de datos de referencia utilizando la secuenciación in situ de Xenium de colon de ratón, donde se conocen las posiciones exactas de las células sin deconvolución. Los propios datos de referencia exhiben el mismo patrón: los cúmulos celulares adyacentes pero distintos muestran una correlación negativa a 8 µm (r = -0,06) pero una fuerte correlación positiva a 128 µm (r = +0,68), lo que confirma que la inversión del signo observada refleja la geometría del tejido en lugar de la escasez de datos o la metodología de deconvolución (Nota suplementaria 4; Fig. S15). La capacidad de FlashDeconv para procesar datos de alta resolución de forma eficiente permite la detección de estos artefactos dependientes de la resolución, revelando la verdadera organización espacial que el agrupamiento grueso oscurece.

Las puntuaciones de influencia explican la preservación de las señales de las células raras.

Para verificar la conexión mecánica entre el diseño matemático de FlashDeconv y los hallazgos biológicos anteriores, confirmamos que los genes marcadores de los tipos de células clave exhiben altas puntuaciones de influencia en la referencia intestinal (Fig. S14). El marcador canónico de las células madre, Lgr5, se encuentra entre el 1% superior por influencia (rango n.º 283 de 27.998 genes), a pesar de que solo se encuentra entre el 10% superior por varianza. En general, los marcadores de las células madre tienen una puntuación de influencia media en el percentil 95, con 5 de 6 marcadores en el 5% superior. Esto confirma que la detección del nicho de células madre a 8 µm demostrada anteriormente es una consecuencia directa del esbozo ponderado por la influencia: las señales de los tipos de células raras se conservan durante la reducción de la dimensionalidad precisamente porque sus marcadores definen direcciones únicas en el espacio de expresión génica, independientemente de su magnitud de expresión general.

FlashDeconv resuelve el nicho quimiosensorial Tuft-Stem.

Más allá de la validación de la preservación de los marcadores, FlashDeconv permitió la cuantificación a resolución de nicho de la colocalización de tipos de células directamente a partir de la transcriptómica espacial basada en la captura, recuperando una arquitectura espacial consistente con la biología conocida de las células Tuft [^[43], ^[44]] a través de la deconvolución de plataformas basadas en la secuenciación sin necesidad de segmentación celular basada en imágenes. Las células Tuft (células ciliadas), células epiteliales quimiosensoriales raras que comprenden solo el 0,4-2% del epitelio intestinal [^[45]], exhibieron la mayor "ceguera de los genes altamente variables" (HVG) entre todos los tipos de células en nuestro análisis (Fig. 7a): sus genes marcadores (incluidos Pik3r5, Ptgs1) se clasifican 21 puntos porcentuales más bajo según la selección basada en la varianza que según la clasificación basada en la influencia, lo que las coloca en el mayor riesgo de ser descartadas por las canalizaciones de selección de características estándar. A una resolución de 8 µm, FlashDeconv identificó 2.244 nichos de células Tuft focales con proporciones que alcanzaron el 61%, es decir, puntos de células Tuft casi puros (Fig. 7b). Estos nichos exhibieron un patrón espacial sorprendente: un enriquecimiento de 15,3 veces para las células madre intestinales y un enriquecimiento de 14,0 veces para las células enteroendocrinas (Fig. 7c, e). Por el contrario, los tipos de células diferenciadas se agotaron en gran medida: enterocitos (0,11×), células caliciformes (0,10×) y células de Paneth (0,22×), todos significativamente no aleatorios (prueba de permutación, p < 10-4, n = 10.000). Esta colocalización de Tuft-Stem es anatómica y es consistente con la localización conocida de las células Tuft cerca de la zona de las células madre intestinales en la base de las criptas [^[43], ^[44]] y su capacidad recientemente descubierta para funcionar como células madre de reserva tras una lesión epitelial [^[46]]. Cabe destacar que el análisis exploratorio de ligandos y receptores reveló que Il17ra, que codifica una subunidad del receptor de IL-25 a través del cual las células Tuft señalan a las células vecinas [^[47]], se expresa 7 veces más en los nichos Tuft-Stem que en el tejido de fondo (Fig. S20), lo que sugiere que esta proximidad espacial puede facilitar la comunicación paracrina. La validación del modelo nulo confirma que esta señal es biológica y no un artefacto: conjuntos de genes marcadores independientes muestran patrones espaciales consistentes (r = 0,30, p < 10-200), la colocalización es específica de las células madre (no aleatoria) y la distribución de las células Tuft exhibe una autocorrelación espacial significativa (I de Moran = 0,44 frente a la línea de base aleatoria ~0), y la proximidad Tuft-Stem se recapitula directamente en la expresión génica sin deconvolución (Pou2f3–Lgr5 enriquecimiento de vecinos, p < 0,001; Nota suplementaria 6, Fig. S19). La capacidad de FlashDeconv para procesar datos de alta resolución de forma eficiente permite la detección de estos artefactos dependientes de la resolución, revelando la verdadera organización espacial que el agrupamiento grueso oscurece.

Las puntuaciones de influencia explican la preservación de las señales de las células raras.

Para verificar la conexión mecánica entre el diseño matemático de FlashDeconv y los hallazgos biológicos anteriores, confirmamos que los genes marcadores de los tipos de células clave exhiben altas puntuaciones de influencia en la referencia intestinal (Fig. S14). El marcador canónico de las células madre, Lgr5, se encuentra entre el 1% superior por influencia (rango n.º 283 de 27.998 genes), a pesar de que solo se encuentra entre el 10% superior por varianza. En general, los marcadores de las células madre tienen una puntuación de influencia media en el percentil 95, con 5 de 6 marcadores en el 5% superior. Esto confirma que la detección del nicho de células madre a 8 µm demostrada anteriormente es una consecuencia directa del esbozo ponderado por la influencia: las señales de los tipos de células raras se conservan durante la reducción de la dimensionalidad precisamente porque sus marcadores definen direcciones únicas en el espacio de expresión génica, independientemente de su magnitud de expresión general.

FlashDeconv resuelve el nicho quimiosensorial Tuft-Stem.

Más allá de la validación de la preservación de los marcadores, FlashDeconv permitió la cuantificación a resolución de nicho de la colocalización de tipos de células directamente a partir de la transcriptómica espacial basada en la captura, recuperando una arquitectura espacial consistente con la biología conocida de las células Tuft [^[43], ^[44]] a través de la deconvolución de plataformas basadas en la secuenciación sin necesidad de segmentación celular basada en imágenes. Las células Tuft (células ciliadas), células epiteliales quimiosensoriales raras que comprenden solo el 0,4-2% del epitelio intestinal [^[45]], exhibieron la mayor "ceguera de los genes altamente variables" (HVG) entre todos los tipos de células en nuestro análisis (Fig. 7a): sus genes marcadores (incluidos Pik3r5, Ptgs1) se clasifican 21 puntos porcentuales más bajo según la selección basada en la varianza que según la clasificación basada en la influencia, lo que las coloca en el mayor riesgo de ser descartadas por las canalizaciones de selección de características estándar. A una resolución de 8 µm, FlashDeconv identificó 2.244 nichos de células Tuft focales con proporciones que alcanzaron el 61%, es decir, puntos de células Tuft casi puros (Fig. 7b). Estos nichos exhibieron un patrón espacial sorprendente: un enriquecimiento de 15,3 veces para las células madre intestinales y un enriquecimiento de 14,0 veces para las células enteroendocrinas (Fig. 7c, e). Por el contrario, los tipos de células diferenciadas se agotaron en gran medida: enterocitos (0,11×), células caliciformes (0,10×) y células de Paneth (0,22×), todos significativamente no aleatorios (prueba de permutación, p < 10-4, n = 10.000). Esta colocalización de Tuft-Stem es anatómica y es consistente con la localización conocida de las células Tuft cerca de la zona de las células madre intestinales en la base de las criptas [^[43], ^[44]] y su capacidad recientemente descubierta para funcionar como células madre de reserva tras una lesión epitelial [^[46]]. Cabe destacar que el análisis exploratorio de ligandos y receptores reveló que Il17ra, que codifica una subunidad del receptor de IL-25 a través del cual las células Tuft señalan a las células vecinas [^[47]], se expresa 7 veces más en los nichos Tuft-Stem que en el tejido de fondo (Fig. S20), lo que sugiere que esta proximidad espacial puede facilitar la comunicación paracrina. La validación del modelo nulo confirma que esta señal es biológica y no un artefacto: conjuntos de genes marcadores independientes muestran patrones espaciales consistentes (r = 0,30, p < 10-200), la colocalización es específica de las células madre (no aleatoria) y la distribución de las células Tuft exhibe una autocorrelación espacial significativa (I de Moran = 0,44 frente a la línea de base aleatoria ~0), y la proximidad Tuft-Stem se recapitula directamente en la expresión génica sin deconvolución (Pou2f3–Lgr5 enriquecimiento de vecinos, p < 0,001; Nota suplementaria 6, Fig. S19). La capacidad de FlashDeconv para procesar datos de alta resolución de forma eficiente permite la detección de estos artefactos dependientes de la resolución, revelando la verdadera organización espacial que el agrupamiento grueso oscurece.

Comparación entre métodos confirma la arquitectura del nicho.

Para evaluar si esta arquitectura espacial refleja una biología tisular genuina o es específica del diseño de FlashDeconv, aplicamos RCTD, un método basado en la probabilidad que trata cada punto de forma independiente, al mismo tejido a 16 µm de resolución, la escala más fina en la que la inferencia por punto de RCTD sigue siendo práctica en este tejido (10.952 puntos; 8 µm requeriría >350.000 regresiones independientes). Ambos métodos detectaron un enriquecimiento de las células madre en los puntos calientes de las células Tuft, lo que confirma que el nicho refleja la arquitectura del tejido en lugar de un artefacto de regularización. Sin embargo, FlashDeconv produjo asignaciones marcadamente más coherentes espacialmente, consolidando la señal de las células Tuft en 9 clústeres frente a 168 fragmentos dispersos para RCTD, con un enriquecimiento de 7,7 veces de las células madre en los puntos calientes en comparación con 3,0 veces (Fig. S24). Esta diferencia refleja en parte la regularización del laplaciano del grafo de FlashDeconv, que toma prestada información de los vecinos espaciales para hacer cumplir la continuidad local. Para verificar que esta coherencia corresponde a una biología genuina en lugar de un sobreajuste, examinamos Il17ra, que codifica una subunidad del receptor de IL-25 crítico para la señalización paracrina Tuft-Stem [^[47]], como un resultado funcional independiente de ambos métodos de deconvolución. Las zonas de nicho definidas por FlashDeconv mostraron un enriquecimiento de 5,2 veces de Il17ra sobre el fondo frente a 1,5 veces para las zonas definidas por RCTD, lo que indica que las asignaciones espacialmente coherentes delinean con mayor precisión los microentornos de señalización funcional (Nota suplementaria 8).

El horizonte de resolución.

Nuestro análisis reveló una transición pronunciada entre una resolución de 8 µm y 16 µm (Fig. 6b). A 8 µm, el 61,5% de los bins estaban dominados por un solo tipo de célula (proporción >80%), lo que es consistente con una pureza casi unicelular. Esta fracción disminuyó a 13,3% a 16 µm, una reducción del 78%, y continuó disminuyendo a 3,9% a 128 µm. La entropía de Shannon normalizada de la mezcla de tipos celulares aumentó en consecuencia, de 0,23 a 8 µm a 0,48 a 16 µm. Esta transición representa el límite más allá del cual la identidad celular se ve fundamentalmente oscurecida por el promedio espacial. La transición de 8 a 16 µm observada en el intestino delgado del ratón se reprodujo de forma independiente en el colon del ratón utilizando datos de referencia de Xenium sin deconvolución (Nota suplementaria 4), lo que sugiere que esta escala es una característica robusta del epitelio intestinal. Cabe destacar que esta transición coincide con el diámetro característico de las células epiteliales intestinales (~10-15 µm), lo que es consistente con la intuición geométrica de que el horizonte de resolución se produce cuando los bins de medición pasan de capturar predominantemente células individuales a promediar múltiples células. Para los tejidos con tamaños celulares o patrones de organización espacial sustancialmente diferentes, se esperaría que el horizonte de resolución se desplazara en consecuencia, lo que destaca que este es un parámetro biofísico dependiente del tejido en lugar de una constante universal.

Los tipos de células exhiben distintas sensibilidades a la resolución.

Diferentes tipos de células mostraron vulnerabilidades marcadamente diferentes a la agregación espacial (Fig. 6c). Las células madre intestinales, localizadas en las bases de las criptas con un tamaño de nicho característico de aproximadamente 10-15 µm, exhibieron la mayor pérdida de información: la autocorrelación espacial (Índice de Moran) disminuyó en un 70% de 8 µm a 128 µm. En contraste, las células de Paneth, que forman cúmulos estrechos en las bases de las criptas, mostraron solo una pérdida del 17% de la coherencia espacial en el mismo rango de resolución. Estas diferencias reflejan las escalas espaciales características de la organización tisular de cada tipo de célula.

Validación mediante el análisis del límite cripta-villo.

Para confirmar que los efectos de resolución observados reflejan una estructura biológica genuina, analizamos la nitidez de los límites cripta-villo, la zona de transición entre las criptas ricas en células de Paneth y los vellos cubiertos de enterocitos (Fig. 6d). Trazamos 100 trayectorias lineales desde los núcleos de las criptas (Paneth >50%) hasta las regiones de los vellos (enterocito >70%) y calculamos el gradiente máximo de la proporción de enterocitos a lo largo de cada trayectoria. A 8 µm, la nitidez media del gradiente fue de 0,036 ± 0,029. A 16 µm, esto disminuyó a 0,008 ± 0,003, una reducción del 77% en la definición del límite. A 32 µm y a resoluciones más bajas, los núcleos de las criptas que cumplían nuestros criterios ya no pudieron identificarse. Este análisis cuantitativo del límite confirma que la pérdida de información corresponde a un desenfoque anatómico en lugar de artefactos algorítmicos.

El agrupamiento grueso induce una colocalización espuria.

Más allá de la pérdida de señal, la agregación espacial puede distorsionar fundamentalmente la inferencia de las relaciones célula-célula (Fig. 6e). Las células de Paneth y las células caliciformes son ambos tipos de epitelio secretor, pero ocupan nichos espaciales distintos: las células de Paneth residen exclusivamente en las bases de las criptas, mientras que las células caliciformes se distribuyen a lo largo del eje cripta-villo. A una resolución de 8 µm, esta segregación espacial se manifiesta como una débil correlación negativa (r = -0,12, p < 10-100, N = 351.817), lo que refleja su exclusión mutua a escala celular. Sin embargo, a medida que la resolución disminuye, ambos tipos de células se mezclan dentro de los mismos bins de medición, lo que induce una correlación positiva espuria que alcanza su punto máximo a 64 µm (r = +0,80). Este cambio de signo de la correlación, de negativo a positivo, representa una inversión cualitativa en la relación aparente célula-célula, un ejemplo a escala de tejido del problema de la unidad areal modificable (MAUP) de la estadística espacial [^[41]], que se ha destacado recientemente en el contexto de la transcriptómica espacial [^[42]]. El mecanismo es geométrico: a alta resolución, las poblaciones celulares adyacentes pero distintas se resuelven por separado, pero a medida que el tamaño del bin aumenta más allá de las dimensiones físicas de las células, se promedian en la misma unidad de medición y parecen estar artificialmente colocalizadas. Los investigadores que analicen datos a la resolución convencional de Visium (55 µm) observarían una fuerte colocalización y podrían concluir erróneamente que las células de Paneth y las células caliciformes comparten un microambiente común o responden a las mismas señales espaciales. Para confirmar que este fenómeno refleja la geometría espacial en lugar de la metodología de deconvolución, realizamos una validación de datos de referencia utilizando la secuenciación in situ de Xenium en el colon del ratón, donde se conocen las posiciones celulares exactas sin deconvolución. Los propios datos de referencia exhiben el mismo patrón: los cúmulos celulares adyacentes pero distintos muestran una correlación negativa a 8 µm (r = -0,06) pero una fuerte correlación positiva a 128 µm (r = +0,68), lo que confirma que la inversión del signo observada refleja la geometría del tejido en lugar de la escasez de datos o la metodología de deconvolución (Nota suplementaria 4; Fig. S15). La capacidad de FlashDeconv para procesar datos de alta resolución de manera eficiente permite la detección de estos artefactos dependientes de la resolución, revelando la verdadera organización espacial que el agrupamiento grueso oscurece.

Las puntuaciones de influencia explican la preservación de las señales de las células raras.

Para verificar la conexión mecánica entre el diseño matemático de FlashDeconv y los hallazgos biológicos anteriores, confirmamos que los genes marcadores de los tipos celulares clave exhiben altas puntuaciones de influencia en la referencia del intestino (Fig. S14). El marcador canónico de las células madre Lgr5 se clasifica en el 1% superior por influencia (rango #283 de 27.998 genes), a pesar de que solo se clasifica en el 10% superior por varianza. En general, los marcadores de las células madre tienen una puntuación de influencia promedio en el percentil 95, con 5 de 6 marcadores en el 5% superior. Esto confirma que la detección del nicho de células madre a 8 µm demostrada anteriormente es una consecuencia directa del bocetaje ponderado por influencia: las señales de los tipos celulares raros se conservan durante la reducción de dimensionalidad precisamente porque sus marcadores definen direcciones únicas en el espacio de expresión génica, independientemente de su magnitud de expresión general.

FlashDeconv resuelve el nicho quimiosensorial Tuft-Stem.

Más allá de la validación de la preservación de los marcadores, FlashDeconv permitió la cuantificación a resolución de nicho de la colocalización de tipos celulares directamente a partir de la transcriptómica espacial basada en la captura, recuperando una arquitectura espacial consistente con la biología conocida de las células Tuft [^[43], ^[44]] mediante la deconvolución de plataformas basadas en la secuenciación sin requerir la segmentación celular basada en imágenes. Las células Tuft (células ciliadas), células epiteliales quimiosensoriales raras que comprenden solo el ~0,4-2% del epitelio intestinal [^[45]], exhibieron la mayor "ceguera de los genes altamente variables" (HVG) entre todos los tipos de células en nuestro análisis (Fig. 7a): sus genes marcadores (incluidos Pik3r5, Ptgs1) se clasifican 21 puntos porcentuales más bajo bajo la selección basada en la varianza que bajo la clasificación basada en la influencia, lo que las coloca en el mayor riesgo de ser descartadas por las canalizaciones de selección de características estándar. A una resolución de 8 µm, FlashDeconv identificó 2.244 nichos de células Tuft focales con proporciones que alcanzaron el 61%, es decir, puntos de células Tuft casi puros (Fig. 7b). Estos nichos exhibieron un patrón espacial sorprendente: un enriquecimiento de 15,3 veces para las células madre intestinales y un enriquecimiento de 14,0 veces para las células enteroendocrinas (Fig. 7c, e). Por el contrario, los tipos de células diferenciadas se agotaron significativamente: enterocitos (0,11×), células caliciformes (0,10×) y células de Paneth (0,22×), todos significativamente no aleatorios (prueba de permutación, p < 10-4, n = 10.000). Esta colocalización de Tuft-Stem es anatómica y es consistente con la localización conocida de las células Tuft cerca de la zona de las células madre intestinales en la base de las criptas [^[43], ^[44]] y su capacidad recientemente descubierta para funcionar como células madre de reserva después de una lesión epitelial [^[46]]. Cabe destacar que el análisis exploratorio de ligandos y receptores reveló que Il17ra, que codifica una subunidad del receptor IL-25 a través del cual las células Tuft señalan a las células vecinas [^[47]], se expresa 7 veces más en los nichos Tuft-Stem que en el tejido de fondo (Fig. S20), lo que sugiere que esta proximidad espacial puede facilitar la comunicación paracrina. La validación del modelo nulo confirma que esta señal es biológica y no un artefacto: conjuntos de genes marcadores independientes muestran patrones espaciales consistentes (r = 0,30, p < 10-200), la colocalización es específica de las células madre (no de las células aleatorias), la distribución de las células Tuft exhibe una autocorrelación espacial significativa (Índice de Moran = 0,44 frente a la línea de base aleatoria ~0) y la proximidad Tuft-Stem se recapitula directamente en la expresión génica sin deconvolución (Pou2f3–Lgr5 enriquecimiento de vecinos, p < 0,001; Nota suplementaria 6, Fig. S19). La capacidad de FlashDeconv para procesar datos de alta resolución de manera eficiente permite la detección de estos artefactos dependientes de la resolución, revelando la verdadera organización espacial que el agrupamiento grueso oscurece.

Las puntuaciones de influencia explican la preservación de las señales de las células raras.

Para verificar la conexión mecánica entre el diseño matemático de FlashDeconv y los hallazgos biológicos anteriores, confirmamos que los genes marcadores de los tipos celulares clave exhiben altas puntuaciones de influencia en la referencia del intestino (Fig. S14). El marcador canónico de las células madre Lgr5 se clasifica en el 1% superior por influencia (rango #283 de 27.998 genes), a pesar de que solo se clasifica en el 10% superior por varianza. En general, los marcadores de las células madre tienen una puntuación de influencia promedio en el percentil 95, con 5 de 6 marcadores en el 5% superior. Esto confirma que la detección del nicho de células madre a 8 µm demostrada anteriormente es una consecuencia directa del bocetaje ponderado por influencia: las señales de los tipos celulares raros se conservan durante la reducción de dimensionalidad precisamente porque sus marcadores definen direcciones únicas en el espacio de expresión génica, independientemente de su magnitud de expresión general.

FlashDeconv resuelve el nicho quimiosensorial Tuft-Stem.

Más allá de la validación de la preservación de los marcadores, FlashDeconv permitió la cuantificación a resolución de nicho de la colocalización de tipos celulares directamente a partir de la transcriptómica espacial basada en la captura, recuperando una arquitectura espacial consistente con la biología conocida de las células Tuft [^[43], ^[44]] mediante la deconvolución de plataformas basadas en la secuenciación sin requerir la segmentación celular basada en imágenes. Las células Tuft (células ciliadas), células epiteliales quimiosensoriales raras que comprenden solo el ~0,4-2% del epitelio intestinal [^[45]], exhibieron la mayor "ceguera de los genes altamente variables" (HVG) entre todos los tipos de células en nuestro análisis (Fig. 7a): sus genes marcadores (incluidos Pik3r5, Ptgs1) se clasifican 21 puntos porcentuales más bajo bajo la selección basada en la varianza que bajo la clasificación basada en la influencia, lo que las coloca en el mayor riesgo de ser descartadas por las canalizaciones de selección de características estándar. A una resolución de 8 µm, FlashDeconv identificó 2.244 nichos de células Tuft focales con proporciones que alcanzaron el 61%, es decir, puntos de células Tuft casi puros (Fig. 7b). Estos nichos exhibieron un patrón espacial sorprendente: un enriquecimiento de 15,3 veces para las células madre intestinales y un enriquecimiento de 14,0 veces para las células enteroendocrinas (Fig. 7c, e). Por el contrario, los tipos de células diferenciadas se agotaron significativamente: enterocitos (0,11×), células caliciformes (0,10×) y células de Paneth (0,22×), todos significativamente no aleatorios (prueba de permutación, p < 10-4, n = 10.000). Esta colocalización de Tuft-Stem es anatómica y es consistente con la localización conocida de las células Tuft cerca de la zona de las células madre intestinales en la base de las criptas [^[43], ^[44]] y su capacidad recientemente descubierta para funcionar como células madre de reserva después de una lesión epitelial [^[46]]. Cabe destacar que el análisis exploratorio de ligandos y receptores reveló que Il17ra, que codifica una subunidad del receptor IL-25 a través del cual las células Tuft señalan a las células vecinas [^[47]], se expresa 7 veces más en los nichos Tuft-Stem que en el tejido de fondo (Fig. S20), lo que sugiere que esta proximidad espacial puede facilitar la comunicación paracrina. La validación del modelo nulo confirma que esta señal es biológica y no un artefacto: conjuntos de genes marcadores independientes muestran patrones espaciales consistentes (r = 0,30, p < 10-200), la colocalización es específica de las células madre (no de las células aleatorias), la distribución de las células Tuft exhibe una autocorrelación espacial significativa (Índice de Moran = 0,44 frente a la línea de base aleatoria ~0) y la proximidad Tuft-Stem se recapitula directamente en la expresión génica sin deconvolución (Pou2f3–Lgr5 enriquecimiento de vecinos, p < 0,001; Nota suplementaria 6, Fig. S19). La capacidad de FlashDeconv para procesar datos de alta resolución de manera eficiente permite la detección de estos artefactos dependientes de la resolución, revelando la verdadera organización espacial que el agrupamiento grueso oscurece.

Comparación entre métodos confirma la arquitectura del nicho.

Para evaluar si esta arquitectura espacial refleja una biología tisular genuina o es específica del diseño de FlashDeconv, aplicamos RCTD, un método basado en la probabilidad que trata cada punto de forma independiente, al mismo tejido a 16 µm de resolución, la escala más fina en la que la inferencia por punto de RCTD sigue siendo práctica en este tejido (10.952 puntos; 8 µm requeriría >350.000 regresiones independientes). Ambos métodos detectaron un enriquecimiento de las células madre en los puntos calientes de las células Tuft, lo que confirma que el nicho refleja la arquitectura del tejido en lugar de un artefacto de regularización. Sin embargo, FlashDeconv produjo asignaciones marcadamente más coherentes espacialmente, consolidando la señal de las células Tuft en 9 cúmulos frente a 168 fragmentos dispersos para RCTD, con un enriquecimiento de 7,7 veces de las células madre en los puntos calientes en comparación con 3,0 veces (Fig. S24). Esta diferencia refleja en parte la regularización del Laplaciano del grafo de FlashDeconv, que toma prestada información de los vecinos espaciales para hacer cumplir la continuidad local. Para verificar que esta coherencia corresponde a una biología genuina en lugar de un sobreajuste, examinamos Il17ra, que codifica una subunidad del receptor IL-25 crítico para la señalización paracrina Tuft-Stem [^[47]], como un resultado funcional independiente de ambos métodos de deconvolución. Las zonas de nicho definidas por FlashDeconv mostraron un enriquecimiento de 5,2 veces de Il17ra sobre el fondo frente a 1,5 veces para las zonas definidas por RCTD, lo que indica que las asignaciones espacialmente coherentes delinean con mayor precisión los microambientes de señalización funcional (Nota suplementaria 8).

Discusión

En este estudio, presentamos FlashDeconv, un marco de deconvolución diseñado para la transcriptómica espacial a escala de atlas. Al combinar el muestreo de importancia basado en la puntuación de influencia con la regularización de grafos dispersos, FlashDeconv logra una precisión comparable a la de los métodos probabilísticos, al tiempo que reduce el costo computacional en órdenes de magnitud. El concepto de influencia estadística se origina en los diagnósticos de regresión, donde cuantifica la influencia de las observaciones individuales en los modelos ajustados, y posteriormente se demostró que permite una aproximación eficiente de matrices mediante el muestreo de importancia en el álgebra lineal numérica aleatoria [^[48], ^[49]]. En la biología de una sola célula, el muestreo basado en la influencia se ha aplicado para submuestrear células, preservando al mismo tiempo las poblaciones raras [^[50], ^[51]]. En el espacio genético, las puntuaciones de influencia se han utilizado para la identificación de características mediante la descomposición CUR [^[52]] y para la selección de variables en la transcriptómica espacial [^[53]]. FlashDeconv extiende este principio integrando directamente los pesos de importancia basados en la puntuación de influencia en una proyección aleatoria CountSketch para la deconvolución espacial, abordando el desafío complementario de que la selección de características basada en la varianza descarta sistemáticamente los marcadores de los tipos celulares raros. A pesar de la aleatoriedad inherente al muestreo, FlashDeconv produce resultados altamente reproducibles: en 10 ejecuciones con diferentes semillas aleatorias, las correlaciones de Pearson por pares superaron el 0,98, lo que confirma que los usuarios pueden obtener resultados consistentes sin fijar las semillas aleatorias.

La idea central que subyace a nuestro enfoque es la distinción entre la estructura geométrica y la varianza estadística. Los métodos basados en la varianza, incluidos PCA y la selección de genes con alta variabilidad, confunden la señal biológica con la frecuencia de la población, lo que sistemáticamente reduce el peso de las poblaciones raras, independientemente de su importancia biológica. Las puntuaciones de influencia, en cambio, capturan la contribución de cada gen a la estructura discriminativa entre los tipos celulares, independientemente de la magnitud de la expresión o el tamaño de la población. Nuestros experimentos confirman esta separación: la clasificación basada en la influencia se mantiene estable con cambios de 67 veces en la abundancia del tipo celular, y el conjunto de genes (GOLD) con información estructural muestra un enriquecimiento funcional coherente y una clara organización espacial, mientras que los genes dominados por la varianza (NOISE) carecen de ambos, lo que indica que la alta varianza por sí sola no garantiza la relevancia biológica.

Nuestra elección de la normalización Log-CPM refleja un compromiso de ingeniería más que una afirmación de superioridad estadística. Si bien los residuos de Pearson son estadísticamente válidos para los datos de conteo binomial negativo, Log-CPM proporciona ventajas específicas para el muestreo basado en L2: su norma acotada evita que los genes con alta expresión dominen el espacio comprimido. Esta elección pragmática, combinada con el muestreo ponderado por la influencia, permite que FlashDeconv preserve las señales biológicas esenciales durante la reducción de la dimensionalidad.

Nuestros estudios de caso revelan tres modos de fallo complementarios en la deconvolución espacial que FlashDeconv aborda a través de mecanismos distintos. El conjunto de datos de melanoma representa un desafío en el espacio de características: los estados malignos altamente correlacionados (r > 0,98) a lo largo de un espectro fenotípico continuo crean un problema de regresión mal condicionado. Aquí, NNLS disperso selecciona de forma natural las señales dominantes presentes en el tejido sin requerir una curación manual de referencia, una propiedad particularmente valiosa para el mapeo a escala de atlas, donde la curación exhaustiva de la referencia es poco práctica. El conjunto de datos de intestino de ratón Visium HD representa un desafío en el espacio de la señal: con una resolución de 8 m y conteos dispersos, los marcadores de células raras corren el riesgo de descartarse durante la reducción de la dimensionalidad. El muestreo ponderado por la influencia preserva estas señales geométricamente distintas, lo que permite la detección del nicho quimiosensorial Tuft-Stem: una arquitectura espacial que requiere tanto la selección de características consciente de los marcadores raros como una resolución inferior a 16 m para su resolución. La comparación entre métodos con RCTD confirma que cualquiera de los dos enfoques puede detectar el nicho, pero destaca el papel de la regularización espacial en la resolución de la arquitectura del nicho: los métodos independientes de los puntos que tratan cada ubicación de forma aislada dispersan la señal en todo el tejido, lo que produce zonas de nicho con un enriquecimiento más débil del gen de señalización parácrina Il17ra que las estimaciones espacialmente regularizadas (Nota complementaria 8). Esta íntima proximidad espacial entre las células Tuft y las células madre intestinales se alinea con los hallazgos recientes de que las células Tuft pueden dediferenciarse en células madre funcionales durante la regeneración [^[46]], lo que sugiere que la arquitectura del nicho que observamos puede facilitar tanto la señalización parácrina como la interconversión celular directa. Cuantitativamente, nuestras mediciones (un enriquecimiento de 15,3 veces de las células madre dentro de los focos de células Tuft a una resolución de ~10–15 m) son consistentes con los estudios de trazado de linaje e imagen que localizan las células Tuft en el compartimento de la base del cripto positivo para Lgr5 [^[43], ^[44]] y con el rango espacial requerido para la señalización parácrina de IL-25 [^[47]]. La contribución de FlashDeconv aquí no es el descubrimiento de esta proximidad per se, sino su caracterización cuantitativa a partir de la transcriptómica espacial basada en la captura, recuperando una arquitectura espacial a la que antes solo se podía acceder mediante la imagen o el trazado de linaje, y demostrando que requiere una resolución inferior a 16 m para su resolución.

El análisis de CRC Visium HD revela un tercer desafío específico de las plataformas subcelulares: los métodos basados en la clasificación que asignan a cada bin una etiqueta de tipo celular discreta fallan cuando los bins de medición contienen mRNA mixto de múltiples células. Incluso el modo de dobletes de RCTD, que permite hasta dos tipos de células por bin, clasifica solo el 46–59 % de los bins como singletes y rechaza directamente el 5–7 %, porque las etiquetas discretas no pueden capturar la mezcla continua inherente a una resolución de 8 m. El marco de regresión de FlashDeconv logra una cobertura del 100 % de los bins con proporciones continuas, y la validación independiente de los genes marcadores confirma la precisión en más del 86 % de las asignaciones disputadas. La importancia biológica de esta brecha de cobertura se ilustra con el análisis del microdominio de neutrófilos (Fig. 5): RCTD clasifica correctamente solo el 2,3 % de los 16 827 bins de puntos calientes como singletes de neutrófilos, lo que hace que la estructura del nicho organizada (neutrófilos colocalizados con mRegDC inmunorreguladores [^[54]], macrófagos, mastocitos y células endoteliales en sitios estromales vascularizados) sea completamente indetectable. Las consecuencias funcionales de esta arquitectura espacial para la presentación de antígenos y la regulación inmunitaria merecen una mayor investigación (Nota complementaria 9). Esta distinción entre regresión y clasificación se vuelve cada vez más crítica a medida que la transcriptómica espacial avanza hacia la resolución subcelular, donde casi cada unidad de medición captura la señal de múltiples tipos de células. Ningún mecanismo único aborda los tres desafíos; la combinación de compresión que preserva la estructura, la inferencia basada en la señal y la regresión continua de FlashDeconv proporciona robustez en estos modos de fallo cualitativamente diferentes.

Más allá de la precisión, la eficiencia computacional de FlashDeconv permite una exploración sistemática del espacio de escalas. El fenómeno de la pérdida de información dependiente de la resolución al agregar espacialmente (incluida la inversión del signo de la correlación) está bien establecido en la estadística espacial como el problema de la unidad areal modificable (MAUP) [^[41]], y recientemente se ha identificado como relevante para la transcriptómica espacial [^[42]]. Nuestro análisis multirresolución proporciona una cuantificación sistemática y específica del tejido de este efecto en la transcriptómica espacial de alta resolución, identificando lo que llamamos el horizonte de resolución: la escala espacial en la que la segregación biológica colapsa en una mezcla geométrica. La pureza de la señal disminuye drásticamente entre 8 y 16 m, mientras que las correlaciones entre células sufren una inversión de signo (de r = ?0,12 a r = +0,80 a 64 m), según se validó en la verdad fundamental de Xenium. En esencia, el horizonte de resolución es específico del tejido y del tipo celular: las células madre requieren una resolución de 8 m, mientras que las células de Paneth toleran 32 m, una granularidad que no se captura en los tratamientos teóricos previos de MAUP. La escalabilidad lineal de FlashDeconv transforma la selección de la resolución de una elección experimental arbitraria en una determinación basada en los datos.

Nuestra regularización de la laplaciana de grafos dispersos proporciona beneficios dependientes de la cobertura particularmente relevantes para las plataformas de alta resolución emergentes (Nota complementaria). A baja profundidad de secuenciación típica de los bins de 2 m de Visium HD, la regularización espacial mejora la precisión al tomar prestada información de los puntos vecinos, lo que reduce el ruido de muestreo sin introducir un sesgo excesivo. A medida que la transcriptómica espacial se amplía a la resolución subcelular con mediciones cada vez más dispersas, esta regularización adaptativa se vuelve cada vez más importante.

Reconocemos escenarios en los que los enfoques alternativos pueden ser preferibles. Para conjuntos de datos pequeños (