Pérdida de antígenos inducida por IFN en la terapia con células T con receptores quiméricos de antígenos.

La inmunoterapia se ha establecido como el cuarto pilar del tratamiento del cáncer, además de la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia (^[1], ^[2]). El bloqueo de los puntos de control inmunitario (ICB) ha tenido un impacto significativo en los resultados del cáncer de pulmón y el melanoma, pero su eficacia en el cáncer colorrectal (CCR) se limita a un pequeño porcentaje de pacientes con CCR con deficiencia en la reparación del ADN (dMMR) o inestabilidad de microsatélites (MSI) (^[3]–^[5]). Varios activadores de células T bispecíficos (BiTE), que poseen brazos que se unen a los antígenos de superficie de las células cancerosas y a CD3 en las células T, han sido aprobados para tratar los cánceres hematológicos (^[6]–^[8]). Además, las células T que expresan receptores de antígenos quiméricos (CART) aprobadas por la FDA, dirigidas contra CD19 y el antígeno de maduración de células B (BCMA), han mejorado notablemente los resultados de los pacientes con neoplasias hematológicas recurrentes/refráctarias (^[9]–^[11]). Sin embargo, ninguna CART para neoplasias sólidas ha logrado perfiles de eficacia y seguridad en ensayos clínicos que permitan obtener la aprobación de la FDA.

Se han explorado varios antígenos como objetivos para las inmunoterapias CART y BiTE en el CCR (^[12]). El factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2), una tirosina quinasa receptora que se encuentra aguas arriba de muchas vías de señalización tumorigénica, fue uno de los primeros (^[13]). El anticuerpo monoclonal terapéutico (mAb) dirigido a HER2, trastuzumab, tiene un beneficio y un perfil de seguridad bien establecidos en pacientes con cáncer de mama y cáncer gástrico (^[12], ^[14]–^[16]). En 2024, el conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) trastuzumab-deruxtican fue aprobado para los tumores sólidos con amplificación de HER2, incluido el CCR (^[17], ^[18]). Si bien Her2CART ha producido toxicidad grave en pacientes (^[19]), sigue siendo un foco de investigación muy activo para el CCR CART, con el objetivo de ajustar la afinidad del CAR para dirigirse a las células tumorales HER2 altas y preservar los tejidos normales HER2 bajos (^[20]–^[22]) o emplear CARs inducidos por hipoxia, una estrategia clínicamente validada (^[23]) para preservar los tejidos normales que expresan HER2 (^[24]). Otro objetivo prometedor que se está investigando clínicamente es la cadherina-17 (CDH17). Este antígeno de unión celular descubierto recientemente está organizado de forma diferente en los tejidos normales y tumorales, lo que permite que la CART dirigida a CDH17 (CDH17CART) sea segura y eficaz en modelos preclínicos (^[25]). Actualmente, CDH17CART se está evaluando en un ensayo clínico de fase I/II (NCT06055439) en pacientes con CCR. Además, la guanilato ciclasa C (GUCY2C) es un antígeno bien establecido para las inmunoterapias del CCR. De hecho, un ensayo clínico de fase I estableció la seguridad y la inmunogenicidad de la vacunación basada en adenovirus GUCY2C en pacientes con CCR en etapa temprana (^[26]). Se desarrolló un BiTE específico para GUCY2C por Pfizer y se avanzó a la fase de pruebas clínicas (^[27]). Además, hemos diseñado CART dirigida a GUCY2C (GucyCART), que tiene perfiles de seguridad y eficacia prometedores en modelos preclínicos con alta expresión de antígeno (^[28]–^[30]). Las terapias CART dirigidas a GUCY2C se han aplicado a pacientes en China y los EE. UU. con resultados mixtos en cuanto a seguridad y eficacia (^[31]–^[34]).

El fracaso de la CART en tumores sólidos puede reflejar múltiples factores, incluida la mala expansión, persistencia y migración tumoral de la CART, así como la heterogeneidad y la evasión del antígeno. De hecho, la evasión del antígeno, que se refiere a la pérdida parcial o completa del antígeno después del tratamiento, es una limitación conocida de la terapia CART en pacientes. Aproximadamente del 30 al 70% de los pacientes han presentado evasión del antígeno en múltiples estudios después de la terapia CART dirigida a CD19 o BCMA (^[35]–^[40]). De manera similar, se ha observado evasión del antígeno en múltiples ensayos clínicos de CART para neoplasias sólidas, incluidos aquellos dirigidos a EGFRvIII (^[41]), IL13Rα2 (^[42]), mesotelina (^[43]) y HER2 (^[20]). Es importante destacar que todos los mecanismos conocidos de pérdida de antígeno, incluida la mutación genética, la pérdida alélica y el empalme alternativo del ARNm, dependen de la selección directa y/o la presión de supervivencia ejercida por la CART (^[35], ^[36], ^[38], ^[40]). En contraste, aquí identificamos una inducción inesperada de la pérdida de antígeno GUCY2C, CDH17 y HER2 en las células CCR vecinas, mediada por IFNγ y la señalización canónica de IFNγR/JAK, pero no por otras citocinas derivadas de la CART. La pérdida de antígeno reflejó la inducción de señales de estrés por IFNγ, que podría revertirse mediante la focalización farmacológica del estrés. En conjunto, estos estudios identifican un posible mecanismo subyacente al fracaso de la CART en tumores sólidos, que, en contraste con la pérdida genética del antígeno, podría revertirse mediante una terapia combinada dirigida.

Resultados

GucyCART induce la pérdida de GUCY2C en múltiples líneas celulares de CCR

Estudios previos demostraron que GucyCART trata eficazmente los tumores de CCR intraperitoneales establecidos en ratones con células T84 que expresan abundante GUCY2C (^[28]–^[30]). Sin embargo, en modelos intraperitoneales de tumores LS174T y LoVo, que expresan niveles más bajos de ARNm de GUCY2C (Figura 1A) y proteína (Figura 1B), GucyCART tiene una eficacia limitada (Figura 1C). In vitro, GucyCART lisa todas las líneas celulares con expresión moderada y baja de antígeno (Figuras 2A, B). Sin embargo, en consonancia con el fracaso in vivo en los modelos LS174T y LoVo (Figura 1C), observamos una citólisis lenta e incompleta a bajas proporciones efector-a-objetivo (E:T) (Figura 2B). Por lo tanto, hipotetizamos que el fracaso in vitro e in vivo puede reflejar la selección de variantes con pérdida de GUCY2C. De hecho, las células de CCR que persistieron después de la citólisis tenían niveles sustancialmente más bajos de ARNm y proteína de GUCY2C (Figuras 2C, D).

La pérdida de GUCY2C se produce en las células CCR vecinas

La literatura previa sobre los mecanismos de pérdida de antígeno inducida por CART sugiere que la pérdida de antígeno depende de que las células CART entren en contacto directo con las células tumorales para imponer la selección y/o la presión de supervivencia (^[35], ^[36], ^[38], ^[40]). Inicialmente, hipotetizamos que la pérdida de GUCY2C inducida por GucyCART depende del contacto de la CART con las células de CCR. Por lo tanto, el tratamiento de las células de CCR con medios acondicionados por las células GucyCART activadas no debería afectar la expresión de GUCY2C (Figura 3A). Inesperadamente, los niveles de proteína GUCY2C se redujeron drásticamente mediante los medios acondicionados de los cocultivos de CCR + GucyCART (Figura 3B). Los niveles de ARNm de GUCY2C también se redujeron significativamente en las células LS174T y SKCO1, pero no en LoVo, que tiene niveles muy bajos de ARNm de GUCY2C en la línea de base (Figura 3C). Para determinar si esta reducción refleja un producto generalizable de las células T humanas activadas, en lugar de un producto de las células cancerosas que mueren o la activación del antígeno de GucyCART, probamos los medios acondicionados de las células T humanas activadas con cuentas conjugadas con anticuerpos anti-CD2/CD3/CD28 que carecen de un CAR (Figura 3D). De hecho, los niveles de proteína (Figura 3E) y ARNm (Figura 3F) de GUCY2C en las tres líneas celulares de CCR se redujeron sustancialmente mediante los medios de las células T humanas activadas.

La pérdida de GUCY2C está mediada por el eje de señalización IFNγR-JAK-STAT1

Para investigar más a fondo el mecanismo de la pérdida de GUCY2C, empleamos estrategias de detección de citocinas, anticuerpos bloqueantes, farmacológicas y de eliminación genética (Figura 4A). La lista de candidatos de citocinas secretadas por las células T activadas cuyos receptores se expresan en las líneas celulares de CCR incluyó GM-CSF, TNFα, IL-8, MIP-1α, MIP-1β e IFNγ. Solo IFNγ replicó el efecto de GucyCART y redujo la proteína GUCY2C total (Figura 4B) y la expresión superficial de GUCY2C (Figura suplementaria 1). El receptor de IFNγ (IFNγR) es un heterodímero de IFNGR1 e IFNGR2 (^[44]). Tras la unión de IFNγ, IFNGR1 e IFNGR2 se dimerizan, lo que conduce a la transfosforilación de JAK1 y JAK2, dos quinasas Janus asociadas con los IFNGR (^[45], ^[46]). Las JAK1 y JAK2 fosforiladas pueden entonces fosforilar STAT1 (pSTAT1), que se dimeriza y se traslada al núcleo para regular la expresión génica (^[47]). Uno de los genes regulado al alza por STAT1 fosforilada es el propio STAT1, lo que crea un bucle de retroalimentación positiva. Como se esperaba, el tratamiento de las células LS174T con IFNγ o medios acondicionados por células T indujo la fosforilación de STAT1 (Figuras 4C, D), el aumento de la STAT1 total (Figura suplementaria 2) y la pérdida de GUCY2C (Figuras 4C, D). Además, los anticuerpos neutralizantes de IFNγ bloquearon la fosforilación de STAT1 y el aumento de la STAT1 total, así como previnieron la pérdida de GUCY2C inducida por los medios acondicionados (Figura 4D; Figura suplementaria 2B). Para confirmar el papel de JAK1/2 en la pérdida de GUCY2C, empleamos el inhibidor de JAK1/2 bien establecido (^[48], ^[49]) ruxolitinib (Figura 4E) y la eliminación mediada por CRISPR-Cas9 de JAK1/2 (Figura 4F; Figura suplementaria 3). De hecho, la suplementación de los medios acondicionados por células T con ruxolitinib previno la fosforilación de STAT1 y la pérdida de GUCY2C (Figura 4E). La eliminación por CRISPR-Cas9 redujo las proteínas JAK1/2 ≥70% (Figura suplementaria 3), redujo la fosforilación de STAT1 >80% (Figura 4F) y restauró GUCY2C en presencia de medios acondicionados por células T (Figura 4F). En conjunto, estos datos demostraron que IFNγ es necesario y suficiente para reducir los niveles de GUCY2C en presencia de células GucyCART activadas, mediado por el eje de señalización IFNγR-JAK1/2.

La pérdida de GUCY2C inducida por IFNγ está mediada por la señalización del estrés celular

Para comprender cómo la señalización IFNγR-JAK induce la pérdida de GUCY2C, realizamos análisis transcriptómicos de las células LS174T en presencia de medios de control o medios acondicionados por CART, confirmando la regulación al alza esperada de la respuesta de IFNγ y otras vías relacionadas con las citocinas efectoras, como IFNα, IL-6-JAK-STAT y TNFα (Figura 5A). Además, encontramos que la vía de la respuesta al estrés del retículo endoplásmico (UPR) también se reguló al alza significativamente (Figura 5A). La UPR es un mecanismo crucial de señalización celular que puede regular la producción de proteínas cuando las células están bajo estrés inflamatorio (^[50]–^[53]). En general, cuando las proteínas mal plegadas y desplegadas se acumulan en el retículo endoplásmico (RE) para causar estrés en el RE, estas proteínas mal plegadas y desplegadas compiten con HSPA5 para unirse a tres proteínas sensoras bien definidas: la enzima 1 que requiere inositol (ERN1), el factor de transcripción 6 activador (ATF6) y la quinasa similar a la proteína quinasa del RE (PERK) (^[52], ^[54]). Estas proteínas sensoras activan las vías de señalización descendentes que involucran a ATF4, la proteína de unión al elemento de respuesta de la secuencia CCAAAT/amplificador (C/EBPγ) y la proteína homóloga a C/EBP (CHOP) para restaurar las funciones normales del RE mediante el aumento de la capacidad de plegamiento de proteínas, la degradación de las proteínas mal plegadas y la atenuación de la producción de proteínas (^[50], ^[55]–^[57]). Varios reguladores clave de esta señalización del estrés, incluidos HSPA5, ATF4, ATF6, ERN1, CHOP y C/EBPγ, se regularon al alza mediante los medios acondicionados por células T (Figura 5B). Confirmamos a nivel de proteína que los medios acondicionados por células T inducen la regulación al alza de CHOP (Figuras 5C, D), lo que se abolió mediante anticuerpos neutralizantes de IFNγ (Figura 5C) y la inhibición de JAK/1/2 con ruxolitinib (Figura 5D). Además, el tratamiento de las células LS174T con tunicamicina, un conocido inductor químico de UPR (^[58]–^[61]), aumentó los niveles de proteína CHOP y redujo los niveles de proteína GUCY2C (Figura 5E).

El 4-fenilbutirato revierte la pérdida de GUCY2C inducida por IFNγ y permite una eliminación más completa de las células de CCR

Los datos anteriores sugieren que la IFNγ producida por GucyCART induce la pérdida de GUCY2C mediante la inducción de UPR, y la reversión de la UPR podría restaurar GUCY2C y mejorar la función de la CART in vitro. En ese contexto, el 4-fenilbutirato (4PBA) es una molécula pequeña, un acompañante químico que alivia el estrés por plegamiento incorrecto de proteínas en el RE y puede reducir la activación de las vías de respuesta al estrés (^[62]–^[65]). De hecho, 4PBA redujo CHOP y restauró la proteína GUCY2C, sin alterar la señalización canónica de IFNγR/JAK/STAT1 (Figura 6A). Además, si bien 4PBA por sí solo no induce la muerte celular (Figura suplementaria 4), el cotratamiento con 4PBA mejoró la velocidad (tiempo para el 50% de la muerte) y la integridad (citólisis máxima) de la citólisis de las células LS174T y LoVo (Figura 6B).

Estudios previos demostraron que GucyCART trata eficazmente los tumores de CRC intraperitoneales establecidos en ratones con células T84 que expresan abundante GUCY2C (^[28]–^[30]). Sin embargo, en modelos intraperitoneales de tumores LS174T y LoVo, que expresan niveles más bajos de ARNm de GUCY2C (Figura 1A) y proteína (Figura 1B), GucyCART tiene una eficacia limitada (Figura 1C). In vitro, GucyCART lisa todas las líneas celulares con expresión moderada y baja de antígeno (Figuras 2A, B). Sin embargo, en consonancia con el fracaso in vivo en los modelos LS174T y LoVo (Figura 1C), observamos una citólisis lenta e incompleta a bajas proporciones efector-a-diana (E:T) (Figura 2B). Por lo tanto, hipotetizamos que el fracaso in vitro e in vivo puede reflejar la selección de variantes con pérdida de GUCY2C. De hecho, las células de CRC que persistieron después de la citólisis presentaban niveles sustancialmente más bajos de ARNm y proteína de GUCY2C (Figuras 2C, D).

La pérdida de GUCY2C se produce en las células de CRC vecinas

La literatura previa sobre los mecanismos de pérdida de antígeno inducidos por CART sugiere que la pérdida de antígeno depende del contacto directo de las células CART con las células tumorales para imponer una presión de selección y/o supervivencia (^[35], ^[36], ^[38], ^[40]). Inicialmente, hipotetizamos que la pérdida de GUCY2C inducida por GucyCART depende del contacto de las células CART con las células de CRC. Por lo tanto, el tratamiento de las células de CRC con medios de cultivo acondicionados por las células GucyCART activadas no debería afectar la expresión de GUCY2C (Figura 3A). Inesperadamente, los niveles de proteína GUCY2C se redujeron drásticamente mediante los medios de cultivo acondicionados de cocultivos de CRC + GucyCART (Figura 3B). Los niveles de ARNm de GUCY2C también se redujeron significativamente en las células LS174T y SKCO1, pero no en LoVo, que tiene una expresión muy baja de ARNm de GUCY2C en la línea de base (Figura 3C). Para determinar si esta reducción refleja un producto generalizable de las células T humanas activadas, en lugar de un producto de las células cancerosas que mueren o de la activación del antígeno de GucyCART, probamos los medios de cultivo acondicionados de células T humanas activadas con cuentas conjugadas con anticuerpos anti-CD2/CD3/CD28 que carecen de un CAR (Figura 3D). De hecho, los niveles de proteína GUCY2C (Figura 3E) y ARNm (Figura 3F) en las tres líneas celulares de CRC se redujeron sustancialmente mediante los medios de cultivo de células T humanas activadas.

La pérdida de GUCY2C está mediada por el eje de señalización IFNγR-JAK-STAT1

Para investigar más a fondo el mecanismo de la pérdida de GUCY2C, empleamos estrategias de detección de citocinas, anticuerpos bloqueantes, farmacológicas y de eliminación de genes (Figura 4A). La lista de candidatos de citocinas secretadas por las células T activadas cuyos receptores se expresan en las líneas celulares de cáncer de CRC incluyó GM-CSF, TNFα, IL-8, MIP-1α, MIP-1β e IFNγ. Solo IFNγ reprodujo el efecto de GucyCART y redujo la proteína GUCY2C total (Figura 4B) y la expresión superficial de GUCY2C (Figura suplementaria 1). El receptor de IFNγ (IFNγR) es un heterodímero de IFNGR1 e IFNGR2 (^[44]). Tras la unión de IFNγ, IFNGR1 e IFNGR2 se dimerizan, lo que conduce a la transfosforilación de JAK1 y JAK2, dos quinasas Janus asociadas a IFNGR (^[45], ^[46]). JAK1 y JAK2 fosforiladas pueden entonces fosforilar STAT1 (pSTAT1), que se dimeriza y se trasloca al núcleo para regular la expresión génica (^[47]). Uno de los genes regulados al alza por STAT1 fosforilada es el propio STAT1, creando un bucle de retroalimentación positiva. Como se esperaba, el tratamiento de las células LS174T con IFNγ o medios de cultivo de células T indujo la fosforilación de STAT1 (Figuras 4C, D), la regulación al alza de STAT1 total (Figura suplementaria 2) y la pérdida de GUCY2C (Figuras 4C, D). Además, los anticuerpos neutralizantes de IFNγ bloquearon la fosforilación de STAT1 y la regulación al alza de STAT1 total, así como previnieron la pérdida de GUCY2C inducida por los medios de cultivo acondicionados (Figura 4D; Figura suplementaria 2B). Para confirmar el papel de JAK1/2 en la pérdida de GUCY2C, empleamos el inhibidor de JAK1/2 ruxolitinib, bien establecido (^[48], ^[49]) (Figura 4E) y la eliminación mediada por CRISPR-Cas9 de JAK1/2 (Figura 4F; Figura suplementaria 3). De hecho, la suplementación de los medios de cultivo de células T con ruxolitinib previno la fosforilación de STAT1 y la pérdida de GUCY2C (Figura 4E). La eliminación por CRISPR-Cas9 redujo las proteínas JAK1/2 ≥70% (Figura suplementaria 3), redujo la fosforilación de STAT1 >80% (Figura 4F) y restauró GUCY2C en presencia de medios de cultivo de células T (Figura 4F). En conjunto, estos datos demostraron que IFNγ es necesario y suficiente para reducir los niveles de GUCY2C en presencia de células GucyCART activadas, mediado por el eje de señalización IFNγR-JAK1/2.

La pérdida de GUCY2C inducida por IFNγ está mediada por la señalización de estrés celular

Para comprender cómo la señalización IFNγR-JAK induce la pérdida de GUCY2C, realizamos análisis transcriptómicos de las células LS174T en presencia de medios de cultivo de control o medios de cultivo acondicionados por CART, confirmando la regulación al alza esperada de la respuesta de IFNγ y otras vías relacionadas con las citocinas efectoras, como IFNα, IL-6-JAK-STAT y TNFα (Figura 5A). Además, encontramos que la vía de la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) también se reguló al alza significativamente (Figura 5A). UPR es un mecanismo crucial de señalización celular que puede regular la producción de proteínas cuando las células están bajo estrés inflamatorio (^[50]–^[53]). Canónicamente, cuando las proteínas mal plegadas y desplegadas se acumulan en el retículo endoplásmico (RE) para causar estrés en el RE, estas proteínas mal plegadas y desplegadas compiten con HSPA5 para unirse a tres proteínas sensoras bien definidas: enzima que requiere inositol 1 (ERN1), factor de transcripción 6 (ATF6) y quinasa similar a la proteína quinasa activada por ARN (PERK) (^[52], ^[54]). Estas proteínas sensoras activan las vías de señalización descendentes que involucran a ATF4, proteína de unión a CCAAT/potenciador gamma (C/EBPγ) y proteína homóloga a C/EBP (CHOP), para restaurar las funciones normales del RE mejorando la capacidad de plegamiento de proteínas, degradando las proteínas mal plegadas y atenuando la producción de proteínas (^[50], ^[55]–^[57]). Múltiples reguladores clave de esta señalización de estrés, incluidos HSPA5, ATF4, ATF6, ERN1, CHOP y C/EBPγ, se regularon al alza mediante los medios de cultivo de células T (Figura 5B). Confirmamos a nivel de proteína que los medios de cultivo de células T inducen la regulación al alza de CHOP (Figuras 5C, D), lo que se abolió con los anticuerpos neutralizantes de IFNγ (Figura 5C) y la inhibición de JAK/1/2 con ruxolitinib (Figura 5D). Además, el tratamiento de las células LS174T con tunicamicina, un conocido inductor químico de UPR (^[58]–^[61]), aumentó los niveles de proteína CHOP y redujo GUCY2C (Figura 5E).

El 4-fenilbutirato rescata la pérdida de GUCY2C inducida por IFNγ y permite una eliminación más completa de CRC

Los datos anteriores sugieren que la IFNγ producida por GucyCART induce la pérdida de GUCY2C mediante la inducción de UPR, y la reversión de UPR podría restaurar GUCY2C y mejorar la función de CART in vitro. En ese contexto, el 4-fenilbutirato (4PBA) es una pequeña molécula química chaperona que alivia el estrés de plegamiento incorrecto de proteínas en el RE y puede reducir la activación de las vías de respuesta al estrés (^[62]–^[65]). De hecho, 4PBA redujo CHOP y restauró la proteína GUCY2C, sin alterar la señalización canónica de IFNγR/JAK/STAT1 (Figura 6A). Además, si bien 4PBA por sí solo no induce la muerte celular (Figura suplementaria 4), el cotratamiento con 4PBA mejoró la velocidad (tiempo para el 50% de la muerte) y la integridad (citólisis máxima) de la citólisis de las células LS174T y LoVo (Figura 6B).

Discusión

Una densidad de antígeno de superficie suficiente para inducir la activación de las células CART es un parámetro crucial para la eficacia de CART (^[39], ^[66]). CART requiere niveles de antígeno sustancialmente más altos para inducir las funciones efectoras descendentes en comparación con el umbral requerido para la interacción receptor de células T nativas y péptido-CMH (^[67], ^[68]). Además, la heterogeneidad del antígeno en los tumores sólidos, en comparación con los tumores líquidos, dificulta aún más la activación de CART (^[69], ^[70]). Además, estudios previos han observado la reducción del antígeno en los ensayos clínicos de neoplasias tanto líquidas como sólidas (^[20], ^[35], ^[37], ^[40]–^[43]). Aquí, observamos una eficacia subóptima de GucyCART en modelos de CRC con bajos niveles de GUCY2C y extendimos nuestra observación in vivo in vitro para estudiar el mecanismo subyacente. Aquí, encontramos que las líneas celulares de CRC con niveles bajos/moderados de GUCY2C pierden el antígeno en presencia de GucyCART e identificamos un mecanismo inesperado de pérdida de antígeno en las células de CRC vecinas impulsado por la IFNγ producida por CART. La IFNγ secretada indujo la activación de JAK1/2, la posterior fosforilación de STAT1 y la activación de UPR, lo que condujo a la pérdida de GUCY2C en las células de CRC vecinas, sin contacto directo entre la célula tumoral y GucyCART.

IFNγ tiene beneficios bien establecidos en la inmunidad de las células T (^[71]). Los estudios clave a principios de la década de 2000 revelaron el papel fundamental del eje de señalización de IFNγ en los modelos de ratón de "vigilancia inmunitaria del cáncer", revitalizando el campo de la inmunología del cáncer (^[72], ^[73]). Como una citocina efectora fundamental, IFNγ aumenta las funciones inmunitarias de las células T al unirse a IFNγR tanto en las células T como en las células tumorales. IFNγ promueve la diferenciación de las células T citotóxicas, estimula la liberación de perforina y granzimas, así como la secreción de quimiocinas para reclutar células T y otras células inmunitarias (^[71]). En las células cancerosas, IFNγ regula al alza los complejos péptido-CMH de la superficie, la maquinaria de procesamiento de antígenos y las moléculas de adhesión para mejorar el reconocimiento de las células T (^[74]). En el contexto de CART, la secreción de IFNγ se ha relacionado con el síndrome de liberación de citocinas (CRS) en los pacientes (^[75], ^[76]). Sin embargo, la señalización de IFNγR en las células tumorales sólidas es necesaria para la eficacia de CART debido a sus funciones en la regulación al alza de las moléculas de adhesión y la mejora de la formación de sinapsis (^[77]). Investigaciones previas sobre la iniciación y la progresión del tumor, las vacunas contra el cáncer y las células T infiltrantes tumorales (TIL) han demostrado las contribuciones de IFNγ a la reducción de los niveles de antígeno, como los antígenos de melanosomas en el melanoma (^[78]), el antígeno retroviral endógeno gp70 en el CRC murino (^[79]), HER2 en el cáncer de mama (^[80]) y anexina 2 en el cáncer de próstata (^[81]). Los mecanismos revelados por esos estudios incluyen la regulación a la baja de la transcripción (^[78], ^[79]) y la modulación de la vía del proteasoma de ubiquitina (^[80], ^[81]). Aquí, identificamos un efecto negativo de IFNγ en la reducción de los niveles de antígeno en las células de CRC vecinas, en el contexto de GucyCART. Sin embargo, si bien el ruxolitinib bloqueó la pérdida de GUCY2C inducida por IFNγ (Figura 4), tuvo un impacto negativo general en la eficacia de GucyCART (Figura suplementaria 5), lo que refleja el impacto previamente identificado en la formación de sinapsis (^[77]), lo que hace necesario la identificación de nuevos mecanismos dirigibles que subyacen a la pérdida de antígeno inducida por IFNγ.

La incapacidad de ruxolitinib para mejorar la eficacia al tiempo que bloquea la pérdida de antígenos nos llevó a analizar más a fondo la relación entre IFNγ/JAK y la reducción de antígenos. El análisis de la vía de señalización transcriptómica (Figuras 5A y 5B), la validación de la proteína CHOP (Figuras 5C y 5D), así como la atenuación de CHOP (Figuras 5C y 5D) y la recuperación de GUCY2C con el anticuerpo neutralizante anti-IFNγ (Figura 4D), ruxolitinib (Figura 4E) y 4PBA (Figura 6A) respaldan firmemente la activación de la señalización de estrés por parte de IFNγ y el papel de esta vía en la reducción de antígenos. Sin embargo, es esencial distinguir entre la señalización de estrés y el estrés. La alta producción y carga de procesamiento de proteínas inducidas por la transcripción dirigida por STAT1 pueden provocar estrés del RE, lo que a su vez activa las vías de señalización de estrés (^[82], ^[83]). Alternativamente, el JAK/STAT1 fosforilado puede activar directamente los sensores de estrés para iniciar las señales de estrés, incluso en ausencia de estrés (^[84], ^[85]). Enrichr (^[86]), una herramienta que integra experimentos ChIP a nivel del genoma de los proyectos ENCODE (^[87]) y ChEA (^[88]), se utilizó para investigar si la regulación de factores de transcripción específicos se alteraba en las células LS174 expuestas a medios acondicionados por CART. Los resultados indican que los miembros de la familia IRF, IRF8 e IRF1, fueron los dos reguladores transcripcionales más enriquecidos para los genes regulados al alza (Figura S6). Posteriormente, utilizando HOMER (^[89]), identificamos motivos reguladores que estaban enriquecidos en los promotores de los genes regulados al alza y al baja. Los motivos relacionados con los miembros de la familia IRF se encontraban entre los motivos más enriquecidos en el conjunto de genes regulados al alza (Figura S6). El análisis de enriquecimiento de motivos de los datos transcriptómicos de las células LS174T tratadas con medios acondicionados reveló un enriquecimiento de los motivos IRF1 e IRF8, lo que respalda la activación de la señalización descendente canónica de IFNγ (^[90]). Por el contrario, la regulación a la baja de los genes diana y los motivos de E2F4, así como de TATA-Box (^[91]), KLF3 (^[92]), TEAD1 (^[93]) y HOXA9 (^[94]) (Figura S6) indican una supresión global de la iniciación de la transcripción canónica y un estado adaptado al estrés. Por lo tanto, especulamos que la pérdida de antígenos inducida por UPR compromete la transcripción y la traducción en el estado adaptado al estrés. Se necesitan estudios futuros para analizar los mecanismos subyacentes a las señales de estrés inducidas por CART, mediadas por la señalización de IFNγ aguas abajo de la UPR, en las células CRC vecinas.

GUCY2C es un interesante objetivo terapéutico que se está investigando en múltiples ensayos clínicos en curso con diferentes modalidades terapéuticas. Un ensayo clínico de fase I reciente evaluó la seguridad y la actividad antitumoral preliminar de GCC19CART en 15 pacientes con CRC metastásico (^[33]). GCC19CART empleó la plataforma "CoupledCAR" que combina CART dirigido a GUCY2C con CART dirigido a CD19, así como genes transgenos adicionales para expresar IFNγ, IL-6 e IL-12 (^[33]). En este ensayo clínico, todos los efectos secundarios fueron autolimitados y manejables, y 4 de 7 pacientes tratados con la dosis alta de GCC19CART experimentaron una respuesta parcial (^[33]). Aunque los prometedores resultados del ensayo de fase I dieron lugar a una importante adquisición farmacéutica para continuar con el desarrollo clínico, nuestras observaciones sobre la pérdida de GUCY2C inducida por IFNγ pueden proporcionar información valiosa para mejorar la eficacia de CART dirigido a GUCY2C. Abordar la pérdida de GUCY2C inducida por IFNγ sin comprometer la señalización de IFNγR/JAK/STAT, que es beneficiosa para la citotoxicidad, tiene el potencial de profundizar la eliminación tumoral (Figura 6B), prolongar la durabilidad de las respuestas clínicas y aumentar el porcentaje de pacientes que responden. GUCY2C también se ha utilizado como objetivo terapéutico para vacunas contra el cáncer. En un ensayo de fase I que involucró a 10 pacientes con CRC en etapa temprana, una vacuna contra el cáncer basada en adenovirus dirigida a GUCY2C produjo resultados prometedores en términos de seguridad e inmunogenicidad (^[26]). Actualmente, se está llevando a cabo un ensayo de fase II para la vacuna contra el cáncer dirigida a GUCY2C (NCT04111172). En contraste con nuestras observaciones en el contexto de CART, hipotetizamos que la pérdida de GUCY2C inducida por IFNγ no debería ser perjudicial para la eficacia de la vacuna contra el cáncer. Aunque la proteína total de GUCY2C se reduce en los CRC, la presentación del péptido GUCY2C por el HLA de la superficie debería aumentar tras la exposición a IFNγ, mejorando así el reconocimiento por las células T.

Los estudios aquí se centraron principalmente en GUCY2C y GucyCART. Sin embargo, estas observaciones podrían generalizarse a otros objetivos de CART y a otras modalidades de inmunoterapia. De hecho, similar a GUCY2C, observamos una reducción total de CDH17 y HER2 tras la exposición a IFNγ (Figura S7). Además, la CDH17 y HER2 de la superficie (medida mediante citometría de flujo) se redujeron con IFNγ (Figura S7), lo que se alinea con el requisito de antígeno de superficie de las células CAR-T. Por el contrario, se informó que algunos otros objetivos, incluidos IL13Rα2, EGFR y mesotelina, permanecieron sin cambios tras la exposición a IFNγ (^[77]). No está claro por qué algunos objetivos son sensibles a IFNγ y otros son resistentes. Estudios adicionales sobre las estructuras de estas proteínas transmembrana o sus procesos de síntesis pueden proporcionar información valiosa para las estrategias para superar la pérdida de antígenos inducida por IFNγ. Además, la pérdida de antígenos inducida por IFNγ probablemente planteará desafíos para otras terapias que se dirigen al antígeno nativo de la superficie, incluidos los anticuerpos bispecíficos anti-CD3 (BiTE). Por el contrario, las terapias de células T diseñadas con receptores de células T (TCR), que se dirigen a los complejos péptido-HLA, pueden ser insensibles, similar a nuestras expectativas para las vacunas contra el cáncer dirigidas a GUCY2C. Por lo tanto, las inmunoterapias que se dirigen al antígeno nativo, como CART y BiTE, pero no a los complejos péptido-HLA, como las células T-RCR y las vacunas, pueden verse afectadas por la reducción del antígeno inducida por IFNγ.

Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que demuestra que IFNγ causa la pérdida del antígeno CART en las células cancerosas. Este nuevo mecanismo de pérdida de antígenos, a diferencia de muchos mecanismos de escape de antígenos bien establecidos (^[35], ^[36], ^[38], ^[39], ^[66], ^[95], ^[96]), no requiere alteraciones genéticas ni que las células cancerosas entren en contacto directo con las células CART para reducir el antígeno. En el contexto de las terapias CART y BiTE, la reducción del antígeno en las células vecinas debido a IFNγ secretado por las células T estimuladas puede ser una barrera para la eliminación completa de los tumores. Dada los efectos generales positivos de IFNγ sobre la citotoxicidad mediada por las células T, hemos identificado además la señalización de estrés celular como el principal mediador que relaciona la vía IFNγ/JAK/STAT con la reducción observada en el antígeno. Aunque 4PBA alivia la señalización de estrés celular y preserva la fosforilación de STAT1 en presencia de IFNγ in vitro, la aplicación in vivo de 4PBA es un desafío. Un estudio previo demostró que 4PBA tiene una vida media corta de