Targeting GPA33 con CAR-macrófagos: un enfoque inmunoterapéutico novedoso para el cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común a nivel mundial y ocupa el segundo lugar entre las causas de muerte relacionadas con el cáncer [^[1]]. En los últimos años, la incidencia de CCR ha ido aumentando progresivamente entre los adultos jóvenes [^[2]], lo que constituye un problema urgente de salud pública a nivel mundial. El CCR en etapa temprana a menudo es curable tras la resección quirúrgica y la quimioterapia adyuvante, mientras que el CCR metastásico irresecable se trata habitualmente con terapias sistémicas, incluida la inmunoterapia. Aunque las inmunoterapias dirigidas molecularmente a características específicas del tumor han mejorado la supervivencia general de algunos pacientes, la supervivencia a cinco años sigue siendo inferior al 20% [^[3]]. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas estrategias inmunoterapéuticas para el CCR es de suma importancia.

La terapia de transferencia de células adoptivas (TCA) es una inmunoterapia contra el cáncer emergente que aumenta la inmunidad antitumoral del huésped mediante la reinfusión de células inmunitarias derivadas del huésped con actividad antitumoral intrínseca o células modificadas genéticamente para expresar receptores quiméricos de antígenos (CAR). Las células CAR-T han logrado un éxito notable contra las neoplasias hematológicas, pero no han alcanzado todo su potencial contra los tumores epiteliales, incluido el CCR. Las principales limitaciones son la insuficiente infiltración intratumoral de las células CAR-T y su susceptibilidad a los mecanismos inmunosupresores dentro del microambiente tumoral (MET) [^[4]]. Estas limitaciones en la eficacia de las células CAR-T en tumores sólidos han impulsado la exploración de plataformas celulares alternativas. Los macrófagos asociados al tumor (MAT), el subconjunto de células inmunitarias más abundante que infiltra el MET del CCR, desempeñan un papel fundamental en la tumorigénesis y la progresión del CCR [^[5]]. Como componentes clave de la inmunidad innata, los macrófagos se caracterizan por su plasticidad y heterogeneidad fenotípica y pueden polarizarse en respuesta a las señales del MET hacia estados clásicamente activados (M1) o alternativamente activados (M2). Los macrófagos M1 poseen propiedades proinflamatorias y antitumorales, secretando citocinas como la IL-12 y el TNF-α, matando directamente las células tumorales y cooperando con las células dendríticas para activar la inmunidad mediada por células T. Por el contrario, los macrófagos M2 promueven la angiogénesis tumoral, la supresión inmunitaria y la remodelación de la matriz mediante la secreción de factores que incluyen el VEGF, el TGF-β y las MMP, que inhiben las funciones de los linfocitos T citotóxicos y las células asesinas naturales, y, por lo tanto, facilitan la progresión y la metástasis del tumor [^[6], ^[7]]. En los tumores avanzados, los MAT de tipo M2 suelen predominar y promueven el crecimiento y la metástasis del tumor. La modulación de la polarización de los macrófagos, suprimiendo el fenotipo M2 y promoviendo la polarización M1, ha surgido como una de las estrategias clave en la inmunoterapia tumoral [^[8], ^[9]]. Estudios previos han demostrado que los macrófagos con receptores quiméricos de antígenos (CAR) poseen capacidades únicas, que incluyen el reconocimiento específico, la fagocitosis y la destrucción de las células tumorales, así como una mayor presentación de antígenos para reforzar la inmunidad adaptativa. En consecuencia, la ingeniería de macrófagos con CAR se ha convertido en un enfoque viable para combatir los tumores sólidos.

La glicoproteína A33 (GPA33), un receptor de superficie celular de la superfamilia de las inmunoglobulinas, se expresa en aproximadamente el 95% de los cánceres colorrectales y está ausente en la mayoría de los tejidos humanos normales [^[10], ^[11]]. Estudios recientes informan de la expresión de GPA33 en hasta el 98% de las metástasis pulmonares del CCR, superando a otros marcadores de origen intestinal e indicando una alta sensibilidad y especificidad diagnóstica [^[12]]. Dada su localización tisular y celular distinta, se considera que la GPA33 es un objetivo ideal para la terapia del CCR. Las células CAR-T dirigidas contra la GPA33 han demostrado una potente actividad antitumoral in vitro e in vivo [^[13]]. Sin embargo, el potencial de los macrófagos CAR dirigidos contra la GPA33 (CAR-M) en el CCR aún no se ha investigado.

En el presente estudio, construimos macrófagos CAR basados en un nuevo anticuerpo anti-GPA33 y evaluamos su capacidad fagocítica específica de antígeno y su capacidad de destrucción tumoral en modelos preclínicos definidos. Nuestros resultados demuestran que los macrófagos con receptores quiméricos de antígenos (CAR-M) diseñados a partir de células Thp-1 exhiben una alta especificidad y afinidad de orientación del antígeno, se someten a una polarización impulsada por el antígeno hacia un fenotipo proinflamatorio in vitro y muestran una mayor inhibición del crecimiento tumoral in vitro y en modelos de xenoinjerto inmunodeficientes. Estos hallazgos establecen los mecanismos fundamentales de los CAR-M específicos de GPA33 y respaldan su desarrollo adicional como un posible enfoque inmunoterapéutico para el cáncer colorrectal.

Materiales y métodos

Preparación del antígeno recombinante e inmunización animal

Para obtener anticuerpos específicos que se dirijan a la GPA33, primero construimos un antígeno recombinante de GPA33. Específicamente, se seleccionó la secuencia de aminoácidos de la región extracelular de la GPA33 humana (aminoácidos 22-235) y se fusionó una secuencia que codifica una etiqueta 6×His a su N-terminal. Posteriormente, se llevó a cabo la expresión de proteínas utilizando un sistema de expresión de mamíferos, y se purificó la proteína His-GPA33 recombinante de alta pureza utilizando cromatografía de afinidad con columna de níquel. Este antígeno recombinante se utilizó para inmunizar ratones BALB/c hembra de 6 semanas de edad (adquiridos de GemPharmatech Co., Ltd.). El protocolo de inmunización fue el siguiente: cada ratón recibió una inyección subcutánea de una emulsión que contenía 50 µg de antígeno mezclado con el adyuvante completo de Freund (F5881, sigma) (para la inmunización primaria) o el adyuvante incompleto (F5506, sigma) (para las inmunizaciones de refuerzo), administrado cuatro veces a intervalos de dos semanas. Una semana después de la inmunización final, se recogió suero de los ratones mediante punción de la órbita. El título de los anticuerpos anti-GPA33 en el suero se evaluó mediante ELISA. Se seleccionaron los ratones con los títulos de suero más altos para los experimentos posteriores.

Aislamiento de células plasmáticas específicas del antígeno y clasificación de células B individuales

Tras la confirmación de la inmunización exitosa, se sacrificó el ratón mencionado y se extirpó el bazo de forma aséptica. Se preparó la suspensión de células simples del bazo mediante molienda mecánica. Posteriormente, utilizando el kit de selección positiva de células CD138 positivas del ratón (100-0601, STEMCELL Technologies) según las instrucciones del fabricante, se clasificaron positivamente las poblaciones de células CD138+ a partir de la suspensión de células del bazo. Para obtener células B monoclonales que secreten anticuerpos dirigidos a la GPA33, se realizó el aislamiento de células individuales utilizando el sistema automatizado de selección de células CellCelector de Sartorius (Alemania). El sistema de imágenes de fluorescencia del CellCelector identificó y seleccionó automáticamente las células B individuales que secretan anticuerpos específicos, que se clasificaron directamente en una placa de PCR de 96 pocillos que contenía tampón de lisis celular para su uso inmediato en la transcripción inversa posterior.

Amplificación de los genes de la región variable de los anticuerpos

Utilizando el kit de preamplificación de cDNA de una sola célula/baja cantidad de SuperScript™ IV (1152048, Thermo Fisher), se realizó la transcripción inversa del mRNA y la preamplificación de cDNA en las células B individuales clasificadas. El procedimiento se siguió estrictamente de acuerdo con las instrucciones del kit. Posteriormente, utilizando los productos de preamplificación como plantillas, se empleó la PCR anidada para amplificar los genes de la región variable de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos; las secuencias específicas de todos los cebadores utilizados para la PCR se proporcionan en el archivo adicional 3. Todas las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando el kit de ADN polimerasa de alta fidelidad (P501, Vazyme) para garantizar la fidelidad de la amplificación. Los productos de PCR se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y las bandas del tamaño correcto se excindieron, purificaron y enviaron a Anhui General Biol Co., Ltd. para la secuenciación de Sanger.

Producción de anticuerpos monoclonales recombinantes

La selección de anticuerpos se realizó en función de las diferencias de secuencia en las regiones CDR, en particular en la región CDR3. De todos los clones secuenciados con éxito, se seleccionaron cinco secuencias de anticuerpos únicas (designadas como Ab1 a Ab5), caracterizadas por una baja similitud de la secuencia de aminoácidos en las regiones CDR y representativas de la diversidad observada. En resumen, los fragmentos de genes de la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera seleccionados se clonaron individualmente en un vector de expresión de anticuerpos humanizados que contiene la región constante de la IgG1 humana, construyendo así plásmidos de expresión de cadena pesada y cadena ligera de longitud completa. Estos plásmidos se transfectaron posteriormente en células HEK-293 F para la expresión y purificación de anticuerpos.

Evaluación de la afinidad de los anticuerpos

La afinidad de unión del anticuerpo recombinante al antígeno se determinó utilizando un método de ELISA indirecto. El antígeno His-GPA33 recombinante se diluyó a una concentración de 1 µg/mL en un tampón de recubrimiento y se añadieron 100 µL a cada pocillo de una placa de 96 pocillos, seguido de una incubación durante la noche a 4 °C para el recubrimiento. El anticuerpo purificado se sometió a una serie de diluciones en gradiente, comenzando con 20 nM y realizando diluciones seriadas de tres en tres, que luego se añadieron a los pocillos correspondientes para la incubación. Se empleó citometría de flujo para evaluar la capacidad de unión del anticuerpo a las células que expresan GPA33. El anticuerpo recombinante a la concentración de dilución correspondiente se incubó con un millón de células LS174T a 4 °C durante una hora, seguido de la adición de anticuerpo anti-IgG Fc humano de cabra (FITC) (RS2304, Immunoway) como anticuerpo secundario para el análisis citométrico de flujo.

Líneas celulares

Las líneas celulares de cáncer colorrectal humano (T84, LS174T, HCT116, RKO, SW480, SW620, Caco2, HT29) y la línea celular THP-1 (leucemia monocítica humana) se obtuvieron de Procell Life Science and Technology Co., Ltd., Wuhan, China. Las líneas celulares NCM460 (células epiteliales normales del colon humano), HEK-293T y HEK293-F se mantienen en nuestro laboratorio. Todas las líneas celulares se autenticaron mediante el perfilado de repeticiones cortas en tándem (STR). Las células se cultivaron en RPMI-1640 o DMEM suplementado con un 10% de suero fetal bovino (Gibco) y un 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco) a 37 °C en una incubadora con un 5% de CO2. La línea celular SW620-GPA33 se estableció infectando las células SW620 con una versión truncada del gen humano GPA33 sin un dominio intracelular de sobreexpresión. El virus de ARN de interferencia pequeño (shRNA) dirigido a GPA33 se utilizó para generar la línea celular LS174T-GPA33 con expresión reducida. La secuencia de orientación para el shRNA#1 de GPA33 fue: 5'-GGGACTTATTCAATGGGATAATTCAAGAGATTATCCCATTGAATAAGTCCC-3'. La secuencia de orientación para el shRNA#2 de GPA33 fue: 5'-GGACGCAGTTCTGCAACATCATTCAAGAGATGATGTTGCAGAACTGCGTCC-3'. Las líneas celulares correspondientes que expresan el gen de la luciferasa o la proteína fluorescente roja mCherry se obtuvieron infectando las líneas celulares respectivas con virus lentivirales de luciferasa-puromicina o mCherry-puromicina, y todas las células infectadas con el virus se sometieron a selección con puromicina para establecer líneas celulares estables.

Acoplamiento molecular

La secuencia de aminoácidos de la proteína GPA33 se recuperó de la base de datos UniProt (https://www.uniprot.org/). Las secuencias de GPA33 y CAR-scFv se enviaron posteriormente al servidor AlphaFold3 (https://deepmind.google/technologies/alphafold/alphafold-server/) para el modelado de la interacción. Se generaron cinco modelos de interacción, y el modelo con la puntuación más alta se seleccionó para un análisis posterior de sus sitios de interacción predichos. La visualización de los residuos de aminoácidos específicos involucrados en la interacción se realizó utilizando la versión 2.6 de código abierto de PyMOL.

Producción de CAR y macrófagos

El constructo CAR comprende un péptido señal CD8α, un scFv que se dirige al dominio extracelular de GPA33, las regiones de bisagra y transmembrana de CD8α, el dominio ITAM del receptor FcγI y el dominio de reclutamiento de PI3K de CD19, unidos a eGFP a través de una secuencia P2A. La síntesis del plásmido CAR y la producción lentiviral fueron realizadas por Anhui General Biol Co., Ltd. Las células THP-1 fueron transducidas a una concentración de 50 MOI en presencia de 2 µg/mL de polibreno durante 24 horas; la eficiencia de la transducción se evaluó 72 horas después mediante la detección citométrica de flujo de la expresión de eGFP. Las células THP-1 transducidas o no transducidas con lentivirus se indujeron con 50 µg/mL de PMA (S1819, Beyotime) durante 48 horas, y luego se reemplazó el medio por un medio RPMI-1640 completo y se cultivaron durante 24 horas adicionales. La inducción exitosa de M0 se evaluó mediante análisis citométrico de flujo de la expresión de CD14 y CD11b. Las células THP-1 diferenciadas con PMA representan un modelo de macrófago artificial con características preactivadas que pueden no recapitular completamente la biología de los macrófagos residentes en los tejidos o derivados de monocitos. Este modelo se seleccionó por su reproducibilidad y facilidad de manipulación genética para estudios iniciales de prueba de concepto mecanística.

Ensayo de fagocitosis basado en citometría de flujo

Las células LS174T-mCherry y los macrófagos GFP-positivos (CON-M) o CAR-M se cocultivaron en una proporción de 1:1. Los sistemas de cocultivo se recolectaron utilizando Accutase (00-4555-56, Invitrogen) a los 30 minutos, 1 hora, 2 horas y 4 horas. El procesamiento de la muestra incluyó múltiples lavados para garantizar la máxima disociación de los agregados celulares. La proporción de células GFP/mCherry doble-positivas se utilizó como la probabilidad de eventos fagocíticos. Las células LS174T-mCherry, T84-mCherry, SW620-vector o SW620-GPA33 se cocultivaron con CON-M o CAR-M en una proporción de 1:1 durante 1 hora. El cocultivo se recolectó y se utilizó citometría de flujo para determinar la proporción de células mCherry-positivas dentro de la población GFP-positiva, lo que representa la tasa de fagocitosis de los respectivos macrófagos. La estrategia de selección se muestra en la Figura Suplementaria S11A.

Detección de la afinidad entre CAR-M y el antígeno GPA33

Un millón de células THP-1, cada una transducida con diferentes lentivirus (CAR1, CAR3, CAR5 y GFP-CON), se co-incubaron con 20 nM de antígeno 6xHis-GPA33 purificado durante 1 hora. Luego, las células se tiñeron con anticuerpo anti-His Tag conjugado con APC (362605, BioLegend), y la intensidad media de fluorescencia (MFI) en el canal APC se midió mediante citometría de flujo para evaluar la capacidad de unión de las moléculas CAR en las células THP-1 al dominio extracelular de GPA33.

Análisis de citocinas

Los kits ELISA Human IL-6 (EK106, LiankeBiotech), Human TNF-α (EK182, LiankeBiotech), Human IL-1β (EK101b, LiankeBiotech) y Human IFN-γ (EK180, LiankeBiotech) se utilizaron para detectar los niveles de citocinas en los sobrenadantes del sistema de cocultivo. Todas las operaciones se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones.

Ensayo de citotoxicidad in vitro

Las líneas celulares LS174T, T84 y SW620 se transfectaron con un gen reportero de luciferasa. La línea celular SW620 también se transfectó para sobreexpresar un fragmento truncado de GPA33 junto con la luciferasa. Las líneas celulares transfectadas de forma estable se seleccionaron con puromicina. Los macrófagos y las células diana se cocultivaron en diferentes proporciones en una incubadora durante 24 horas. Se añadió D-Luciferina (40901ES, Yeasen Biotechnology Co., Ltd.) a las placas de 96 pocillos para la imagen de bioluminiscencia. Las señales de bioluminiscencia se capturaron utilizando un sistema IVIS (NEWTON 7.0, Francia) y se cuantificaron para calcular la citotoxicidad.

Lisis (%) = [(Señal de la muestra – Señal solo del tumor)] / [(Señal de fondo – Señal solo del tumor)] × 100.

Modelo tumoral de xenoinjerto en ratones desnudos

Se compraron ratones BALB/c hembra de seis semanas de edad de Gempharmatech Co., Ltd. y se mantuvieron en las instalaciones de animales SPF del Centro de Experimentación Animal de la Universidad de Lanzhou. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Segundo Hospital de la Universidad de Lanzhou y se llevaron a cabo en estricta conformidad con las pautas éticas. Un total de 1 × 10^6 células T84 positivas para luciferasa se mezclaron en una proporción de 1:1 con Matrigel (354234, Gibco) y se inyectaron en la axila izquierda de cada ratón. Una semana después del trasplante tumoral, los ratones se asignaron aleatoriamente a tres grupos. Los ratones con tumores recibieron inyecciones semanales en la vena de la cola de PBS, 1 × 10^7 CON-Ms o 1 × 10^7 CAR-Ms. Se realizó una imagen de bioluminiscencia utilizando el sistema de imagen IVIS (NEWTON 7.0, Francia) semanalmente. Los volúmenes tumorales se registraron con un calibrador electrónico y se calcularon según la fórmula (L × A × A) / 2. El peso de los ratones se midió cada tres días. Cuando el diámetro tumoral más largo excedió los 10 mm, los ratones con tumores se sacrificaron y se recolectaron los tejidos tumorales y los órganos principales para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E).

Citometría de flujo

Todas las células THP-1 y los macrófagos se sometieron a un bloqueo del receptor Fc con Human TruStain FcX (422302, BioLegend) antes de la tinción. Los marcadores de macrófagos se evaluaron utilizando anticuerpo anti-CD11b humano APC/Cyanina7 (301341, Biolegend) y anticuerpo anti-CD14 humano APC (301808, BioLegend). Los marcadores de macrófagos M1 se detectaron utilizando anticuerpo anti-CD80 humano PE (375410, BioLegend), anticuerpo anti-CD86 humano APC (374208, BioLegend) y anticuerpo anti-HLA-DR humano PE/Cyanina7 (361611, BioLegend). Los marcadores de macrófagos M2 se detectaron utilizando anticuerpo anti-CD163 humano APC (326509, BioLegend) y anticuerpo anti-CD206 humano PE/Cyanina7 (321123, BioLegend). Para la detección de los marcadores M1/M2 de los macrófagos, primero, los macrófagos en el sistema de cocultivo se aislaron utilizando cuentas magnéticas CD14 (17858, STEMCELL Technologies), y luego los macrófagos aislados y purificados se sometieron a una tinción de rutina. La apoptosis de las células diana en el sistema de cocultivo se evaluó utilizando el kit de apoptosis Annexin V-APC/7-AAD (AT105, LiankeBiotech). La estrategia de selección se muestra en la Figura Suplementaria S11B. Los experimentos de citometría de flujo se realizaron en BD FACSLyric (BD Biosciences), y los datos se analizaron con Flowjo 10.8.1.

Western blot, inmunohistoquímica e inmunofluorescencia

Todos los experimentos se llevaron a cabo siguiendo los procedimientos estándar. Cuando las líneas celulares de cáncer de colon alcanzaron una confluencia del 50%, se extrajeron las proteínas totales utilizando el tampón de lisis RIPA (P0013C, Beyotime). Se utilizaron GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech) y GPA33 (ab108938, abcam) como anticuerpos primarios. Para la tinción de inmunohistoquímica (IHC), se utilizó GPA33 (ab108938, Abcam) en una dilución de 1:1000. Para la inmunofluorescencia, se utilizó Hoechst (C0030, Solarbio) para la tinción nuclear y se empleó el anticuerpo anti-IgG Fc de cabra contra el humano (FITC) (RS2304, Immunoway) como anticuerpo secundario. Las secciones se fotografiaron con un microscopio confocal de fluorescencia (Leica, Alemania).

Análisis estadístico

Se utilizó GraphPad Prism 10.6.0 para realizar los análisis estadísticos. Los valores de p para las comparaciones múltiples de ANOVA se obtuvieron utilizando la prueba de comparación múltiple de Tukey. A menos que se especifique lo contrario, todas las pruebas t fueron de dos colas. Todos los datos se presentan como medias ± desviación estándar (medias ± DE). Para todas las figuras del estudio, * denota P < 0,05, denota P < 0,01 y * denota P < 0,001.

Preparación del antígeno recombinante e inmunización animal

Para obtener anticuerpos específicos que se dirijan a GPA33, primero construimos un antígeno recombinante GPA33. Específicamente, se seleccionó la secuencia de aminoácidos de la región extracelular de GPA33 humano (aminoácidos 22-235) y se fusionó una secuencia que codifica una etiqueta 6xHis a su N-terminal. Posteriormente, se llevó a cabo la expresión de proteínas utilizando un sistema de expresión de mamíferos, y se purificó una proteína His-GPA33 recombinante de alta pureza utilizando cromatografía de afinidad con columna de níquel. Este antígeno recombinante se utilizó para inmunizar ratones BALB/c hembra de seis semanas de edad (comprados de GemPharmatech Co., Ltd.). El protocolo de inmunización fue el siguiente: cada ratón recibió una inyección subcutánea de una emulsión que contenía 50 µg de antígeno mezclado con el adyuvante completo de Freund (F5881, sigma) (para la inmunización primaria) o adyuvante incompleto (F5506, sigma) (para las inmunizaciones de refuerzo), administrado cuatro veces a intervalos de dos semanas. Una semana después de la inmunización final, se recolectó suero de los ratones mediante sangría orbital. El título de los anticuerpos anti-GPA33 en el suero se evaluó utilizando ELISA. Se seleccionaron los ratones con los títulos de suero más altos para los experimentos posteriores.

Aislamiento de células plasmáticas específicas del antígeno y clasificación de células B únicas

Tras la confirmación del éxito de la inmunización, se sacrificó el ratón mencionado y se extirpó el bazo de forma aséptica. Se preparó una suspensión de células únicas del bazo mediante molienda mecánica. Posteriormente, utilizando el kit de selección positiva de células CD138 de ratón (100-0601, STEMCELL Technologies) según las instrucciones del fabricante, se clasificaron positivamente las poblaciones de células CD138+ de la suspensión de células del bazo. Para obtener células B monoclonales que secreten anticuerpos dirigidos a GPA33, se realizó el aislamiento de células únicas utilizando el sistema automatizado de selección de células CellCelector de Sartorius (Alemania). El sistema de imagen de fluorescencia del CellCelector identificó y seleccionó automáticamente las células B únicas que secretan anticuerpos específicos, que se clasificaron directamente en una placa de PCR de 96 pocillos que contiene tampón de lisis para su uso inmediato en la transcripción inversa posterior.

Amplificación de los genes de la región variable de los anticuerpos

Utilizando el kit SuperScript™ IV Single Cell/Low-Input cDNA PreAmp (1152048, Thermo Fisher), se realizó la transcripción inversa del mRNA y la preamplificación del cDNA en las células B únicas clasificadas. El procedimiento se siguió estrictamente de acuerdo con las instrucciones del kit. Posteriormente, utilizando los productos preamplificados como plantillas, se empleó la PCR anidada para amplificar los genes de la región variable de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos; las secuencias específicas de todos los cebadores utilizados para la PCR se proporcionan en el archivo adicional 3. Todas las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando el kit de ADN polimerasa de alta fidelidad (P501, Vazyme) para garantizar la fidelidad de la amplificación. Los productos de PCR se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y se cortaron las bandas del tamaño correcto, se purificaron y se enviaron a Anhui General Biol Co., Ltd. para el secuenciamiento de Sanger.

Producción de anticuerpos monoclonales recombinantes

La selección de anticuerpos se realizó en función de las diferencias de secuencia en las regiones CDR, en particular en la región CDR3. De todos los clones secuenciados con éxito, se seleccionaron cinco secuencias de anticuerpos únicas (designadas como Ab1 a Ab5), caracterizadas por una baja similitud de la secuencia de aminoácidos en las regiones CDR y representativas de la diversidad observada. En resumen, los fragmentos de genes de la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera seleccionados se clonaron individualmente en un vector de expresión de anticuerpos humanizados que contiene la región constante de la IgG1 humana, construyendo así plásmidos de expresión de cadena pesada y cadena ligera de longitud completa. Estos plásmidos se transfectaron posteriormente en células HEK-293 F para la expresión y purificación de anticuerpos.

Evaluación de la afinidad del anticuerpo

La afinidad de unión del anticuerpo recombinante al antígeno se determinó utilizando un método ELISA indirecto. El antígeno His-GPA33 recombinante se diluyó a una concentración de 1 µg/mL en un tampón de recubrimiento y se añadieron 100 µL a cada pocillo de una placa de 96 pocillos, seguido de una incubación durante la noche a 4 °C para el recubrimiento. El anticuerpo purificado se sometió a una serie de diluciones en gradiente, comenzando desde 20 nM y realizando diluciones seriadas de tres en tres, que luego se añadieron a los pocillos correspondientes para la incubación. Se utilizó citometría de flujo para evaluar la capacidad de unión del anticuerpo a las células que expresan GPA33. El anticuerpo recombinante a la concentración de dilución correspondiente se incubó con un millón de células LS174T a 4 °C durante una hora, seguido de la adición de anticuerpo anti-IgG Fc de cabra contra el humano (FITC) (RS2304, Immunoway) como anticuerpo secundario para el análisis citométrico de flujo.

Líneas celulares

Líneas celulares de cáncer colorrectal humano (T84, LS174T, HCT116, RKO, SW480, SW620, Caco2, HT29) y la línea celular THP-1 (célula de leucemia monocítica humana) se obtuvieron de Procell Life Science and Technology Co., Ltd., Wuhan, China. Las líneas celulares NCM460 (células epiteliales normales del colon humano), HEK-293T y HEK293-F se mantienen en nuestro laboratorio. Todas las líneas celulares se autenticaron mediante el perfilado de repeticiones tándem cortas (STR). Las células se cultivaron en RPMI-1640 o DMEM suplementado con un 10% de suero bovino fetal (Gibco) y un 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco) a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2. La línea celular SW620-GPA33 se estableció infectando las células SW620 con una versión truncada de GPA33 humano sin un dominio intracelular, utilizando un lentivirus de sobreexpresión. Se empleó un lentivirus de ARN de interferencia pequeño (shRNA) dirigido a GPA33 para generar la línea celular LS174T con la expresión de GPA33 reducida. La secuencia diana para el shRNA GPA33#1 fue: 5'-GGGACTTATTCAATGGGATAATTCAAGAGATTATCCCATTGAATAAGTCCC-3'. La secuencia diana para el shRNA GPA33#2 fue: 5'-GGACGCAGTTCTGCAACATCATTCAAGAGATGATGTTGCAGAACTGCGTCC-3'. Las líneas celulares correspondientes que expresan el gen de la luciferasa o la proteína fluorescente roja mCherry se obtuvieron infectando las respectivas líneas celulares con lentivirus de luciferasa-puromicina o mCherry-puromicina, y todas las células transducidas con el virus se sometieron a selección con puromicina para establecer líneas celulares estables.

Acoplamiento molecular

La secuencia de aminoácidos de la proteína GPA33 se recuperó de la base de datos UniProt (https://www.uniprot.org/). Las secuencias de GPA33 y CAR-scFv se enviaron posteriormente al servidor AlphaFold3 (https://deepmind.google/technologies/alphafold/alphafold-server/) para el modelado de la interacción. Se generaron cinco modelos de interacción, y se seleccionó el modelo con la puntuación de clasificación más alta para un análisis posterior de sus sitios de interacción predichos. La visualización de los residuos de aminoácidos específicos involucrados en la interacción se realizó utilizando la versión 2.6 de código abierto de PyMOL.

Producción de CAR y macrófagos

El constructo CAR comprende un péptido de señal CD8α, un scFv que se dirige al dominio extracelular de GPA33, las regiones de bisagra y transmembrana de CD8α, el dominio ITAM del receptor FcγI y el dominio de reclutamiento de PI3K de CD19, enlazados a eGFP a través de una secuencia P2A. La síntesis del plásmido CAR y la producción de lentivirus se realizaron por Anhui General Biol Co., Ltd. Las células THP-1 se transdujeron a una MOI de 50 en presencia de 2 µg/mL de polibreno durante 24 horas, y la eficiencia de la transducción se evaluó 72 horas después mediante la detección citométrica de flujo de la expresión de eGFP. Las células THP-1 transducidas o no transducidas con lentivirus se indujeron con 50 µg/mL de PMA (S1819, Beyotime) durante 48 horas, y luego se reemplazó por un medio RPMI-1640 completo y se cultivó durante 24 horas adicionales. Se evaluó la inducción exitosa de M0 mediante el análisis citométrico de flujo de la expresión de CD14 y CD11b. Las células THP-1 diferenciadas con PMA representan un modelo de macrófago artificial con características preactivadas que pueden no recapitular completamente la biología de los macrófagos residentes en los tejidos o derivados de monocitos. Este modelo se seleccionó por su reproducibilidad y facilidad de manipulación genética para estudios iniciales de prueba de concepto mecanicista.

Ensayo de fagocitosis basado en citometría de flujo

Las células LS174T-mCherry y los macrófagos GFP-positivos (CON-M) o CAR-M se cocultivaron en una proporción de 1:1. Los sistemas de cocultivo se recolectaron utilizando Accutase (00-4555-56, Invitrogen) a los 30 minutos, 1 hora, 2 horas y 4 horas. El procesamiento de la muestra incluyó múltiples lavados para garantizar la máxima disociación de los agregados celulares. La proporción de células GFP/mCherry de doble positividad se utilizó como la probabilidad de eventos fagocíticos. Las células LS174T-mCherry, T84-mCherry, SW620-vector o SW620-GPA33 se cocultivaron con CON-M o CAR-M en una proporción de 1:1 durante 1 hora. El cocultivo se recolectó y se empleó citometría de flujo para determinar la proporción de células mCherry-positivas dentro de la población GFP-positiva, lo que representa la tasa de fagocitosis de los respectivos macrófagos. La estrategia de clasificación se muestra en la Figura S11A del Material Suplementario.

Detección de la afinidad entre CAR-M y el antígeno GPA33

Un millón de células THP-1, cada una transducida con diferentes lentivirus (CAR1, CAR3, CAR5 y GFP-CON), se co-incubaron con 20 nM de antígeno 6xHis-GPA33 purificado durante 1 hora. Luego, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-His Tag conjugado con APC (362605, BioLegend), y se midió la intensidad media de fluorescencia (MFI) en el canal APC mediante citometría de flujo para evaluar la capacidad de unión de las moléculas CAR en las células THP-1 al dominio extracelular de GPA33.

Análisis de citocinas

Los kits ELISA Human IL-6 (EK106, LiankeBiotech), Human TNF-α (EK182, LiankeBiotech), Human IL-1β (EK101b, LiankeBiotech) y Human IFN-γ (EK180, LiankeBiotech) se utilizaron para detectar los niveles de citocinas en los sobrenadantes del sistema de cocultivo. Todas las operaciones se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones.

Ensayo de citotoxicidad in vitro

Las líneas celulares LS174T, T84 y SW620 se transfectaron con un gen de luciferasa reportera. La línea celular SW620 también se transfectó para sobreexpresar un fragmento truncado de GPA33 junto con la luciferasa. Las líneas celulares transfectadas de forma estable se seleccionaron con puromicina. Los macrófagos y las células diana se cocultivaron en diferentes proporciones en una incubadora durante 24 horas. Se añadió D-Luciferina (40901ES, Yeasen Biotechnology Co., Ltd.) a las placas de 96 pocillos para la imagen de bioluminiscencia. Las señales de bioluminiscencia se capturaron utilizando un sistema IVIS (NEWTON 7.0, Francia) y se cuantificaron para calcular la citotoxicidad.

Lisis (%) = [(Señal de la muestra – Señal solo del tumor)] / [(Señal de fondo – Señal solo del tumor)] × 100.

Modelo tumoral de xenoinjerto en ratones desnudos

Se compraron ratones BALB/c hembra de seis semanas de edad de Gempharmatech Co., Ltd. y se mantuvieron en las instalaciones de animales SPF del Centro de Experimentación Animal de la Universidad de Lanzhou. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Segundo Hospital de la Universidad de Lanzhou y se llevaron a cabo en estricta conformidad con las pautas éticas. Un total de 1 × 10^6 células T84 positivas para luciferasa se mezclaron en una proporción de 1:1 con Matrigel (354234, Gibco) y se inyectaron en la axila izquierda de cada ratón. Una semana después del trasplante tumoral, los ratones se asignaron aleatoriamente a tres grupos. Los ratones con tumores recibieron inyecciones intravenosas semanales de PBS, 1 × 10^7 CON-M o 1 × 10^7 CAR-M. Se realizó una imagen de bioluminiscencia utilizando el sistema de imagen IVIS (NEWTON 7.0, Francia) semanalmente. Los volúmenes tumorales se registraron con un calibrador electrónico y se calcularon según la fórmula (L × A × A) / 2. Se pesaron los ratones cada tres días. Cuando el diámetro tumoral más largo excedió los 10 mm, se sacrificaron los ratones con tumores y se recolectaron los tejidos tumorales y los principales órganos para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E).

Citometría de flujo

Todas las células THP-1 y los macrófagos se sometieron a un bloqueo de los receptores Fc con Human TruStain FcX (422302, BioLegend) antes de la tinción. Los marcadores de macrófagos se evaluaron utilizando APC/cianina 7 anti-humano CD11b (301341, Biolegend) y APC anti-humano CD14 (301808, BioLegend). Los marcadores de macrófagos M1 se detectaron utilizando PE anti-humano CD80 (375410, BioLegend), APC anti-humano CD86 (374208, BioLegend) y PE/cianina 7 anti-humano HLA-DR (361611, BioLegend). Los marcadores de macrófagos M2 se detectaron utilizando APC anti-humano CD163 (326509, BioLegend) y PE/cianina 7 anti-humano CD206 (321123, BioLegend). Para la detección de los marcadores M1/M2 de los macrófagos, primero se aislaron los macrófagos en el sistema de cocultivo utilizando cuentas magnéticas CD14 (17858, STEMCELL Technologies), y luego los macrófagos aislados y purificados se sometieron a una tinción de rutina. La apoptosis de las células diana en el sistema de cocultivo se evaluó utilizando el kit de apoptosis Annexin V-APC/7-AAD (AT105, LiankeBiotech). La estrategia de clasificación se muestra en la Figura S11B del Material Suplementario. Los experimentos de citometría de flujo se realizaron en BD FACSLyric (BD Biosciences), y los datos se analizaron con Flowjo 10.8.1.

Western blot, inmunohistoquímica e inmunofluorescencia

Todos los experimentos se llevaron a cabo siguiendo los procedimientos estándar. Cuando las líneas celulares de cáncer de colon alcanzaron una confluencia del 50%, se extrajeron las proteínas totales utilizando un tampón de lisis RIPA (P0013C, Beyotime). Se utilizaron GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech) y GPA33 (ab108938, abcam) como anticuerpos primarios. Para la tinción de inmunohistoquímica (IHC), se utilizó GPA33 (ab108938, Abcam) en una dilución de 1:1000. Para la inmunofluorescencia, se utilizó Hoechst (C0030, Solarbio) para la tinción nuclear, y se empleó el anticuerpo anti-IgG Fc de cabra contra el humano (FITC) (RS2304, Immunoway) como anticuerpo secundario. Las secciones se fotografiaron con un microscopio confocal de fluorescencia (Leica, Alemania).

Análisis estadístico

Se utilizó GraphPad Prism 10.6.0 para realizar análisis estadísticos. Los valores p para las comparaciones múltiples de ANOVA se obtuvieron utilizando la prueba de comparación múltiple de Tukey. A menos que se especifique lo contrario, todas las pruebas t fueron de dos colas. Todos los datos se presentan como medias ± desviación estándar (medias ± DE). Para todas las figuras del estudio, * indica P < 0,05, indica P < 0,01 y * indica P < 0,001.

Resultados

Anticuerpos monoclonales anti-GPA33 de alta afinidad basados en la tecnología de células B únicas

Para obtener scFv de alta afinidad que se dirijan a GPA33 humano, empleamos un flujo de trabajo de generación de anticuerpos monoclonales murinos basado en la clasificación de células B únicas y las técnicas de PCR de células únicas. El diagrama de flujo se muestra en la Figura 1A. Primero, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular (DEC) de GPA33 humano (Ile22-Val235) se utilizó para construir un gen recombinante con una etiqueta 6×His N-terminal codificada en el marco. Este gen se sintetizó y la proteína se expresó en células HEK-293 F. El antígeno recombinante se validó mediante SDS-PAGE (Archivo suplementario 1: Fig. S1). Tras la inmunización de ratones con el antígeno GPA33, se evaluaron los títulos séricos mediante ELISA indirecto (Archivo suplementario 1: Fig. S2), y se seleccionó el ratón con el título sérico más alto para la posterior recuperación de la secuencia de anticuerpos. Las células plasmáticas del bazo se aislaron utilizando un kit de clasificación de células positivas para CD138, y la citometría de flujo mostró que la población de células plasmáticas clasificadas superó el 90% (Archivo suplementario 1: Fig. S3). Las células plasmáticas secretoras de anticuerpos específicos para GPA33 se identificaron y se clasificaron individualmente en tubos de PCR utilizando el CellCelector (Fig. 1B). Se realizó la transcripción inversa en cada célula B única clasificada para amplificar el ADNc, y se utilizaron cebadores para amplificar las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras. Las secuencias de anticuerpos relevantes son actualmente objeto de una solicitud de patente (número de solicitud de patente 202511700515.7). Luego, se produjeron anticuerpos recombinantes de acuerdo con los métodos informados en la literatura [^[14]].

El ensayo ELISA indirecto demostró que varios de los anticuerpos producidos (ab1, ab2, ab3, ab5) presentaban diferentes afinidades por el antígeno GPA33 (Fig. 1C). Considerando que el antígeno recombinante podría no replicar completamente la conformación nativa de GPA33, evaluamos además la unión de estos anticuerpos a las células LS174T, que sobreexpresan GPA33 (Fig. 1D), mediante citometría de flujo (Fig. 1E). Ab1, Ab3 y Ab5 se unieron a GPA33 en la superficie celular, mientras que Ab5 no mostró una afinidad específica detectable. Para confirmar la especificidad del antígeno, se utilizó Ab1 para marcar líneas celulares de cáncer colorrectal y líneas celulares de epitelio colónico normal. Los histogramas de citometría de flujo (Fig. 1F) fueron consistentes con los resultados de la expresión de GPA33 obtenidos mediante inmunoblotting (Fig. 1D), lo que indica que el anticuerpo monoclonal es específico para GPA33. También utilizamos vectores lentivirales para generar células LS174T-sh con una expresión de GPA33 establemente silenciada (Archivo suplementario 1: Fig. S4A) y células 293T con una sobreexpresión estable de GPA33 (Archivo suplementario 1: Fig. S4C). La sensibilidad de Ab1, Ab3 y Ab5 a los cambios en la expresión del antígeno GPA33 se evaluó mediante citometría de flujo (Archivo suplementario 1: Figs. S4B, D). Los resultados indican que Ab1, Ab3 y Ab5 reconocen específicamente tanto el antígeno GPA33 endógeno como el sobreexpresado y son capaces de detectar cambios dinámicos en los niveles de expresión. Además, la inmunofluorescencia de células vivas (Fig. 1G) y la tinción inmunofluorescente de secciones congeladas de tejidos de cáncer colorrectal (Fig. 1H) validaron la capacidad del anticuerpo monoclonal recombinante para reconocer el antígeno GPA33 in vitro y en tejidos tumorales. En conjunto, estos resultados indican que los anticuerpos monoclonales generados reconocen GPA33 de manera específica y eficaz y pueden servir como fuentes de fragmentos scFv para la construcción de receptores quiméricos de antígenos específicos para GPA33.

Construcción y selección de macrófagos quiméricos con receptores de antígenos específicos para GPA33 de alta afinidad

Construimos scFv a partir de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos monoclonales de alta afinidad para GPA33 (Ab1, Ab3 y Ab5). Cada scFv se fusionó a un CAR que comprende el dominio intracelular de FcγRI que contiene motivos ITAM y el dominio intracelular de reclutamiento de PI3K de CD19. Estas construcciones de CAR se clonaron en un vector lentiviral y se unieron a eGFP a través de una secuencia P2A (Fig. 2A).

Para generar macrófagos con receptores quiméricos de antígenos, primero transdujimos células THP-1 con lentivirus que codifican el CAR. La expresión de eGFP se evaluó mediante citometría de flujo, y las eficiencias de transducción de los tres lentivirus CAR y el lentivirus de control GFP superaron el 95% (Fig. 2B). Después de la coincubación con 20 nM de antígeno His-GPA33, CAR1 (con scFv derivado de Ab1) exhibió la intensidad media de fluorescencia (MFI) más alta, más de cinco veces mayor que la de CAR5, mientras que CAR3 no mostró unión al antígeno His-GPA33 (Fig. 2C). Para evaluar la capacidad fagocítica de los tres macrófagos modificados con CAR, los macrófagos inducidos se cocultivaron con células LS174T+ mCherry en una proporción de 1:1. El análisis por citometría de flujo demostró que los macrófagos modificados con CAR1 exhibieron la actividad fagocítica más alta (Archivo suplementario 1: Fig. S5). En consecuencia, CAR1 se seleccionó para experimentos posteriores y, a partir de ahora, se denominará CAR. La predicción estructural de AlphaFold3 combinada con el análisis de PyMOL indicó una fuerte interacción de unión entre el scFv del CAR y GPA33. Como se muestra en la Fig. 2F, las dos moléculas forman una red de reconocimiento molecular a través de múltiples residuos de aminoácidos clave, que incluyen interacciones electrostáticas/puente de hidrógeno Glu32–Gly102 y Glu105–Lys163, y un puente de hidrógeno Asn55–Asp105, con distancias de 3,03 Å, 2,78 Å y 2,79 Å, respectivamente, manteniendo colectivamente la estabilidad del complejo proteico. Las células THP-1, GFP-THP-1 y CAR-THP-1 se trataron con 50 ng/mL de PMA durante 48 h, seguido de un período de reposo de 24 horas para obtener los macrófagos correspondientes. En comparación con las células preinducción, la expresión de los marcadores de macrófagos CD11b y CD14 aumentó significativamente (Figs. 2D-E), lo que confirma la inducción exitosa de macrófagos. Estas células se denominarán UTD-M, CON-M y CAR-M. Independientemente de la transfección con lentivirus de control GFP o CAR, las células THP-1 y los macrófagos inducidos por PMA no mostraron diferencias significativas en la capacidad de proliferación, el ciclo celular o la viabilidad celular (Archivo suplementario 1: Fig. S6).

Para evaluar si el antígeno GPA33 puede activar específicamente los macrófagos modificados con CAR, estimulamos CON-M y CAR-M con placas de cultivo de tejidos recubiertas con BSA o antígeno GPA33. El análisis por citometría de flujo de los marcadores de macrófagos M1 CD80, CD86 y HLA-DR mostró que CAR-M exhibió una regulación al alza significativa de CD80 y HLA-DR después de la estimulación con el antígeno GPA33, mientras que la expresión de CD86 no cambió significativamente (Fig. 2H). Este patrón no se observó en CON-M (Fig. 2G). Evaluamos la capacidad fagocítica no específica de ambos tipos de macrófagos utilizando cuentas fluorescentes rojas de 1 μm y no observamos cambios bajo la estimulación con BSA o antígeno GPA33 (Figs. 2I-J). En particular, CAR-M tratado con antígeno GPA33 exhibió cambios morfológicos similares a M1: las células se agrandaron sustancialmente, pasaron de una forma redondeada a una forma poligonal irregular y extendieron numerosas pseudopódios (Fig. 2J), lo que indica que el antígeno GPA33 puede inducir específicamente la polarización M1 de los macrófagos mediada por CAR.

CAR-M demostró una pronunciada actividad fagocítica específica para el antígeno contra células tumorales positivas para GPA33 in vitro

Para evaluar la actividad fagocítica dirigida de CAR-M contra células de cáncer colorrectal positivas para GPA33, transdujimos las líneas celulares LS174T, T84 y SW620 con proteína fluorescente roja mCherry. Además, la línea celular SW620 se transdujo con una versión truncada del antígeno GPA33. CAR-M o CON-M se cocultivaron con células LS174T-mCherry en una relación E:T de 1:1, y en varios puntos temporales, se utilizó la citometría de flujo para cuantificar la proporción de células dobles positivas para GFP/mCherry como la tasa de eventos fagocíticos. Los resultados de la citometría de flujo mostraron que CAR-M exhibió una eficiencia fagocítica significativamente mayor que CON-M en todos los puntos temporales (Fig. 3A), con la eficiencia máxima que se produjo entre 1 y 2 horas. Después de una hora de cocultivo, la tasa de fagocitosis de CAR-M alcanzó el 20%, más de seis veces mayor que la de CON-M (Fig. 3B). Se observaron resultados similares cuando se utilizaron las células diana T84-mCherry y SW620-GPA33 (Figs. 3C-D). Un resumen de la eficiencia fagocítica de los macrófagos después de una hora de cocultivo se muestra en la Fig. 3E.

Las imágenes de los sistemas de cocultivo fotografiadas con microscopía de fluorescencia corroboraron aún más la fagocitosis específica del antígeno de CAR-M y demostraron que una sola célula efectora puede endocitar múltiples células diana. Después de 24 horas de cocultivo, se observaron células diana lisadas dentro de CAR-M pero no dentro de CON-M (Figs. 4A-C). Además, cuando las células SW620 negativas para GPA33 se cocultivaron con CAR-M y CON-M, no se detectaron eventos fagocíticos (Fig. 4C), lo que indica que la fagocitosis de CAR-M es específica para el antígeno. Curiosamente, CAR-M en los sistemas de cocultivo también mostró características de macrófagos similares a M1, incluido el aumento del tamaño celular y la extensión de pseudopódios para capturar las células diana. Al mismo tiempo, realizamos imágenes de fluorescencia confocal en el sistema de cocultivo de CAR-M y LS174T-mCherry, obteniendo imágenes de pila Z para observar los procesos de captura, englobamiento y degradación de las células diana por parte de CAR-M. Las observaciones confirman que CAR-M puede matar directamente las células tumorales mediante la fagocitosis (Archivo suplementario 1: Fig. S10).

CAR-M media una potente actividad citotóxica dependiente del contacto contra células tumorales positivas para GPA33 in vitro

Para investigar los efectos citotóxicos de CAR-M contra células de cáncer colorrectal positivas para GPA33, cocultivamos CON-M y CAR-M con células diana a una relación E:T de 5:1 durante 24 horas, y se evaluó la apoptosis de las células tumorales GFP− dentro del sistema de cocultivo mediante citometría de flujo. En las células LS174T, T84 y SW620 diseñadas para sobreexpresar una forma truncada de GPA33, CAR-M indujo un aumento significativo de la apoptosis de las células tumorales, con una elevación particularmente pronunciada en las señales de apoptosis tardía (Figs. 5A-C). Por el contrario, CAR-M no exhibió una citotoxicidad dirigida significativa contra las células SW620-Vector negativas para GPA33 (Fig. 5C). Un resumen de las proporciones de células apoptóticas se presenta en la Fig. 5D.

A continuación, realizamos un ensayo de citotoxicidad basado en la bioluminiscencia para evaluar la actividad citolítica in vitro de CAR-M. Se utilizaron células LS174T, T84, SW620-GPA33 y SW620-Vector transfectadas con luciferasa como dianas, y se midió la luminiscencia después de 24 horas de cocultivo con CON-M o CAR-M a varias relaciones E:T. Coherente con los ensayos de apoptosis, CAR-M demostró una potente actividad tumoricida que aumentó con relaciones E:T más altas, produciendo aproximadamente un 80% de inhibición después de 24 horas a una relación E:T de 10:1. CON-M no mostró una citotoxicidad apreciable (Figs. 5E-F). El ataque selectivo de las células SW620-GPA33 pero no de las células SW620-Vector confirma que la muerte de las células tumorales por parte de CAR-M es específica para el antígeno y mediada por CAR (Fig. 5G). Además, el análisis por citometría de flujo de las células tumorales viables restantes en los sistemas de cocultivo mantenidos a una relación E:T de 10:1 durante 24 horas reveló un número significativamente mayor de células tumorales restantes en la condición CON-M en comparación con la condición CAR-M (Figs. 5H-I). En conjunto, estos resultados indican que CAR-M puede atacar y matar de manera eficiente y específica las células tumorales positivas para GPA33 in vitro, exhibiendo una robusta actividad antitumoral. Dado el contacto directo célula a célula en el sistema de cocultivo utilizado, el efecto citotóxico de CAR-M sobre las células diana puede lograrse mediante dos mecanismos: mediación por citocinas y muerte fagocítica directa.

Para evaluar los posibles efectos fuera del objetivo, cocultivamos células NCM460-Luci con CON-M y CAR-M, respectivamente, a varias relaciones E:T durante 24 horas. La viabilidad celular se determinó posteriormente mediante un ensayo de bioluminiscencia, que reveló que no hubo inhibición significativa de la viabilidad celular en ninguna de las relaciones E:T probadas (Archivo suplementario 1: Fig. S8 D, F). Dado el nivel extremadamente bajo de expresión del antígeno GPA33 en las células NCM460, investigamos más a fondo la expresión de GPA33 en las células epiteliales normales de la mucosa gástrica humana (GES-1). El análisis de Western blot confirmó que la línea celular GES-1 expresa el antígeno GPA33 (Archivo suplementario 1: Fig. S8 A-B). De manera similar, los ensayos de citotoxicidad realizados en las células GES-1-Luci demostraron que CAR-M no ejerció efectos citotóxicos significativos sobre estas células normales que expresan el antígeno GPA33 (Archivo suplementario 1: Fig. S8 C, E).

CAR-M exhibe un fenotipo sesgado hacia M1 al interactuar con células tumorales positivas para GPA33 in vitro

Una característica de los macrófagos es su marcada plasticidad. En el microambiente tumoral, los macrófagos generalmente se polarizan hacia un fenotipo similar a M2 y antiinflamatorio que promueve la progresión tumoral. Por lo tanto, revertir esta polarización es una estrategia crítica para reprogramar los macrófagos. Para determinar si GPA33 en las células tumorales puede sesgar específicamente a CAR-M hacia un estado similar a M1 y, por lo tanto, mejorar la actividad antitumoral, utilizamos la citometría de flujo para evaluar los niveles de marcadores fenotípicos de macrófagos en presencia o ausencia de células diana positivas para GPA33.

En estado de reposo, CAR-M exhibió niveles significativamente más altos de expresión de marcadores asociados a M1, como CD80, CD86 y HLA-DR, en comparación con las células de control UTD-M (Fig. 6A). Después del cocultivo con células LS174T, la expresión de los marcadores M1 en CAR-M se incrementó aún más, mientras que UTD-M no mostró un aumento detectable de los marcadores M1, independientemente de la presencia de células tumorales (Fig. 6B). La estimulación por las células tumorales aumentó la expresión de los marcadores M2, CD163 y CD206, tanto en UTD-M como en CAR-M. Sin embargo, los niveles de CD163 y CD206 en CAR-M se mantuvieron sustancialmente más bajos que en CON-M en ambas condiciones (Figs. 6C-D). Además, cuantificamos la secreción de citocinas proinflamatorias por los macrófagos en el sobrenadante de los estados de reposo y cocultivo. Los resultados de ELISA demostraron que CAR-M secretó cantidades significativamente mayores de IL-6, IL-1β, TNF-α e IFN-γ que los controles, independientemente de la estimulación por las células tumorales, mientras que la secreción de citocinas por CON-M fue significativamente menor y no se vio afectada por la presencia del antígeno tumoral GPA33 (Figs. 6J-M). En conjunto, estos datos indican que el reconocimiento específico del antígeno a través del CAR impulsa a los macrófagos hacia un estado funcional caracterizado por un aumento de los marcadores de superficie asociados a M1, una supresión de los marcadores M2 y un aumento de la secreción de citocinas proinflamatorias.

CAR-M inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto

Para evaluar la eficacia terapéutica de CAR-M contra el cáncer colorrectal, establecimos un modelo de xenoinjerto subcutáneo utilizando células T84 luciferase+. Una semana después de la inoculación de 1 × 10^6 células T84, los ratones se asignaron aleatoriamente a tres grupos que recibieron inyecciones intravenosas de PBS, macrófagos de control (UTD-M) o CAR-M semanalmente, comenzando el día 7 (Fig. 7A). En comparación con los grupos de PBS y CON-M, los tumores del grupo CAR-M mostraron un crecimiento volumétrico significativamente más lento (Fig. 7B). El análisis de imagen in vivo en serie demostró una marcada reducción de la carga tumoral en el grupo CAR-M (Fig. 7C). El análisis cuantitativo de la carga tumoral al final del experimento indicó que CAR-M suprime la progresión del tumor colorrectal (Fig. 7D). La tinción con HE de las secciones tumorales mostró que las células T84 conservaron las características histológicas típicas del carcinoma colorrectal después del trasplante, proporcionando así un mejor modelo para evaluar la eficacia in vivo de CAR-M (Fig. 7E). Además, se observaron extensas regiones necróticas en los tumores del grupo CAR-M, mientras que solo se detectaron focos necróticos pequeños o insignificantes en los grupos CON-M y UTD-M.

Para evaluar la seguridad, monitoreamos el peso corporal de los ratones durante todo el estudio y no observamos diferencias significativas entre los grupos (Fig. 7F). La tinción post mortem con H&E de los principales órganos (corazón, hígado, bazo, pulmones, riñones) no reveló daños patológicos aparentes (Fig. 7G). Además, un análisis bioquímico completo del suero (n = 5 por grupo) no mostró un deterioro significativo de las funciones hepáticas, renales, cardíacas o metabólicas atribuible al tratamiento con CAR-M (Archivo complementario 2).

En conjunto, estos resultados in vivo demuestran que los CAR-M dirigidos a GPA33 ejercen una potente actividad antitumoral y no muestran toxicidad sistémica detectable en un modelo de xenoinjerto inmunodeficiente. Esto apoya la investigación adicional de este enfoque en entornos más complejos e inmunocompetentes.

Para investigar la biodistribución in vivo, la persistencia y la infiltración tumoral de los macrófagos CAR, diseñamos un vector CAR-Luci, en el que la secuencia de eGFP dentro de la construcción CAR original se reemplazó por luciferasa. Las células THP-1 se transfectaron con el lentivirus CAR-Luci para generar células CAR-M-Luci que expresan el gen de la luciferasa. Para la comparación, se construyeron células CON-M-Luci utilizando un vector viral de gen de luciferasa de control. La biodistribución in vivo de los macrófagos CAR-M-Luci y CON-M-Luci administrados por vía intravenosa se evaluó posteriormente en varios puntos temporales en un modelo de tumor subcutáneo de T84 en ratones. Los resultados demostraron que CAR-M-Luci migró eficazmente al sitio del tumor, con su acumulación aumentando con el tiempo, y permaneció detectable en el tejido tumoral dos semanas después de la inyección. En contraste, CON-M-Luci consistentemente no mostró una acumulación observable dentro del tejido tumoral (Archivo complementario 1: Fig. S9).

Anticuerpos monoclonales de alta afinidad contra GPA33 basados en la tecnología de células B únicas

Para obtener scFvs de alta afinidad que se dirijan al GPA33 humano, empleamos un flujo de trabajo de generación de anticuerpos monoclonales murinos basado en la clasificación de células B únicas y las técnicas de PCR de una sola célula. El diagrama de flujo se muestra en la Fig. 1A. Primero, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular (ECD) del GPA33 humano (Ile22-Val235) se utilizó para construir un gen recombinante con una etiqueta 6×His N-terminal codificada en el marco de lectura. Este gen se sintetizó y la proteína se expresó en células HEK-293 F. El antígeno recombinante se validó mediante SDS-PAGE (Archivo complementario 1: Fig. S1). Tras la inmunización de ratones con el antígeno GPA33, los títulos séricos se evaluaron mediante ELISA indirecto (Archivo complementario 1: Fig. S2), y el ratón con el título sérico más alto se seleccionó para la posterior recuperación de la secuencia de anticuerpos. Las células plasmáticas del bazo se aislaron utilizando un kit de clasificación de células CD138-positivas, y la citometría de flujo mostró que la población de células plasmáticas clasificadas superó el 90% (Archivo complementario 1: Fig. S3). Las células plasmáticas secretoras de anticuerpos específicos para GPA33 se identificaron y se clasificaron individualmente en tubos de PCR utilizando el CellCelector (Fig. 1B). Se realizó la transcripción inversa en cada célula B única clasificada para amplificar el ADNc, y se utilizaron cebadores para amplificar las regiones variables de las cadenas pesada y ligera. Las secuencias de anticuerpos relevantes son actualmente objeto de una solicitud de patente (número de solicitud de patente 202511700515.7). Posteriormente, se produjeron anticuerpos recombinantes de acuerdo con los métodos informados en la literatura [^[14]].

El ELISA indirecto demostró que varios anticuerpos producidos (ab1, ab2, ab3, ab5) exhibieron diferentes afinidades por el antígeno GPA33 (Fig. 1C). Teniendo en cuenta que el antígeno recombinante podría no recapitular completamente la conformación nativa del GPA33, evaluamos además la unión de estos anticuerpos a las células LS174T, que sobreexpresan GPA33 (Fig. 1D), mediante citometría de flujo (Fig. 1E). Ab1, Ab3 y Ab5 se unieron al GPA33 de la superficie celular, mientras que Ab5 no mostró una afinidad específica detectable. Para confirmar la especificidad del antígeno, se utilizó Ab1 para etiquetar las líneas celulares de cáncer colorrectal y las líneas celulares de epitelio colónico normal. Los histogramas de citometría de flujo (Fig. 1F) fueron consistentes con los resultados de la expresión de GPA33 obtenidos mediante inmunoblotting (Fig. 1D), lo que indica que el anticuerpo monoclonal es específico para GPA33. También utilizamos vectores lentivirales para generar células LS174T-sh con una expresión de GPA33 establemente silenciada (Archivo complementario 1: Fig. S4A) y células 293T con una sobreexpresión estable de GPA33 (Archivo complementario 1: Fig. S4C). La sensibilidad de Ab1, Ab3 y Ab5 a los cambios en la expresión del antígeno GPA33 se evaluó mediante citometría de flujo (Archivo complementario 1: Figs. S4B, D). Los resultados indican que Ab1, Ab3 y Ab5 reconocen específicamente tanto el antígeno GPA33 endógeno como el sobreexpresado y son capaces de detectar cambios dinámicos en los niveles de expresión. Además, la inmunofluorescencia de células vivas (Fig. 1G) y la tinción de inmunofluorescencia de secciones congeladas de tejidos de cáncer colorrectal (Fig. 1H) validaron la capacidad del anticuerpo monoclonal recombinante para reconocer el antígeno GPA33 in vitro y en los tejidos tumorales. En conjunto, estos resultados indican que los anticuerpos monoclonales generados reconocen específicamente y eficazmente el GPA33 y pueden servir como fuentes de fragmentos scFv para la construcción de receptores de antígenos quiméricos específicos para GPA33.

Construcción y selección de macrófagos quiméricos de alta afinidad específicos para GPA33

Construimos scFvs a partir de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales de alta afinidad contra GPA33 (Ab1, Ab3 y Ab5). Cada scFv se fusionó a un CAR que comprende el dominio intracelular de FcγRI que contiene motivos ITAM y el dominio de reclutamiento de PI3K intracelular de CD19. Estas construcciones CAR se clonaron en un vector lentiviral y se unieron a eGFP a través de una secuencia P2A (Fig. 2A).

Para generar macrófagos con receptores de antígenos quiméricos, primero transfectamos las células THP-1 con lentivirus que codifican el CAR. La expresión de eGFP se evaluó mediante citometría de flujo, y las eficiencias de transducción de los tres lentivirus CAR y el lentivirus de control GFP superaron el 95% (Fig. 2B). Después de la co-incubación con 20 nM de antígeno His-GPA33, CAR1 (con scFv derivado de Ab1) exhibió la intensidad media de fluorescencia (MFI) más alta, más de cinco veces mayor que la de CAR5, mientras que CAR3 no mostró unión al antígeno His-GPA33 (Fig. 2C). Para evaluar la capacidad fagocítica de los tres macrófagos modificados con CAR, los macrófagos inducidos se cocultivaron con células LS174T mCherry+ en una proporción de 1:1. El análisis de citometría de flujo demostró que los macrófagos modificados con CAR1 exhibieron la actividad fagocítica más alta (Archivo complementario 1: Fig. S5). En consecuencia, CAR1 se seleccionó para experimentos posteriores y se denominó CAR a partir de ahora. La predicción estructural de AlphaFold3 combinada con el análisis de PyMOL indicó una fuerte interacción de unión entre el scFv CAR y GPA33. Como se muestra en la Fig. 2F, las dos moléculas forman una red de reconocimiento molecular a través de múltiples residuos de aminoácidos clave, que incluyen interacciones electrostáticas/de enlaces de hidrógeno Glu32–Gly102 y Glu105–Lys163, y un enlace de hidrógeno Asn55–Asp105, con distancias de 3,03 Å, 2,78 Å y 2,79 Å, respectivamente, manteniendo colectivamente la estabilidad del complejo proteico. Las células THP-1, GFP-THP-1 y CAR-THP-1 se trataron con 50 ng/mL de PMA durante 48 h, seguidas de un período de reposo de 24 horas para obtener los macrófagos correspondientes. En comparación con las células pre-inducción, la expresión de los marcadores de macrófagos CD11b y CD14 aumentó significativamente (Figs. 2D-E), lo que confirmó la inducción exitosa de los macrófagos. Estas células se denominan a partir de ahora UTD-M, CON-M y CAR-M. Independientemente de la transfección con lentivirus de control GFP o CAR, las células THP-1 y los macrófagos inducidos por PMA no mostraron diferencias significativas en la capacidad de proliferación, el ciclo celular o la viabilidad celular (Archivo complementario 1: Fig. S6).

Para evaluar si el antígeno GPA33 puede activar específicamente los macrófagos modificados con CAR, estimulamos CON-M y CAR-M con placas de cultivo recubiertas con BSA o antígeno GPA33. El análisis de citometría de flujo de los marcadores de macrófagos M1, CD80, CD86 y HLA-DR, mostró que CAR-M exhibió una regulación al alza significativa de CD80 y HLA-DR después de la estimulación con el antígeno GPA33, mientras que la expresión de CD86 no cambió significativamente (Fig. 2H). Este patrón no se observó en CON-M (Fig. 2G). Evaluamos la capacidad fagocítica no específica de ambos tipos de macrófagos utilizando cuentas fluorescentes rojas de 1 μm y no observamos cambios bajo la estimulación con BSA o antígeno GPA33 (Figs. 2I-J). En particular, los macrófagos CAR-M tratados con antígeno GPA33 exhibieron pronunciados cambios morfológicos similares a M1: las células se agrandaron sustancialmente, pasaron de una forma redondeada a una forma poligonal irregular y extendieron numerosas pseudopodos (Fig. 2J), lo que indica que el antígeno GPA33 puede inducir específicamente la polarización de macrófagos similar a M1 mediada por CAR.

CAR-M demostró una pronunciada actividad fagocítica específica para el antígeno contra células tumorales positivas para GPA33 in vitro

Para evaluar la actividad fagocítica dirigida de CAR-M contra células de cáncer colorrectal positivas para GPA33, transducimos las líneas celulares LS174T, T84 y SW620 con la proteína fluorescente roja mCherry. Además, la línea celular SW620 se transducía con una versión truncada del antígeno GPA33. Se cocultivaron CAR-M o CON-M con células LS174T-mCherry en una relación E:T de 1:1, y en varios puntos temporales, se utilizó citometría de flujo para cuantificar la proporción de células dobles positivas para GFP/mCherry como la tasa de eventos fagocíticos. Los resultados de la citometría de flujo mostraron que CAR-M exhibió una eficiencia fagocítica significativamente mayor que CON-M en todos los puntos temporales (Fig. 3A), con la máxima eficiencia que se produjo entre 1 y 2 horas. Después de una hora de cocultivo, la tasa fagocítica de CAR-M alcanzó el 20%, más de seis veces mayor que la de CON-M (Fig. 3B). Se observaron resultados similares cuando se utilizaron las células diana T84-mCherry y SW620-GPA33 (Figs. 3C-D). Un resumen de la eficiencia fagocítica de los macrófagos después de una hora de cocultivo se muestra en la Fig. 3E.

Las imágenes de los sistemas de cocultivo fotografiadas mediante microscopía de fluorescencia corroboraron aún más la fagocitosis específica del antígeno de CAR-M, y demostraron que una sola célula efectora puede endocitar múltiples células diana. Después de 24 horas de cocultivo, se observaron células diana lisadas dentro de CAR-M, pero no dentro de CON-M (Figs. 4A-C). Además, cuando las células SW620 negativas para GPA33 se cocultivaron con CAR-M y CON-M, no se detectaron eventos fagocíticos (Fig. 4C), lo que indica que la fagocitosis de CAR-M es específica del antígeno. Curiosamente, CAR-M en los sistemas de cocultivo también mostró características de macrófagos similares a M1, incluido el aumento del tamaño celular y la extensión de los pseudópodos para capturar las células diana. Concurrentemente, realizamos imágenes de fluorescencia confocal en el sistema de cocultivo de CAR-M y LS174T-mCherry, adquiriendo imágenes Z-stack para observar los procesos de captura, englobamiento y degradación de las células diana por parte de CAR-M. Las observaciones confirman que CAR-M puede matar directamente las células tumorales mediante la fagocitosis (Archivo suplementario 1: Fig. S10).

CAR-M media una potente citotoxicidad tumoral dependiente del contacto in vitro

Para investigar los efectos citotóxicos de CAR-M contra las células de cáncer colorrectal positivas para GPA33, se cocultivaron COM-M y CAR-M con células diana en una relación E:T de 5:1 durante 24 horas, y se evaluó la apoptosis de las células tumorales GFP− dentro del sistema de cocultivo mediante citometría de flujo. En las células LS174T, T84 y SW620 diseñadas para sobreexpresar una forma truncada de GPA33, CAR-M indujo un aumento significativo en la apoptosis de las células tumorales, con una elevación particularmente pronunciada en las señales de apoptosis tardía (Figs. 5A-C). Por el contrario, CAR-M no exhibió una citotoxicidad dirigida significativa contra las células SW620-Vector negativas para GPA33 (Fig. 5C). Un resumen de las proporciones de células apoptóticas se presenta en la Fig. 5D.

A continuación, realizamos un ensayo de citotoxicidad basado en la bioluminiscencia para evaluar la actividad citolítica in vitro de CAR-M. Se utilizaron células LS174T, T84, SW620-GPA33 y SW620-Vector transfectadas con luciferasa como dianas, y se midió la luminiscencia después de 24 horas de cocultivo con CON-M o CAR-M a diferentes relaciones E:T. Coherente con los ensayos de apoptosis, CAR-M demostró una potente actividad tumoricida que aumentó con mayores relaciones E:T, produciendo aproximadamente un 80% de inhibición después de 24 horas a una relación E:T de 10:1. CON-M no mostró una citotoxicidad apreciable (Figs. 5E-F). La muerte selectiva de las células SW620-GPA33, pero no de las células SW620-Vector, confirma que la muerte de las células tumorales por parte de CAR-M es específica del antígeno y mediada por CAR (Fig. 5G). Además, el análisis citométrico de flujo de las células tumorales viables restantes en los sistemas de cocultivo mantenidos a una relación E:T de 10:1 durante 24 horas reveló un número significativamente mayor de células tumorales restantes en la condición CON-M en comparación con la condición CAR-M (Figs. 5H-I). En conjunto, estos resultados indican que CAR-M puede atacar y matar de manera eficiente y específica las células tumorales positivas para GPA33 in vitro, exhibiendo una robusta actividad antitumoral. Dado el contacto directo célula a célula en el sistema de cocultivo utilizado, el efecto citotóxico de CAR-M sobre las células diana puede lograrse mediante dos mecanismos: mediación por citocinas y muerte fagocítica directa.

Para evaluar los posibles efectos fuera del objetivo, cocultivamos células NCM460-Luci con CON-M y CAR-M, respectivamente, a varias relaciones E:T durante 24 horas. La viabilidad celular se determinó posteriormente mediante un ensayo de bioluminiscencia, que reveló que no hubo una inhibición significativa de la viabilidad celular en ninguna de las relaciones E:T probadas (Archivo suplementario 1: Fig. S8 D, F). Dado el nivel extremadamente bajo de expresión del antígeno GPA33 en las células NCM460, investigamos más a fondo la expresión de GPA33 en las células epiteliales normales de la mucosa gástrica humana (GES-1). El análisis de Western blot confirmó que la línea celular GES-1 expresa el antígeno GPA33 (Archivo suplementario 1: Fig. S8 A-B). De manera similar, los ensayos de citotoxicidad realizados en células GES-1-Luci demostraron que CAR-M no ejerció efectos citotóxicos significativos sobre estas células normales que expresan el antígeno GPA33 (Archivo suplementario 1: Fig. S8 C, E).

CAR-M muestra un fenotipo sesgado hacia M1 al interactuar con células tumorales positivas para GPA33 in vitro

Una característica de los macrófagos es su marcada plasticidad. En el microambiente tumoral, los macrófagos típicamente se polarizan hacia un fenotipo similar a M2, antiinflamatorio, que promueve la progresión tumoral. Por lo tanto, revertir esta polarización es una estrategia crítica para reprogramar los macrófagos. Para determinar si GPA33 en las células tumorales puede sesgar específicamente a CAR-M hacia un estado similar a M1 y, por lo tanto, mejorar la actividad antitumoral, utilizamos citometría de flujo para evaluar los niveles de marcadores fenotípicos de macrófagos en presencia o ausencia de células diana positivas para GPA33.

En el estado de reposo, CAR-M exhibió niveles de expresión marcadamente más altos de los marcadores asociados a M1 de CD80, CD86 y HLA-DR en comparación con las células UTD-M de control (Fig. 6A). Después del cocultivo con células LS174T, la expresión de los marcadores M1 en CAR-M se mejoró aún más, mientras que UTD-M no mostró una mejora detectable de los marcadores M1 independientemente de la presencia de células tumorales (Fig. 6B). La estimulación por las células tumorales aumentó la expresión de los marcadores M2 CD163 y CD206 en UTD-M y CAR-M. Sin embargo, los niveles de CD163 y CD206 en CAR-M permanecieron sustancialmente más bajos que los de CON-M en ambas condiciones (Figs. 6C-D). Además, cuantificamos la secreción de citocinas proinflamatorias por los macrófagos en el sobrenadante de los estados de reposo y cocultivo. Los resultados de ELISA demostraron que CAR-M secretó cantidades significativamente mayores de IL-6, IL-1β, TNF-α e IFN-γ que los controles, independientemente de la estimulación por las células tumorales, mientras que la secreción de citocinas por CON-M fue significativamente menor y no se vio afectada por la presencia del antígeno tumoral GPA33 (Figs. 6J-M). En conjunto, estos datos indican que el reconocimiento específico del antígeno a través del CAR impulsa a los macrófagos hacia un estado funcional caracterizado por marcadores de superficie asociados a M1 más altos, marcadores M2 suprimidos y una mayor secreción de citocinas proinflamatorias.

CAR-M inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto

Para evaluar la eficacia terapéutica de CAR-M contra el cáncer colorrectal, establecimos un modelo de xenoinjerto subcutáneo utilizando células T84 luciferasa+. Una semana después de la inoculación de 1 × 10^6 células T84, los ratones se asignaron aleatoriamente a tres grupos que recibieron inyecciones intravenosas de PBS, macrófagos de control (UTD-M) o CAR-M semanalmente, comenzando el día 7 (Fig. 7A). En comparación con los grupos de PBS y CON-M, los tumores en el grupo CAR-M exhibieron un crecimiento volumétrico significativamente más lento (Fig. 7B). El análisis de imagen in vivo en serie demostró una marcada reducción de la carga tumoral en el grupo CAR-M (Fig. 7C). El análisis cuantitativo de la carga tumoral al final del experimento indicó que CAR-M suprime la progresión del tumor colorrectal (Fig. 7D). La tinción con HE de las secciones tumorales mostró que las células T84 retuvieron características histológicas típicas del carcinoma colorrectal después del trasplante, proporcionando así un mejor modelo para evaluar la eficacia in vivo de CAR-M (Fig. 7E). Además, se observaron extensas regiones necróticas en los tumores del grupo CAR-M, mientras que solo se detectaron focos necróticos pequeños o insignificantes en los grupos CON-M y UTD-M.

Para evaluar la seguridad, monitoreamos el peso corporal de los ratones durante todo el estudio y no observamos diferencias significativas entre los grupos (Fig. 7F). La tinción con H&E post mortem de los principales órganos (corazón, hígado, bazo, pulmones, riñones) no reveló daños patológicos aparentes (Fig. 7G). Además, un análisis bioquímico completo del suero (n = 5 por grupo) no mostró un deterioro significativo de las funciones hepática, renal, cardíaca o metabólica atribuible al tratamiento con CAR-M (Archivo suplementario 2).

En conjunto, estos resultados in vivo demuestran que los CAR-M dirigidos a GPA33 ejercen una potente actividad antitumoral y no muestran toxicidad sistémica detectable en un modelo de xenoinjerto inmunodeficiente. Esto apoya la investigación adicional de este enfoque en entornos inmunocompetentes más complejos.

Para investigar la biodistribución in vivo, la persistencia y la infiltración tumoral de los macrófagos CAR, diseñamos un vector CAR-Luci, en el que la secuencia de eGFP dentro de la construcción CAR original se reemplazó por luciferasa. Las células THP-1 se transfectaron con el lentivirus CAR-Luci para generar células CAR-M-Luci que expresan el gen de la luciferasa. Para la comparación, se construyeron células CON-M-Luci utilizando un vector viral de control del gen de la luciferasa. La biodistribución in vivo de los macrófagos CAR-M-Luci y CON-M-Luci administrados por vía intravenosa se evaluó posteriormente en varios puntos temporales en un modelo de ratón con tumor subcutáneo de T84. Los resultados demostraron que CAR-M-Luci migró eficazmente al sitio del tumor, con su acumulación aumentando con el tiempo, y permaneció detectable en el tejido tumoral dos semanas después de la inyección. En contraste, CON-M-Luci consistentemente no mostró una acumulación observable dentro del tejido tumoral (Archivo suplementario 1: Fig. S9).

Discusión

La inmunoterapia, en particular la terapia de transferencia de células adoptivas (ACT), ha surgido como un foco de investigación en oncología debido a su alta especificidad y efectos adversos relativamente bajos. ACT abarca múltiples modalidades, incluidos los linfocitos infiltrantes tumorales (TIL), las células T con receptores quiméricos de antígeno (CAR-T) y las células T con receptores de células T diseñados (TCR-T), que mejoran el propio sistema inmunitario del paciente para reconocer y erradicar las células tumorales y han demostrado un potencial sustancial [^[15], ^[16]]. En las neoplasias hematológicas, la terapia con CAR-T ha logrado un progreso significativo y ha obtenido múltiples aprobaciones de la FDA [^[17]]. Aunque las células CAR-T dirigidas a antígenos como CEA, CD133, HER2 y GCC han demostrado un potencial de actividad antitumoral contra el cáncer colorrectal [^[18]–^[21]], la aplicación clínica de CAR-T en el cáncer colorrectal aún enfrenta múltiples desafíos. Estos desafíos incluyen principalmente la escasez de antígenos específicos del tumor, el microambiente tumoral inmunosupresor que restringe la infiltración y la función de las células inmunitarias, la heterogeneidad antigénica intratumoral y los mecanismos de escape inmunitario [^[18], ^[22], ^[23]]. Además, el síndrome de liberación de citocinas grave sigue siendo un factor no despreciable que limita la aplicación de las terapias con CAR-T.

Recientemente, la nueva estrategia de utilizar macrófagos como portadores de CAR ha atraído una gran atención. Los macrófagos CAR (CAR-M) han demostrado un potencial considerable en las terapias de transferencia de células adoptivas (ACT): no solo poseen capacidades inherentes de infiltración del tejido tumoral, sino que también eliminan directamente las células tumorales mediante la fagocitosis, secretan citocinas proinflamatorias para activar la inmunidad adaptativa y remodelan el microambiente inmunitario [^[24], ^[25]]. Los CAR-M exhiben ventajas distintas en la inhibición de la polarización M2 de los macrófagos asociados al tumor y en la promoción de la polarización M1, superando así la tolerancia inmunitaria en los tumores sólidos y mejorando la eficacia terapéutica [^[25]]. Una terapia celular CAR-M reciente dirigida a tumores sólidos avanzados con sobreexpresión de HER2 —CT-0508— ha mostrado resultados favorables en cuanto a seguridad y viabilidad [^[26]], lo que brinda confianza a los investigadores para explorar las aplicaciones de los CAR-M en neoplasias sólidas. Aunque los CAR-M están recibiendo cada vez más atención para el tratamiento de tumores sólidos, su aplicación en el cáncer colorrectal aún no se ha investigado y requiere un estudio más profundo.

Desde su descubrimiento, GPA33 ha sido un objetivo importante en la investigación del cáncer colorrectal debido a su patrón de expresión distintivo: alta expresión en los tumores gastrointestinales primarios y sus metástasis, junto con una expresión restringida en los tejidos normales, lo que lo convierte en uno de los objetivos preferidos para las terapias dirigidas al cáncer colorrectal. Las estrategias basadas en anticuerpos, radiofármacos y CAR-T dirigidas a GPA33 ya han mostrado un progreso preliminar [^[13], ^[27]–^[29]], lo que subraya el potencial traslacional de GPA33 en los tumores colorrectales. En este estudio, realizamos una tinción de inmunohistoquímica en tejidos de cáncer colorrectal y otros tejidos normales. Coherente con informes anteriores, GPA33 no solo se expresa abundantemente y de forma continua en los tejidos tumorales, sino que también tiene una distribución limitada en los tejidos normales (Archivo suplementario 1: Fig. S7), lo que destaca su eficacia y seguridad como objetivo CAR. Por lo tanto, llevamos a cabo un estudio de prueba de concepto sobre CAR-M dirigidos a GPA33 utilizando macrófagos derivados de THP-1.

Los receptores quiméricos de antígenos (CAR) son proteínas de fusión compuestas principalmente por un dominio de reconocimiento de antígenos, una región de unión, un dominio transmembrana y motivos de señalización intracelular. El dominio de reconocimiento de antígenos es típicamente un fragmento de cadena variable de un solo dominio (scFv) o un ligando natural y es responsable del reconocimiento específico del antígeno diana, determinando así la afinidad del CAR por el epítopo antigénico [^[30]]. La afinidad es uno de los parámetros clave que rigen la funcionalidad de las células CAR-T y la eficacia terapéutica. Las células CAR-T de alta afinidad exhiben una mayor sensibilidad al reconocer las células tumorales que expresan antígenos a bajos niveles, lo que confiere una marcada ventaja en la actividad antitumoral [^[31]]. Los estudios han demostrado que los dominios de unión de alta afinidad diseñados computacionalmente, utilizados para construir CAR dirigidos a EGFR o CD276, no solo promueven la proliferación de las células CAR-T y la secreción de citocinas citotóxicas, sino que también aumentan la resistencia al agotamiento celular [^[32]]. La optimización de la afinidad del scFv puede mejorar aún más la eficacia contra los tumores con baja expresión de antígenos y ayudar a prevenir la recurrencia debido a la pérdida de antígenos [^[33]]. Sin embargo, las células CAR-T de alta afinidad tienen limitaciones significativas, notablemente un mayor riesgo de toxicidad "on-target, off-tumor": las células CAR-T pueden atacar los tejidos normales que expresan el antígeno diana a bajos niveles, lo que resulta en un daño grave a los órganos sanos. Por ejemplo, las células CAR-T dirigidas a HER2 de alta afinidad, a pesar de su potente actividad antitumoral, han inducido toxicidades fatales causadas por la activación y el direccionamiento excesivos de HER2 expresado en los tejidos normales, manifestándose como inflamación y lesión celular en los tejidos normales HER2-positivos y, en algunos casos, síndrome de liberación de citocinas (CRS) [^[34]]. La modulación de la afinidad puede optimizar la eficacia antitumoral de las células CAR-T al tiempo que reduce los efectos adversos inespecíficos [^[31], ^[34]].

A diferencia de las células CAR-T, estudios previos han demostrado que la liberación de citocinas inducida por los CAR-M es relativamente leve y que no se ha observado CRS grave a nivel clínico. Esto está estrechamente relacionado con su perfil de activación inmunitaria más controlable y su modo de acción predominantemente localizado [^[35]]. Por lo tanto, en lugar de evitar la activación inespecífica y los posibles riesgos citotóxicos, aumentar la afinidad del CAR para mejorar el reconocimiento del antígeno diana por parte de los macrófagos y la función tumoricida es de mayor importancia. Para obtener fragmentos de direccionamiento óptimos, empleamos una plataforma de cribado de una sola célula B para aislar células B específicas del antígeno del bazo de ratones inmunizados con GPA33 y recuperar directamente las secuencias de las regiones variables de cadena pesada y ligera emparejadas de forma natural mediante PCR de una sola célula (Fig. 1A). Este enfoque evita la pérdida de afinidad o el sesgo del marco que pueden surgir del cribado convencional de bibliotecas de fagos y produjo múltiples anticuerpos monoclonales anti-GPA33 recombinantes con afinidades en el rango nanomolar (Figs. 1C, E). Luego, utilizamos dominios scFv derivados de varios de estos anticuerpos como regiones de reconocimiento de antígenos para construir moléculas CAR para macrófagos. El dominio de activación intracelular CAR comprendía una secuencia ITAM de FcγRI, capaz de desencadenar la fagocitosis y las funciones inmunorreguladoras de los macrófagos, junto con una secuencia de reclutamiento de PI3K de CD19 para mejorar la capacidad de fagocitosis de los macrófagos [^[36]]. Los CAR-M se generaron mediante la transducción de la línea celular THP-1 con lentivirus que expresan CAR, y los ensayos de fagocitosis demostraron que los macrófagos CAR1, que poseían la mayor afinidad por el antígeno, también exhibieron la actividad fagocítica más fuerte (Archivo suplementario 1: Fig. S5).

Este estudio proporciona evidencia inicial de prueba de concepto, tanto de experimentos in vitro como in vivo, para el direccionamiento de GPA33 con CAR-M en modelos de cáncer colorrectal. Nuestros hallazgos establecen el perfil de actividad fundamental de los CAR-M dirigidos a GPA33 y respaldan su mayor investigación como una posible estrategia terapéutica. La actividad antitumoral de los CAR-M dirigidos a GPA33 se demuestra mediante los siguientes hallazgos: al interactuar con el antígeno GPA33, los CAR-M exhibieron una tendencia hacia un fenotipo similar a M1 (Figs. 2G, H) y una potente actividad tumoricida dependiente del antígeno (Fig. 5). Este cambio funcional se basó en una mayor capacidad fagocítica y un aumento de la secreción de citocinas proinflamatorias, incluidas IL-6, IL-1β, IFN-γ y TNF-α (Figs. 3, 4 y 6). En particular, la regulación al alza de las moléculas de la clase II del MHC (HLA-DR) en los CAR-M sugiere un potencial para una mayor presentación de antígenos, una característica que, si se conserva en entornos inmunocompetentes, podría contribuir a la inmunidad adaptativa [^[24], ^[37]]. Esta actividad localizada de las citocinas proinflamatorias se asocia con un perfil de seguridad favorable, ya que los aumentos de los niveles de citocinas solo se observaron dentro del tumor y no a nivel sistémico [^[38]]. Los estudios han demostrado que incluso cuando los macrófagos se prepolarizan a un fenotipo M1 in vitro, los altos niveles de factores proinflamatorios producidos tras la administración in vivo son insuficientes para causar citotoxicidad sistémica [^[39], ^[40]]. Si bien las redes de citocinas son fundamentales para los efectos mediados por los macrófagos, nuestro estudio en modelos inmunodeficientes demuestra principalmente su papel directo en la muerte de las células tumorales. La actividad antitumoral localizada observada en nuestro modelo de xenoinjerto se asoció con un perfil de seguridad favorable, ya que no se detectó toxicidad sistémica (Fig. 7, Archivo suplementario 2). En conjunto, estos datos validan la premisa funcional central de los CAR-M dirigidos a GPA33 y justifican su futura evaluación en modelos que permitan la evaluación del remodelamiento del microambiente inmunitario y la inmunomodulación sistémica.

Si bien la actividad antitumoral y el perfil de seguridad preliminar de los CAR-M se han establecido en nuestros modelos preclínicos, su desarrollo traslacional para el cáncer colorrectal enfrenta varios desafíos clave. La expresión de antígenos varía considerablemente tanto dentro como entre los tumores de CRC, y las células tumorales pueden evadir la vigilancia inmunitaria a través de variantes de pérdida de antígenos [^[16], ^[41]]. Los estudios han demostrado que GPA33 puede perderse en el borde del tumor invasor, mientras que la inhibición de la actividad de WNT puede inducir la reexpresión del antígeno GPA33 en las poblaciones tumorales GPA33-negativas [^[13]]. Este fenómeno refleja la inestabilidad de los antígenos tumorales dentro del complejo microambiente inmunitario, donde su expresión se ve fácilmente alterada por la señalización paracrina local. Sin embargo, la plasticidad de las células del cáncer colorrectal también ofrece nuevas vías para las terapias ACT. Por ejemplo, los investigadores han propuesto combinar inhibidores de WNT con células CAR-T EpCAM para mejorar el reconocimiento y la infiltración de las células CAR-T en los tumores [^[42]]. Este enfoque también sugiere una posible estrategia para las futuras terapias ACT dirigidas a GPA33, en la que la coadministración de inhibidores de WNT podría aumentar la eficacia de los CAR-M dirigidos a GPA33.

Limitaciones del estudio y direcciones futuras

Si bien este estudio se centró principalmente en la validación preliminar de los CAR-M dirigidos a GPA33 en posibles estrategias terapéuticas para el cáncer colorrectal, es crucial reconocer que la dependencia de las líneas celulares THP-1 diferenciadas inducidas por PMA como modelo de macrófagos constituye una limitación clara. Si bien este modelo facilita investigaciones controladas y reproducibles sobre la expresión y la función de los receptores quiméricos de antígenos (CAR), no puede replicar completamente la complejidad de los macrófagos humanos primarios. En consecuencia, los fenotipos observados, particularmente los resultados sobre citocinas específicas y tendencias de polarización, pueden no ser directamente extrapolables a los macrófagos humanos primarios. El trabajo futuro debe validar estos hallazgos críticos en macrófagos derivados de monocitos humanos primarios (hMDM) y, en última instancia, en modelos de macrófagos derivados de pacientes, lo cual es esencial para evaluar el potencial traslacional de nuestro enfoque. Además, la investigación del rendimiento de estos macrófagos diseñados con CAR en modelos más complejos del microambiente tumoral in vivo será el siguiente paso crucial. La capacidad de presentación de antígenos y la capacidad de activación de la inmunidad adaptativa de los CAR-M se validarán aún más en futuros modelos de ratón humanizados o modelos sinérgicos inmunocompetentes. Nuestro estudio sobre los CAR-M en el cáncer colorrectal representa un paso importante hacia la exploración de posibles soluciones para la inmunoterapia del cáncer colorrectal.

Limitaciones del estudio y direcciones futuras

Si bien este estudio se centró principalmente en la validación preliminar de los CAR-M dirigidos a GPA33 en posibles estrategias terapéuticas para el cáncer colorrectal, es crucial reconocer que la dependencia de las líneas celulares THP-1 diferenciadas inducidas por PMA como modelo de macrófagos constituye una limitación clara. Si bien este modelo facilita investigaciones controladas y reproducibles sobre la expresión y la función de los receptores quiméricos de antígenos (CAR), no puede replicar completamente la complejidad de los macrófagos humanos primarios. En consecuencia, los fenotipos observados, particularmente los resultados sobre citocinas específicas y tendencias de polarización, pueden no ser directamente extrapolables a los macrófagos humanos primarios. El trabajo futuro debe validar estos hallazgos críticos en macrófagos derivados de monocitos humanos primarios (hMDM) y, en última instancia, en modelos de macrófagos derivados de pacientes, lo cual es esencial para evaluar el potencial traslacional de nuestro enfoque. Además, la investigación del rendimiento de estos macrófagos diseñados con CAR en modelos más complejos del microambiente tumoral in vivo será el siguiente paso crucial. La capacidad de presentación de antígenos y la capacidad de activación de la inmunidad adaptativa de los CAR-M se validarán aún más en futuros modelos de ratón humanizados o modelos sinérgicos inmunocompetentes. Nuestro estudio sobre los CAR-M en el cáncer colorrectal representa un paso importante hacia la exploración de posibles soluciones para la inmunoterapia del cáncer colorrectal.

Información complementaria

A continuación, se muestra el enlace al material complementario electrónico.