CX3CR1 identifica un potente subconjunto de células T CD8(+) efectoras asociado a la eficacia terapéutica anti-PD-1 en cáncer colorrectal.

El CRC sigue siendo una de las principales causas de mortalidad por cáncer, y se prevé que ocupe el tercer lugar en incidencia en 2025 (^[1]). A pesar de los avances en las terapias quirúrgicas y sistémicas, el pronóstico de la enfermedad avanzada sigue siendo subóptimo, con tasas de supervivencia a 5 años de solo el 40% para la enfermedad oligometastásica y de aproximadamente el 20% para los casos metastásicos (^[2]–^[7]). En consecuencia, el bloqueo de los puntos de control inmunitarios, específicamente dirigido a la vía PD-1/PD-L1, se ha consolidado como un pilar fundamental de la oncología moderna (^[8], ^[9]). Si bien la aprobación de los inhibidores de los puntos de control inmunitarios (ICIs) para los tumores con alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H)/dMMR marcó un cambio de paradigma en la oncología de precisión (^[10]–^[12]), los beneficios clínicos son limitados. El fenotipo MSI-H comprende solo alrededor del 15% de los casos de CRC, y este porcentaje disminuye al 4-5% en la enfermedad metastásica (^[13], ^[14]). Por el contrario, el fenotipo predominante de microsatélites estables (MSS) suele manifestarse como inmunológicamente "frío" y resistente a los ICIs (^[15]). Además, la eficacia terapéutica no está garantizada, incluso dentro de la cohorte MSI-H, donde aproximadamente el 30% al 50% de los pacientes presentan refractariedad primaria o adquieren resistencia al tratamiento con anti-PD-1 en monoterapia (^[11], ^[16]). Por lo tanto, es imprescindible analizar la heterogeneidad del microambiente tumoral (TME) para identificar subconjuntos específicos de células T que impulsen la inmunidad antitumoral, con el fin de superar la resistencia y mejorar la estratificación de los pacientes.

La eficacia clínica de la inhibición de PD-1 depende de la revitalización de los linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) y de la reversión de la inmunosupresión microambiental. Mecánicamente, el bloqueo de PD-1 no solo alivia la señalización inhibitoria directa sobre el TCR y CD28, sino que también impulsa la reprogramación metabólica, lo que permite a las células T recuperar su aptitud mitocondrial y persistir en el TME con pocos nutrientes (^[17]). Además, esta revitalización impulsa una interacción recíproca con el TME, de modo que las células T revitalizadas liberan citocinas proinflamatorias como el IFN-γ. Esta secreción, a su vez, induce a las células estromales y mieloides a producir quimiocinas como CXCL9 y CXCL10, estableciendo un circuito de retroalimentación que amplifica la infiltración de subconjuntos específicos de células T efectoras en el lecho tumoral (^[18], ^[19]). De hecho, la densidad de estos efectores, cuantificada como el Immunoscore, ofrece una mayor precisión pronóstica en comparación con la estadificación TNM tradicional (^[20]–^[22]). Sin embargo, los linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) exhiben una profunda heterogeneidad. La exposición crónica a antígenos suele llevar a las células T a un estado disfuncional de agotamiento, caracterizado por la sobreexpresión de moléculas inhibidoras (por ejemplo, PD-1, TIM-3) y una citotoxicidad alterada (^[23], ^[24]). Si bien la revitalización de las células T agotadas es el objetivo principal de los ICIs, los análisis de alta dimensión a nivel de célula única sugieren que el beneficio terapéutico también puede depender del reclutamiento y el mantenimiento de subconjuntos efectores específicos no agotados (^[25], ^[26]). En consecuencia, distinguir los efectores genuinos de las poblaciones terminalmente agotadas es fundamental para dilucidar los mecanismos de respuesta a los ICIs.

CX3CR1 actúa como un receptor acoplado a proteína G (GPCR) canónico, que media la transducción de señales a través de su interacción con las proteínas G heterotriméricas. Estructuralmente, esta proteína de 355 aminoácidos se caracteriza por una arquitectura alfa-helicoidal de siete transmembranas. Su topología incluye un N-terminal extracelular y bucles responsables de la unión al ligando CX3CL1, junto con un C-terminal intracelular y bucles que forman el sitio de unión para las subunidades alfa de la proteína G (^[27], ^[28]). Genéticamente, el locus CX3CR1 se mapea al cromosoma 3p22.2, y comprende cuatro exones y tres intrones, con una actividad transcripcional estrictamente regulada por tres promotores ascendentes distintos: P1, P2 y P3 (^[29]). Más allá de sus características moleculares fundamentales, CX3CR1 ahora se reconoce ampliamente como un indicador sólido del estado de diferenciación de las células T (^[30]). En el contexto de la infección viral crónica y la malignidad, la expresión de CX3CR1 identifica una subpoblación específica de células T efectoras de memoria (Tem). Estas células se distinguen de los progenitores similares a células madre y de las poblaciones terminalmente agotadas por su potente capacidad citolítica a pesar de su limitada capacidad de proliferación (^[31], ^[32]). La evidencia emergente de cohortes clínicas en melanoma y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) sugiere que la frecuencia de células CX3CR1+CD8+T, ya sean circulantes o infiltrantes tumorales, se correlaciona positivamente con la eficacia terapéutica tras la inhibición de PD-1 (^[33], ^[34]). Recientemente, atlas integrales de células únicas a nivel de todo el cáncer han caracterizado ampliamente a las células CX3CR1+CD8+T como un subconjunto efector terminal distinto de las poblaciones agotadas (^[35], ^[36]). Sin embargo, las redes reguladoras transcripcionales específicas que gobiernan la generación y el mantenimiento de este subconjunto dentro del microambiente inmunitario único del CRC, y su valor clínico preciso en la estratificación de poblaciones heterogéneas (por ejemplo, MSI-H frente a MSS), aún deben dilucidarse por completo.

En este estudio, empleamos un enfoque multi-ómico integrado mediante la combinación de scRNA-seq, mIHC y el perfilado de cohortes clínicas a gran escala para caracterizar sistemáticamente el panorama de las células CX3CR1+CD8+T dentro del microambiente tumoral del CRC. Identificamos este subconjunto como una población distinta de células efectoras de memoria terminal (Temra) no agotadas, caracterizadas por una potente citotoxicidad y características mínimas de agotamiento. Clínicamente, la robusta infiltración intratumoral de este subconjunto sirvió como un factor pronóstico independiente asociado con una supervivencia general (OS) prolongada. Mecánicamente, utilizando modelos in vivo e inferencia SCENIC, demostramos que el bloqueo de PD-1 revitaliza la inmunidad antitumoral al impulsar la expansión intratumoral y la persistencia funcional de estos efectores a través de una red reguladora transcripcional orquestada por ETS1 y PRDM1. En conjunto, estos hallazgos destacan el subconjunto CX3CR1+ como un determinante fundamental de la eficacia de la inmunoterapia, lo que proporciona una base para dirigir esta población con el fin de superar la resistencia en el CRC.

Materiales y métodos

Cohorte de pacientes y muestras de tejido

Se obtuvo un microarray de tejido de CRC de alta densidad de Shanghai Outdo Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China) y se utilizó para la presente investigación. Los identificadores de producto específicos son Cat. No. HColA180Su22 y Protocol No. XCSW-JS1-SOP-002-F0. La cohorte original comprendió 94 núcleos de tejido tumoral de CRC confirmados patológicamente y 86 núcleos de tejido no tumoral adyacente correspondientes. Para garantizar la solidez de nuestra evaluación pronóstica, implementamos criterios de elegibilidad rigurosos. La cohorte comprendió exclusivamente a individuos no tratados previamente, lo que significa que ningún paciente había recibido quimioterapia neoadyuvante preoperatoria, radioterapia o cualquier otra forma de intervenciones antitumorales. Se recuperaron parámetros clinicopatológicos completos para cada paciente, incluido el género, la edad, las dimensiones del tumor, el grado de diferenciación y la estadificación TNM. La cohorte abarcó las resecciones quirúrgicas realizadas entre febrero de 2012 y noviembre de 2014, con un seguimiento clínico que se extendió hasta junio de 2021. La cohorte de estudio final consistió en 78 pacientes, después de que se eliminaran del conjunto de datos aquellos con información clínica faltante, pérdida de seguimiento o núcleos de tejido dañados. Aprobado por el Comité de Ética de la Investigación Clínica de Shanghai Outdo Biotech Co., Ltd. (No. SHYJS-CP-230902), todos los procedimientos de investigación se llevaron a cabo en estricta conformidad con las normas éticas pertinentes.

Tinción inmunohistoquímica multicolor

La coexpresión espacial de PANCK, CD8 y CX3CR1 en los tejidos de CRC se evaluó mediante tinción inmunohistoquímica multicolor (mIHC) (AlphaX TSA 7-Color Kit, Cat. No. AXT37100041) según los protocolos estándar. Primero, las láminas se calentaron a 63 °C durante 60 minutos, seguidas de la desparafinación y rehidratación automatizadas utilizando xileno y gradientes de alcohol, respectivamente. Se realizó una recuperación de antígeno asistida por microondas en un tampón 1×. Para minimizar el ruido de fondo, la peroxidasa endógena se inhibió con H2O2 y los sitios no específicos se bloquearon. Posteriormente, los tejidos se tiñeron con anticuerpos primarios contra CD8 (clon 66868-1-Ig, 1:2000) y CX3CR1 (clon ab167571, 1:50). Posteriormente, la detección se logró utilizando anticuerpos secundarios conjugados con HRP emparejados con fluoróforos de amplificación de señal de tiramina (TSA). Entre las rondas de tinción, los complejos anticuerpo-TSA se eliminaron mediante tratamiento térmico con microondas. Los núcleos se contrateñeron con DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) y, posteriormente, las láminas se montaron utilizando un reactivo antifade. Se adquirieron imágenes de toda la lámina utilizando el sistema de imagen ZEN 3.3, y el análisis cuantitativo de la expresión de los marcadores se realizó utilizando el software de análisis de patología HALO.

Adquisición de imágenes y análisis cuantitativo

El escaneo digital de toda la lámina de los TMA teñidos se realizó utilizando el sistema Zeiss Axioscan 7. Las imágenes multiespectrales sin procesar se procesaron y analizaron utilizando el software ZEN 3.3. Posteriormente, se empleó la separación espectral para diferenciar las emisiones de fluoróforos individuales. Este proceso se basó en una biblioteca de firmas espectrales únicas, que se estableció meticulosamente utilizando secciones de tejido teñidas individualmente como controles. Para el análisis cuantitativo, el canal DAPI sirvió como máscara nuclear para identificar células individuales. Las células únicas válidas se segmentaron mediante el filtrado basado en el área nuclear y la intensidad de la fluorescencia, eliminando así los restos celulares y los agregados superpuestos. Posteriormente, se cuantificaron los niveles de expresión de proteínas dentro de compartimentos celulares específicos (nuclear y/o citoplasmático). Se establecieron umbrales de intensidad específicos para definir poblaciones de marcadores positivos, y la frecuencia de cada subconjunto de células se calculó en relación con el número total de células teñidas con DAPI válidas.

Adquisición y análisis bioinformático de conjuntos de datos públicos

Los datos de secuenciación de ARN de células únicas de cáncer colorrectal humano se obtuvieron del repositorio GEO (GSE236581). El paquete R Seurat se utilizó para todos los análisis posteriores, incluidos los métodos de reducción de dimensionalidad y los algoritmos de agrupamiento no supervisado. Los subconjuntos de células inmunitarias, con un enfoque específico en las células T CD8+, se anotaron en función de los marcadores canónicos referenciados en CellMarker 2.0 y se visualizaron utilizando ggplot2. Para validar la relevancia clínica y la amplia aplicabilidad de nuestros hallazgos, curamos un compendio completo de conjuntos de datos de transcriptómica a granel. Esto incluyó la cohorte TCGA-COAD y múltiples cohortes clínicas independientes de pacientes tratados con ICIs (anti-PD-1/L1 o anti-CTLA-4). Se analizaron múltiples cohortes de tumores sólidos, que abarcaron melanoma, carcinoma urotelial, carcinoma de células renales y NSCLC, utilizando datos de IMvigor210 y conjuntos de datos GEO (GSE78220, GSE91061 y GSE126044).

Ratones y líneas celulares

Se compraron ratones hembra C57BL/6J de 6 a 8 semanas de edad a Cavens Laboratory Animal Co. y se mantuvieron en condiciones SPF. Los experimentos con animales se llevaron a cabo después de la aprobación del Comité de Ética del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad de Soochow y en estricta conformidad con las normas institucionales. Las células MC38, una línea de adenocarcinoma de colon derivada de ratón, se compraron al Instituto de Ciencias de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China) y se mantuvieron en DMEM que contiene un 10% de FBS y antibióticos a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2.

Modelos tumorales in vivo y tratamiento

Para la generación del modelo tumoral subcutáneo, se inyectó a ratones C57BL/6J una suspensión de células MC38 (1×106) en 100 μL de PBS por vía subcutánea. Tras la formación palpable del tumor (día 5 después de la inoculación), los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos de control y tratamiento con anti-PD-1. El grupo de tratamiento recibió inyecciones intraperitoneales (i.p.) de anticuerpo monoclonal anti-PD-1 para ratones (200 μg/dosis; clon J43, Bio X Cell) en los días 5, 8, 11 y 14. A los ratones del grupo de control se les administró IgG isotípica correspondiente. Para los análisis posteriores, incluido el citometría de flujo y el secuenciamiento de ARN unicelular (scRNA-seq), los tumores se recolectaron 24 horas después del tratamiento.

Citometría de flujo y tinción intracelular de citocinas

Para evaluar el fenotipo y la función de las células infiltrantes del tumor (TIL), los especímenes tumorales se sometieron a digestión enzimática con Liberase TL y DNase I (37 °C, 30 min). Para preparar preparaciones de células individuales, la mezcla celular se pasó a través de un tamiz de 100 μm, seguido de la suspensión en solución salina tamponada con Hank suplementada con un 1% de suero fetal bovino. Los linfocitos se activaron ex vivo utilizando un cóctel de activación celular que contenía Brefeldin A (BioLegend) durante 5 horas antes de la tinción para evaluar la actividad funcional. Para la caracterización inmunofenotípica, se evaluaron los marcadores de superficie e intracelulares utilizando un protocolo de citometría de flujo de múltiples pasos. Las células viables se identificaron utilizando un tinte de viabilidad fijable (Ghost Dye™ Violet 510) y se tiñeron para CD45 (30F11), CD3 (17A2), CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7) y CX3CR1 (SA011F11). Después de la fijación y permeabilización (Invitrogen), se realizó la detección intracelular de interferón-γ (IFN-γ) (XMG1.2), factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-α) (MP6-XT22) y granzima B (GB11). Los datos se recolectaron en un sistema DxFLEX (Beckman Coulter) y se procesaron utilizando el software FlowJo.

Procesamiento de datos de scRNA-seq de ratones

Siguiendo un protocolo previamente establecido (^[37]), la alineación de las lecturas sin procesar al genoma del ratón (mm10) se realizó con el conjunto de software Cell Ranger (v4.0.0). Los análisis posteriores se ejecutaron dentro del entorno R utilizando el paquete Seurat (v4.x). Para garantizar la integridad de los datos, se aplicó una rigurosa canalización de control de calidad: los posibles dobletes se excluyeron mediante DoubletFinder y las células de baja calidad se filtraron en función de criterios específicos (200 < nFeatureRNA < 6000; nCountRNA < 50000; contenido mitocondrial < 10%). Se utilizó el análisis de componentes principales para reducir la dimensionalidad de los datos de forma lineal, tras la aplicación de la escala LogNormalize y la detección de los genes altamente variables (HVG). Para mitigar los efectos de lote técnico entre las muestras, se empleó el algoritmo Harmony para la integración de datos. Utilizando componentes principales informativos, aplicamos la incrustación no lineal y la agrupación basada en gráficos no supervisada implementada en FindNeighbors y FindClusters, tras lo cual se anotaron los tipos de células según las firmas de genes marcadores característicos.

Inferencia de la trayectoria de pseudotiempo

Para reconstruir la jerarquía de desarrollo y las líneas de diferenciación de las células CD8+T, se realizó la inferencia de la trayectoria utilizando los paquetes R Monocle 2 y Slingshot. Para facilitar el análisis de Monocle, las matrices de expresión génica se extrajeron del objeto Seurat y se transformaron al formato CellDataSet requerido. Se realizó un modelado estadístico de la varianza de la expresión génica utilizando las funciones estimateSizeFactors y estimateDispersions. Posteriormente, se ejecutó la reducción de dimensionalidad y el ordenamiento de células mediante el algoritmo DDRTree (reducción de dimensionalidad discriminativa mediante el aprendizaje de un árbol), basándose en los genes altamente variables (HVG) identificados. Las células se proyectaron en el colector inferido para visualizar la transición fenotípica desde un estado ingenuo a un estado efector a lo largo del pseudotiempo latente.

Análisis de enriquecimiento funcional

Para dilucidar los procesos biológicos y los impulsores moleculares responsables del remodelamiento del microambiente tumoral (TME) inducido por la terapia anti-PD-1, realizamos un perfilado sistemático de enriquecimiento funcional de los genes expresados diferencialmente (DEG) identificados. Se empleó el paquete clusterProfiler (versión 4.8.3) para evaluar el enriquecimiento funcional en los dominios de Gene Ontology y las vías KEGG. La anotación de los genes de ratón se basó en la base de datos org.Mm.eg.db. Para tener en cuenta las comparaciones múltiples, los valores P se corrigieron utilizando el enfoque de Benjamini-Hochberg, y se retuvieron los resultados de enriquecimiento con valores P ajustados por FDR inferiores a 0,05. Las vías más relevantes que se sobreexpresaron o subexpresaron en el grupo de tratamiento en relación con los controles se visualizaron mediante gráficos de barras y gráficos de burbujas para ilustrar las transiciones funcionales clave inducidas por el bloqueo de PD-1.

Análisis de la comunicación célula-célula

Para caracterizar el panorama de la comunicación intercelular, empleamos el paquete R CellChat (versión 1.6.1). Las interacciones ligando-receptor se compararon sistemáticamente entre los grupos pre y postratamiento utilizando la base de datos de referencia CellChatDB. Para garantizar la solidez de nuestras inferencias estadísticas, las probabilidades de interacción se estimaron solo para los grupos de células que contenían al menos 10 células. Posteriormente, se realizó un análisis diferencial para identificar las vías de señalización que presentaban cambios significativos en el flujo global de información y la fuerza de interacción acumulada. Las visualizaciones de datos se generaron a través de las funciones integradas de CellChat y el marco ComplexHeatmap (versión 2.22.0).

Análisis estadístico

Todos los análisis se realizaron en R (versión 4.4.1), y las figuras se generaron utilizando GraphPad Prism 8. Se aplicó el paquete survminer para determinar los umbrales óptimos para la dicotomización de la expresión génica. Los datos continuos se compararon entre los grupos utilizando la prueba de Wilcoxon. La relevancia pronóstica de la infiltración de células CD8+CX3CR1+ se evaluó mediante la estimación de la supervivencia de Kaplan-Meier y la comparación de rangos logarítmicos. Para construir un modelo pronóstico estable, las variables se seleccionaron mediante la regresión de Cox univariada seguida de la regresión de subconjunto óptimo (BSR) y la regresión LASSO con validación cruzada. Los factores retenidos de estos análisis se incluyeron posteriormente en un modelo de riesgos proporcionales de Cox multivariado para identificar los determinantes pronósticos independientes y desarrollar un nomograma. Se consideró que un valor P bilateral inferior a 0,05 era estadísticamente significativo.

Cohorte de pacientes y muestras de tejido

Se obtuvo un microarreglo de tejido (TMA) de alta densidad de CRC de Shanghai Outdo Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China) y se utilizó para la presente investigación. Los identificadores de producto específicos son Cat. No. HColA180Su22 y Protocol No. XCSW-JS1-SOP-002-F0. La cohorte original comprendía 94 núcleos de tejido tumoral de CRC confirmados patológicamente y 86 núcleos de tejido adyacente no tumoral correspondientes. Para garantizar la solidez de nuestra evaluación pronóstica, implementamos rigurosos criterios de elegibilidad. La cohorte se compuso exclusivamente de individuos no tratados previamente, lo que significa que ningún paciente había recibido quimioterapia neoadyuvante preoperatoria, radioterapia o cualquier otra forma de intervenciones antitumorales. Se recuperaron parámetros clinicopatológicos completos para cada paciente, incluido el género, la edad, las dimensiones del tumor, el grado de diferenciación y la estadificación TNM. La cohorte abarcó las resecciones quirúrgicas realizadas entre febrero de 2012 y noviembre de 2014, con un seguimiento clínico que se extendió hasta junio de 2021. La cohorte de estudio final consistió en 78 pacientes, después de que se eliminaran del conjunto de datos aquellos con información clínica faltante, pérdida de seguimiento o núcleos de tejido dañados. Aprobado por el Comité de Ética de la Investigación Clínica de Shanghai Outdo Biotech Co., Ltd. (No. SHYJS-CP-230902), todos los procedimientos de investigación se llevaron a cabo en estricta conformidad con las normas éticas pertinentes.

Tinción inmunohistoquímica multicolor

La coexpresión espacial de PANCK, CD8 y CX3CR1 en los tejidos de CRC se evaluó mediante tinción inmunohistoquímica multicolor (mIHC) (AlphaX TSA 7-Color Kit, Cat. No. AXT37100041) según los protocolos estándar. Primero, las láminas se calentaron a 63 °C durante 60 minutos, seguidas de la desparafinación y rehidratación automatizadas utilizando xileno y gradientes de alcohol, respectivamente. Se realizó una recuperación de antígeno asistida por microondas en un tampón 1×. Para minimizar el ruido de fondo, la peroxidasa endógena se inhibió con H2O2 y los sitios no específicos se bloquearon. Posteriormente, los tejidos se tiñeron utilizando anticuerpos primarios contra CD8 (clon 66868-1-Ig, 1:2000) y CX3CR1 (clon ab167571, 1:50). Posteriormente, la detección se logró utilizando anticuerpos secundarios conjugados con HRP emparejados con fluoróforos de amplificación de señal de тирамида (TSA). Entre las rondas de tinción, los complejos anticuerpo-TSA se eliminaron utilizando el tratamiento térmico por microondas. Los núcleos se contratiñeron con DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) y las láminas se montaron posteriormente utilizando un reactivo antidesvanecimiento. Se adquirieron imágenes de toda la lámina utilizando el sistema de imágenes ZEN 3.3, y se realizó un análisis cuantitativo de la expresión de los marcadores utilizando el software de análisis de patología HALO.

Adquisición de imágenes y análisis cuantitativo

Se realizó el escaneo digital de toda la lámina de los TMA teñidos utilizando el sistema Zeiss Axioscan 7. Las imágenes multiespectrales sin procesar se procesaron y analizaron utilizando el software ZEN 3.3. Posteriormente, se empleó la separación espectral para diferenciar las emisiones de fluoróforos individuales. Este proceso se basó en una biblioteca de firmas espectrales únicas, que se estableció meticulosamente utilizando secciones de tejido teñidas individualmente como controles. Para el análisis cuantitativo, el canal DAPI sirvió como máscara nuclear para identificar las células individuales. Las células individuales válidas se segmentaron filtrando en función del área nuclear y la intensidad de la fluorescencia, eliminando así los desechos celulares y los agregados superpuestos. Posteriormente, se cuantificaron los niveles de expresión de proteínas dentro de compartimentos celulares específicos (nuclear y/o citoplasmático). Se establecieron umbrales de intensidad específicos para definir las poblaciones de marcadores positivos, y se calculó la frecuencia de cada subconjunto de células en relación con el número total de células teñidas con DAPI válidas.

Adquisición de conjuntos de datos públicos y análisis bioinformático

Los datos de scRNA-seq de cáncer colorrectal humano se obtuvieron del repositorio GEO (GSE236581). El paquete R Seurat se utilizó para todos los análisis posteriores, incluidas las técnicas de reducción de dimensionalidad y los algoritmos de agrupación no supervisados. Los subconjuntos de células inmunitarias, con un enfoque específico en las células CD8+T, se anotaron en función de los marcadores canónicos referenciados en CellMarker 2.0 y se visualizaron utilizando ggplot2. Para validar la relevancia clínica y la amplia aplicabilidad de nuestros hallazgos, curamos un compendio completo de conjuntos de datos de transcriptómica a granel. Esto incluyó la cohorte TCGA-COAD y múltiples cohortes clínicas independientes de pacientes tratados con ICI (anti-PD-1/L1 o anti-CTLA-4). Se analizaron múltiples cohortes de tumores sólidos, que abarcan melanoma, carcinoma urotelial, carcinoma de células renales y CPNP, utilizando datos de IMvigor210 y conjuntos de datos GEO (GSE78220, GSE91061 y GSE126044).

Ratones y líneas celulares

Se compraron ratones hembra C57BL/6J de 6 a 8 semanas de edad a Cavens Laboratory Animal Co. y se mantuvieron en condiciones SPF. Los experimentos con animales se llevaron a cabo después de la aprobación del Comité de Ética del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad de Soochow y en estricta conformidad con las normas institucionales. Las células MC38, una línea de adenocarcinoma de colon derivada de ratón, se compraron a la Academia China de Ciencias (Shanghai, China) y se mantuvieron en DMEM que contiene un 10% de FBS y antibióticos a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2.

Modelos tumorales in vivo y tratamiento

Para la generación del modelo tumoral subcutáneo, ratones C57BL/6J recibieron una inyección subcutánea de células MC38 (1×106) suspendidas en 100 μL de PBS. Tras la formación palpable del tumor (día 5 post-inoculación), los ratones fueron asignados aleatoriamente a los grupos de control y tratamiento con anti-PD-1. El grupo de tratamiento recibió inyecciones intraperitoneales (i.p.) de anticuerpo monoclonal anti-PD-1 para ratones (200 μg/dosis; Clon J43, Bio X Cell) en los días 5, 8, 11 y 14. A los ratones del grupo de control se les administró IgG isotípica correspondiente. Para los análisis posteriores, incluyendo citometría de flujo y secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq), los tumores se recolectaron 24 horas después del tratamiento.

Citometría de flujo y tinción intracelular de citocinas

Para evaluar el fenotipo y la función de las TIL (células infiltrantes tumorales), los especímenes tumorales se sometieron a digestión enzimática con Liberase TL y DNase I (37 °C, 30 min). Para preparar preparaciones de células individuales, la mezcla celular se pasó a través de un tamiz de 100 μm, seguido de la suspensión en solución salina tamponada de Hank suplementada con 1% de suero fetal bovino. Los linfocitos se activaron ex vivo utilizando un cóctel de activación celular que contenía Brefeldin A (BioLegend) durante 5 horas antes de la tinción para evaluar la actividad funcional. Para la caracterización inmunofenotípica, se evaluaron los marcadores de superficie e intracelulares utilizando un protocolo de citometría de flujo de múltiples pasos. Las células viables se identificaron utilizando un tinte de viabilidad fijable (Ghost Dye™ Violet 510) y se tiñeron para CD45 (30F11), CD3 (17A2), CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7) y CX3CR1 (SA011F11). Después de la fijación y permeabilización (Invitrogen), se realizó la detección intracelular de interferón-γ (IFN-γ) (XMG1.2), factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-α) (MP6-XT22) y granzima B (GB11). Los datos se recolectaron en un sistema DxFLEX (Beckman Coulter) y se procesaron utilizando el software FlowJo.

Procesamiento de datos de scRNA-seq de ratón

Siguiendo un protocolo previamente establecido (^[37]), la alineación de las lecturas sin procesar al genoma del ratón (mm10) se realizó con el conjunto de software Cell Ranger (v4.0.0). Los análisis posteriores se ejecutaron dentro del entorno R utilizando el paquete Seurat (v4.x). Para garantizar la integridad de los datos, se aplicó una rigurosa línea de control de calidad: los posibles dobletes se excluyeron mediante DoubletFinder y las células de baja calidad se filtraron en función de criterios específicos (200 < nFeatureRNA < 6000; nCountRNA < 50000; contenido mitocondrial < 10%). Se utilizó el análisis de componentes principales para reducir la dimensionalidad de los datos de forma lineal, tras la aplicación de la escala LogNormalize y la detección de los genes altamente variables (HVG). Para mitigar los efectos de lote técnico entre las muestras, se empleó el algoritmo Harmony para la integración de datos. Utilizando componentes principales informativos, aplicamos la incrustación no lineal y la agrupación basada en gráficos no supervisada implementada en FindNeighbors y FindClusters, tras lo cual se anotaron los tipos de células según las características de los genes marcadores.

Inferencia de la trayectoria de pseudotiempo

Para reconstruir la jerarquía de desarrollo y las líneas de diferenciación de las células CD8+T, se realizó la inferencia de la trayectoria utilizando los paquetes R Monocle 2 y Slingshot. Para facilitar el análisis de Monocle, las matrices de expresión génica se extrajeron del objeto Seurat y se transformaron al formato CellDataSet requerido. Se realizó el modelado estadístico de la varianza de la expresión génica utilizando las funciones estimateSizeFactors y estimateDispersions. Posteriormente, se ejecutó la reducción de dimensionalidad y el ordenamiento de células mediante el algoritmo DDRTree (Reducción de dimensionalidad discriminativa mediante el aprendizaje de un árbol), basándose en los genes altamente variables (HVG) identificados. Las células se proyectaron en el colector inferido para visualizar la transición fenotípica desde un estado ingenuo a un estado efector a lo largo del pseudotiempo latente.

Análisis de enriquecimiento funcional

Para dilucidar los procesos biológicos y los impulsores moleculares responsables del remodelamiento del microambiente tumoral (TME) inducido por la terapia anti-PD-1, realizamos un perfilado sistemático de enriquecimiento funcional de los genes expresados diferencialmente (DEG) identificados. Se empleó el paquete clusterProfiler (versión 4.8.3) para evaluar el enriquecimiento funcional en los dominios de Gene Ontology y las vías KEGG. La anotación de los genes de ratón se basó en la base de datos org.Mm.eg.db. Para tener en cuenta las comparaciones múltiples, los valores P se corrigieron utilizando el enfoque de Benjamini-Hochberg, y se retuvieron los resultados de enriquecimiento con valores P ajustados por FDR inferiores a 0,05. Las vías más relevantes que se sobreexpresaron o subexpresaron en el grupo de tratamiento en relación con los controles se visualizaron mediante gráficos de barras y gráficos de burbujas para ilustrar las transiciones funcionales clave inducidas por el bloqueo de PD-1.

Análisis de la comunicación célula-célula

Para caracterizar el panorama de la comunicación intercelular, empleamos el paquete R CellChat (versión 1.6.1). Las interacciones ligando-receptor se compararon sistemáticamente entre los grupos pre y postratamiento utilizando la base de datos de referencia CellChatDB. Para garantizar la solidez de nuestras inferencias estadísticas, las probabilidades de interacción se estimaron solo para los grupos de células que contenían al menos 10 células. Posteriormente, se realizó un análisis diferencial para identificar las vías de señalización que presentaban cambios significativos en el flujo global de información y la intensidad acumulativa de la interacción. Las visualizaciones de datos se generaron a través de las funciones integradas de CellChat y el marco de trabajo ComplexHeatmap (versión 2.22.0).

Análisis estadístico

Todos los análisis se llevaron a cabo en R (versión 4.4.1), y las figuras se generaron utilizando GraphPad Prism 8. Se aplicó el paquete survminer para determinar los umbrales óptimos para la dicotomización de la expresión génica. Los datos continuos se compararon entre los grupos utilizando la prueba de Wilcoxon. La relevancia pronóstica de la infiltración de células CD8+T CX3CR1+ se evaluó mediante la estimación de la supervivencia de Kaplan-Meier y la comparación de rango logarítmico. Para construir un modelo pronóstico estable, las variables se seleccionaron mediante la regresión de Cox univariada seguida de la regresión de subconjunto óptimo (BSR) y la regresión LASSO con validación cruzada. Los factores retenidos de estos análisis se incluyeron posteriormente en un modelo de riesgos proporcionales de Cox multivariado para identificar los determinantes pronósticos independientes y desarrollar un nomograma. Se consideró que un valor P bilateral inferior a 0,05 era estadísticamente significativo.

Resultado

Los niveles elevados de células CD8+T CX3CR1+ infiltrantes en el tumor predicen resultados clínicos favorables

Para caracterizar espacialmente el patrón de infiltración de las células CD8+T CX3CR1+ y su importancia clínica, se realizó una inmunohistoquímica multiplexada (mIHC) en especímenes de CRC y sus correspondientes tejidos normales adyacentes. La infiltración de células CD8+T CX3CR1+ fue evidente tanto en los compartimentos estromal como intratumoral, como se verificó mediante la precisa colocalización de CD8A y CX3CR1 en las imágenes representativas (Figura 1A). Si bien la abundancia total de células CD8+T fue comparable entre el tumor y las regiones normales adyacentes, las células CD8+T CX3CR1+ se acumularon preferentemente en el microambiente tumoral (P < 0,05; Figuras 1B-D). Posteriormente, evaluamos la importancia pronóstica de esta subpoblación específica en una cohorte de pacientes con CRC. Los pacientes que presentaban una mayor infiltración de células CD8+T CX3CR1+ mostraron una mejora notable en la supervivencia general (OS) en relación con los pacientes con menor infiltración, según lo determinado por el análisis de Kaplan-Meier (P = 0,032; HR = 0,339, IC del 95%: 0,161-0,715; Figura 1E). Estos hallazgos sugieren que el enriquecimiento de células CD8+T CX3CR1+ en los tumores es un potente indicador de la inmunidad antitumoral y predice buenos resultados clínicos.

Construcción y validación de un nomograma pronóstico robusto que integra la firma de infiltración de células CD8+T CX3CR1+

Este estudio evaluó la correlación clinicopatológica en 78 pacientes con CRC. La evaluación estadística reveló que la abundancia intratumoral de células CD8+T CX3CR1+ no estaba significativamente asociada con la edad, el sexo o la estadificación TNM del paciente (P > 0,05). Sin embargo, se observó una tendencia marginalmente significativa con respecto al grado patológico (P = 0,081). Además, no se observó una asociación significativa entre la abundancia de células CD8+T totales o células CX3CR1+ y la mayoría de los parámetros clinicopatológicos (Tabla 1). La falta de una fuerte correlación entre las células CD8+T CX3CR1+ y los parámetros de estadificación anatómica tradicionales sugiere que la infiltración de este grupo de células representa una característica biológica independiente del microambiente inmunitario tumoral y puede proporcionar información complementaria a los sistemas de estadificación existentes.

Implementamos una estrategia estadística de múltiples pasos para investigar la relevancia pronóstica de la infiltración de células CD8+T CX3CR1+ y para seleccionar rigurosamente los factores clinicopatológicos asociados. En la regresión de Cox univariada, la etapa N avanzada surgió como un factor de riesgo significativo para la supervivencia (N1: HR = 2,496, P = 0,023; N2: HR = 6,333, P < 0,001), mientras que los niveles más altos de infiltración de células CD8+T CX3CR1+ se asociaron con un efecto protector (HR = 0,337, IC del 95%: 0,119-0,957, P = 0,041) (Tabla 2; Figura suplementaria 1A). Para mitigar el sesgo de selección y minimizar el riesgo de sobreajuste, empleamos el algoritmo BSR, priorizado por la métrica R2 ajustada, en conjunto con la regresión LASSO. Ambos algoritmos seleccionaron la etapa N y el nivel de infiltración de células CD8+T CX3CR1+ como variables clave; el modelo LASSO también incluyó la etapa M (Figura suplementaria 1B; Figuras 2A-C). El análisis de regresión de Cox multivariado confirmó aún más que el papel protector de la alta infiltración de células CD8+T CX3CR1+ siguió siendo robusto, incluso después de controlar los potentes predictores clínicos, como las etapas N y M. (HR = 0,37 y 0,40 respectivamente) (Figura suplementaria 1C; Figura 2C). Aunque limitado por el tamaño de la muestra del subgrupo de alta infiltración (n = 18), su valor P fue marginalmente significativo (P = 0,069 y 0,09 respectivamente), pero el tamaño del efecto significativo confirmó el potencial de este subgrupo como un biomarcador pronóstico robusto independiente del estado de metástasis tumoral.

Evaluamos el poder discriminatorio de los diferentes enfoques de modelado. El modelo de Cox multivariado produjo el área bajo la curva (AUC) más alta de 78,3 (IC del 95%: 68,6-87,9), superando ligeramente al modelo LASSO (AUC = 78,1, IC del 95%: 66,2-90,0) y al modelo BSR (AUC = 76,5, IC del 95%: 64,9-88,1) (Figura 2D). Sin embargo, considerando la solidez de la regresión LASSO para minimizar el sobreajuste y la alta relevancia clínica de las características seleccionadas, priorizamos las variables identificadas por LASSO para construir el nomograma pronóstico visual final. Este nomograma integró la etapa N, la etapa M, el sexo, el grado patológico y la infiltración de células CD8+T CX3CR1+. En particular, dentro de este sistema de puntuación, la baja infiltración de células CD8+T CX3CR1+ contribuyó significativamente a la puntuación de riesgo total (aproximadamente 48 puntos), cuantificando visualmente el impacto pronóstico adverso de su ausencia (Figura 2F). Además, los gráficos de calibración mostraron un alto grado de concordancia entre las probabilidades predichas y las tasas de supervivencia general observadas a 1, 3 y 5 años (Figura 2G). En resumen, el nomograma basado en las características seleccionadas por LASSO proporciona una herramienta precisa y robusta para la estratificación de riesgos de los pacientes con CRC.

El perfilado de células únicas identifica el subconjunto de células CD8+T CX3CR1+ como una población clave que responde en los pacientes tratados con bloqueo de PD-1

Para evaluar el valor predictivo de CX3CR1, primero analizamos su expresión en múltiples neoplasias. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de muestra única (ssGSEA) reveló que los respondedores a la terapia anti-PD-1 en melanoma, CPNP y carcinoma esofágico mostraron puntuaciones CX3CR1 significativamente más altas que los no respondedores (P < 0,001; Figura 3A).

Centrándonos en el microambiente tumoral (TME) del CRC, reanalizamos un conjunto de datos de secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq) de humanos. El agrupamiento no supervisado identificó las principales líneas celulares inmunitarias y estromales (Figura 3B), y el agrupamiento secundario reveló que la expresión de CX3CR1 se restringía predominantemente al compartimento de células T CD8+ (Figura suplementaria 2A; Figura 3C). El análisis longitudinal indicó una marcada acumulación de células T CD8+CX3CR1+ dentro del TME de los pacientes que mostraron una respuesta clínica a la terapia anti-PD-1 (Figura 3D). El análisis de genes diferencialmente expresados (DGE) caracterizó este subconjunto como distinto de sus contrapartes CX3CR1−, mostrando una regulación al alza de la citotoxicidad (por ejemplo, GNLY, PRF1, FGFBP2) y marcadores de diferenciación efectora (por ejemplo, KLRG1, TBX21). Por el contrario, los genes asociados con la residencia tisular (ITGAE, CXCR6) y el agotamiento de las células precursoras (GZMK) se regularon a la baja (Figura 3E). Estas características sugieren que CX3CR1 marca una población de células T CD8+ circulantes con un potente potencial citolítico, que se asemeja a un fenotipo de memoria efectora terminal (Temra). El subagrupamiento de alta resolución de las células T CD8+ validó esta identidad, delineando subconjuntos distintos, incluidos las células T naive (Tn), las células T de memoria central (Tcm), las células T de memoria residentes en tejidos (Trm), las células T agotadas (Tex), las células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT) y los linfocitos intraepiteliales (IEL), Tem y Temra (Figura 3F; Figura suplementaria 2B). En particular, la expresión robusta de CX3CR1 se limitó específicamente al grupo Temra (Figura 3G), lo que confirma su papel como marcador de este subconjunto efector.

Para dilucidar los mecanismos ascendentes que impulsan este cambio fenotípico, realizamos un análisis SCENIC, que reveló una profunda remodelación del paisaje transcripcional tras la inmunoterapia. Las células T basales se caracterizaron por la actividad de la familia AP-1 (por ejemplo, JUN, FOS) y el regulón NFκB, lo que indica un estado de respuesta al estrés. En contraste, la población postratamiento exhibió un programa regulador distinto impulsado por los efectores de la diferenciación y la señalización de los interferones, notablemente PRDM1 (que codifica Blimp-1), STAT1 y ETS1 (Figura 3H). La validación de estos hallazgos en la cohorte TCGA-COAD (n = 512) mostró que la expresión de CX3CR1 presentó fuertes correlaciones positivas con ETS1 (R = 0,62, P < 0,001) y PRDM1 (R = 0,54, P < 0,001), lo que refuerza su papel en la orquestación del programa efector terminal (Figuras 4A, B). CX3CR1 también se correlacionó significativamente con STAT1 (R = 0,38, P < 0,001), lo que es consistente con la activación de la vía de los interferones (Figura 4C). Si bien CEBPB estaba activo a nivel de célula única, su correlación en el tejido a granel no fue significativa (P > 0,05), probablemente debido a la expresión confusa en los compartimentos estromales o mieloides (Figura suplementaria 2C). En conjunto, estos datos sugieren que una red impulsada por ETS1, PRDM1 y STAT1 regula la infiltración de células T CD8+CX3CR1+.

Si bien la reprogramación transcripcional intrínseca gobierna la diferenciación efectora, la acumulación espacial de estas células está críticamente modulada por señales extrínsecas dentro del TME. Para determinar cómo el bloqueo de PD-1 remodela el paisaje de comunicación intercelular para facilitar este proceso, realizamos un análisis CellChat. A nivel global, la terapia intensificó significativamente el cruce inmunitario, como lo demuestra un marcado aumento tanto en la frecuencia como en la fuerza acumulativa de las interacciones ligando-receptor inferidas en las muestras postratamiento (Figura 4D; Figuras suplementarias 2D, E). El análisis de interacción diferencial reveló además que esta mejora de la señalización se concentró preferentemente entre las células Temra y las células presentadoras de antígenos (APC) de origen mieloide. Un análisis comparativo del flujo de señalización identificó una profunda transición en el paisaje del TME, donde la vía MIF, un conocido mediador de la supresión inmunitaria en la línea de base, se atenuó notablemente tras la terapia (Figura 4E). Por el contrario, las vías esenciales para la adhesión de los leucocitos y la migración transendotelial se regularon al alza de forma robusta después del tratamiento. En concreto, las células Temra recibieron señales entrantes intensificadas a través de los ejes ADGRE5 (CD97) y CD99 de las células mieloides, al tiempo que interactuaban con el TME a través de las interacciones salientes de SELPLG (Figura 4E; Figura suplementaria 2F). En conjunto, estos hallazgos indican que el bloqueo de PD-1 orquesta un nicho inmunitario más permisivo al desmantelar las barreras inhibitorias y al mismo tiempo reforzar los mecanismos de anclaje físico necesarios para un injerto exitoso de Temra.

Complementando estas alteraciones regulatorias y comunicativas, los análisis de enriquecimiento funcional de los DGE proporcionaron más información sobre la programación biológica de las células T CD8+CX3CR1+. El análisis GO reveló un enriquecimiento predominante en las vías que regulan la diferenciación de los linfocitos y las respuestas de los interferones β/γ (Figura 4F), lo que subraya un fuerte compromiso con las funciones efectoras. En particular, la regulación al alza de la maquinaria de procesamiento de antígenos (por ejemplo, unión a TAP) sugiere una mayor capacidad de reconocimiento tumoral, mientras que el enriquecimiento de las actividades de modificación de histonas implica que la remodelación epigenética sustenta este fenotipo terminal. Corroborando estos hallazgos, el análisis de la vía KEGG destacó la activación de la señalización inflamatoria y citotóxica, incluidas las vías de TNF, la necroptosis y la apoptosis (Figura 4G). Además, el enriquecimiento específico de la vía de control PD-1/PD-L1 refuerza la relevancia clínica de este subconjunto en el contexto de los inhibidores de puntos de control inmunitario (ICIs). En conjunto, estas firmas definen a las células T CD8+CX3CR1+ como una población efectora altamente activada, epigenéticamente distinta y funcionalmente potente.

Para evaluar la eficacia terapéutica del bloqueo de los puntos de control inmunitario, se administraron anticuerpos anti-PD-1 a ratones C57BL/6J portadores de tumores MC38 a partir de cinco días después de la inoculación del tumor. Como se muestra en las figuras (Figuras 5A, B; Figura suplementaria 3A), el bloqueo de PD-1 atenuó significativamente la progresión tumoral en comparación con los controles, y los beneficios terapéuticos se volvieron estadísticamente significativos después de solo dos dosis (P < 0,01) y se intensificaron con el tiempo. Tras confirmar la respuesta del modelo, investigamos a continuación la cinética longitudinal de los subconjuntos de células T CD8+CX3CR1+ dentro del microambiente tumoral. Los datos de citometría de flujo demostraron que el tratamiento indujo una acumulación marcada y selectiva de la población de células T CD8+CX3CR1+. En particular, este enriquecimiento se limitó espacialmente al tejido tumoral, mientras que estuvo ausente en el bazo y los ganglios linfáticos, y se hizo evidente a partir del día 9 después de la inoculación (Figuras 5C, D; Figuras suplementarias 3B, C), lo que sugiere un efecto de revitalización localizado en esta población efectora específica.

Posteriormente, examinamos la capacidad de la terapia anti-PD-1 para preservar el estado funcional de la población de células T CD8+CX3CR1+ a lo largo del desarrollo del tumor. El perfilado longitudinal reveló que, en el grupo de control, las células T CD8+CX3CR1+ intratumorales sufrieron una pérdida progresiva de la potencia funcional, evidenciada por la disminución de la expresión de la granzima B (GZMB), el IFN-γ y el TNF-α en el día 15. En contraste, la terapia anti-PD-1 contrarrestó eficazmente esta decadencia funcional. El grupo de tratamiento mantuvo una expresión robusta de GZMB y preservó la capacidad polifuncional, con proporciones significativamente mayores de células productoras de IFN-γ y TNF-α en la etapa tardía del tumor en comparación con los controles (Figuras 5E, F). Además, se observó un pico transitorio pero distinto en la función efectora en los órganos linfoides secundarios (bazo y ganglios linfáticos) alrededor del día 9, lo que indica un evento de activación sistémica que puede preceder a la respuesta sostenida dentro del tumor (Figuras suplementarias 3B, C). En conjunto, nuestros hallazgos demuestran que el bloqueo de PD-1 mantiene la potente función citotóxica de las células T CD8+CX3CR1+, evitando eficazmente la disminución funcional que normalmente acompaña al crecimiento tumoral.

Utilizando ratones portadores de tumores MC38 tratados con inhibidores de PD-1, realizamos una secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq) para mapear la firma transcripcional subyacente a la acumulación de células T CD8+CX3CR1+ (Figura 6A). El agrupamiento no supervisado identificó distintos subconjuntos de células T CD8+, incluidos las células T naive (Tn), las células T efectoras (Teff), las células T progenitoras agotadas (Tpex), las células T agotadas (Tex), las células Tem, las células T CD8+ positivas para Ki67 (Mki67) y las poblaciones de células Temra (Figura 6B; Figura suplementaria 4A). El análisis cuantitativo reveló una remodelación significativa del compartimento de células T tras el bloqueo de PD-1, caracterizada por la contracción de los grupos naive y proliferativos y la expansión concomitante de los subconjuntos similares a los efectores, en particular la población Temra (Figura 6D). Para dilucidar la jerarquía de desarrollo que impulsa este cambio, realizamos un análisis de trayectoria de pseudotiempo de célula única. La trayectoria reveló un proceso de diferenciación continuo que se origina en los grupos Tn, que se bifurcó en dos estados terminales distintos (Figura 6C). Si bien una rama progresó hacia el grupo Tex clásico, una trayectoria divergente condujo a la formación del grupo Temra. El subconjunto Tpex ocupó una posición transicional crítica que precedió a esta bifurcación, lo que sugiere su plasticidad para diferenciarse en cualquiera de las dos líneas. Este hallazgo proporciona evidencia convincente de que la población Temra representa una línea distinta del agotamiento terminal, conservando el potencial efector en lugar de sucumbir a la disfunción. En particular, la expresión de Cx3cr1 se limitó predominantemente a este subconjunto Temra y se reguló al alza significativamente tras el bloqueo de PD-1, lo que corrobora nuestros resultados de citometría de flujo e identifica a CX3CR1 como un marcador de esta población efectora que responde a la terapia (Figuras 6E, F).

El análisis de los DGE reveló que el bloqueo de PD-1 indujo una firma transcripcional distinta caracterizada por la regulación al alza de las quimiocinas (por ejemplo, Cxcl9, Ccl12, Ccl2) y el receptor coestimulador Tnfsf9, junto con el regulador metabólico Cd36. En contraste, Gzmk, un marcador canónico de las células T progenitoras agotadas, se reguló a la baja significativamente. Este cambio transcripcional sugiere que el bloqueo de PD-1 abole eficazmente el bloqueo de la diferenciación, impulsando a las células T desde un estado transicional hacia un fenotipo efector terminal (Figura suplementaria 4B).

Para diseccionar las redes de comunicación intercelular que facilitan esta diferenciación y expansión, realizamos un análisis CellChat en el conjunto de datos de scRNA-seq murino. El bloqueo de PD-1 vigorizó notablemente el interactoma del TME, como lo demuestra un aumento sustancial tanto en la frecuencia como en la fuerza acumulativa de las interacciones entre células (Figura 6G; Figura suplementaria 4D). El análisis de red diferencial reveló que esta mejora funcional se debió en gran medida al cruce intensificado entre las células T CD8+ Temra y las poblaciones mieloides, incluidos los macrófagos y las células dendríticas (Figura suplementaria 4C).

El análisis de vías descubrió un cambio profundo en el paisaje de señalización, donde los tumores de control estaban dominados por ejes inmunosupresores como TGFβ y MIF, mientras que el bloqueo de PD-1 reguló significativamente al alza las vías proinflamatorias y asociadas al reclutamiento, incluidas CXCL, CCL, IFN-II y CD86 (Figura suplementaria 4E). En particular, identificamos un bucle de retroalimentación positiva bidireccional en el que las células Temra secretan activamente IFN-γ y quimiocinas como CCL5 para remodelar el TME, al tiempo que reciben señales coestimuladoras potentes a través del eje CD86–CD28 y señales de retención a través del eje CXCL16–CXCR6 de las células presentadoras de antígenos (Figura 6H).

Complementando esta remodelación intercelular, analizamos el panorama funcional mediante análisis de enriquecimiento GO y KEGG (Figuras 6I, J). El análisis de enriquecimiento GO destacó una activación significativa de las vías relacionadas con la migración y la quimiotaxis de los leucocitos. Estos resultados de expresión génica, que son coherentes con las interacciones receptor-ligando identificadas por CellChat, aclaran los mecanismos moleculares que impulsan el aumento de la infiltración intratumoral de las células CX3CR1+CD8+T observadas mediante citometría de flujo. Simultáneamente, la regulación al alza de las firmas de biogénesis de ribosomas y actividad de citocinas indica un estado hipermetabólico, esencial para mantener una potente síntesis de proteínas efectoras. Corroborando estas observaciones, el análisis KEGG destacó la activación de ejes inmunitarios clave, incluidos los ejes de quimiocinas, el receptor de células T (TCR) y las vías de señalización NF-κB. En particular, el enriquecimiento significativo de las vías metabólicas, especialmente la fosforilación oxidativa, implica que el bloqueo de PD-1 impulsa la reprogramación metabólica para satisfacer las altas demandas bioenergéticas de la citotoxicidad antitumoral. Además, la prominencia de las vías relacionadas con los lisosomas apunta a una mayor capacidad para el procesamiento de gránulos secretores y la desgranulación. En conjunto, estos datos demuestran que la terapia anti-PD-1 revitaliza la inmunidad antitumoral orquestando un programa multifacético que integra una mayor captación, aptitud metabólica y función efectora citotóxica.

Niveles elevados de células CX3CR1+CD8+T infiltrantes en el tumor predicen resultados clínicos favorables

Para caracterizar espacialmente el patrón de infiltración de las células CX3CR1+CD8+T y su importancia clínica, se realizó inmunohistoquímica multiplexada (mIHC) en muestras de CRC y en sus correspondientes tejidos normales adyacentes. La infiltración de células CX3CR1+CD8+T fue evidente tanto en los compartimentos estromal como intratumoral, como se verificó mediante la precisa colocalización de CD8A y CX3CR1 en imágenes representativas (Figura 1A). Si bien la abundancia total de células CD8+T fue comparable entre el tumor y las regiones normales adyacentes, las células CX3CR1+CD8+T se acumularon preferentemente en el microambiente tumoral (P < 0,05; Figuras 1B–D). Posteriormente, evaluamos la importancia pronóstica de esta subpoblación específica en una cohorte de pacientes con CRC. Los pacientes que presentaban una mayor infiltración de células CX3CR1+CD8+T mostraron una mejora notable en la supervivencia global (SG) en relación con los pacientes con menor infiltración, según lo determinado por el análisis de Kaplan-Meier (P = 0,032; HR = 0,339, IC del 95%: 0,161–0,715; Figura 1E). Estos hallazgos sugieren que el enriquecimiento de células CX3CR1+CD8+T en los tumores es un indicador potente de la inmunidad antitumoral y predice buenos resultados clínicos.

Construcción y validación de un nomograma pronóstico robusto que integra la firma de infiltración de células CX3CR1+CD8+T

Este estudio evaluó la correlación clinicopatológica en 78 pacientes con CRC. La evaluación estadística reveló que la abundancia intratumoral de células CX3CR1+CD8+T no estaba significativamente asociada con la edad, el sexo o la estadificación TNM del paciente (P > 0,05). Sin embargo, se observó una tendencia marginalmente significativa con respecto al grado patológico (P = 0,081). Además, no se observó una asociación significativa entre la abundancia de células CD8+T totales o células CX3CR1+ y la mayoría de los parámetros clinicopatológicos (Tabla 1). La falta de una fuerte correlación entre las células CX3CR1+CD8+T y los parámetros de estadificación anatómica tradicionales sugiere que la infiltración de este grupo de células representa una característica biológica independiente del microambiente inmunitario tumoral y puede proporcionar información complementaria a los sistemas de estadificación existentes.

Implementamos una estrategia estadística de múltiples pasos para investigar la relevancia pronóstica de la infiltración de células CX3CR1+CD8+T y para examinar rigurosamente los factores clinicopatológicos asociados. En la regresión de Cox univariante, una etapa N avanzada surgió como un factor de riesgo significativo para la supervivencia (N1: HR = 2,496, P = 0,023; N2: HR = 6,333, P < 0,001), mientras que niveles más altos de infiltración de células CX3CR1+CD8+T se asociaron con un efecto protector (HR = 0,337, IC del 95%: 0,119–0,957, P = 0,041) (Tabla 2; Figura suplementaria 1A). Para mitigar el sesgo de selección y minimizar el riesgo de sobreajuste, empleamos el algoritmo BSR, priorizado por la métrica R2 ajustada, en conjunto con la regresión de Cox LASSO. Ambos algoritmos identificaron la etapa N y el nivel de infiltración de células CX3CR1+CD8+T como variables clave; el modelo LASSO también incluyó la etapa M (Figura suplementaria 1B; Figuras 2A–C). El análisis de regresión de Cox multivariante confirmó además que el papel protector de la alta infiltración de células CX3CR1+CD8+T siguió siendo robusto, incluso después de controlar los potentes predictores clínicos, como las etapas N y M. (HR = 0,37 y 0,40 respectivamente) (Figura suplementaria 1C; Figura 2C). Aunque limitado por el tamaño de la muestra del subgrupo de alta infiltración (n = 18), su valor de P fue marginalmente significativo (P = 0,069 y 0,09 respectivamente), pero el tamaño del efecto significativo confirmó el potencial de este subgrupo como un biomarcador pronóstico robusto independiente del estado de metástasis tumoral.

Evaluamos el poder discriminatorio de diferentes enfoques de modelado. El modelo de Cox multivariante produjo el área bajo la curva (AUC) más alta de 78,3 (IC del 95%: 68,6–87,9), superando ligeramente al modelo LASSO (AUC = 78,1, IC del 95%: 66,2–90,0) y al modelo BSR (AUC = 76,5, IC del 95%: 64,9–88,1) (Figura 2D). Sin embargo, considerando la robustez de la regresión LASSO para minimizar el sobreajuste y la alta relevancia clínica de las características seleccionadas, priorizamos las variables identificadas por LASSO para construir el nomograma pronóstico visual final. Este nomograma integró la etapa N, la etapa M, el sexo, el grado patológico y la infiltración de células CX3CR1+CD8+T. En particular, dentro de este sistema de puntuación, la baja infiltración de células CX3CR1+CD8+T contribuyó significativamente a la puntuación de riesgo total (aproximadamente 48 puntos), cuantificando visualmente el impacto pronóstico adverso de su ausencia (Figura 2F). Además, los diagramas de calibración exhibieron un alto grado de concordancia entre las probabilidades predichas y las tasas de supervivencia global (SG) observadas a 1, 3 y 5 años (Figura 2G). En resumen, el nomograma basado en las características seleccionadas por LASSO proporciona una herramienta precisa y robusta para la estratificación de riesgos de los pacientes con CRC.

El perfilado de células individuales identifica el subconjunto de células CX3CR1+CD8+T como una población clave que responde en pacientes tratados con bloqueo de PD-1

Para evaluar el valor predictivo de CX3CR1, primero analizamos su expresión en múltiples neoplasias. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de muestra única (ssGSEA) reveló que los respondedores a la terapia anti-PD-1 en melanoma, CPNP y carcinoma esofágico exhibieron puntuaciones CX3CR1 significativamente más altas que los no respondedores (P < 0,001; Figura 3A).

Centrándonos en el MET de CRC, reanalizamos un conjunto de datos de secuenciación de ARN de células individuales humanas. La agrupación no supervisada identificó las principales líneas de células inmunitarias y estromales (Figura 3B), y la agrupación secundaria reveló que la expresión de CX3CR1 se restringió predominantemente al compartimento de células CD8+T (Figura suplementaria 2A; Figura 3C). El análisis longitudinal indicó una acumulación pronunciada de células CX3CR1+CD8+T dentro del MET de los pacientes que mostraron una respuesta clínica a la terapia anti-PD-1 (Figura 3D). El análisis DGE caracterizó este subconjunto como distinto de sus contrapartes CX3CR1−, mostrando una regulación al alza de la citotoxicidad (por ejemplo, GNLY, PRF1, FGFBP2) y los marcadores de diferenciación efectora (por ejemplo, KLRG1, TBX21). Por el contrario, los genes asociados con la residencia tisular (ITGAE, CXCR6) y el agotamiento de los precursores (GZMK) se regularon a la baja (Figura 3E). Estas características sugieren que CX3CR1 marca una población de células CD8+T circulantes con un potente potencial citolítico, que se asemeja a un fenotipo de memoria efectora terminal (Temra). La agrupación secundaria de alta resolución de células CD8+T validó esta identidad, delineando subconjuntos distintos que incluyen células T ingenuas (Tn), células T de memoria central (Tcm), células T de memoria residentes en tejidos (Trm), células T agotadas (Tex), células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT), linfocitos intraepiteliales (IEL), Tem y Temra (Figura 3F; Figura suplementaria 2B). En particular, la robusta expresión de CX3CR1 se limitó específicamente al grupo Temra (Figura 3G), lo que confirma su papel como marcador de este subconjunto efector.

Para dilucidar los mecanismos ascendentes que impulsan este cambio fenotípico, realizamos un análisis SCENIC, que reveló una remodelación profunda del panorama transcripcional después de la inmunoterapia. Se caracterizó que las células T basales presentaban actividad de la familia AP-1 (por ejemplo, JUN, FOS) y las vías NFκB, lo que indica un estado de respuesta al estrés. En contraste, la población postratamiento exhibió un programa regulatorio distinto impulsado por los efectores de diferenciación y la señalización de los interferones, en particular PRDM1 (que codifica Blimp-1), STAT1 y ETS1 (Figura 3H). La validación de estos hallazgos en la cohorte TCGA-COAD (n = 512) mostró que la expresión de CX3CR1 presentó fuertes correlaciones positivas con ETS1 (R = 0,62, P < 0,001) y PRDM1 (R = 0,54, P < 0,001), lo que refuerza su papel en la orquestación del programa efector terminal (Figuras 4A, B). CX3CR1 también se correlacionó significativamente con STAT1 (R = 0,38, P < 0,001), lo que es coherente con la activación de la vía de los interferones (Figura 4C). Si bien CEBPB estaba activo a nivel de células individuales, su correlación en el tejido a granel no fue significativa (P > 0,05), probablemente debido a la expresión confusa en los compartimentos estromales o mieloides (Figura suplementaria 2C). En conjunto, estos datos sugieren que una red impulsada por ETS1, PRDM1 y STAT1 regula la infiltración de células CX3CR1+CD8+T.

Si bien la reprogramación transcripcional intrínseca gobierna la diferenciación efectora, la acumulación espacial de estas células está modulada críticamente por las señales extrínsecas dentro del MET. Para determinar cómo el bloqueo de PD-1 remodela el panorama de comunicación intercelular para facilitar este proceso, realizamos un análisis de CellChat. A nivel global, la terapia intensificó significativamente el crosstalk inmunitario, como lo demuestra un marcado aumento tanto en la frecuencia como en la fuerza acumulativa de las interacciones ligando-receptor inferidas en las muestras postratamiento (Figura 4D; Figuras suplementarias 2D, E). El análisis de interacción diferencial reveló además que esta mejora de la señalización se concentró preferentemente entre las células Temra y las células presentadoras de antígenos (APC) derivadas de mieloides. Un análisis comparativo del flujo de señalización identificó una transición profunda en el panorama del MET, donde la vía MIF, un mediador conocido de la supresión inmunitaria en la línea de base, se atenuó notablemente después de la terapia (Figura 4E). Por el contrario, las vías esenciales para la adhesión de los leucocitos y la migración transendotelial se regularon al alza de manera robusta después del tratamiento. En particular, las células Temra recibieron señales entrantes intensificadas a través de los ejes ADGRE5 (CD97) y CD99 de las células mieloides, al tiempo que interactuaban con el MET a través de las interacciones SELPLG salientes (Figura 4E; Figura suplementaria 2F). En conjunto, estos hallazgos indican que el bloqueo de PD-1 orquesta un nicho inmunitario más permisivo al desmantelar las barreras inhibitorias y al mismo tiempo reforzar los mecanismos de acoplamiento físico necesarios para un injerto exitoso de Temra.

Complementando estas alteraciones regulatorias y comunicativas, los análisis de enriquecimiento funcional de los genes diferencialmente expresados (DEGs) proporcionaron información adicional sobre la programación biológica de las células CX3CR1+CD8+T. El análisis GO reveló un enriquecimiento predominante en las vías que regulan la diferenciación de los linfocitos y las respuestas a los interferones β/γ (Figura 4F), lo que subraya un fuerte compromiso con las funciones efectoras. En particular, la regulación al alza de la maquinaria de procesamiento de antígenos (por ejemplo, la unión a TAP) sugiere una mayor capacidad de reconocimiento tumoral, mientras que el enriquecimiento de las actividades de modificación de histonas implica que el remodelamiento epigenético sustenta este fenotipo terminal. Corroborando estos hallazgos, el análisis de la vía KEGG destacó la activación de la señalización inflamatoria y citotóxica, incluyendo las vías de TNF, necroptosis y apoptosis (Figura 4G). Además, el enriquecimiento específico de la vía de control inmunitario PD-1/PD-L1 refuerza la relevancia clínica de este subconjunto en el contexto de las ICIs. En conjunto, estas características definen a las células CX3CR1+CD8+T como una población efectora altamente activada, epigenéticamente distinta y funcionalmente potente.

El bloqueo de PD-1 revitaliza la inmunidad antitumoral promoviendo específicamente la expansión y el mantenimiento funcional de las células CX3CR1+CD8+T

Para evaluar la eficacia terapéutica del bloqueo del punto de control inmunitario, se administraron anticuerpos anti-PD-1 a ratones C57BL/6J portadores de tumores MC38, comenzando cinco días después de la inoculación del tumor. Como se muestra en las figuras (Figuras 5A, B; Figura suplementaria 3A), el bloqueo de PD-1 atenuó significativamente la progresión tumoral en comparación con los controles, y los beneficios terapéuticos se volvieron estadísticamente significativos después de solo dos dosis (P < 0,01) y se intensificaron con el tiempo. Tras confirmar la respuesta del modelo, analizamos a continuación la cinética longitudinal de los subconjuntos de células CX3CR1+CD8+T dentro del microambiente tumoral. Los datos de citometría de flujo demostraron que el tratamiento indujo una acumulación marcada y selectiva de la población de células CX3CR1+CD8+T. En particular, este enriquecimiento se limitó espacialmente al tejido tumoral, mientras que estuvo ausente en el bazo y los ganglios linfáticos, y se hizo evidente a partir del día 9 después de la inoculación (Figuras 5C, D; Figuras suplementarias 3B, C), lo que sugiere un efecto revitalizante localizado sobre esta población efectora específica.

Posteriormente, examinamos la capacidad de la terapia anti-PD-1 para preservar el estado funcional de la población de células CX3CR1+CD8+T a lo largo del desarrollo tumoral. El perfilado longitudinal reveló que, en el grupo de control, las células CX3CR1+CD8+T intratumorales sufrieron una pérdida progresiva de la potencia funcional, evidenciada por la disminución de la expresión de Granzima B (GZMB), IFN-γ y TNF-α al día 15. En contraste, la terapia anti-PD-1 contrarrestó eficazmente esta disminución funcional. El grupo de tratamiento mantuvo una expresión robusta de GZMB y preservó la capacidad polifuncional, con proporciones significativamente mayores de células productoras de IFN-γ y TNF-α en la etapa tardía del tumor en comparación con los controles (Figuras 5E, F). Además, se observó un pico transitorio pero distinto en la función efectora en los órganos linfoides secundarios (bazo y ganglios linfáticos) alrededor del día 9, lo que indica un evento de activación sistémica que puede preceder a la respuesta sostenida dentro del tumor (Figuras suplementarias 3B, C). En conjunto, nuestros hallazgos demuestran que el bloqueo de PD-1 mantiene la potente función citotóxica de las células CX3CR1+CD8+T, evitando eficazmente la disminución funcional que normalmente acompaña al crecimiento tumoral.

La reprogramación transcripcional hacia un fenotipo Temra hipermetabólico y migratorio impulsa la respuesta de las células T inducida por PD-1

Utilizando ratones portadores de tumores MC38 tratados con inhibidores de PD-1, realizamos secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) para mapear la firma transcripcional subyacente a la acumulación de células CX3CR1+CD8+T (Figura 6A). El agrupamiento no supervisado identificó distintos subconjuntos de células CD8+T, incluyendo células T ingenuas (Tn), células T efectoras (Teff), células T progenitoras agotadas (Tpex), células T agotadas (Tex), células Tem, células CD8+T positivas para Ki67 (Mki67) y poblaciones de células Temra (Figura 6B; Figura suplementaria 4A). El análisis cuantitativo reveló un remodelamiento significativo del compartimento de células T tras el bloqueo de PD-1, caracterizado por la contracción de los grupos ingenuos y proliferativos y la expansión concomitante de los subconjuntos similares a los efectores, en particular la población Temra (Figura 6D). Para dilucidar la jerarquía de desarrollo que impulsa este cambio, realizamos un análisis de trayectoria de pseudotiempo de célula única. La trayectoria reveló un proceso de diferenciación continuo que se origina en los grupos Tn, que se bifurcan en dos estados terminales distintos (Figura 6C). Si bien una rama progresó hacia el grupo Tex clásico, una trayectoria divergente condujo a la formación del grupo Temra. El subconjunto Tpex ocupó una posición transicional crítica que precedió a esta bifurcación, lo que sugiere su plasticidad para diferenciarse en cualquiera de las dos líneas. Este hallazgo proporciona evidencia convincente de que la población Temra representa una línea distinta del agotamiento terminal, conservando el potencial efector en lugar de sucumbir a la disfunción. En particular, la expresión de Cx3cr1 se limitó predominantemente a este subconjunto Temra y se reguló al alza significativamente tras el bloqueo de PD-1, lo que corrobora nuestros resultados de citometría de flujo e identifica a CX3CR1 como un marcador de esta población efectora que responde a la terapia (Figuras 6E, F).

El análisis de los DEGs reveló que el bloqueo de PD-1 indujo una firma transcripcional distinta caracterizada por la regulación al alza robusta de las quimiocinas (por ejemplo, Cxcl9, Ccl12, Ccl2) y el receptor coestimulador Tnfsf9, junto con el regulador metabólico Cd36. En contraste, Gzmk, un marcador canónico de las células T progenitoras agotadas, se reguló a la baja significativamente. Este cambio transcripcional sugiere que el bloqueo de PD-1 abole eficazmente el bloqueo de la diferenciación, impulsando a las células T desde un estado transicional hacia un fenotipo efector terminal (Figura suplementaria 4B).

Para diseccionar las redes de comunicación intercelular que facilitan esta diferenciación y expansión, realizamos un análisis CellChat en el conjunto de datos de scRNA-seq murino. El bloqueo de PD-1 revitalizó notablemente el interactoma del microambiente tumoral (TME), como lo demuestra un aumento sustancial tanto en la frecuencia como en la fuerza acumulativa de las interacciones célula-célula (Figura 6G; Figura suplementaria 4D). El análisis de red diferencial reveló que esta mejora funcional fue impulsada en gran medida por una intensificación de la comunicación cruzada entre las células CD8+ Temra y las poblaciones mieloides, incluyendo macrófagos y células dendríticas (Figura suplementaria 4C).

El análisis de vías reveló un cambio profundo en el panorama de señalización, donde los tumores de control estaban dominados por ejes inmunosupresores como TGFβ y MIF, mientras que el bloqueo de PD-1 reguló al alza significativamente las vías proinflamatorias y asociadas al reclutamiento, incluyendo CXCL, CCL, IFN-II y CD86 (Figura suplementaria 4E). En particular, identificamos un bucle de retroalimentación positiva bidireccional donde las células Temra secretan activamente IFN-γ y quimiocinas como CCL5 para remodelar el TME, mientras que, a su vez, reciben potentes señales coestimuladoras a través del eje CD86–CD28 y señales de retención a través del eje CXCL16–CXCR6 de las células presentadoras de antígenos (Figura 6H).

Complementando este reajuste intercelular, interrogamos el panorama funcional utilizando los análisis de enriquecimiento GO y KEGG (Figuras 6I, J). El análisis de enriquecimiento GO destacó una activación significativa de las vías relacionadas con la migración de leucocitos y la quimiotaxis. Estos resultados de expresión génica, que son consistentes con las interacciones receptor-quimiocina identificadas por CellChat, aclaran los mecanismos moleculares que impulsan el aumento de la infiltración intratumoral de las células CX3CR1+CD8+T observadas mediante citometría de flujo. Concomitantemente, la regulación al alza de las firmas de biogénesis de ribosomas y actividad de citocinas indica un estado hipermetabólico, esencial para mantener una potente síntesis de proteínas efectoras. Corroborando estas observaciones, el análisis KEGG destacó la activación de ejes inmunitarios clave, incluyendo las vías de quimiocinas, receptor de células T (TCR) y NF-κB (Figura 6J). En particular, el enriquecimiento significativo de las vías metabólicas, en particular la fosforilación oxidativa, implica que el bloqueo de PD-1 impulsa la reprogramación metabólica para satisfacer las altas demandas bioenergéticas de la citotoxicidad antitumoral. Además, la prominencia de las vías relacionadas con los lisosomas apunta a una mayor capacidad para el procesamiento de gránulos secretores y la desgranulación. En conjunto, estos datos demuestran que la terapia anti-PD-1 revitaliza la inmunidad antitumoral orquestando un programa multifacético que integra una mayor captación, aptitud metabólica y función efectora citotóxica.

Discusión

En la era de las ICIs, la cantidad y la calidad de los TIL son determinantes fundamentales de la eficacia terapéutica (^[38], ^[39]). Aunque las células CTL CD8+ sirven como los principales mediadores de las respuestas inmunitarias antitumorales, la eficacia clínica está fundamentalmente gobernada por su diversidad funcional, que abarca desde estados precursores similares a los de las células madre hasta el agotamiento terminal (^[40]). Aquí, perfilamos exhaustivamente una subpoblación única de células CX3CR1+CD8+T en el contexto del CRC. Contrariamente al paradigma tradicional que equipara la diferenciación terminal con el agotamiento funcional, nuestro análisis multi-ómico identificó estas células como una población de memoria efectora no agotada (Temra) y altamente citotóxica. Clínicamente, una alta infiltración de este subconjunto sirvió como un robusto factor pronóstico independiente, ofreciendo una mejor estratificación del riesgo en comparación con la estadificación TNM tradicional. Estos hallazgos se alinean con la evidencia emergente en el melanoma y el CPNP, que vincula a los efectores CX3CR1+ con una mayor respuesta a las ICIs (^[31], ^[33]).

Además de su valor pronóstico general, el enriquecimiento de las células CX3CR1+CD8+T es particularmente relevante para las características histopatológicas únicas de los tumores del síndrome de Lynch y los cánceres colorrectales esporádicos MSI-H. Estos tumores se caracterizan por defectos en las proteínas de reparación de errores de emparejamiento, lo que conduce a la inestabilidad de microsatélites y, en consecuencia, a una alta carga mutacional tumoral (TMB) (^[41]). La abundante cantidad de neoantígenos peptídicos con cambio de marco de lectura crea un microambiente altamente inmunogénico que estimula de manera robusta las respuestas de las células T. Proponemos que este contexto rico en neoantígenos actúa como un impulsor continuo para la diferenciación de progenitores similares a células madre en células CX3CR1+CD8+T. A diferencia de los tumores MSS con baja mutación, donde la estimulación de las células T puede ser subóptima, la fuerte señal antígeno en los tumores del síndrome de Lynch, especialmente cuando se libera mediante el bloqueo de PD-1, probablemente impulsa la acumulación sostenida de estos efectores citotóxicos CX3CR1+, contribuyendo así a los mejores resultados clínicos y la respuesta a la inmunoterapia que se observa típicamente en esta población de pacientes (^[42]). Sin embargo, debido al tamaño limitado de la muestra de nuestra cohorte de secuenciación de ARN de células únicas (scRNA-seq), que estaba sesgada hacia los pacientes MSI-H, no pudimos realizar un análisis comparativo robusto de la infiltración de células CX3CR1+CD8+T entre los subtipos MSI-H y MSS. Dada la distinta composición inmunogénica de estos dos subtipos, se necesitan estudios futuros con cohortes más grandes y equilibradas para dilucidar cómo los diferentes microambientes tumorales regulan de manera diferente el reclutamiento y la función de este subconjunto de efectores. Además, queda una pregunta crítica sobre la utilidad de las células T para estratificar a los pacientes con el síndrome de Lynch o tumores MSI-H esporádicos, que generalmente presentan un pronóstico favorable. Si bien nuestro estudio actual se centró en la población general de CRC, hipotetizamos que este subconjunto podría servir como un indicador sensible de una vigilancia inmunitaria eficaz específicamente dentro del contexto MSI-H. Aunque la alta carga mutacional tumoral en los tumores del síndrome de Lynch proporciona el potencial antígeno, no garantiza una respuesta inmunitaria eficaz. La infiltración de efectores confirma la ejecución citotóxica. Por lo tanto, proponemos que la escasez de este subconjunto podría identificar a la minoría de pacientes con el síndrome de Lynch que tienen un mayor riesgo de recurrencia (evasión inmunitaria a pesar de la alta antigenicidad), que de otro modo serían pasados por alto mediante la estadificación tradicional. Se justifican estudios futuros con cohortes MSI-H más grandes y diseñadas específicamente para validar estadísticamente este potencial de estratificación, que fue limitado en nuestro análisis actual del conjunto de datos público debido a la baja tasa de eventos en este grupo con un pronóstico favorable.

Un hallazgo fundamental de nuestro estudio es la expansión específica del subconjunto CX3CR1+ después del bloqueo de PD-1. En nuestros modelos murinos, la terapia no solo aumentó la infiltración total de CD8+, sino que enriqueció específicamente esta población de efectores. A nivel transcriptómico, estas células exhibieron una firma única de "éxito de diferenciación": disminución de la expresión del marcador de agotamiento de precursores GZMK y aumento de la expresión de moléculas citotóxicas (GNLY, PRF1). Esto refina el modelo actual de "rejuvenecimiento similar a células madre" (^[25]) al destacar que el beneficio terapéutico está mediado en última instancia por la acumulación y la persistencia funcional de estos efectores terminales, en lugar de los progenitores en sí. Además, la expresión sostenida de IFN-γ y TNF-α en las etapas tardías del tumor indica que el bloqueo de PD-1 previene eficazmente el agotamiento funcional que normalmente es impulsado por la estimulación crónica del antígeno (^[24]).

Además, dilucidamos los mecanismos subyacentes a esta acumulación. El enriquecimiento transcriptómico de las vías de migración de leucocitos, junto con la regulación al alza de las quimiocinas (CXCL9, CCL12) y sus receptores, sugiere que el bloqueo de PD-1 remodela el paisaje de quimiocinas para reclutar activamente estos efectores desde la circulación. Este modelo de "reclutamiento periférico" desafía la idea de que la expansión intratumoral depende únicamente de la proliferación local (^[43]) y está fuertemente respaldado por estudios recientes de mapeo del destino que demuestran que la inmunidad antitumoral sostenida depende del reabastecimiento continuo de efectores CX3CR1+ a partir de progenitores residentes en los ganglios linfáticos (^[44]). Más allá de este reclutamiento inicial impulsado por los gradientes de quimiocinas, la persistencia y la ejecución funcional de las células CX3CR1+CD8+T dentro del microambiente tumoral (TME) dependen en gran medida de su interacción dinámica con las poblaciones inmunitarias vecinas. Nuestro análisis de comunicación intercelular revela que el bloqueo de PD-1 orquesta un programa de retención y activación en múltiples etapas. Inicialmente, la regulación al alza de los ejes de adhesión inducida por la terapia, como ADGRE5 (CD97) y CD99, facilita el anclaje físico de los efectores reclutados a las células presentadoras de antígeno (APC) mieloides y la matriz del estroma. Este mecanismo de acoplamiento es crucial para estabilizar la sinapsis inmunitaria y garantizar el injerto duradero de las células T. Posteriormente, observamos un refuerzo del eje coestimulador CD86–CD28 y el establecimiento de un bucle de retroalimentación positiva mediado por IFN-γ y CCL5. Esto sugiere que, una vez retenidas, las células CX3CR1+CD8+T remodelan activamente el nicho local para promover la maduración de las células dendríticas y los macrófagos, que a su vez sustentan recíprocamente la función de efector de las células T. Además, la marcada atenuación de las vías de señalización MIF y TGF-β después del tratamiento indica el desmantelamiento de la red tolerogénica que normalmente respalda a las células T reguladoras (Tregs). En conjunto, estos hallazgos sugieren que la acumulación de células CX3CR1+CD8+T no es simplemente una afluencia pasiva, sino el resultado de una reestructuración ecológica coordinada que favorece la retención de efectores sobre la supresión.

Además, la persistencia funcional de estas células reclutadas se enfrenta a un desafío importante: el microambiente tumoral hipóxico. La hipoxia crónica es una característica distintiva del CRC que normalmente estabiliza el factor inducible por hipoxia 1-alfa (HIF-1α) y reprime la biogénesis mitocondrial, lo que lleva a las células T a la insuficiencia metabólica y el agotamiento terminal (^[17], ^[45]). En este contexto hostil, el enriquecimiento robusto de las vías de fosforilación oxidativa y la biogénesis de ribosomas en el subconjunto de células CX3CR1+CD8+T es particularmente significativo. Indica que el bloqueo de PD-1 confiere una aptitud metabólica crítica, lo que permite a estos efectores mantener la respiración mitocondrial y resistir la disfunción inducida por la hipoxia. Proponemos que esta resistencia metabólica previene el programa de agotamiento mediado por HIF-1α y permite que las células CX3CR1+CD8+T mantengan las altas demandas bioenergéticas de la función citotóxica, lo que las diferencia de las poblaciones metabólicamente agotadas (^[46]). En consecuencia, la combinación del bloqueo de PD-1 con agentes dirigidos a la hipoxia (por ejemplo, inhibidores de HIF u agentes de oxigenación) representa una prometedora estrategia terapéutica para liberar aún más el potencial de este subconjunto de efectores (^[47], ^[48]).

A nivel transcripcional, identificamos una red impulsada por ETS1 y PRDM1 que gobierna esta diferenciación de efectores. El análisis SCENIC reveló un cambio drástico de una respuesta al estrés dominada por AP-1 antes del tratamiento a un programa de efectores posterior al tratamiento orquestado por ETS1, PRDM1 y STAT1. Si bien ETS1 se asocia clásicamente con el mantenimiento de la similitud con células madre en células progenitoras agotadas (^[49]), nuestros datos revelan un papel dependiente del contexto en el que ETS1 se regula al alza de manera robusta en el subconjunto de células CX3CR1+ Temra terminalmente diferenciadas después de la inmunoterapia. Proponemos que, en este contexto terapéutico, la actividad sostenida de ETS1 se sinergiza con PRDM1, un regulador maestro de la citotoxicidad (^[50]), para impulsar un programa migratorio pero citotóxico, evitando así el silenciamiento epigenético que normalmente se asocia con el agotamiento terminal.

A pesar de las ideas mecánicas y clínicas proporcionadas por este estudio, varias limitaciones justifican una mayor investigación. El análisis transcriptómico actual se basa en un número relativamente limitado de muestras de scRNA-seq, y la validación clínica, aunque estadísticamente robusta, se basa en una cohorte retrospectiva de un solo centro, lo que puede introducir un sesgo de selección inherente. Para establecer firmemente la infiltración de células CX3CR1+CD8+T como un biomarcador clínicamente útil, particularmente para la estratificación de la desafiante población MSS, la validación a través de estudios prospectivos a gran escala y multicéntricos es indispensable. Más allá de la validación clínica, se requiere un mapeo de mayor resolución de la dinámica espacial y los orígenes celulares de este subconjunto. Aunque mIHC confirmó la localización de estas células dentro de los nidos tumorales, su interacción precisa con las células presentadoras de antígeno aún no se ha dilucidado por completo. Por ejemplo, dado que la CX3CL1 derivada de las células dendríticas orquesta el reclutamiento de células T de manera dependiente del ciclo circadiano (^[51]), los estudios futuros deberían determinar si las células CX3CR1+CD8+T dependen de nichos espaciales específicos, como las estructuras linfoides terciarias (^[52]), para su reclutamiento y mantenimiento. Al mismo tiempo, se necesitan modelos de trazado de linaje o fotoconversión definitivos (^[26]) para distinguir si la expansión posterior al tratamiento surge predominantemente de la proliferación local de las células Tpex o del reclutamiento sistémico de efectores circulantes.

Además, las implicaciones a largo plazo de esta diferenciación de efectores merecen un examen cuidadoso. Coherente con el modelo de "reóstato" (^[53]), la aceleración de la diferenciación de progenitores en estados de efectores impulsada por el bloqueo de PD-1 puede comprometer inadvertidamente la longevidad del reservorio similar a células madre renovable. En nuestro contexto, la marcada acumulación de células CX3CR1+CD8+T indica el despliegue eficaz de efectores antitumorales. Por el contrario, en el contexto de la resistencia adquirida, este fenómeno puede indicar el agotamiento excesivo del reservorio ascendente de Tpex, lo que hace que la respuesta sea insostenible. Por lo tanto, las estrategias terapéuticas óptimas deben tener como objetivo equilibrar la movilización de los efectores CX3CR1+ con la preservación de sus progenitores para garantizar un control tumoral duradero. En última instancia, si bien identificamos la red transcripcional impulsada por ETS1 y PRDM1, el paisaje de la cromatina que regula este bloqueo fenotípico permanece inexplorado. Desentrañar la estabilidad epigenética de esta subpoblación podría revelar nuevos objetivos para prevenir la desdiferenciación o el agotamiento prematuro.

Reconocemos un informe aparentemente contradictorio que sugiere que el agotamiento de las células CX3CR1+CD8+T no abroga la eficacia de la terapia celular adoptiva (ACT) (^[54]). Esta discrepancia probablemente refleja mecanismos distintos: ACT se basa en el reservorio similar a células madre infundido, mientras que el bloqueo de PD-1 depende de la revitalización del sistema inmunitario del huésped endógeno. En nuestro entorno experimental, la expansión del compartimento de células CX3CR1+CD8+T funciona como un indicador clave que refleja una diferenciación eficaz y la movilización de efectores inducida por la terapia. La falta de eficacia en los no respondedores probablemente se debe a un bloqueo en esta trayectoria de diferenciación. Además, la redundancia funcional entre los receptores de quimiocinas (por ejemplo, CXCR3) puede compensar la pérdida de CX3CR1 en los modelos de eliminación, una hipótesis que justifica una mayor investigación.

Finalmente, reconocemos que nuestro estudio se basa en análisis correlativos de datos humanos y modelos observacionales in vivo. Si bien identificamos las células como un subconjunto de efectores clave, no realizamos experimentos de eliminación o sobreexpresión específica de células T Cx3cr1. Por lo tanto, no podemos concluir definitivamente que el propio CX3CR1 sea el impulsor de la función de efector, sino un marcador de superficie de un programa transcripcional más amplio. Se necesitan estudios futuros que utilicen modelos de eliminación condicional para diseccionar la contribución funcional específica del receptor CX3CR1 en comparación con su red reguladora asociada.

En resumen, nuestro estudio establece que las células CX3CR1+CD8+T son un determinante fundamental del pronóstico y la respuesta a la inmunoterapia en el cáncer colorrectal. Clínicamente, el seguimiento de la expansión dinámica de este subconjunto ofrece un biomarcador sólido para mejorar la estratificación del riesgo y controlar la eficacia terapéutica, abordando en particular el desafío de la heterogeneidad de la respuesta dentro de la población MSI-H. Mecanísticamente, proponemos que el fracaso terapéutico, incluyendo tanto la falta de respuesta primaria como la resistencia adquirida, resulta de un bloqueo de la diferenciación que dificulta la generación o el mantenimiento de este fenotipo efector específico. Al dilucidar la red transcripcional orquestada por ETS1 y PRDM1, nuestros hallazgos proporcionan una base sólida para las terapias de nueva generación diseñadas para movilizar este potente reservorio efector, ofreciendo así una nueva estrategia para superar la resistencia inmunitaria.