El análisis combinado de la accesibilidad de la cromatina, las interacciones entre promotores y la secuenciación del genoma completo resolvió la heredabilidad ausente en el cáncer gástrico

La heredabilidad faltante en el cáncer gástrico difuso hereditario (HDGC) oscila entre el 60 y el 90%. Estas familias similares a HDGC, a pesar de cumplir con los criterios clínicos de HDGC, carecen de variantes germinales accionables de CDH1 y CTNNA1, y no se les ofrecen medidas de prevención de enfermedades que salvan vidas dirigidas a HDGC. Aquí exploramos nuevos mecanismos de predisposición a HDGC que afectan la red regulatoria de CDH1. Identificamos variantes de nucleótido único (SNV) y variantes del número de copias (CNV) a partir de datos de secuenciación del genoma completo de 19 probandos similares a HDGC y realizamos análisis de ontología génica.

Se evaluaron marcas de potenciadores de cromatina e interacciones del promotor de CDH1 en estómago normal mediante ChIP-seq, ATAC-seq y 4C-seq; la causalidad de variantes se evaluó mediante RT-PCR, inmunohistoquímica y análisis de inestabilidad de microsatélites (MSI) en tumores. Se realizó análisis funcional utilizando CRISPR-Cas9, RT-PCR y citometría de flujo en líneas celulares, y ensayos de potenciadores utilizando embriones de ratón. Dentro del dominio topológicamente asociado (TAD) de CDH1, encontramos dos deleciones en las familias F4 y F9. F4 llevaba una CNV heterocigota de 20kb en CDH3 que desencadenaba pérdida de mRNA/proteína de CDH1 en homocigosis mediante edición con CRISPR-Cas9, similar a una deleción de codificación de CDH1.

Esta secuencia de 20kb encierra dos elementos reguladores (REs) tisulares específicos hipomórficos, cada uno contribuyendo al 50% de la regulación de la expresión de CDH1. F9 llevaba una CNV intergénica heterocigota de 39pb aguas abajo de CDH1, desencadenando pérdida de mRNA/proteína de CDH1 mediante CRISPR-Cas9. F15, que presentaba cáncer gástrico pero no colorrectal, llevaba una CNV germinal heterocigota de 2.7Kb en MLH1 que se superpone a un RE específico de estómago encontrado por ChIP-seq. El tumor gástrico de histología mixta mostró inestabilidad de microsatélites (MSI), reducción de mRNA y proteína de MLH1, y reducción de proteína de CDH1 y E-cadherina.

Los clones CRISPR-Cas9 que mimetizan la CNV heterocigota de MLH1 desencadenaron pérdida de mRNA y proteína de MLH1 y CDH1/E-cadherina, similar a una deleción de codificación. Más allá del TAD de CDH1 y genes de síndrome de riesgo tumoral, se encontraron deleciones múltiples de secuencias de cromatina accesible del estómago en individuos particularmente jóvenes afectados de 6 familias adicionales. Este patrón oligogénico afectó específicamente genes de mucina y múltiples vías relacionadas con el sistema inmunológico. Aquí identificamos nuevos mecanismos detrás de la predisposición a HDGC.

Uno implica deleciones de REs de CDH1 en el TAD o REs de CDH1 específicos de estómago en el locus MLH1. El segundo implica deleciones múltiples de REs de estómago que afectan genes relacionados con mucina e inmunidad, favoreciendo un fenotipo de inmunodeficiencia gástrica. En conjunto, al combinar la accesibilidad de cromatina específica del estómago e interacciones del promotor con la secuenciación del genoma completo, resolvimos la heredabilidad faltante en el 47% de las familias similares a HDGC dentro de nuestra cohorte.