Valor pronóstico de los niveles perioperatorios de ADN tumoral circulante estimados por metilación del ADN libre de células en pacientes con metástasis hepáticas de cáncer colorrectal resecables.

Tras el tratamiento inicial del cáncer colorrectal, muchos pacientes presentan metástasis confinadas al hígado. Estos pacientes con metástasis hepáticas de cáncer colorrectal (MHC) aún pueden ser tratados con intención curativa. Sin embargo, aproximadamente la mitad de estos pacientes presentan recurrencia de la enfermedad en el plazo de un año. Los ensayos aleatorizados han demostrado que la quimioterapia (neo)adyuvante aumenta la supervivencia libre de recurrencia (SLR), pero no la supervivencia global (SG). Como resultado, y en ausencia de biomarcadores clínicamente validados, las guías locales actuales recomiendan la quimioterapia perioperatoria para todos los pacientes o para ninguno. El ADN tumoral circulante (ctDNA) es un biomarcador prometedor y fácil de usar para el paciente, y se están llevando a cabo un número creciente de estudios y ensayos en varios tipos de cáncer.

Realizamos una búsqueda en PubMed de artículos revisados por pares que incluyeran los términos "metástasis hepáticas de cáncer colorrectal" y "ADN tumoral circulante", desde el inicio de la base de datos hasta el 4 de marzo de 2026, sin restricciones de idioma, e identificamos 26 artículos relevantes después de excluir las revisiones y los artículos de opinión. Una gran cantidad de estudios informan que la detección de ctDNA en el período posoperatorio se asocia con una peor SLR y, en un subconjunto de esos estudios, también con una peor SG, mientras que un estudio mostró que los pacientes con ctDNA en el período posoperatorio obtienen mayores beneficios de la quimioterapia adyuvante. La evidencia es contradictoria con respecto al efecto del ctDNA preoperatorio en la SLR y, en su mayoría, negativa para la SG, aunque la gran mayoría de estos estudios se han realizado en poblaciones mixtas con diversos esquemas de quimioterapia perioperatoria.

Dos estudios investigaron específicamente el valor del ctDNA durante la quimioterapia de inducción e informan sobre las asociaciones entre el ctDNA basal, durante el tratamiento y preoperatorio (es decir, después de la terapia de inducción) y la recurrencia temprana de la enfermedad después de la terapia local, así como la SG.

Valor añadido de este estudio

Realizamos un análisis de ctDNA en una cohorte de 120 pacientes con MHC, sin tratamiento quimioterapéutico previo, que inicialmente eran elegibles para un tratamiento curativo, utilizando un ensayo no específico para el tumor. En esta cohorte homogénea, observamos una asociación significativa entre los niveles de ctDNA basales (sin tratar) y tanto la SLR como la SG. Esto se mantuvo después de corregir por los niveles de ctDNA posoperatorios.

Implicaciones de toda la evidencia disponible

El ctDNA tiene el potencial de guiar las decisiones de tratamiento para los pacientes con MHC durante todo el curso de la enfermedad, desde el diagnóstico hasta después del tratamiento curativo. Además de detectar la enfermedad residual posoperatoria, permite la identificación temprana de un grupo de pacientes con un mal pronóstico basal, que podrían beneficiarse del tratamiento neoadyuvante, lo que en última instancia disminuiría tanto el sobretratamiento como el infratratamiento.

Introducción

El cáncer colorrectal (CCR) es una enfermedad común y mortal, que ocupa el tercer lugar en incidencia mundial y el segundo en número de muertes entre todos los tipos de cáncer.^[1] En el momento del diagnóstico inicial, aproximadamente el 20% de los pacientes con CCR presentarán metástasis hepáticas de cáncer colorrectal (MHC), y un 20-30% adicional de los pacientes desarrollarán MHC durante el curso de su enfermedad.^[2],^[3] En aproximadamente el 20% de los casos, las MHC se tratan con intención curativa. Sin embargo, la mitad de estos pacientes presentan recurrencia de la enfermedad en el plazo de un año.^[4]

Los ensayos controlados aleatorizados demostraron que la quimioterapia perioperatoria en pacientes con MHC resecables retrasa la recurrencia de la enfermedad, pero no aumenta la supervivencia global (SG),^[5], ^[6], ^[7], lo que sugiere que solo un subconjunto de pacientes obtiene un beneficio en la supervivencia del tratamiento sistémico adicional. Por otro lado, estos tratamientos causan una toxicidad sustancial a corto y largo plazo. Existen varios puntajes de riesgo pronóstico basados en parámetros clínicos y/o marcadores moleculares adicionales (por ejemplo, el estado de mutación de KRAS/BRAF) que se pueden aplicar antes de la cirugía,^[8], siendo el más conocido el puntaje de Fong et al.^[9] Sin embargo, la mayoría de las guías clínicas recomiendan administrar quimioterapia a todos los pacientes resecables o a ninguno, lo que sugiere que los modelos de riesgo actuales no se utilizan en la práctica clínica diaria, lo que resulta en un sobretratamiento o infratratamiento de los pacientes con MHC.

El ADN tumoral circulante (ctDNA) ha ganado popularidad recientemente como una herramienta para la predicción temprana y la detección de la enfermedad residual mínima (ERM) después de la cirugía en pacientes con cáncer.^[10], ^[11], ^[12] El ctDNA se puede detectar de varias maneras: mutaciones en genes específicos del cáncer (colorectal) (utilizando paneles de secuenciación dirigidos), alteraciones específicas del paciente (informadas por el tumor) o alteraciones más universales, no específicas del tumor, como la aneuploidía,^[13] la metilación del ADN,^[14] y la fragmentómica.^[15] En MHC resecables, estudios previos han encontrado asociaciones significativas entre la detección de ctDNA posoperatorio, pero no preoperatorio, y peores resultados.^[16],^[17] La primera prueba de la utilidad clínica de la detección de ctDNA posquirúrgico, informado por el tumor, en MHC resecables se sugirió en un análisis de subgrupos no aleatorizado del ensayo GALAXY de 2024, que mostró un beneficio en la supervivencia con la quimioterapia adyuvante específicamente en pacientes con ctDNA positivo después de la cirugía.^[18] Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las poblaciones de pacientes investigadas en todos estos estudios eran heterogéneas en términos de los tratamientos sistémicos perioperatorios recibidos.

En los Países Bajos, la quimioterapia perioperatoria no es el tratamiento estándar en pacientes con MHC resecables, lo que permite la evaluación del verdadero potencial pronóstico del ctDNA en una población homogénea, sin tratamiento quimioterapéutico previo. Esto inspiró el estudio MIRACLE holandés, en el que se recolectaron muestras pre y posoperatorias en 188 pacientes sin tratamiento quimioterapéutico previo con MHC inicialmente resecables de cuatro hospitales diferentes.^[19] El trabajo previo en esta cohorte utilizando la detección de mutaciones mediante un panel específico de CCR confirmó que la detección de ctDNA posoperatorio, pero no preoperatorio, se asoció con una peor supervivencia libre de recurrencia (SLR).^[19] Sin embargo, el ensayo dirigido utilizado no pudo detectar ctDNA en el 33% de los pacientes antes de la cirugía,^[19], mientras que los resultados del ensayo GALAXY utilizando un ensayo de ctDNA informado por el tumor indicaron la presencia de ctDNA preoperatorio en casi todos los pacientes.^[11] Por otro lado, el porcentaje de pacientes con ctDNA positivo en el período posoperatorio fue similar en los dos estudios (27 y 32%).^[18],^[19] Aunque los resultados con los paneles de detección de ctDNA informado por el tumor son prometedores en términos de sensibilidad y especificidad,^[18], su diseño específico para cada paciente también los hace costosos y complicados, con tiempos de respuesta considerables.

En resumen, la evidencia del uso de ctDNA en el manejo clínico de los pacientes con MHC está aumentando. Esto requiere un mayor desarrollo de ensayos de detección de ctDNA universalmente aplicables y asequibles para facilitar su implementación a nivel mundial en la práctica clínica diaria. Aquí, evaluamos un método para el perfilado cromosómico y de metilación simultáneos y no específicos del tumor de cfDNA^[20],^[21] para detectar y cuantificar el ctDNA en muestras pre y posquirúrgicas de la cohorte MIRACLE.

Métodos

Pacientes y datos

Incluimos a 154 pacientes que dieron su consentimiento y que padecían MHC y que eran elegibles para un tratamiento curativo y que participaron en el estudio MIRACLE,^[19], un estudio de biomarcadores observacional prospectivo con cuatro hospitales participantes en los Países Bajos (Fig. 1A) entre octubre de 2015 y diciembre de 2021. Los pacientes con CCR diagnosticados con MHC resecables eran elegibles para participar en el estudio. Se excluyeron los pacientes con enfermedad extrahepática, tratamientos de primera línea en el hígado, MHC no resecables o que hubieran recibido algún tipo de quimioterapia perioperatoria. El diagnóstico de recurrencia se realizó mediante imágenes radiográficas en combinación con mediciones de CEA, de acuerdo con las guías holandesas. Para cada paciente, recolectamos una muestra de sangre preoperatoria menos de 24 horas antes de la cirugía (T0) y una muestra posoperatoria 3 semanas después de la cirugía (T3, Fig. 1B).

También incluimos muestras de sangre preoperatorias de 12 pacientes que dieron su consentimiento y que fueron excluidos de la cohorte MIRACLE debido a una enfermedad no resecable en el momento de la cirugía, la administración de quimioterapia adyuvante o las resecciones de primera línea en el hígado, como muestras de control positivo. Para comparar los perfiles de cfDNA de nuestros pacientes con los de individuos sanos, obtuvimos plasma de 34 voluntarios. Además, utilizamos 30 muestras de tejido congelado fresco de MHC obtenidas durante la cirugía para definir la señal específica del tumor.

Ética

El protocolo del estudio fue aprobado por el comité de ética institucional del centro iniciador (Centro Médico Universitario de Erasmus) y en todos los centros participantes (hospital Amphia, hospital IJsselland y hospital Albert Schweitzer) con el número de registro NL53086.078.15. Todos los participantes proporcionaron un consentimiento informado por escrito de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki.

Aislamiento de ADN y perfilado de metilación

Recolectamos sangre en tubos CellSave (Menarini) y los procesamos para obtener plasma en un plazo de 96 horas mediante 2 pasos de centrifugación secuenciales, como se describió anteriormente.^[22] El cfDNA se aisló del plasma utilizando el kit QIAmp Circulating Nucleic Acid (Qiagen). Para todas las muestras, se utilizaron 10 ng de cfDNA para el perfilado de metilación utilizando el ensayo MeD-seq (Fig. 1C).^[20],^[23] En resumen, fragmentamos el cfDNA con la enzima de restricción dependiente de la metilación LpnPI, que crea fragmentos de 32 pares de bases con un sitio CpG metilado en su centro. Se ligaron adaptadores, seguido de una selección de tamaño utilizando Pippin (Sage Science) para eliminar los fragmentos no digeridos. Las bibliotecas resultantes se secuenciaron en la plataforma NextSeq o Hi-seq (Illumina), generando aproximadamente 20 millones de lecturas por muestra. La influencia de las condiciones preanalíticas en los perfiles de metilación de cfDNA de MeD-seq fue evaluada por Deger et al.^[20] El perfilado de metilación del ADN genómico de los tejidos de MHC se realizó de manera similar, como se describió anteriormente.^[23]

LpnPI reconoce un CpG metilado en contextos de secuencia particulares (CCG, CCGG, CGG y GCGC), lo que corresponde a 16.596.934 ubicaciones en el genoma humano (hg38).^[23] Las lecturas de secuenciación que tenían uno de los cuatro sitios de reconocimiento de LpnPI a 16 pares de bases de cualquiera de los extremos del fragmento (lecturas de CpG) se mapearon al genoma de referencia. En todas nuestras muestras, al menos el 80% (mediana del 98,2%, IQR [97,8%–98,8%]) de las lecturas de CpG se mapearon a una de las ubicaciones mencionadas anteriormente. Las lecturas no CpG se ignoraron para el perfilado de metilación.

Eliminamos las muestras en las que sospechábamos que la digestión de LpnPI era subóptima o no exitosa, lo que definimos como muestras que consistían en menos del 20% de lecturas de CpG o que tenían menos de 3.000.000 de lecturas de CpG mapeadas al genoma humano.

Luego, agregamos los niveles de metilación de los sitios CpG cercanos. Esto alivia el ruido en los datos causado por la escasez de datos (especialmente significativo en el análisis de cfDNA) y la "competencia" de los sitios CpG cercanos para unirse a una molécula de LpnPI determinada. Más específicamente, dividimos el genoma en 27.923 regiones, cada una de las cuales corresponde a una isla CpG,^[24] y, por muestra, sumamos el número de lecturas de todos los sitios de destino de LpnPI dentro de cada región para obtener el recuento total de lecturas para esa región. Para eliminar los efectos específicos del sexo, solo utilizamos las 26.840 regiones ubicadas en los 22 cromosomas autosómicos en los análisis posteriores.

Los recuentos de islas CpG por muestra son generalmente sobre dispersos, por lo que elegimos modelarlos utilizando distribuciones binomiales negativas^[21] y utilizamos el paquete edgeR v3.36^[25] para encontrar regiones diferencialmente metiladas (DMR).

Para vincular las DMR con los perfiles de metilación específicos del tejido, utilizamos 205 perfiles de metilación^[14] y convertimos los valores beta de metilación de todo el genoma en un perfil de islas CpG calculando, dentro de cada muestra, el valor beta medio de todos los sitios CpG en cada isla CpG. Dado un conjunto de islas CpG diferencialmente metiladas con los cambios de registro correspondientes, calculamos la correlación de Spearman entre estos cambios y el valor beta medio de esa isla CpG en cada muestra del atlas. Luego, promediamos todas las correlaciones de las muestras del mismo tejido y ordenamos los tejidos según estas correlaciones medias.

Estimación de la fracción tumoral basada en las variaciones del número de copias (CNV) y las mutaciones

Anteriormente demostramos que, además del perfilado de metilación, el ensayo MeD-seq puede utilizarse para identificar CNV.^[21] Dividimos el genoma en intervalos de 1 Mbp y contamos el número de lecturas de fondo (no CpG) en cada intervalo. Utilizamos la regresión LOESS para corregir los sesgos del contenido de GC y la capacidad de mapeo, y calculamos la relación logarítmica del recuento de lecturas corregido en cada intervalo con el recuento de lecturas corregido medio correspondiente en nuestros 31 donantes sanos. Estas relaciones logarítmicas se utilizaron posteriormente como entrada para ichorCNA, que devuelve una estimación de la fracción tumoral junto con el perfil de número de copias más probable. Siguiendo este enfoque, descrito con más detalle en ^[21], derivamos estimaciones de la fracción tumoral utilizando ichorCNA^[13] (TFE-CNV) para todas las muestras de pacientes preoperatorias y postoperatorias (cobertura media para la determinación de CNV de 0,1x).

Los mismos pacientes se analizaron preoperatoriamente (T0) para detectar mutaciones en puntos calientes en 14 genes de CRC utilizando el ensayo Oncomine™ Colon cfDNA Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), como se describió anteriormente.^[19] La frecuencia máxima del alelo variante (VAF) de todas las mutaciones detectadas se utilizó como un indicador de la fracción tumoral en los pacientes Oncomine™-positivos. En T3, la presencia y la cantidad de ctDNA en los pacientes con mutaciones Oncomine™ detectadas se evaluaron utilizando PCR digital (dPCR) cuando estuvo disponible, y de lo contrario, utilizando el panel Oncomine™.^[19] Se proporciona una descripción general del número de pacientes con perfiles de metilación y mutación exitosos en ambos puntos temporales en la Figura S1.

Estimación de la fracción tumoral utilizando la metilación

Asumimos que un perfil de metilación de cfDNA es una mezcla de dos componentes: cfDNA sano y ctDNA (Fig. 1C). Primero, identificamos las DMR entre los dos componentes comparando 31 muestras de cfDNA de controles sanos y 30 muestras de ADN de tejidos tumorales de CRLM utilizando la versión 3.36 del paquete edgeR.^[25] Dado que el cfDNA sano (que consiste principalmente en células inmunitarias y progenitores) tiene perfiles muy diferentes de los tejidos de CRLM, esperábamos encontrar un gran número de regiones con metilación significativamente diferente. Para minimizar las regiones falsas positivas que no reflejan señales derivadas del tumor, aplicamos el estricto procedimiento de corrección de pruebas múltiples de Bonferroni y seleccionamos solo las regiones con una tasa de error familiar (FWER) < 0,05.

Para enriquecer aún más las diferencias de metilación relacionadas con el tumor, utilizamos un conjunto de control positivo independiente (n = 10) para el cual se dispuso de datos de metilación y mutación. En este conjunto de datos, calculamos la correlación entre la frecuencia del alelo variante detectado más grande (VAF, mediana del 8%, IQR [2,6%, 23,5%]) y los recuentos de metilación normalizados por log-TPM^[26], y conservamos solo las regiones con correlaciones estadísticamente significativas (FDR < 0,05) cuyo signo coincidiera con el del cambio de pliegue.

Luego, calculamos la media y la varianza de los recuentos de metilación sin procesar en cada región en cada componente y los introducimos en un algoritmo de deconvolución binomial negativa,^[27] que encuentra el valor de fracción tumoral más probable (TFE-ME, en el rango [0,0, 1,0], Métodos suplementarios S1).

Análisis de supervivencia

El resultado principal de interés fue la recurrencia de la enfermedad en un plazo de un año, que fue el punto final primario predefinido del estudio MIRACLE.^[19] Por lo tanto, a menos que se especifique lo contrario, todos los pacientes se censuraron para el RFS a los 365 días después de la resección, tanto para los análisis de Kaplan-Meier como para los de Cox. Como punto final secundario, también evaluamos la OS.

Los análisis multivariables incluyeron la edad, el sexo, la ubicación del tumor primario, el estado mutacional de KRAS, si el diagnóstico de CRLM fue sincrónico o metacrónico con el diagnóstico del tumor primario y el grupo de riesgo según la puntuación de Fong.^[9]

El estado de mutación de KRAS del tumor primario faltaba en 75/120 pacientes, porque esta información no se recopilaba de forma sistemática en todos los centros al inicio de este estudio. Por lo tanto, investigamos si el uso del estado de mutación de KRAS del panel Oncomine es un buen indicador del tumor primario, utilizando los 45 pacientes para los que disponíamos de ambas mediciones. Descubrimos que, de los 25 pacientes KRAS WT, todos resultaron negativos para las mutaciones de KRAS mediante el panel Oncomine (es decir, 100% de especificidad). De los 20 tumores KRAS mutantes, 17 también se identificaron como KRAS mutantes, lo que resultó en una sensibilidad del 85% y una precisión total del 93,3%. El gran acuerdo observado entre los ensayos nos motivó a utilizar el estado de mutación de KRAS basado en la biopsia líquida como covariable en nuestros análisis multivariables.

Se eliminó a un sujeto de los análisis multivariables debido a la falta de información clínica (Fig. 1A). El tiempo medio de seguimiento para las observaciones censuradas se calculó utilizando el método de Schemper y Smith.^[28] Para todos los modelos de Cox, utilizamos la relación entre los residuos de Schoenfeld y el tiempo transformado en rango para probar las violaciones del supuesto de proporciones de riesgos.^[29] No se encontraron violaciones significativas del supuesto.

Para facilitar la interpretación de las razones de riesgo (HR), escalamos los TFE de modo que un aumento de 1 unidad en la variable escalada corresponda a un aumento de 10 puntos porcentuales en la carga tumoral (es decir, un aumento de 0,1 en la estimación de la fracción tumoral). La edad se estandarizó a una media de cero y una desviación estándar de uno.

Estadísticas

Probamos las diferencias en la mediana de una variable continua entre dos grupos utilizando la prueba U de Mann-Whitney y para la sobrerrepresentación de una variable categórica en uno de dos grupos utilizando la prueba exacta de Fisher. Para probar la sobrerrepresentación de las DMR a nivel del genoma (n = 26.840), utilizamos la prueba aproximada de chi-cuadrado en lugar de la prueba de Fisher por razones computacionales. La prueba de chi-cuadrado también se utilizó para probar las asociaciones de variables categóricas con más de dos categorías. Las diferencias en el tiempo de supervivencia se evaluaron utilizando la prueba de rango logarítmico.

Cuando fue necesario, aplicamos la corrección de pruebas múltiples, controlando la tasa de descubrimiento falso (FDR) utilizando el procedimiento de Benjamini-Hochberg. Una excepción es la comparación de cfDNA sano con tejidos de CRLM, donde se aplicó la corrección de Bonferroni más estricta para corregir la FWER multiplicando todos los valores p por el número de pruebas realizadas.

Dado nuestro tamaño de muestra de 120 pacientes con 60 eventos de RFS en un plazo de un año, realizamos un cálculo de potencia para estimar la razón de riesgo mínima que podemos identificar utilizando el método de Schoenfeld.^[30] En el análisis preoperatorio (T0), dividimos los datos en dos grupos iguales, mientras que en el postoperatorio, los datos se dividieron en dos grupos desiguales (70%-30%). La Figura S2 muestra que nuestro estudio tuvo un 80% de potencia para detectar razones de riesgo de al menos 2,05 en T0 y de al menos 2,2 en T3. Para la OS, el número de eventos fue de 50 y, por lo tanto, las razones de riesgo mínimas con un 80% de potencia fueron de 2,225 (T0) y 2,375 (T3, Figura S2). La validez de los puntos de corte elegidos se evaluó mediante bootstrapping y probando su generalización en diferentes lotes de secuenciación y centros de inclusión (Métodos suplementarios S2).

Evaluación y comparación de las estimaciones de la fracción tumoral

Comparamos el TFE-ME, el TFE-CNV, la puntuación de Fong y nuestro modelo multivariable utilizando variables clínicas y el TFE-ME en términos de su capacidad para modelar los resultados de supervivencia, discriminar entre pacientes con y sin un evento y estimar con precisión los riesgos de un evento (calibración). Entrenamos modelos de Cox para predecir el RFS y la OS y los evaluamos utilizando el índice de concordancia, el ROCAUC y el índice de calibración integrado (ICI).^[31] Tenga en cuenta que un índice de concordancia y un ROCAUC más altos corresponden a un mejor modelo, mientras que un ICI más bajo corresponde a un mejor modelo, con una calibración perfecta que tiene un ICI de 0. El ROCAUC y el ICI se evaluaron a los 12 meses para el RFS (el objetivo primario de nuestro estudio) y a los 3 años para la OS. Empleamos una validación cruzada de 10 pliegues estratificada por la presencia de un evento a 1 o 3 años (para el RFS y la OS, respectivamente) e informamos la media y el error estándar de cada métrica en los 10 pliegues.

Además, empleamos el análisis de la curva de decisión^[32] para probar si las predicciones del modelo de OS a 3 años que incluye el TFE-ME preoperatorio podrían utilizarse potencialmente para guiar las decisiones clínicas con respecto a la administración de quimioterapia neoadyuvante. Los detalles de este experimento se proporcionan en los Métodos suplementarios S3.

Identificación de un conjunto más pequeño de marcadores para la estimación de la fracción tumoral

A partir del conjunto final de marcadores que se utilizaron para estimar el TFE-ME, probamos si es posible obtener estimaciones comparables de la fracción tumoral utilizando un conjunto más pequeño de marcadores, que se pueden analizar utilizando un ensayo dirigido más asequible. Utilizamos los perfiles de metilación de cfDNA de todos los 130 pacientes con CRLM y nuestro objetivo fue construir un modelo de regresión que prediga la carga de ctDNA a partir de los recuentos de metilación de cfDNA normalizados por log-TPM en estas regiones de marcadores. En lugar de predecir el TFE-ME directamente, primero aplicamos la transformación logística inversa y entrenamos el regresor utilizando los valores transformados. Esto garantiza que nuestro modelo siempre realice predicciones estrictamente en el rango [0, 1] y estabiliza la varianza de los residuos, que es diferente para los valores cercanos a 0 o 1 que para los valores más cercanos a 0,5.

Probamos dos modelos de regresión lineal que imponen la escasez y, por lo tanto, realizan la selección de variables, a saber, mínimos cuadrados con regularización L1 y regresión de ángulo mínimo.^[33] Cada modelo tiene un único parámetro: la cantidad de regularización L1 y el número máximo de características con coeficientes distintos de cero, respectivamente. El ajuste y la selección del modelo se realizaron utilizando una validación cruzada anidada de 3 pliegues y el R2 como criterio. Esto permite una evaluación imparcial del rendimiento del modelo seleccionado en datos no vistos. Luego, utilizamos una única validación cruzada de 3 pliegues para seleccionar un único modelo y parámetro óptimos que volvimos a entrenar en todo el conjunto de datos. Finalmente, los marcadores que tenían un coeficiente distinto de cero en ese modelo se seleccionaron como posibles marcadores que se utilizarán en un ensayo dirigido.

Además, probamos si nuestro enfoque para encontrar un conjunto reducido de nuestros marcadores se generaliza a pacientes de diferentes hospitales y de diferentes lotes de secuenciación. Agrupamos a los pacientes del Erasmus MC en un grupo (Tabla 1, EMC) y a los pacientes de los otros tres hospitales en un segundo grupo (periférico). Luego, utilizamos un grupo para encontrar los marcadores y lo probamos en el otro. Repetimos este análisis, pero agrupamos a los pacientes según el lote de secuenciación, con los tres primeros lotes (n = 57) que constituyen un grupo y los cuatro lotes restantes (n = 63) un segundo grupo.

Función de los financiadores

Los financiadores no participaron en el diseño del estudio, la recopilación de datos, el análisis de datos, la interpretación o la redacción del informe.

Pacientes y datos

Incluimos a 154 pacientes que dieron su consentimiento para participar en el estudio MIRACLE,^[19], un estudio de biomarcadores prospectivo y observacional con cuatro hospitales participantes en los Países Bajos (Fig. 1A) entre octubre de 2015 y diciembre de 2021. Los pacientes con CRC diagnosticados con CRLM resecable y aislado eran elegibles para participar en el estudio. Los pacientes con enfermedad extrahepática, tratamientos de primera línea en el hígado, CRLM no resecables o que hubieran recibido alguna quimioterapia perioperatoria fueron excluidos. La recurrencia se diagnosticó utilizando imágenes radiográficas en combinación con mediciones de CEA, según las directrices holandesas. Para cada paciente, se recogió una muestra de sangre preoperatoria menos de 24 horas antes de la cirugía (T0) y una muestra postoperatoria 3 semanas después de la cirugía (T3, Fig. 1B).

También incluimos muestras de sangre preoperatorias de 12 pacientes que dieron su consentimiento y que fueron excluidos del grupo MIRACLE debido a una enfermedad no resecable en el momento de la cirugía, la administración de quimioterapia adyuvante o las resecciones de primera línea en el hígado, como muestras de control positivo. Para comparar los perfiles de cfDNA de nuestros pacientes con los de individuos sanos, obtuvimos plasma de 34 voluntarios. Además, utilizamos 30 muestras de tejido de CRLM congeladas para definir la señal específica del tumor.

Ética

El protocolo del estudio fue aprobado por el comité de ética institucional del centro iniciador (Erasmus University Medical Center) y en todos los centros participantes (hospital Amphia, hospital IJsselland y hospital Albert Schweitzer) con el número de registro NL53086.078.15. Todos los participantes proporcionaron su consentimiento informado por escrito de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki.

Aislamiento de ADN y perfilado de metilación

Recogimos sangre en tubos CellSave (Menarini) y la procesamos para obtener plasma en un plazo de 96 horas mediante 2 pasos de centrifugación secuenciales, según se describió anteriormente.^[22] El cfDNA se aisló del plasma utilizando el kit QIAmp Circulating Nucleic Acid (Qiagen). Para todas las muestras, se utilizaron 10 ng de cfDNA para el perfilado de metilación utilizando el ensayo MeD-seq (Fig. 1C).^[20],^[23] En resumen, digerimos los fragmentos de cfDNA con la enzima de restricción dependiente de la metilación LpnPI, que crea fragmentos de 32 pares de bases con un sitio CpG metilado en su centro. Se ligaron adaptadores, seguido de una selección de tamaño utilizando Pippin (Sage Science) para eliminar los fragmentos no digeridos. Las bibliotecas resultantes se secuenciaron en la plataforma NextSeq o Hi-seq (Illumina), generando aproximadamente 20 millones de lecturas por muestra. Deger y colaboradores^[20] evaluaron la influencia de las condiciones preanalíticas en los perfiles de metilación de cfDNA obtenidos con el ensayo MeD-seq. El perfilado de metilación del ADN genómico de tejidos CRLM se realizó de manera similar, como se describió anteriormente.^[23]

LpnPI reconoce un CpG metilado en contextos de secuencia particulares (CCG, CCGG, CGG y GCGC), lo que corresponde a 16.596.934 ubicaciones en el genoma humano (hg38).^[23] Las lecturas de secuenciación que tenían uno de los cuatro sitios de reconocimiento de LpnPI a 16 pares de bases de cualquiera de los extremos del fragmento (lecturas de CpG) se mapearon al genoma de referencia. En todas nuestras muestras, al menos el 80% (mediana del 98,2%, IQR [97,8%–98,8%]) de las lecturas de CpG se mapearon a una de las ubicaciones mencionadas anteriormente. Las lecturas no CpG se ignoraron para el perfilado de metilación.

Eliminamos las muestras en las que sospechábamos que la digestión con LpnPI era subóptima o no exitosa, lo que definimos como muestras que consistían en menos del 20% de lecturas de CpG o que tenían menos de 3.000.000 de lecturas de CpG mapeadas al genoma humano.

Luego, agregamos los niveles de metilación de los sitios CpG cercanos. Esto reduce el ruido en los datos causado por la escasez de datos (especialmente significativo en el análisis de cfDNA) y la "competencia" de los sitios CpG cercanos para unirse a una molécula de LpnPI determinada. Más específicamente, dividimos el genoma en 27.923 regiones, cada una correspondiente a una isla CpG,^[24] y, por muestra, sumamos el número de lecturas de todos los sitios objetivo de LpnPI dentro de cada región para obtener el recuento total de lecturas para esa región. Para eliminar los efectos específicos del sexo, solo utilizamos las 26.840 regiones ubicadas en los 22 cromosomas autosómicos en los análisis posteriores.

Los recuentos de lecturas por isla CpG son generalmente sobre-dispersos, por lo que elegimos modelarlos utilizando distribuciones binomiales negativas^[21] y utilizamos el paquete edgeR v3.36^[25] para encontrar regiones diferencialmente metiladas (DMR).

Para vincular las DMR con los perfiles de metilación específicos de los tejidos, utilizamos 205 perfiles de metilación^[14] y convertimos los valores beta de metilación de todo el genoma en un perfil de islas CpG calculando, dentro de cada muestra, el valor beta medio de todos los sitios CpG en cada isla CpG. Dado un conjunto de islas CpG diferencialmente metiladas con los cambios de registro correspondientes, calculamos la correlación de Spearman entre estos cambios y el valor beta medio de esa isla CpG en cada muestra del atlas. Luego, promediamos todas las correlaciones de las muestras del mismo tejido y ordenamos los tejidos según estas correlaciones medias.

Estimación de la fracción tumoral basada en las variaciones del número de copias (CNV) y las mutaciones

Previamente demostramos que, además del perfilado de metilación, el ensayo MeD-seq se puede utilizar para identificar CNV.^[21] Dividimos el genoma en intervalos de 1 Mbp y contamos el número de lecturas de fondo (no CpG) en cada intervalo. Utilizamos la regresión LOESS para corregir los sesgos del contenido de GC y la capacidad de mapeo, y calculamos la relación de registro del recuento de lecturas corregido en cada intervalo con el recuento de lecturas corregido medio correspondiente en nuestros 31 donantes sanos. Estas relaciones de registro se utilizaron luego como entrada para ichorCNA, que devuelve una estimación de la fracción tumoral junto con el perfil de número de copias más probable. Siguiendo este enfoque, descrito con más detalle en,^[21] derivamos estimaciones de la fracción tumoral utilizando ichorCNA^[13] (TFE-CNV) para todas las muestras de pacientes pre y postoperatorias (cobertura media para la llamada de CNV de 0,1x).

Los mismos pacientes se analizaron preoperatoriamente (T0) para detectar mutaciones en puntos calientes en 14 genes de CRC utilizando el ensayo Oncomine™ Colon cfDNA Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), como se describió anteriormente.^[19] La frecuencia máxima del alelo variante (VAF) de todas las mutaciones detectadas se utilizó como un indicador de la fracción tumoral en los pacientes positivos para Oncomine™. En T3, la presencia y la cantidad de ctDNA en los pacientes con mutaciones detectadas por Oncomine™ se evaluaron utilizando PCR digital (dPCR) cuando estuvo disponible, de lo contrario utilizando el panel Oncomine™.^[19] Se proporciona una descripción general del número de pacientes con perfiles de metilación y mutación exitosos en ambos puntos temporales en la Figura S1.

Estimación de la fracción tumoral utilizando la metilación

Asumimos que un perfil de metilación de cfDNA es una mezcla de dos componentes: cfDNA sano y ctDNA (Fig. 1C). Primero, identificamos las DMR entre los dos componentes comparando 31 muestras de cfDNA de controles sanos y 30 muestras de ADN de tejidos tumorales CRLM utilizando el paquete edgeR versión 3.36.^[25] Dado que el cfDNA sano (que consiste principalmente en células inmunitarias y progenitores) tiene perfiles muy diferentes de los tejidos CRLM, esperábamos encontrar un gran número de regiones con metilación significativamente diferente. Para minimizar las regiones falsas positivas que no reflejan señales derivadas del tumor, aplicamos el estricto procedimiento de corrección de múltiples pruebas de Bonferroni y seleccionamos solo las regiones con una tasa de error familiar (FWER) < 0,05.

Para enriquecer aún más las diferencias de metilación relacionadas con el tumor, utilizamos un conjunto de control positivo independiente (n = 10) para el cual se dispuso de datos de metilación y mutación. En este conjunto de datos, calculamos la correlación entre la frecuencia máxima del alelo variante detectado (VAF, mediana del 8%, IQR [2,6%, 23,5%]) y los recuentos de metilación normalizados por registro-TPM^[26] y solo conservamos las regiones con correlaciones estadísticamente significativas (FDR < 0,05) cuyo signo coincidía con el del cambio de registro.

Luego, calculamos la media y la varianza de los recuentos de metilación sin procesar en cada región en cada componente y los introducimos en un algoritmo de deconvolución binomial negativa,^[27] que encuentra el valor de fracción tumoral más probable (TFE-ME, en el rango [0,0, 1,0], Métodos suplementarios S1).

Análisis de supervivencia

El resultado principal de interés fue la recurrencia de la enfermedad en un plazo de un año, que fue el punto final primario predefinido del estudio MIRACLE.^[19] Por lo tanto, a menos que se especifique lo contrario, todos los pacientes se censuraron para la supervivencia libre de recurrencia (SLR) a los 365 días de la resección para los análisis de Kaplan-Meier y Cox. Como punto final secundario, también evaluamos la supervivencia global (SG).

Los análisis multivariables incluyeron la edad, el sexo, la ubicación del tumor primario, el estado mutacional de KRAS, si el diagnóstico de CRLM fue sincrónico o metacrónico con el diagnóstico del tumor primario y el grupo de riesgo según la puntuación de Fong.^[9]

El estado mutacional de KRAS del tumor primario faltaba en 75/120 pacientes, porque esta información no se recopilaba de forma sistemática en todos los centros al inicio de este estudio. Por lo tanto, investigamos si el uso del estado mutacional de KRAS del panel Oncomine es un buen indicador del tumor primario utilizando los 45 pacientes para los que disponíamos de ambas mediciones. Encontramos que de los 25 pacientes con KRAS WT, todos fueron negativos para las mutaciones de KRAS mediante el panel Oncomine (es decir, 100% de especificidad). De los 20 tumores con mutación KRAS, 17 también se identificaron como mutaciones de KRAS, lo que condujo a una sensibilidad del 85% y una precisión total del 93,3%. El gran acuerdo observado entre los ensayos nos motivó a utilizar el estado mutacional de KRAS basado en la biopsia líquida como covariable en nuestros análisis multivariables.

Un sujeto se eliminó de los análisis multivariables debido a la falta de información clínica (Fig. 1A). El tiempo medio de seguimiento para las observaciones censuradas se calculó utilizando el método de Schemper y Smith.^[28] Para todos los modelos de Cox, utilizamos la relación entre los residuos de Schoenfeld y el tiempo transformado en rango para probar las violaciones del supuesto de proporciones de riesgos.^[29] No se encontraron violaciones significativas del supuesto.

Para facilitar la interpretación de las razones de riesgo (HR), escalamos los TFE de modo que un aumento de 1 unidad en la variable escalada corresponda a un aumento de 10 puntos porcentuales en la carga tumoral (es decir, un aumento de 0,1 en la estimación de la fracción tumoral). La edad se estandarizó a una media de cero y una desviación estándar de uno.

Estadísticas

Probamos las diferencias en la mediana de una variable continua entre dos grupos utilizando la prueba U de Mann-Whitney y para la sobrerrepresentación de una variable categórica en uno de dos grupos utilizando la prueba exacta de Fisher. Para probar la sobrerrepresentación de las DMR de todo el genoma (n = 26.840), utilizamos la prueba aproximada de chi-cuadrado en lugar de la prueba de Fisher por razones computacionales. La prueba de chi-cuadrado también se utilizó para probar las asociaciones de variables categóricas con más de dos categorías. Las diferencias en el tiempo de supervivencia se evaluaron utilizando la prueba de rango logarítmico.

Cuando fue necesario, aplicamos la corrección de múltiples pruebas, controlando la tasa de descubrimiento falso (FDR) utilizando el procedimiento de Benjamini-Hochberg. Una excepción es la comparación de cfDNA sano con tejidos CRLM, donde se aplicó la corrección de Bonferroni más estricta para corregir la FWER multiplicando todos los valores p por el número de pruebas realizadas.

Dado nuestro tamaño de muestra de 120 pacientes con 60 eventos de SLR dentro de un año, realizamos un cálculo de potencia para estimar la razón de riesgo mínima que podemos identificar utilizando el método de Schoenfeld.^[30] En el análisis preoperatorio (T0), dividimos los datos en dos grupos iguales, mientras que en el postoperatorio, los datos se dividieron en dos grupos desiguales (70%–30%). La Figura S2 muestra que nuestro estudio tuvo un 80% de potencia para detectar razones de riesgo de al menos 2,05 en T0 y de al menos 2,2 en T3. Para la SG, el número de eventos fue de 50 y, por lo tanto, las razones de riesgo mínimas con un 80% de potencia fueron de 2,225 (T0) y 2,375 (T3, Figura S2). La validez de los umbrales elegidos se evaluó mediante bootstrapping y probando su generalización en diferentes lotes de secuenciación y centros de inclusión (Métodos suplementarios S2).

Evaluación y comparación de las estimaciones de la fracción tumoral

Comparamos el TFE-ME, el TFE-CNV, la puntuación de Fong y nuestro modelo multivariable utilizando variables clínicas y el TFE-ME en términos de su capacidad para modelar los resultados de supervivencia, discriminar entre pacientes con y sin un evento y estimar con precisión los riesgos de un evento de los pacientes (calibración). Entrenamos modelos de Cox para predecir la SLR y la SG y los evaluamos utilizando el índice de concordancia, el ROCAUC y el índice de calibración integrado (ICI).^[31] Tenga en cuenta que un índice de concordancia y un ROCAUC más altos corresponden a un mejor modelo, mientras que un ICI más bajo corresponde a un mejor modelo, con una calibración perfecta que tiene un ICI de 0. El ROCAUC y el ICI se evaluaron a los 12 meses para la SLR (el objetivo primario de nuestro estudio) y a los 3 años para la SG. Empleamos una validación cruzada de 10 pliegues estratificada por la presencia de un evento a 1 o 3 años (para la SLR y la SG, respectivamente) e informamos la media y el error estándar de cada métrica en los 10 pliegues.

Además, empleamos el análisis de la curva de decisión^[32] para probar si las predicciones del modelo de SG a 3 años que incluye el TFE-ME preoperatorio podrían utilizarse potencialmente para guiar las decisiones clínicas con respecto a la administración de quimioterapia neoadyuvante. Los detalles de este experimento se proporcionan en los Métodos suplementarios S3.

Identificación de un conjunto más pequeño de marcadores para la estimación de la fracción tumoral

Comenzando con el conjunto final de marcadores que se utilizaron para estimar el TFE-ME, probamos si es posible obtener estimaciones comparables de la fracción tumoral utilizando un conjunto más pequeño de marcadores, que se pueden analizar mediante un ensayo dirigido más asequible. Utilizamos los perfiles de metilación del cfDNA de los 130 pacientes con CRLM y nuestro objetivo fue construir un modelo de regresión que prediga la carga de ctDNA a partir de los recuentos de metilación del cfDNA normalizados por log-TPM en estas regiones de marcadores. En lugar de predecir el TFE-ME directamente, primero aplicamos la transformación logística inversa y entrenamos el regresor utilizando los valores transformados. Esto garantiza que nuestro modelo siempre realice predicciones estrictamente en el rango [0, 1] y estabiliza la varianza de los residuos, que es diferente para los valores cercanos a 0 o 1 que para los valores más cercanos a 0,5.

Probamos dos modelos de regresión lineal que imponen escasez y, por lo tanto, realizan la selección de variables, a saber, mínimos cuadrados con regularización L1 y regresión de ángulo mínimo.^[33] Cada modelo tiene un único parámetro: la cantidad de regularización L1 y el número máximo de características con coeficientes distintos de cero, respectivamente. La optimización y selección del modelo se realizó utilizando una validación cruzada anidada de 3 pliegues y el R2 como criterio. Esto permite una evaluación imparcial del rendimiento del modelo seleccionado en datos no vistos. Luego, utilizamos una única validación cruzada de 3 pliegues para seleccionar un único modelo y parámetro óptimos, que volvimos a entrenar en todo el conjunto de datos. Finalmente, los marcadores que tenían un coeficiente distinto de cero en ese modelo se seleccionaron como marcadores potenciales para ser utilizados en un ensayo dirigido.

Además, probamos si nuestro enfoque para encontrar un conjunto reducido de nuestros marcadores se generaliza a pacientes de diferentes hospitales y de diferentes lotes de secuenciación. Clasificamos a los pacientes del Erasmus MC en un grupo (Tabla 1, EMC) y a los pacientes de los otros tres hospitales en un segundo grupo (periférico). Luego, utilizamos un grupo para encontrar los marcadores y lo probamos en el otro. Repetimos este análisis, pero agrupamos a los pacientes según el lote de secuenciación, con los primeros 3 lotes (n = 57) constituyendo un grupo y los 4 lotes restantes (n = 63) un segundo grupo.

Papel de los financiadores

Los financiadores no participaron en el diseño del estudio, la recopilación de datos, los análisis de datos, la interpretación o la redacción del informe.

Resultados

Pacientes

Obtuvimos con éxito perfiles de metilación y número de copias de cfDNA preoperatorios (T0) según nuestros criterios de control de calidad de 120 pacientes con CRLM (Fig. 1A, Figura S1), de los cuales 60 presentaban recurrencia de la enfermedad dentro de un año. La mediana de seguimiento para esta cohorte fue de 33,9 meses para la supervivencia libre de recurrencia (RFS) y de 60,5 meses para la supervivencia global (OS). Las características clínicas de esta cohorte de pacientes se enumeran en la Tabla 1. Este subconjunto de pacientes no es significativamente diferente de los 68 pacientes adicionales incluidos en la cohorte MIRACLE original^[19] tanto en las características clínicas como en el resultado, pero existe una sobrerrepresentación significativa de un centro de inclusión (Tabla S1). De manera similar, obtuvimos perfiles postoperatorios (T3) de 117 pacientes, mientras que para 112 pacientes, ambos puntos temporales se analizaron con éxito (Fig. 1A, Figura S1).

La comparación del cfDNA sano y las biopsias de CRLM identifica DMRs específicos del tumor

Después del filtrado, identificamos 1069 DMRs entre el cfDNA sano y los tejidos de CRLM (Fig. 2A), de los cuales 1062 estaban hipermetilados en CRLM. Este conjunto se enriqueció principalmente con regiones de los cromosomas 8, 13 y 20 y se redujo para las regiones del cromosoma 22. Una lista curada manualmente de 28 marcadores de metilación específicos del cáncer colorrectal en cfDNA de la literatura (Tabla S2) también estuvo significativamente sobrerrepresentada (14/28, valor p < 10−6, prueba de chi-cuadrado).

Las comparaciones con los datos de tejidos publicados^[14] mostraron que los cambios de pliegue de estos DMRs se correlacionaron más fuertemente con los perfiles de metilación del intestino delgado y grueso, mientras que se correlacionaron negativamente con los perfiles de granulocitos y precursores de eritrocitos (Figura S3).

Las estimaciones preoperatorias de la fracción tumoral representan con precisión la carga de ctDNA

Obtuvimos estimaciones de la fracción tumoral a partir de los datos de número de copias (TFE-CNV) utilizando nuestra adaptación de ichorCNA^[13],^[21] en 120 muestras de cfDNA preoperatorias de pacientes con CRLM. En 78 pacientes (Figura S1) que tenían una mutación en un punto caliente, según lo determinado previamente mediante el panel Oncomine™ de colon,^[19], el TFE-CNV se correlacionó significativamente con el VAF más grande (ρ de Spearman = 0,67, valor p < 10−6, Figura S4a).

También utilizamos nuestro conjunto de 1069 DMRs y un algoritmo de deconvolución para obtener estimaciones de la fracción tumoral basadas en la metilación (TFE-ME), que se correlacionaron aún más fuertemente con el VAF (ρ de Spearman = 0,77, valor p < 10−6, Fig. 2B). La correlación entre el TFE-CNV y el TFE-ME fue de 0,71 (valor p < 10−6), pero disminuyó drásticamente cuando se recalculó utilizando 1069 regiones aleatorias en lugar de los DMRs (Figura S4b).

El TFE-ME fue en promedio significativamente menor en los pacientes Oncomine™-negativos en comparación con los pacientes Oncomine™-positivos (mediana de 0,03 frente a 0,08, valor p < 0,001, prueba U de Mann-Whitney, Fig. 2C). Sin embargo, varias muestras Oncomine™-negativas tenían un TFE-ME alto (Fig. 2C), lo que implica que quizás estas muestras tienen ctDNA pero no albergan ninguna de las mutaciones en puntos calientes incluidas en el panel de mutaciones utilizado. Por el contrario, el método basado en el número de copias no detectó ctDNA incluso en el 35% de los pacientes con VAF positivo (Figura S4a). Estos aparentes "falsos negativos" del TFE-CNV se encontraron en muestras con VAF significativamente más bajos según el panel Oncomine™ (valor p < 10−6, Figura S4c).

Los pacientes cuyo tumor más grande tenía un diámetro mayor de 5 cm, así como los pacientes con una mutación en el gen APC, tenían una carga de ctDNA preoperatoria significativamente mayor (tanto TFE-ME como TFE-CNV, Figuras S5-S6, Tabla S3) en comparación con los pacientes con lesiones más pequeñas y los pacientes sin mutaciones en APC, respectivamente. Las estimaciones no se asociaron significativamente con la edad (ρ = 0,03) ni con ningún factor técnico (FDR > 0,05, Tabla S3). Además, las estimaciones del TFE-ME obtenidas a partir de dos ejecuciones de secuenciación diferentes de las mismas muestras de pacientes fueron muy similares (n = 12, ρ de Spearman = 0,76, valor p = 0,005, Figura S7). El TFE-CNV también se asoció con el estado de mutación de TP53, el CEA preoperatorio y el grupo de riesgo de Fong, mientras que el TFE-ME no. En conjunto, estos resultados demuestran que las estimaciones de la fracción tumoral derivadas de MeD-seq basadas en la metilación o el número de copias pueden capturar con precisión la carga tumoral circulante en la sangre de los pacientes con CRLM.

Los niveles de ctDNA preoperatorios son un factor pronóstico tanto para la RFS como para la OS

A continuación, probamos el valor pronóstico de las evaluaciones de la carga tumoral preoperatoria. Los pacientes para los que ichorCNA detectó ctDNA (TFE-CNV > 0, n = 65) tuvieron una RFS significativamente más corta (8 frente a 21 meses, valor p = 0,02, prueba de rango logarítmico, HR = 1,85, IC del 95% = [1,09, 3,15], Figura S8a). Los pacientes con TFE-CNV positivo tuvieron una mediana de OS de 52,9 meses, mientras que la mediana de OS no se alcanzó durante el seguimiento para el grupo TFE-CNV negativo (valor p = 0,03, prueba de rango logarítmico, HR = 1,87, IC del 95% = [1,05, 3,33], Figura S8b). Estos efectos ya no fueron estadísticamente significativos cuando se utilizó un análisis multivariable que incluyó factores de riesgo preoperatorios bien conocidos de recurrencia de CRLM (Tabla S4).

Centrándonos en el TFE-ME, en ausencia de un punto de corte validado, dividimos nuestro conjunto de 120 pacientes en dos grupos de igual tamaño (ctDNA-alto y ctDNA-bajo) utilizando la mediana de la fracción tumoral preoperatoria de 5,5%. El análisis de Kaplan-Meier también mostró que la RFS fue significativamente más corta para los pacientes con ctDNA-alto en comparación con los pacientes con ctDNA-bajo (Fig. 3A, mediana de RFS de 7,2 frente a 18 meses, valor p = 0,001, prueba de rango logarítmico, HR = 2,34, IC del 95% = [1,38, 3,99]). Ambas curvas de supervivencia eventualmente convergen hacia la tasa de recurrencia media de esta población (alrededor del 70-80%), pero en este punto solo quedan unos pocos pacientes en riesgo en ambos grupos. El bootstrapping mostró que el uso de la mediana del TFE-ME como punto de corte se encuentra dentro del intervalo de confianza del 95% del punto de corte óptimo determinado por las estadísticas de rango máximo seleccionado^[34] (Métodos suplementarios S2, Figura S9, Tabla S5) y el punto de corte de la mediana se generalizó bien en los hospitales y los lotes de secuenciación (Métodos suplementarios S2, Tablas S6-S7).

Se detectó ctDNA en prácticamente todos los 42 pacientes Oncomine™-negativos, con 14 (33%) que tenían un TFE-ME mayor que la mediana de 5,5% (Fig. 2C). Estos pacientes con TFE-ME alto tuvieron una RFS significativamente más corta que los pacientes Oncomine™-negativos restantes con TFE-ME bajo (mediana de RFS de 6,3 frente a 23 meses, valor p < 0,001, prueba de rango logarítmico, HR = 4,17, IC del 95% = [1,66, 10,45], Fig. 3B), a pesar de la menor potencia debido al análisis de un conjunto de pacientes más pequeño.

Un aumento de 0,1 en el TFE-ME continuo conduce a un aumento del 21% en el riesgo de recurrencia dentro de un año, según un modelo de Cox (HR = 1,21, IC del 95% = [1,05, 1,40], valor p = 0,01). Este efecto siguió siendo estadísticamente significativo con una HR similar cuando se realizó un análisis multivariable (Tabla 2).

Con respecto a la OS, el grupo con TFE-ME alto tuvo una mediana de supervivencia de 55 meses, mientras que la mediana de supervivencia del grupo con TFE-ME bajo no se alcanzó durante el período de seguimiento (HR = 1,73, IC del 95% = [0,98, 3,05], valor p = 0,055, prueba de rango logarítmico, Fig. 3C). El punto de corte de la mediana se encontró nuevamente dentro del intervalo de confianza del 95% del punto de corte óptimo para la OS (Figura S9, Tabla S5). Utilizando las estimaciones continuas, encontramos un efecto estadísticamente significativo de un aumento del 26% en el riesgo por cada aumento de 0,1 en el TFE-ME (HR = 1,26, IC del 95% = [1,08, 1,47], valor p = 0,003), que siguió siendo significativo en un análisis multivariable (Tabla 2).

La validación cruzada de diez pliegues mostró que el TFE-ME supera al TFE-CNV tanto en la RFS como en la OS según el índice de concordancia. También fue más preciso y mejor calibrado para identificar a los pacientes con un evento de RFS de 1 año o un evento de OS de 3 años, aunque las métricas medias en algunos casos están dentro de un error estándar (Figuras S10-S11, Tabla S8). También encontramos que el modelo multivariable con parámetros clínicos y TFE-ME fue el mejor para modelar los resultados de supervivencia, logrando el índice de concordancia más alto. También fue el mejor para identificar los eventos de OS dentro de los 3 años (Figura S11) y tuvo un rendimiento similar al de la metilación únicamente para identificar los eventos de RFS dentro de un año (Figura S10, Tabla S8). La calibración del modelo multivariable de RFS fue menos buena en comparación con el TFE-ME únicamente y Fong únicamente, pero fue competitiva para la OS (Figuras S10-S11, Tabla S8). Esto puede deberse al uso de muchas características no informativas (lateralidad, sexo, etc.), lo que dificulta la calibración. Para ambas tareas, el modelo TFE-ME condujo a la mejor calibración.

Se investigó la utilidad clínica potencial del modelo multivariable de OS anterior (Tabla 2) en la guía de las decisiones sobre la administración de quimioterapia neoadyuvante (NAC) mediante el análisis de la curva de decisión (Métodos suplementarios S3).^[32] Utilizando las estimaciones de riesgo de muerte dentro de los tres años posteriores a la cirugía del modelo, superó el tratamiento de todos y el tratamiento de nadie en términos de beneficio neto para todo el rango de puntos de corte clínicamente relevantes,^[32] mientras que la puntuación de Fong por sí sola demostró una curva de decisión claramente inferior (Figura S12). En conjunto, estos resultados muestran que el TFE-ME es un marcador pronóstico preoperatorio independiente para CRLM con potencial utilidad clínica.

La detección de ctDNA postoperatorio se asocia con una RFS más corta.

Aplicamos el mismo algoritmo de deconvolución a las muestras de cfDNA recogidas aproximadamente tres semanas después del tratamiento local del mismo grupo de pacientes. El TFE-ME se redujo después de la cirugía (disminución media del 30%, valor p < 10−6, prueba de rangos con signo de Wilcoxon, Fig. 2D). De las 117 ejecuciones exitosas de MeD-seq, solo el 6% presentaba un TFE-ME superior a la mediana preoperatoria. El TFE-CNV fue cero en todas las muestras T3, excepto en una, lo que confirma la sensibilidad limitada del perfilado del número de copias para la detección de enfermedad residual mínima. El único paciente TFE-CNV-positivo en T3 resultó negativo para ctDNA según las mutaciones.

Debido a los valores significativamente más bajos de TFE-ME postoperatorios, buscamos un punto de corte alternativo al evaluar el rendimiento pronóstico postoperatorio. Estudios previos encontraron que la positividad para ctDNA postoperatoria fue del 27%^[19] o del 32%^[18], lo que nos motivó a definir el punto de corte de tal manera que el 30% de nuestros pacientes se clasificaran como TFE-ME-positivos, lo que corresponde al 1,9%. El 35% de los pacientes con mutaciones positivas en T3 también fueron positivos para metilación según este punto de corte, mientras que el 23% de los pacientes con mutaciones negativas fueron positivos para metilación (valor p = 0,38, prueba exacta de Fisher), lo que podría indicar que la metilación y las mutaciones capturan información parcialmente diferente. Entre los pacientes sin resultados positivos en Oncomine™ en la línea de base, el 27% fueron ctDNA-positivos postoperatoriamente según la metilación, lo que es comparable a la tasa de detección postoperatoria en los pacientes con resultados positivos en Oncomine™ en la línea de base. Finalmente, el grupo de pacientes TFE-ME-positivos postoperatoriamente se enriqueció con pacientes TFE-ME-altos preoperatoriamente (valor p = 0,03, prueba exacta de Fisher, Figura S13).

La mediana de la supervivencia libre de recurrencia (SLR) para el grupo metilación-positivo (n = 35) fue de 7 meses frente a 20,3 meses para los pacientes con metilación negativa (valor p = 0,003, prueba de log-rank, Fig. 3D). Para 75 pacientes, pudimos evaluar tanto el estado de mutación como el estado de metilación en T3. Este análisis reveló que los pacientes con un estado doblemente negativo tuvieron el mejor resultado, mientras que un pequeño grupo de 7 pacientes (9,6%) que fueron tanto positivos para mutaciones como positivos para metilación, todos tuvieron recurrencia de la enfermedad en un plazo de 10,5 meses (Figura S14, Tabla S9).

Para los análisis multivariables, utilizamos 111 pacientes con ejecuciones exitosas de MeD-seq en ambos puntos temporales y sin información clínica faltante (Fig. 1A). Los pacientes que superaron el punto de corte postoperatorio del 1,9% tuvieron una SLR de 1 año significativamente peor después de corregir por los factores clínicos y el TFE-ME preoperatorio (HR = 2,41, Tabla 2). Sin embargo, esto no se tradujo en una supervivencia global (SG) significativamente más corta (Tabla 2). Los niveles de ctDNA preoperatorios siguieron siendo un factor pronóstico significativo tanto para la SG como para la SLR después de incluir la medición postoperatoria (Tabla 2). Esto implica que existe información pronóstica complementaria en las dos mediciones.

A pesar del pequeño rango de valores del TFE-ME continuo en T3, los niveles continuos de ctDNA postoperatorios transformados logarítmicamente también se asociaron significativamente con la SLR (Tabla S10), mientras que la Tabla S5 muestra que nuestra elección del percentil 70 se encuentra dentro del intervalo de confianza del 95% del punto de corte postoperatorio óptimo tanto para la SLR de 1 año como para la SG. Estos resultados consolidan el valor pronóstico del TFE-ME tanto en el período preoperatorio como en el postoperatorio.

El cálculo del TFE-ME es posible utilizando 43 marcadores

Luego, investigamos si podíamos reducir el número de marcadores para facilitar el desarrollo de un ensayo dirigido. A través de un procedimiento de selección de características basado en datos, obtuvimos un modelo con 43 marcadores (Tabla S11). El mejor modelo fue una regresión de mínimos cuadrados con penalización L1, que logró una R2 media de 0,9 al predecir el TFE-ME en datos no vistos mediante una validación cruzada anidada. Los marcadores seleccionados incluyeron regiones reguladoras asociadas con el silenciamiento de genes supresores de tumores bien conocidos, como HAND2-AS1,^[35] KANK1^[36] (potenciadores) y LIFR (promotor).^[37] La lista completa de regiones seleccionadas se proporciona en la Tabla S11. Este resultado muestra que el perfilado de metilación a nivel del genoma de cfDNA podría no ser necesario para una estimación precisa de la fracción tumoral.

Al probar aún más este enfoque, observamos que se generaliza bien a muestras no vistas de diferentes lotes de secuenciación y hospitales (ρ > 0,84, Tabla S12), al tiempo que se selecciona un número similar de marcadores en cada iteración (24–67, Tabla S12). Además, cuando utilizamos el TFE-ME predicho de nuestro modelo en los datos de prueba para predecir la SG, encontramos razones de riesgo cercanas a 1,31, que obtuvimos en todo el conjunto de datos utilizando las estimaciones basadas en la deconvolución (1,24–1,66, Tabla S12).

Luego, probamos si este modelo de regresión que utiliza 43 marcadores, que se construyó solo con muestras preoperatorias, se generaliza al punto temporal postoperatorio. Encontramos que la correlación de Spearman entre el TFE-ME por deconvolución y el uso de los 43 marcadores fue de 0,642 (valor p < 0,001), mientras que el punto de corte del percentil 70 también se conservó (0,018% de ctDNA utilizando los 43 marcadores frente a 0,019% de la deconvolución utilizando todos los datos). De los 117 pacientes evaluados, la tasa de recurrencia a 1 año en el grupo con el 30% superior de TFE-ME según los 43 marcadores fue del 66%, frente al 45% en el grupo del 70% inferior, lo que indica una sobrerrepresentación estadística de una recurrencia más rápida en el grupo TFE-ME-positivo (valor p = 0,04, prueba exacta de Fisher).

Pacientes

Obtuvimos con éxito perfiles de metilación y número de copias de MeD-seq preoperatorios (T0) de cfDNA según nuestros criterios de control de calidad de 120 pacientes con CRLM (Fig. 1A, Figura S1), de los cuales 60 tuvieron recurrencia de la enfermedad dentro de un año. La mediana de seguimiento para esta cohorte fue de 33,9 meses para la SLR y de 60,5 meses para la SG. Las características clínicas de esta cohorte de pacientes se enumeran en la Tabla 1. Este subconjunto de pacientes no es significativamente diferente de los 68 pacientes adicionales incluidos en la cohorte MIRACLE original^[19] tanto en las características clínicas como en el resultado, pero existe una sobrerrepresentación significativa de un centro de inclusión (Tabla S1). De manera similar, obtuvimos perfiles postoperatorios (T3) de 117 pacientes, mientras que para 112 pacientes, ambos puntos temporales se perfilaron con éxito (Fig. 1A, Figura S1).

La comparación del cfDNA sano y los biopsias de CRLM identifica DMRs específicos del tumor

Después del filtrado, identificamos 1069 DMRs entre el cfDNA sano y los tejidos de CRLM (Fig. 2A), de los cuales 1062 estaban hipermetilados en CRLM. Este conjunto se enriqueció principalmente con regiones en los cromosomas 8, 13 y 20 y se redujo para las regiones del cromosoma 22. Una lista seleccionada manualmente de 28 marcadores de metilación específicos del cáncer colorrectal en cfDNA de la literatura (Tabla S2) también estuvo significativamente sobrerrepresentada (14/28, valor p < 10−6, prueba de chi-cuadrado).

Las comparaciones con los datos de tejidos publicados^[14] mostraron que los cambios de pliegue de estos DMRs se correlacionaron más fuertemente con los perfiles de metilación del intestino delgado y grueso, mientras que se correlacionaron menos con los perfiles de granulocitos y precursores de eritrocitos (Figura S3).

Las estimaciones de la fracción tumoral preoperatorias representan con precisión la carga de ctDNA

Obtuvimos estimaciones de la fracción tumoral a partir de datos de número de copias (TFE-CNV) utilizando nuestra adaptación de ichorCNA^[13],^[21] en 120 muestras de cfDNA preoperatorias de pacientes con CRLM. En 78 pacientes (Figura S1) que tenían una mutación en un punto caliente previamente determinada utilizando el panel de colon Oncomine™,^[19], el TFE-CNV se correlacionó significativamente con el VAF más grande (correlación de Spearman = 0,67, valor p < 10−6, Figura S4a).

También utilizamos nuestro conjunto de 1069 DMRs y un algoritmo de deconvolución para obtener estimaciones de la fracción tumoral basadas en la metilación (TFE-ME), que se correlacionaron aún más con el VAF (correlación de Spearman = 0,77, valor p < 10−6, Fig. 2B). La correlación entre el TFE-CNV y el TFE-ME fue de 0,71 (valor p < 10−6), pero disminuyó drásticamente cuando se recalculó utilizando 1069 regiones aleatorias en lugar de los DMRs (Figura S4b).

El TFE-ME fue en promedio significativamente menor en los pacientes Oncomine™-negativos en comparación con los Oncomine™-positivos (mediana de 0,03 frente a 0,08, valor p < 0,001, prueba de Mann-Whitney U, Fig. 2C). Sin embargo, varias muestras Oncomine™-negativas tenían un TFE-ME alto (Fig. 2C), lo que implica que quizás estas muestras tienen ctDNA pero no albergan ninguna de las mutaciones en los puntos calientes incluidos en el panel de mutaciones utilizado. Por el contrario, el método basado en el CNV no detectó ctDNA incluso en el 35% de los pacientes con VAF positivo (Figura S4a). Estos aparentes "falsos negativos" de TFE-CNV se encontraron en muestras con VAF significativamente más bajos según el panel Oncomine™ (valor p < 10−6, Figura S4c).

Los pacientes cuyo tumor más grande tenía un diámetro mayor de 5 cm, así como los pacientes con una mutación en el gen APC, tuvieron una carga de ctDNA preoperatoria significativamente mayor (tanto TFE-ME como TFE-CNV, Figuras S5–S6, Tabla S3) en comparación con los pacientes con lesiones más pequeñas y los pacientes sin mutaciones en APC, respectivamente. Las estimaciones no se asociaron significativamente con la edad (ρ = 0,03) ni con ningún factor técnico (FDR > 0,05, Tabla S3). Además, las estimaciones de TFE-ME obtenidas a partir de dos ejecuciones de secuenciación diferentes de las mismas muestras de pacientes fueron muy similares (n = 12, correlación de Spearman = 0,76, valor p = 0,005, Figura S7). El TFE-CNV también se asoció con el estado de mutación TP53, el CEA preoperatorio y el grupo de riesgo de Fong, mientras que el TFE-ME no. En conjunto, estos resultados demuestran que las estimaciones de la fracción tumoral derivadas de MeD-seq basadas en la metilación o el número de copias pueden capturar con precisión la carga tumoral circulante en la sangre de los pacientes con CRLM.

Los niveles de ctDNA preoperatorios son un factor pronóstico tanto para la SLR como para la SG

A continuación, probamos el valor pronóstico de las evaluaciones de la carga tumoral preoperatoria. Los pacientes en los que ichorCNA detectó ctDNA (TFE-CNV > 0, n = 65) tuvieron una SLR significativamente más corta (8 frente a 21 meses, valor p = 0,02, prueba de log-rank, HR = 1,85, IC del 95% = [1,09, 3,15], Figura S8a). Los pacientes TFE-CNV-positivos tuvieron una mediana de SG de 52,9 meses, mientras que la mediana de SG no se alcanzó durante el seguimiento para el grupo TFE-CNV-negativo (valor p = 0,03, prueba de log-rank, HR = 1,87, IC del 95% = [1,05, 3,33], Figura S8b). Estos efectos ya no fueron estadísticamente significativos cuando se utilizó un análisis multivariable que incluyó factores de riesgo preoperatorios bien conocidos para la recurrencia de CRLM (Tabla S4).

Centrándonos en TFE-ME, en ausencia de un punto de corte validado, dividimos nuestro conjunto de 120 pacientes en dos grupos de igual tamaño (ctDNA-alto y ctDNA-bajo) utilizando la mediana de la fracción tumoral preoperatoria de 5,5%. El análisis de Kaplan-Meier también mostró que la SLR fue significativamente más corta para los pacientes con ctDNA-alto en comparación con los pacientes con ctDNA-bajo (Fig. 3A, mediana de SLR de 7,2 frente a 18 meses, valor p = 0,001, prueba de log-rank, HR = 2,34, IC del 95% = [1,38, 3,99]). Ambas curvas de supervivencia eventualmente convergen hacia la tasa de recurrencia media de esta población (alrededor del 70-80%), pero en este punto solo quedan unos pocos pacientes en riesgo en ambos grupos. El bootstrapping mostró que el uso de la mediana de TFE-ME como punto de corte se encuentra dentro del intervalo de confianza del 95% del punto de corte óptimo determinado por las estadísticas de rango máximo seleccionado^[34] (Métodos suplementarios S2, Figura S9, Tabla S5) y el punto de corte de la mediana se generalizó bien en los hospitales y lotes de secuenciación (Métodos suplementarios S2, Tablas S6–S7).

Se detectó ctDNA en prácticamente todos los 42 pacientes Oncomine™-negativos, con 14 (33%) que tenían un TFE-ME mayor que la mediana de 5,5% (Fig. 2C). Estos pacientes TFE-ME-altos tuvieron una SLR significativamente más corta que los pacientes Oncomine™-negativos restantes con TFE-ME-bajo (mediana de SLR de 6,3 frente a 23 meses, valor p < 0,001, prueba de log-rank, HR = 4,17, IC del 95% = [1,66, 10,45], Fig. 3B), a pesar de la menor potencia debido al análisis de un conjunto de pacientes más pequeño.

Un aumento de 0,1 en el TFE-ME continuo conduce a un aumento del 21% en el riesgo de recurrencia dentro de un año según un modelo de Cox (HR = 1,21, IC del 95% = [1,05, 1,40], valor p = 0,01). Este efecto siguió siendo estadísticamente significativo con una HR similar al realizar un análisis multivariable (Tabla 2).

En relación con la supervivencia global (OS), el grupo con niveles altos de TFE-ME presentó una supervivencia media de 55 meses, mientras que la supervivencia media del grupo con niveles bajos de TFE-ME no se alcanzó durante el período de seguimiento (HR = 1,73, IC del 95 % = [0,98, 3,05], valor p = 0,055, prueba de log-rank, Fig. 3C). El valor medio de corte se situó nuevamente dentro del intervalo de confianza del 95 % del valor de corte óptimo para la OS (Figura S9, Tabla S5). Utilizando las estimaciones continuas, sí encontramos un efecto estadísticamente significativo de un aumento del 26 % en el riesgo por cada aumento de 0,1 en el TFE-ME (HR = 1,26, IC del 95 % = [1,08, 1,47], valor p = 0,003), lo que siguió siendo significativo en un análisis multivariable (Tabla 2).

La validación cruzada de diez veces mostró que el TFE-ME supera al TFE-CNV tanto en la supervivencia libre de recurrencia (RFS) como en la OS, basándose en el índice de concordancia. También fue más preciso y mejor calibrado para identificar a los pacientes con un evento de RFS a 1 año o un evento de OS a 3 años, aunque las métricas medias en algunos casos se encuentran dentro de un error estándar. (Figuras S10-S11, Tabla S8). Además, encontramos que el modelo multivariable con parámetros clínicos y TFE-ME fue el mejor para modelar los resultados de supervivencia, logrando el índice de concordancia más alto. También fue el mejor para identificar los eventos de OS dentro de los 3 años (Figura S11) y tuvo un rendimiento similar al de la metilación únicamente para identificar los eventos de RFS dentro de un año (Figura S10, Tabla S8). La calibración del modelo multivariable de RFS fue menos buena en comparación con el TFE-ME únicamente y Fong únicamente, pero fue competitiva para la OS (Figuras S10-S11, Tabla S8). Esto podría deberse al uso de muchas características no informativas (lateralidad, sexo, etc.), lo que dificulta la calibración. Para ambas tareas, el modelo TFE-ME condujo a la mejor calibración.

Se investigó la posible utilidad clínica del modelo multivariable de OS anterior (Tabla 2) en la guía de las decisiones sobre la administración de quimioterapia neoadyuvante (NAC) mediante el análisis de la curva de decisión (Métodos complementarios S3).^[32] Utilizando las estimaciones del modelo validadas cruzadamente del riesgo de muerte en un plazo de tres años después de la cirugía, se obtuvieron mejores resultados que al tratar a todos los pacientes o al no tratar a ninguno, en términos de beneficio neto para todo el rango de valores de corte clínicamente relevantes,^[32] mientras que la puntuación de Fong por sí sola demostró una curva de decisión claramente inferior (Figura S12). En conjunto, estos resultados muestran que el TFE-ME es un marcador pronóstico preoperatorio independiente para el CRLM con potencial utilidad clínica.

La detección de ctDNA postoperatorio se asocia con una menor RFS

Aplicamos el mismo algoritmo de deconvolución a las muestras de cfDNA recogidas aproximadamente tres semanas después del tratamiento local del mismo grupo de pacientes. El TFE-ME se redujo después de la cirugía (disminución media del 30 %, valor p < 10−6, prueba de rango con signo de Wilcoxon, Fig. 2D). De las 117 ejecuciones exitosas de MeD-seq, solo el 6 % presentaba un TFE-ME mayor que la mediana preoperatoria. El TFE-CNV fue cero en todas las muestras T3, excepto en una, lo que confirma la sensibilidad limitada del perfilado del número de copias para la detección de enfermedad residual mínima. El único paciente TFE-CNV-positivo en T3 dio negativo para ctDNA según las mutaciones.

Debido a los valores significativamente más bajos de TFE-ME postoperatorios, buscamos un valor de corte alternativo al evaluar el rendimiento pronóstico postoperatorio. Estudios previos encontraron que la positividad del ctDNA postoperatorio fue del 27 %^[19] o del 32 %^[18], lo que nos llevó a definir el valor de corte de modo que el 30 % de nuestros pacientes se etiquetaran como TFE-ME-positivos, lo que corresponde al 1,9 %. El 35 % de los pacientes con mutaciones positivas en T3 también fueron positivos para la metilación según este valor de corte, mientras que el 23 % de los pacientes con mutaciones negativas fueron positivos para la metilación (valor p = 0,38, prueba exacta de Fisher), lo que podría indicar que la metilación y las mutaciones capturan información parcialmente diferente. Entre los pacientes sin un resultado Oncomine™ en la línea de base, el 27 % fueron ctDNA-positivos postoperatoriamente según la metilación, lo que es comparable a la tasa de detección postoperatoria en los pacientes con resultados Oncomine™ positivos en la línea de base. Finalmente, el conjunto de pacientes TFE-ME-positivos postoperatoriamente se enriqueció con pacientes TFE-ME-altos preoperatoriamente (valor p = 0,03, prueba exacta de Fisher, Figura S13).

La mediana de RFS para el grupo con metilación positiva (n = 35) fue de 7 meses frente a 20,3 meses para los pacientes con metilación negativa (valor p = 0,003, prueba de log-rank, Fig. 3D). Para 75 pacientes, pudimos evaluar tanto el estado de mutación como el estado de metilación en T3. Este análisis reveló que los pacientes con un estado doblemente negativo tuvieron el mejor rendimiento, mientras que un pequeño conjunto de 7 pacientes (9,6 %) que eran positivos tanto para mutaciones como para metilación, todos presentaban recurrencia de la enfermedad en un plazo de 10,5 meses (Figura S14, Tabla S9).

Para los análisis multivariables, utilizamos 111 pacientes con ejecuciones exitosas de MeD-seq en ambos puntos temporales y sin información clínica faltante (Fig. 1A). Los pacientes que superaron el valor de corte postoperatorio del 1,9 % presentaron una peor RFS a 1 año de forma significativa después de corregir por los factores clínicos y el TFE-ME preoperatorio (HR = 2,41, Tabla 2). Sin embargo, esto no se tradujo en una OS significativamente más corta (Tabla 2). Los niveles de ctDNA preoperatorios siguieron siendo un factor pronóstico significativo para la OS y la RFS después de incluir la medición postoperatoria (Tabla 2). Esto implica que existe información pronóstica complementaria en las dos mediciones.

A pesar del pequeño rango de valores del TFE-ME continuo en T3, los niveles continuos de ctDNA postoperatorios transformados logarítmicamente también se asociaron significativamente con la RFS (Tabla S10), mientras que la Tabla S5 muestra que nuestra elección del percentil 70 se encuentra dentro del intervalo de confianza del 95 % del valor de corte postoperatorio óptimo tanto para la RFS a 1 año como para la OS. Estos resultados consolidan el valor pronóstico del TFE-ME tanto en la fase preoperatoria como en la postoperatoria.

El cálculo del TFE-ME es posible utilizando 43 marcadores

Luego, investigamos si podíamos reducir el número de marcadores para facilitar el desarrollo de un ensayo dirigido. A través de un procedimiento de selección de características basado en datos, obtuvimos un modelo con 43 marcadores (Tabla S11). El mejor modelo fue una regresión de mínimos cuadrados con penalización L1, que logró una media de R2 de 0,9 al predecir el TFE-ME en datos no vistos basándose en la validación cruzada anidada. Los marcadores seleccionados incluyeron regiones reguladoras asociadas con el silenciamiento de genes supresores de tumores bien conocidos, como HAND2-AS1,^[35] KANK1^[36] (potenciadores) y LIFR (promotor).^[37] La lista completa de regiones seleccionadas se proporciona en la Tabla S11. Este resultado muestra que el perfilado de metilación a nivel del genoma del cfDNA podría no ser necesario para una estimación precisa de la fracción tumoral.

Al probar aún más este enfoque, observamos que se generaliza bien a muestras no vistas de diferentes lotes de secuenciación y hospitales (ρ > 0,84, Tabla S12), seleccionando un número similar de marcadores en cada iteración (24-67, Tabla S12). Además, cuando utilizamos el TFE-ME predicho de nuestro modelo en los datos de prueba para predecir la OS, encontramos razones de riesgo cercanas a 1,31, que obtuvimos en todo el conjunto de datos utilizando las estimaciones basadas en la deconvolución (1,24-1,66, Tabla S12).

Luego, probamos si este modelo de regresión que utiliza 43 marcadores, que se construyó solo con muestras preoperatorias, se generaliza al punto temporal postoperatorio. Encontramos que la correlación de Spearman entre el TFE-ME por deconvolución y el uso de los 43 marcadores fue de 0,642 (valor p < 0,001), mientras que el valor de corte del percentil 70 también se conservó (0,018 % de ctDNA utilizando los 43 marcadores frente a 0,019 % de la deconvolución utilizando todos los datos). De los 117 pacientes evaluados, la tasa de recurrencia a 1 año en el grupo con el 30 % superior de TFE-ME según los 43 marcadores fue del 66 %, frente al 45 % en el grupo del 70 % inferior, lo que indica una sobrerrepresentación estadística de una recurrencia más rápida en el grupo TFE-ME-positivo (valor p = 0,04, prueba exacta de Fisher).

Discusión

Este artículo describe un nuevo método tumoral-agnóstico a nivel del genoma para cuantificar la carga tumoral circulante en pacientes con CRLM que no han recibido quimioterapia utilizando la metilación y las CNV. Al aplicar este método en 120 pacientes, demostramos que los niveles de ctDNA preoperatorios son un factor pronóstico tanto para la RFS a 1 año como para la OS. La metilación tuvo un mejor rendimiento que las CNV, que mostraron una menor sensibilidad a la profundidad de secuenciación de 0,1x y una alta correlación con la puntuación de Fong, mientras que la metilación fue un marcador más preciso e independiente según los análisis multivariables.

Trabajos previos que utilizaron mutaciones en la misma cohorte no encontraron asociación entre la detección de ctDNA preoperatorio, determinado por un panel específico de CRC que detecta mutaciones, y la supervivencia libre de recurrencia, pero no investigaron la cantidad de ctDNA.^[19] Un metaanálisis de tres estudios independientes llegó a la misma conclusión en poblaciones de pacientes sometidas a diversos esquemas perioperatorios.^[38] Otro estudio pequeño con 34 pacientes encontró una asociación entre la RFS y la dinámica del ctDNA durante la NAC, pero no los niveles basales.^[39] Un estudio prospectivo que utilizó un ensayo de metilación dirigido encontró que los pacientes con ctDNA positivo en la línea de base tenían una RFS significativamente más corta, pero no la OS.^[40] Sin embargo, ese estudio no investigó los niveles de ctDNA y utilizó una población mixta con dos tercios de los pacientes que recibieron NAC,^[40] por lo que sus hallazgos podrían reflejar parcialmente la respuesta a la NAC y no el efecto puro del ctDNA basal. Nuestro hallazgo sobre la OS está respaldado por un estudio grande que encontró que los pacientes con más del 10 % de ctDNA en la línea de base tienen una OS significativamente peor,^[10] aunque este estudio se realizó en una población diferente de pacientes con CRC metastásico en términos de estadio y tratamiento.

El ctDNA postoperatorio elevado se asoció con una peor supervivencia libre de recurrencia, lo que confirmó estudios previos que utilizaron mutaciones^[18],^[19] o metilación.^[17] Además, observamos que el TFE-ME postoperatorio aporta valor adicional con respecto a las mutaciones, y los pacientes que fueron positivos para ambos ensayos, todos presentaron recurrencia de la enfermedad en un plazo de un año a partir de la cirugía, aunque el pequeño tamaño de los grupos significa que esta observación requiere una validación adicional. No encontramos evidencia de que el grupo con ctDNA alto postoperatorio también presentara una OS más corta.

Lo más importante es que los niveles de ctDNA preoperatorios son un factor pronóstico fuerte e independiente, incluso después de incluir los niveles de ctDNA postoperatorios. Dado que se sabe que el cumplimiento de la quimioterapia disminuye en caso de complicaciones postquirúrgicas,^[18], la NAC puede representar la estrategia preferible. Los análisis de supervivencia y de la curva de decisión confirmaron que la combinación de los niveles de ctDNA basales con los parámetros clínicos puede guiar potencialmente las decisiones de tratamiento y reducir el sobretratamiento o el infratratamiento, según las pautas locales actuales. Un ensayo futuro podría probar el beneficio de la OS de la NAC en pacientes de alto riesgo según el ctDNA y los factores de riesgo clínicos. Otros estudios sugieren que el ctDNA podría ser útil para controlar a los pacientes durante la NAC,^[39],^[41],^[42], lo que podría identificar un subgrupo de pacientes que permanecen con ctDNA alto y podrían ser candidatos para nuevas opciones de tratamiento, como el trasplante combinado con quimioterapia.^[43] Aunque las evaluaciones de ctDNA en el contexto del trasplante hepático en pacientes con CRLM son limitadas, los primeros estudios sugieren que, después del trasplante, parte de los pacientes revierten de ctDNA+ a ctDNA−.^[43],^[44] Por otro lado, los niveles altos de ctDNA preoperatorio se asocian con un mal pronóstico y, por lo tanto, pueden guiar la selección de candidatos para el trasplante.^[45] Los análisis separados en el MIRACLE indican que los niveles altos de ctDNA preoperatorio se asocian con mayores posibilidades de recurrencia multiorgánica, lo que sugiere que estos pacientes no pueden ser salvados con el tratamiento local únicamente.^[46]

Utilizando MeD-seq y nuestro algoritmo, pudimos detectar ctDNA en prácticamente todos los pacientes, en comparación con el 66 % con el ensayo Oncomine™, que solo evalúa las variantes comunes de CRC en 14 genes.^[19] Esto implica que la mayoría de los pacientes con CRLM que no han recibido quimioterapia tienen ctDNA que también podría haber sido detectado mediante mutaciones utilizando un panel más grande o personalizado. En el estudio GALAXY, la tasa de detección de ctDNA preoperatorio fue del 98 %, aunque en un entorno ligeramente diferente.^[11]

Una desventaja de nuestro enfoque es la tasa de fallos del ensayo (aproximadamente 1 de cada 5), que es demasiado alta para su implementación clínica directa. Sin embargo, esta tasa se ve inflada debido a problemas técnicos relacionados con la celda de flujo utilizada en un lote de secuenciación. Las experiencias previas con este ensayo y el ADN tumoral circulante (ctDNA) demuestran una tasa de fallos más baja, de alrededor del 8%. Además, demostramos que podemos obtener estimaciones de la fracción tumoral altamente concordantes utilizando solo 43 marcadores de los 1069 identificados inicialmente. La creación de un ensayo dirigido utilizando estos marcadores podría aumentar la fiabilidad y reducir el coste del ensayo actual.

Otra limitación es la falta de valores de corte establecidos para el TFE-ME. Definimos los valores de corte para obtener dos grupos iguales preoperatoriamente y utilizando el conocimiento previo de la bibliografía ^[18], ^[19] sobre la fracción de pacientes con ctDNA positivo postoperatoriamente. El hecho de que los niveles continuos de la fracción tumoral, que no sufren pérdida de información debido a la dicotomización ^[47], también estuvieran significativamente asociados con los resultados de interés, apoya firmemente las conclusiones obtenidas utilizando los valores de corte. No obstante, se requiere una validación externa en cohortes independientes antes de que el método pueda aplicarse en la práctica clínica, incluyendo también cohortes que reciban quimioterapia perioperatoria.

Finalmente, la muerte celular no relacionada con el tumor causada por el trauma quirúrgico diluye significativamente la señal derivada del tumor hasta cuatro semanas después de la cirugía ^[48]. Nuestro muestreo a las 3 semanas podría, por lo tanto, haber dificultado nuestra capacidad para detectar diferencias significativas en la supervivencia global (OS) entre los pacientes con enfermedad residual mínima (MRD) positiva y los pacientes con MRD negativa. Por ejemplo, Kataoka et al. sí encontraron este efecto, habiendo recogido las muestras postoperatorias hasta 10 semanas después de la cirugía, pero también utilizaron un ensayo más sensible e informado sobre el tumor ^[18]. Por lo tanto, la precisión de la detección de MRD independiente del tumor podría mejorarse retrasando la extracción de sangre postoperatoria. Los estudios futuros deberían optimizar el momento del muestreo para equilibrar una detección precisa de la MRD con el inicio oportuno de la quimioterapia adyuvante, como se ha hecho para el cáncer colorrectal primario ^[49].

En conclusión, el método presentado, independiente del tumor, para detectar y cuantificar el ADN tumoral circulante proporciona un biomarcador pronóstico mínimamente invasivo e independiente tanto para la recurrencia de la enfermedad como para la supervivencia global. Tras la validación en cohortes independientes, los ensayos aleatorizados deberían confirmar la utilidad clínica de las decisiones de tratamiento guiadas por ctDNA en el manejo de pacientes con metástasis hepáticas resecables de cáncer colorrectal (CRLMs). Nuestros resultados constituyen un paso más hacia la personalización de las estrategias de tratamiento para los pacientes con CRLM.

Colaboradores

SM y SMW han accedido y verificado todos los datos subyacentes. Todos los autores han leído y aprobado la versión final del manuscrito. Las contribuciones detalladas de los autores se describen a continuación:

Conceptualización: SMW, CV, JWMM, SS, SM.

Metodología: SM, MvdW, DH, JBB, SMW.

Software: SM, MvdW, DH, JBB.

Validación: SM, SMW.

Análisis formal: SM.

Investigación: TD, CMB, VdW, SM, LW, DH, MPHMJ, JK.

Recursos: WFJvIJ, RGB, SS, JG, MV, EJTB, PDG, HMWV, DJG, JWMM, CV.

Curación de datos: LW, SM.

Redacción: SM, SMW.

Revisión y edición: todos los autores.

Visualización: SM.

Supervisión: SMW, CV.

Administración del proyecto: SMW, LW, JK.

Obtención de financiación: CV, SMW, SS.

Declaración de intercambio de datos

Los datos de secuenciación sin procesar están disponibles a través del Sequencing Read Archive (SRA, BioProject ID: PRJNA1403605). Los datos de secuenciación procesados y el código de código abierto para reproducir los análisis estadísticos están disponibles en https://github.com/stamakro/miracle-medseq. Los datos clínicos, incluidos los datos individuales desidentificados de los participantes, pueden estar disponibles para los investigadores previa solicitud razonable. Las consultas sobre los datos deben dirigirse al autor correspondiente.

Declaración de intereses

RGB y JB son fundadores y accionistas de Methylomics B.V., una empresa que utiliza MeD-seq para el diagnóstico del cáncer. WFJvIJ es accionista de Methylomics B.V. y JG ha recibido honorarios por consultoría de Methylomics B.V. Los demás autores declaran no tener conflictos de intereses.