Perfiles moleculares multicapa definen un subtipo de cáncer colorrectal inmunológicamente activo con relevancia terapéutica.

El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo, y su creciente incidencia agrava la carga de salud pública a nivel mundial.^[1] Debido a la naturaleza asintomática de la enfermedad en sus etapas iniciales, la mayoría de los casos se diagnostican en etapas avanzadas o metastásicas, donde las opciones terapéuticas son limitadas, lo que resulta en tasas de supervivencia a 5 años inferiores al 12%, a pesar de las intervenciones estándar como la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia.^[2],^[3]

Si bien el bloqueo de los puntos de control inmunitario (BPCI) ha transformado los paradigmas de tratamiento al dirigirse a las vías inhibitorias como PD-1 y PD-L1,^[4],^[5],^[6],^[7], su beneficio clínico en el CCR es notablemente heterogéneo.^[8] Las respuestas duraderas se limitan en gran medida al pequeño subconjunto de pacientes con tumores con alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H) o con deficiencia en la reparación de errores de emparejamiento (dMMR). En contraste, la gran mayoría de los tumores con estabilidad de microsatélites (MSS) presentan resistencia intrínseca. Además, un subconjunto de tumores MSI-H/dMMR que inicialmente responden desarrolla resistencia adquirida, mientras que se han notificado respuestas ocasionales en la enfermedad MSS.^[9],^[10],^[11],^[12] Estas inconsistencias resaltan las limitaciones de las estrategias de estratificación existentes y subrayan la necesidad de descifrar la compleja heterogeneidad inmunológica del microambiente tumoral del CCR (MT).

La progresión del CCR está impulsada por alteraciones genéticas, epigenéticas e inmunológicas en múltiples capas que, en conjunto, inducen una heterogeneidad intratumoral sustancial.^[13] Los sistemas de clasificación transcriptómica existentes, como los subtipos moleculares de consenso (CMS) y los subtipos intrínsecos del cáncer colorrectal (CRIS),^[14],^[15],^[16], han proporcionado información valiosa, pero se basan principalmente en datos de una sola ómica y, por lo tanto, no pueden capturar completamente las intrincadas interacciones celulares y las redes inmunitarias del MT, lo que limita su aplicación a la inmunoterapia de precisión.^[13],^[17]

Para abordar estos desafíos, realizamos un análisis multi-ómica integrativo del conjunto de datos de adenocarcinoma colorrectal del Proyecto del Genoma del Cáncer (TCGA-COAD), combinando perfiles de ARN mensajero (ARNm), ARN no codificante largo (lncARN), metilación del ADN y mutaciones somáticas. Este análisis identificó tres subtipos moleculares robustos, entre los cuales uno, designado CS3, se distinguió por la inestabilidad genómica, la fuerte activación inmunitaria y la mayor sensibilidad prevista a la terapia con BPCI. Los análisis funcionales en múltiples capas, incluido el análisis de redes de coexpresión génica ponderada (WGCNA), la inferencia de redes regulatorias transcripcionales (TRN) y el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes en una sola muestra (ssGSEA), junto con la validación mediante el secuenciamiento de ARN de una sola célula (scARN), revelaron programas transcripcionales específicos del subtipo y un microambiente enriquecido con células inmunitarias. Además, el análisis longitudinal de cohortes independientes de inmunoterapia estableció la actividad de CS3 como un biomarcador dinámico, donde los niveles basales altos predicen el beneficio y la contracción postratamiento refleja la resolución de la respuesta antitumoral. Finalmente, desarrollamos y validamos una firma pronóstica interpretable de 11 genes que estratifica eficazmente el riesgo del paciente y revela vulnerabilidades terapéuticas.

En general, este marco integrativo refina la taxonomía molecular del CCR y relaciona la inestabilidad genómica con la activación inmunitaria y la respuesta terapéutica, proporcionando información mecanicista y biomarcadores candidatos para avanzar en la inmuno-oncología de precisión en el CCR.

Resultados

El perfilado multi-ómica integrativo revela tres subtipos moleculares robustos

Para explorar la heterogeneidad molecular del CCR, realizamos un análisis multi-ómica integrativo utilizando perfiles de ARNm, lncARN, metilación del ADN y mutaciones somáticas del conjunto de datos TCGA-COAD (Tabla S1). Basándonos en el agrupamiento de consenso no supervisado, identificamos tres subtipos moleculares distintos, designados CS1, CS2 y CS3 (Tabla S2). La selección de tres grupos se respaldó mediante múltiples índices, incluido el índice de predicción de consenso (CPI), la estadística de la brecha y el ancho de la silueta (Figuras S1A y S1B). Además, el agrupamiento de consenso indicó una clara separación entre las capas moleculares (Figura 1C), lo que sugiere que estos subtipos reflejan la diversidad biológica subyacente de la cohorte.

Se observaron patrones moleculares distintos para cada subtipo, caracterizados por características transcriptómicas, epigenéticas y mutacionales específicas (Figura 1A). La estabilidad de esta clasificación fue consistente en diez algoritmos de agrupamiento independientes (Figura 1B). En términos de resultados clínicos, el análisis de Kaplan-Meier mostró diferencias significativas en la supervivencia general (SG) entre los tres subtipos (p < 0,05; Figura 1D), lo que destaca la posible relevancia pronóstica de esta estratificación.

La reproducibilidad de las firmas de subtipos derivadas de TCGA se evaluó además utilizando dos cohortes independientes (GSE39582 y GSE17538) (Figura 1E y S1C). Utilizando plantillas específicas del subtipo (Tabla S3), observamos una concordancia sustancial entre las asignaciones basadas en el consenso y los clasificadores basados en ARN, incluido el análisis de predicción para microarrays (PAM) y la predicción del vecino más cercano (NTP) (Kappa > 0,6; Figuras S1D-F). Estos hallazgos proporcionan evidencia de la estabilidad del marco de clasificación y sugieren su posible viabilidad para aplicaciones traslacionales.

Divergencia funcional y mecanismos reguladores subyacentes a los subtipos de CCR

Para analizar la heterogeneidad funcional subyacente a los tres subtipos moleculares, realizamos WGCNA, que identificó dieciséis módulos de coexpresión distintos (Figuras S2A y S2B). El análisis de correlación reveló asociaciones específicas entre los genes principales del módulo (ME) y las identidades del subtipo: los módulos verde-amarillo, azul y cian se asociaron preferentemente con CS1, CS2 y CS3, respectivamente (Figuras S2C-E).

GSEA iluminó aún más los paisajes funcionales de estos subtipos. CS1 se caracterizó por la reprogramación metabólica, mostrando un enriquecimiento de las vías del metabolismo de las hormonas, los carbohidratos y los fármacos. CS2 se definió por una mayor actividad transcripcional, con asociaciones que involucran el procesamiento del ARN y el empalme del ARN. En contraste, CS3 exhibió un perfil inmunitario distinto, marcado por un enriquecimiento robusto de la señalización de las citocinas, la respuesta de los interferones y las vías inflamatorias (Figuras 2A y 2B). Estas observaciones se respaldaron mediante el perfilado ssGSEA de los conjuntos de genes Hallmark, que confirmó el dominio metabólico de CS1, las características proliferativas de CS2 y el MT altamente inflamado de CS3 (Figura 2C).

A nivel transcripcional, la inferencia de TRN identificó programas reguladores específicos del subtipo. Los tumores CS3 mostraron un enriquecimiento de los factores de transcripción asociados a la inmunidad y al tronco, incluidos HIF1A, TP63, KLF4, FOXA1, GATA6 y FOXM1, lo que sugiere una red coordinada que integra la adaptación a la hipoxia, la plasticidad epitelial y la activación inmunitaria. Por el contrario, los tumores CS2 fueron impulsados por los reguladores de la cromatina y los modificadores epigenéticos, lo que es consistente con su fenotipo regulador epigenético (Figura 2D).

Coherente con estos patrones transcripcionales, el perfilado inmunitario reveló que los tumores CS3 mostraron una infiltración significativamente mayor de células T, células asesinas naturales (NK), macrófagos y células dendríticas, en comparación con CS1 y CS2 (Figura 2E). Este paisaje rico en células inmunitarias, junto con la señalización inflamatoria identificada anteriormente, destaca la naturaleza inmunogénica del subtipo CS3 y sugiere un potencial de respuesta al BPCI.

Inestabilidad genómica y potencial inmunoterapéutico del subtipo CS3

Las mutaciones somáticas son los principales impulsores de la evolución tumoral y la respuesta terapéutica. Para explorar el panorama genómico de los subtipos identificados, analizamos los 20 genes mutados con mayor frecuencia (FMG) y los perfiles de mutación generales. Si bien los tumores CS1 y CS2 mostraron altas frecuencias de mutaciones de los genes impulsores del CCR canónico (por ejemplo, APC, TP53, KRAS), el subtipo CS3 exhibió una arquitectura de mutación distinta caracterizada por la inestabilidad genómica. Específicamente, los tumores CS3 se enriquecieron con mutaciones en genes estructurales grandes, como TTN (94%), MUC16 (77%), OBSCN (73%) y SYNE1 (71%), y mostraron una frecuencia comparativamente menor de alteraciones de los genes impulsores clásicos (Figuras 3A, 3B y 3D; Tabla S4). Este perfil, dominado por una alta carga de mutaciones no sinónimas, apunta a un mecanismo distinto de inestabilidad genómica en CS3.

Una caracterización adicional identificó un repertorio específico de alteraciones de los genes impulsores no canónicos en CS3, incluidos TEAD2, CIC, NCOR1, MEGF8 y BMPR2, en contraste con el panorama dominado por KRAS de CS1 y CS2 (Figura S3A-C). El análisis a nivel de la vía indicó mayores cargas de mutación en múltiples vías de señalización oncogénica y módulos de reparación del daño del ADN (DDR) en CS3 (Figura S3D y S3E), lo que es consistente con las alteraciones genómicas generalizadas.

Esta inestabilidad genómica se asoció con una mayor inmunogenicidad. Los tumores CS3 mostraron una carga de mutación tumoral (TMB), una carga de neoantígenos tumorales (TNB) y puntuaciones de MSI significativamente más altas, junto con una menor heterogeneidad intratumoral (ITH), en comparación con CS1 y CS2 (Figura 3E). Coherente con estas características, observamos una mayor expresión de las moléculas de los puntos de control inmunitario (por ejemplo, CD274 [PD-L1], proteína 4 asociada a los linfocitos T citotóxicos [CTLA4], LAG3) (Figura 3C) y los genes del antígeno leucocitario humano (HLA), lo que sugiere una mayor capacidad de presentación de antígenos (Figura 3F).

Las métricas de inmunogenicidad funcional respaldaron aún más estas observaciones. Los tumores CS3 exhibieron puntuaciones de la firma inflamatoria de las células T (TIS) significativamente más altas (p < 0,0001; Figura 3G), lo que indica un MT inflamado. El análisis de mapeo de subconjuntos (SubMap) proporcionó un apoyo adicional a esta observación al demostrar una similitud transcripcional significativa entre los tumores CS3 y las cohortes de pacientes que se sabe que responden a las terapias de BPCI (p < 0,05; Figura 3H), lo que sugiere que los tumores CS3 comparten características transcripcionales con los respondedores clínicos.

Estos hallazgos caracterizan a CS3 como un subtipo molecular definido por una extensa inestabilidad genómica, una mayor inmunogenicidad y un MT altamente inflamado: características que, en conjunto, sugieren un contexto molecular favorable para la intervención inmunoterapéutica de precisión en el CCR.

Para comparar nuestra clasificación con los subtipos establecidos, inferimos las etiquetas CMS para TCGA-COAD e integramos estos datos con las métricas clínicas de MSI y TMB (Tabla S5). CS3 se superpone sustancialmente con CMS1, pero no es idéntico: entre los tumores CS3 con etiquetas CMS definidas (n = 44), el 68,2% fueron CMS1 (30/44), mientras que el resto fueron CMS3 o CMS4 (15,9% cada uno). CS3 se enriqueció con tumores MSI-H (88,9%, 40/45), mientras que CS1 y CS2 fueron predominantemente MSS (>97% cada uno).

En particular, CMS1 incluyó un subconjunto de tumores MSS clínicamente no clasificados como CS3 (n = 13). Por el contrario, CS3 contenía un subgrupo MSS clínicamente (n = 4), tres de los cuales (75%) fueron ultra-mutados (>2000 mutaciones). En conjunto, estos resultados sugieren que CS3 complementa a CMS1/MSI al refinar el límite de la enfermedad inmunogénica y al destacar los tumores MSS hipermutados que pueden no ser capturados por las pruebas de MSI de rutina.

Validación de una sola célula y refinamiento de la heterogeneidad del subtipo

Para validar la relevancia biológica de los subtipos moleculares identificados a nivel de resolución unicelular, integramos datos de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) de tres cohortes independientes de CCRC (Figura S4A). Tras un riguroso control de calidad y corrección de lotes, la agrupación no supervisada de 164.355 células de alta calidad resolvió seis linajes principales: células epiteliales (EPC), T/NK, células mieloides (Mye), fibroblastos (Fb), células endoteliales (Endo) y células B (Figuras 4A y 4B). La puntuación basada en UCell de las firmas de subtipos derivadas de datos masivos reveló distintas distribuciones celulares. Si bien las firmas CS1 y CS2 se limitaron predominantemente a las subpoblaciones epiteliales que representan estados de diferenciación o proliferación divergentes, la firma CS3 exhibió una distribución más amplia en los compartimentos epitelial, T/NK y mieloide. En particular, la firma CS3 mostró una marcada predominancia en Mye, lo que indica una amplia participación inmunitaria y una pronunciada heterogeneidad intratumoral (Figura 4C).

Para analizar más a fondo la heterogeneidad epitelial, realizamos una subagrupación de alta resolución, identificando 13 subpoblaciones epiteliales distintas a nivel transcripcional (Figuras 4D y 4E). La asignación basada en NTP asignó estos subgrupos a identidades CS específicas (Figura 4F). La integración de los resultados de la inferencia de la variación del número de copias (CNV) (inferCNV, CopyKAT) con métricas de enriquecimiento (índice RO/E) respaldó el enriquecimiento maligno dentro de varios grupos epiteliales, incluidos los de tipo troncal (STM), proliferantes, C3CXCL3, C12PLA2G2A, C13IL32 y C14TGFBI (Figura S4B y C).

El análisis de DEG reveló una profunda divergencia funcional entre las poblaciones epiteliales enriquecidas con subtipos. Los grupos enriquecidos con la firma CS2 exhibieron fuertes características proliferativas, de tipo troncal y reguladoras de la cromatina, mientras que los grupos enriquecidos con la firma CS3 mostraron una mayor presentación de antígenos, señalización inflamatoria y funciones de barrera epitelial. En contraste, los grupos asociados con la firma CS1 se asemejaron a los programas de diferenciación de tipo enterocitario o caliciforme característicos de la homeostasis normal de la mucosa (Figuras 4G y 4H y S4C).

La reconstrucción de la trayectoria de pseudotiempo utilizando Monocle3, anclada en el grupo STM, delineó vías de diferenciación epitelial bifurcadas que conducen a puntos finales proliferativos o inflamatorios (Figura S4D). El análisis de módulos de genes reveló transiciones transcripcionales dinámicas, desde programas tempranos enriquecidos en replicación de ADN, empalme de ARN y regulación epigenética (módulos 3-4), a través de respuestas intermedias al estrés oxidativo y la hipoxia (módulo 1), hasta estados terminales caracterizados por la actividad mitótica, la presentación de antígenos y la activación de las células T (módulo 2). Los genes de la firma CS3 se enriquecieron significativamente en el módulo 2, lo que sugiere que los tumores CS3 pueden originarse a partir de poblaciones epiteliales inmunológicamente activas que poseen tanto potencial proliferativo como inmunorregulador (Figura S4E).

El análisis pseudo-masivo a nivel del paciente corroboró aún más estas observaciones. Los pacientes con CS2 exhibieron firmas proliferativas y reguladoras fuertes, los pacientes con CS3 mostraron una activación inmune-inflamatoria dominante y los pacientes con CS1 conservaron características epiteliales homeostáticas (Figura S5A y B).

En conjunto, estos resultados demuestran que los subtipos multiómicos corresponden a programas transcripcionales biológicamente coherentes tanto a nivel unicelular como a nivel del paciente. Esta alineación respalda su utilidad para analizar la heterogeneidad del CCRC y guiar las estrategias de inmunoterapia de precisión.

Heterogeneidad funcional inmunitaria de las células mieloides asociadas a CS3

Dado el distinto fenotipo inmunitario del subtipo CS3, realizamos un análisis unicelular en profundidad del compartimento mieloide para caracterizar su contribución a la inmunidad tumoral. La subagrupación de alta resolución identificó 16 subpoblaciones mieloides distintas a nivel transcripcional (Figura 5A; Figura S6A y B). Entre estas, las firmas CS3 se enriquecieron notablemente dentro de varios subconjuntos de macrófagos, incluidos MacroISG15, MacroSPP1, MacroC1QC y MacroLYVE1 (Figura 5B). Los análisis de enriquecimiento funcional delinearon funciones inmunológicas especializadas para estos subconjuntos. MacroISG15 se caracterizó por una fuerte señalización de interferón y TNF-α; MacroSPP1 se enriqueció para la señalización IL2-STAT5, la transición epitelio-mesenquimal (EMT) y los programas relacionados con la hipoxia, lo que sugiere un fenotipo proinflamatorio y potencialmente invasivo; MacroC1QC mostró un enriquecimiento para la activación del complemento y la fosforilación oxidativa, lo que indica un estado inflamado crónico y metabólicamente adaptado; y MacroLYVE1 exhibió la activación de las vías TNF-α/NF-κB y apoptosis, lo que refleja un perfil inmunosupresor (Figura 5C).

La estratificación de Mye según la intensidad de la firma CS3 aclaró aún más sus identidades funcionales. Las poblaciones de alto CS3 (HCS3) se compusieron predominantemente de subconjuntos inflamatorios, como MacroINHBA y monocitos CD16+, mientras que las poblaciones de bajo CS3 (LCS3) se enriquecieron para las células de tipo dendrítico, incluido cDC1CLEC9A (Figura S6C). El análisis de expresión diferencial reveló que las células HCS3 coexpresaban múltiples mediadores proinflamatorios (IL1B, IL6, CXCL9, CCL4) junto con factores inmunosupresores (EREG, CCL18), lo que destaca la coexistencia de la activación inflamatoria y los programas de evasión inmunitaria. En contraste, las células LCS3 expresaron marcadores homeostáticos como CLEC10A y FCER1A (Figura 5D). GSEA respaldó esta dicotomía: Mye HCS3 exhibió una regulación al alza de las vías NF-κB, IL-17 y de receptores tipo Toll, mientras que las poblaciones LCS3 se enriquecieron para los programas de procesamiento y presentación de antígenos (Figura 5E).

El análisis TRN utilizando SCENIC identificó la activación preferencial de factores de transcripción inmunorreguladores en las células HCS3, incluidos STAT1, NFKB1, MITF y FOXP3. Esto sugiere un programa coordinado que impulsa la señalización de interferón, la amplificación inflamatoria y la modulación inmunitaria. Por el contrario, las poblaciones LCS3 fueron gobernadas por factores de transcripción homeostáticos como REL, SPI1 y TCF4 (Figuras 5F y 5G). El análisis de la puntuación de especificidad regulatoria (RSS) destacó aún más STAT1 y MITF como reguladores clave que impulsan los subconjuntos de macrófagos inflamatorios (MacroSPP1, MacroISG15, Macro_C1QC; Figura S6D).

El análisis de la comunicación célula-célula utilizando CellChat reveló un aumento notable de la señalización intercelular entre Mye HCS3, mediada por pares de ligandos-receptores como SPP1-CD44, MIF-CD74/CD44, LAMA4-CD44, FN1-CD44 y CXCL-ACKR1 (Figura 5H y S6E y F). Estas interacciones apuntan a un papel de Mye asociada a CS3 en la modulación inmunitaria, la remodelación de la matriz extracelular y la amplificación de la señalización inflamatoria dentro del microambiente tumoral (TME).

Estos análisis unicelulares revelan una heterogeneidad funcional y una complejidad regulatoria significativas dentro de las poblaciones mieloides del subtipo CS3. Describen un panorama inmunitario paradójico donde la activación inflamatoria coexiste con la supresión inmunitaria. Esta dualidad ofrece información mecanicista sobre el potencial de evasión inmunitaria en los tumores CS3 y sugiere que la focalización de subconjuntos mieloides específicos podría representar una estrategia terapéutica para el CCRC.

Dinámica de CS3 bajo el bloqueo de los puntos de control inmunitario y traslación clínica

Para investigar la relevancia funcional del subtipo CS3 bajo el BIC, integramos dos conjuntos de datos de secuenciación de ARN unicelular de tumores colorrectales tratados con BIC (GSE236581 y GSE205506) (Figura 6A; Figura S7A y B). La cuantificación de la actividad de la firma CS3 en los compartimentos celulares indicó que el programa CS3 se expresa preferentemente en los linajes de células mieloides y T/NK, lo que sugiere su participación en la coordinación tanto de la inmunidad innata como adaptativa antitumoral (Figura 6B).

A continuación, evaluamos la evolución temporal de la actividad de CS3 durante la terapia. Utilizando la puntuación de UCell, rastreamos la distribución espacio-temporal de las células "CS3-altas" en las etapas de tratamiento y los grupos de respuesta (Figura 6C). En la cohorte GSE236581, los pacientes que lograron una respuesta completa (RC) se caracterizaron por una alta actividad basal de CS3 que disminuyó sustancialmente después del tratamiento, lo que es consistente con la resolución de una respuesta inmunitaria después de la eliminación del tumor. En contraste, aquellos con respuesta parcial (RP) o enfermedad estable (EE) mostraron una actividad basal más baja, con una tendencia creciente durante la terapia, lo que refleja potencialmente una participación inmunitaria retrasada u óptima (Figuras 6D y 6E). Los análisis comparativos revelaron diferencias significativas en los niveles basales de CS3 entre los grupos de RC y RP/EE, así como distintas trayectorias dinámicas posteriores al tratamiento (Figura 6F). Estas observaciones respaldan el potencial de la actividad de CS3 como un biomarcador dinámico, que ofrece utilidad predictiva tanto en la línea de base como a lo largo del curso del tratamiento.

La subagrupación de alta resolución de las células T/NK (Figura 6G; Figura S7E y F) indicó que la firma CS3 se concentró en los subconjuntos de células T CD8+ activadas, incluidos los agotados (CD8Tex), de memoria efectora (CD8Tem) y en estados estimulados por el interferón (Figura S7C y D). La caracterización adicional de los grupos de células T CD8+ enriquecidos con CS3 reveló un fenotipo distinto de "efector citotóxico-agotado". Estas células coexpresaron múltiples receptores inhibitorios (PDCD1, LAG3, TIGIT) al tiempo que exhibían una expresión robusta de moléculas efectoras citotóxicas, incluidas GZMB, PRF1, NKG7 y GNLY (Figura S7E). En contraste con las células progenitoras de tipo troncal agotadas, esta población mostró una expresión insignificante de TCF7 y LEF1. Estos hallazgos sugieren que las características inmunoterapéuticas favorables observadas en CS3 pueden estar impulsadas por la presencia de células T CD8+ preexistentes, altamente citotóxicas pero restringidas por los puntos de control, que podrían liberarse funcionalmente mediante el bloqueo de los puntos de control.

Para facilitar la traslación clínica, desarrollamos un marco de trabajo pronóstico basado en la firma CS3. Al comparar 118 modelos de supervivencia (101 algoritmos de aprendizaje automático y 17 regresiones de Cox por pasos) en la cohorte TCGA-COAD y dos conjuntos de datos externos (GSE17538, GSE39582), identificamos un modelo híbrido de bosque de supervivencia aleatorio (RSF) + plsRcox como el mejor predictor (Figura 7A; Tabla S6). El modelo final consistió en 11 genes centrales con una importancia pronóstica consistente en las cohortes (Figura 7B; Figura S8A–C).

El modelo final consistió en 11 genes centrales con una importancia pronóstica consistente en las cohortes (Figura 7B; Figura S8A–C). Las puntuaciones de riesgo derivadas de Cox estratificaron a los pacientes en grupos de alto riesgo (HRS) y bajo riesgo (LRS) en los conjuntos de datos, con los pacientes HRS que exhibieron una supervivencia marcadamente peor (Figura 7C; Figura S8D y E). El análisis de enriquecimiento funcional reveló que los tumores HRS estaban dominados por programas proliferativos (punto de control G2M, E2F, MYC) y características agresivas (EMT, hipoxia) (Figura 7D). Además, el perfilado de la fenotipo inmunitario tumoral (TIP) reveló un paisaje inmunitario distinto excluido en los tumores HRS: aunque la presencia inmune intratumoral fue elevada (paso 5), la eficiencia de reclutamiento deficiente (paso 4) y la prevalencia de vías inflamatorias disfuncionales (Figura 7E) sugieren que estos tumores evaden eficazmente la eliminación inmunitaria a pesar de su apariencia "caliente". En conjunto, estos hallazgos indican que la firma de 11 genes captura tanto la malignidad intrínseca de las células tumorales como la naturaleza supresora del microambiente.

Para explorar las vulnerabilidades terapéuticas en los tumores HRS, integramos datos de sensibilidad a fármacos de Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC), Cancer Therapeutics Response Portal (CTRP) y Profiling Relative Inhibition Simultaneously in Mixtures (PRISM). Los tumores HRS mostraron una mayor sensibilidad en múltiples clases de fármacos, incluidos los inhibidores multiquinasas SRC/BCR-ABL (dasatinib,^[18], bosutinib^[19]), los inhibidores de PI3K/AKT/mTOR (AZD6482,^[20], AZD8186^[21]), los inhibidores de MEK^[22] (trametinib, PD0325901) y un inhibidor de la vía Wnt (WIKI4^[23]) en el conjunto de datos de GDSC (Figura S8F). Además, se observó sensibilidad a agentes inmunomoduladores y antiinflamatorios (partenolida,^[24], PF-04136309,^[25], ABT-702,^[26], bendamustina^[27]), inhibidores de HDAC (RGFP966, romidepsina^[28]), inhibidores del ciclo celular (N9-isopropilolomoucina, indisulam^[29]) e inhibidores de p53-MDM2 (nutlin-3,^[30], GSK2830371^[31]) en los conjuntos de datos de CTRP y PRISM (Figura S8G–J). Estos hallazgos sugieren posibles vías para estrategias de combinación racionales que aborden la resistencia a la inmunoterapia en pacientes con HRS.

En conjunto, estos análisis caracterizan a CS3 como un subtipo inmunológicamente activo con comportamientos dinámicos distintos bajo inmunoterapia. Su asociación con estados específicos de células T efectoras y agotadas, una robusta estratificación pronóstica y posibles vulnerabilidades farmacológicas resaltan su valor como objetivo para estrategias de oncología de precisión en el CCRC.

El perfilado integrativo multi-ómico revela tres subtipos moleculares robustos

Para explorar la heterogeneidad molecular del CCRC, realizamos un análisis integrativo multi-ómico utilizando perfiles de ARNm, ARN largo no codificante (lncRNA), metilación del ADN y mutaciones somáticas del conjunto de datos TCGA-COAD (Tabla S1). Basándonos en el agrupamiento por consenso no supervisado, identificamos tres subtipos moleculares distintos, designados como CS1, CS2 y CS3 (Tabla S2). La selección de tres grupos se respaldó mediante múltiples índices, incluido el índice de predicción de consenso (CPI), la estadística de brecha y el ancho de silueta (Figuras S1A y S1B). Además, el agrupamiento por consenso indicó una clara separación entre las capas moleculares (Figura 1C), lo que sugiere que estos subtipos reflejan la diversidad biológica subyacente del conjunto de datos.

Se observaron patrones moleculares distintos para cada subtipo, caracterizados por características transcriptómicas, epigenéticas y mutacionales específicas (Figura 1A). La estabilidad de esta clasificación fue consistente en diez algoritmos de agrupamiento independientes (Figura 1B). En términos de resultados clínicos, el análisis de Kaplan-Meier mostró diferencias significativas en la supervivencia global (OS) entre los tres subtipos (p < 0,05; Figura 1D), lo que destaca la posible relevancia pronóstica de esta estratificación.

La reproducibilidad de las firmas de subtipos derivadas de TCGA se evaluó además utilizando dos cohortes independientes (GSE39582 y GSE17538) (Figura 1E y S1C). Utilizando plantillas específicas de subtipos (Tabla S3), observamos una concordancia sustancial entre las asignaciones basadas en el consenso y los clasificadores basados en ARN, incluido el método de predicción de la plantilla más cercana (NTP) y el análisis de predicción para microarrays (PAM) (Kappa > 0,6; Figuras S1D–F). Estos hallazgos proporcionan evidencia de la estabilidad del marco de clasificación y sugieren su posible viabilidad para aplicaciones traslacionales.

Divergencia funcional y mecanismos reguladores subyacentes a los subtipos de CCRC

Para analizar la heterogeneidad funcional subyacente a los tres subtipos moleculares, realizamos WGCNA, que identificó dieciséis módulos de coexpresión distintos (Figura S2A y B). El análisis de correlación reveló asociaciones específicas entre los genes propios del módulo (ME) y las identidades de los subtipos: los módulos verde-amarillo, azul y cian se asociaron preferentemente con CS1, CS2 y CS3, respectivamente (Figuras S2C–E).

GSEA iluminó aún más los paisajes funcionales de estos subtipos. CS1 se caracterizó por la reprogramación metabólica, mostrando un enriquecimiento de las vías del metabolismo de hormonas, carbohidratos y fármacos. CS2 se definió por una mayor actividad transcripcional, con asociaciones que involucran el procesamiento del ARN y el empalme del ARN. En contraste, CS3 exhibió un perfil inmunitario distinto, marcado por un robusto enriquecimiento de la señalización de citocinas, la respuesta de los interferones y las vías inflamatorias (Figuras 2A y 2B). Estas observaciones se respaldaron mediante el perfilado ssGSEA de los conjuntos de genes Hallmark, que confirmó el dominio metabólico de CS1, las características proliferativas de CS2 y el TME altamente inflamado de CS3 (Figura 2C).

A nivel transcripcional, la inferencia de TRN identificó programas reguladores específicos de subtipos. Los tumores CS3 mostraron un enriquecimiento de los factores de transcripción asociados con la inmunidad y el tronco, incluidos HIF1A, TP63, KLF4, FOXA1, GATA6 y FOXM1, lo que sugiere una red coordinada que integra la adaptación a la hipoxia, la plasticidad epitelial y la activación inmunitaria. Por el contrario, los tumores CS2 fueron impulsados por los reguladores de la cromatina y los modificadores epigenéticos, lo que es consistente con su fenotipo regulador epigenético (Figura 2D).

Coherente con estos patrones transcripcionales, el perfilado inmunitario reveló que los tumores CS3 mostraron una infiltración significativamente mayor de células T, células asesinas naturales (NK), macrófagos y células dendríticas, en comparación con CS1 y CS2 (Figura 2E). Este paisaje rico en inmunidad, junto con la señalización inflamatoria identificada anteriormente, destaca la naturaleza inmunogénica del subtipo CS3 y sugiere un potencial de respuesta a la inmunoterapia.

Inestabilidad genómica y potencial inmunoterapéutico del subtipo CS3

Las mutaciones somáticas son los principales impulsores de la evolución tumoral y la respuesta terapéutica. Para explorar el panorama genómico de los subtipos identificados, analizamos los 20 genes más frecuentemente mutados (FMG) y los perfiles de mutación generales. Si bien los tumores CS1 y CS2 mostraron altas frecuencias de mutaciones impulsoras del CCRC canónico (por ejemplo, APC, TP53, KRAS), el subtipo CS3 exhibió una arquitectura de mutación distinta caracterizada por la inestabilidad genómica. Específicamente, los tumores CS3 se enriquecieron con mutaciones en genes estructurales grandes, como TTN (94%), MUC16 (77%), OBSCN (73%) y SYNE1 (71%), y mostraron una frecuencia comparativamente menor de alteraciones impulsoras clásicas (Figuras 3A, B y D; Tabla S4). Este perfil, dominado por una alta carga de mutaciones no sinónimas, apunta a un mecanismo distinto de inestabilidad genómica en CS3.

Una caracterización adicional identificó un repertorio específico de alteraciones impulsoras no canónicas en CS3, que incluyen TEAD2, CIC, NCOR1, MEGF8 y BMPR2, en contraste con el panorama dominado por KRAS de CS1 y CS2 (Figura S3A-C). El análisis a nivel de vía indicó mayores cargas de mutación en múltiples vías de señalización oncogénica y módulos de reparación del daño del ADN (DDR) en CS3 (Figura S3D y E), lo que es consistente con las alteraciones genómicas generalizadas.

Esta inestabilidad genómica se asoció con una mayor inmunogenicidad. Los tumores CS3 mostraron una carga de mutación tumoral (TMB), una carga de neoantígenos tumorales (TNB) y puntuaciones de MSI significativamente más altas, junto con una menor heterogeneidad intratumoral (ITH), en comparación con CS1 y CS2 (Figura 3E). Coherente con estas características, observamos una mayor expresión de moléculas de control inmunitario (por ejemplo, CD274 [PD-L1], proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos [CTLA4], LAG3) (Figura 3C) y genes del antígeno leucocitario humano (HLA), lo que sugiere una mayor capacidad de presentación de antígenos (Figura 3F).

Las métricas de inmunogenicidad funcional respaldaron aún más estas observaciones. Los tumores CS3 exhibieron puntuaciones de la firma inflamada de células T (TIS) significativamente más altas (p < 0,0001; Figura 3G), lo que indica un TME inflamado. El análisis de mapeo de subconjuntos (SubMap) proporcionó un apoyo adicional a esta observación al demostrar una similitud transcriptómica significativa entre los tumores CS3 y los grupos de pacientes que se sabe que responden a las terapias de inmunoterapia (p < 0,05; Figura 3H), lo que sugiere que los tumores CS3 comparten características transcriptómicas con los respondedores clínicos.

Estos hallazgos caracterizan a CS3 como un subtipo molecular definido por una extensa inestabilidad genómica, una mayor inmunogenicidad y un TME altamente inflamado: características que en conjunto sugieren un contexto molecular favorable para la intervención inmunoterapéutica de precisión en el CCRC.

Para comparar nuestra clasificación con los subtipos establecidos, inferimos las etiquetas CMS para TCGA-COAD e integramos estos datos con las métricas clínicas de MSI y TMB (Tabla S5). CS3 se superpone sustancialmente con CMS1, pero no es idéntico: entre los tumores CS3 con etiquetas CMS definidas (n = 44), el 68,2% fueron CMS1 (30/44), mientras que el resto fueron CMS3 o CMS4 (15,9% cada uno). CS3 se enriqueció con tumores MSI altos (88,9%, 40/45), mientras que CS1 y CS2 fueron predominantemente MSS (>97% cada uno).

Cabe destacar que CMS1 incluyó un subconjunto de tumores MSS clínicamente no clasificados como CS3 (n = 13). Por el contrario, CS3 contenía un subgrupo MSS clínicamente (n = 4), tres de los cuales (75%) fueron ultra-mutados (>2000 mutaciones). En conjunto, estos resultados sugieren que CS3 complementa a CMS1/MSI al refinar el límite de la enfermedad inmunogénica y al resaltar los tumores MSS hipermutados que pueden no ser capturados por las pruebas de rutina de MSI.

Validación y refinamiento de la heterogeneidad de subtipos mediante secuenciación de ARN de una sola célula

Para validar la relevancia biológica de los subtipos moleculares identificados a nivel de resolución de una sola célula, integramos los datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) de tres cohortes independientes de CCRC (Figura S4A). Tras un riguroso control de calidad y la corrección de lotes, el agrupamiento no supervisado de 164 355 células de alta calidad resolvió seis linajes principales: células epiteliales (EPC), células T/NK, células mieloides (Mye), fibroblastos (Fb), células endoteliales (Endo) y células B (Figuras 4A y 4B). La puntuación basada en UCell de las firmas de subtipos derivadas del análisis en masa reveló distribuciones celulares distintas. Si bien las firmas de CS1 y CS2 se limitaron principalmente a las subpoblaciones epiteliales que representan estados de diferenciación o proliferación divergentes, la firma de CS3 exhibió una distribución más amplia en los compartimentos epitelial, T/NK y mieloide. En particular, la firma de CS3 mostró un predominio marcado en Mye, lo que indica un compromiso inmunitario extenso y una pronunciada heterogeneidad intratumoral (Figura 4C).

Para analizar aún más la heterogeneidad epitelial, realizamos un subagrupamiento de alta resolución, identificando 13 subpoblaciones epiteliales distintas a nivel transcripcional (Figuras 4D y 4E). La asignación basada en NTP asignó estos subgrupos a identidades CS específicas (Figura 4F). La integración de los resultados de la inferencia de la variación del número de copias (CNV) (inferCNV, CopyKAT) con las métricas de enriquecimiento (índice RO/E) respaldó el enriquecimiento maligno dentro de varios grupos epiteliales, incluidos los grupos de tipo tronco (STM), proliferativo, C3CXCL3, C12PLA2G2A, C13IL32 y C14TGFBI (Figuras S4B y C).

El análisis de DGE reveló una divergencia funcional profunda entre las poblaciones epiteliales enriquecidas con subtipos. Los grupos enriquecidos con la firma de CS2 exhibieron fuertes características proliferativas, de tipo tronco y reguladoras de la cromatina, mientras que los grupos enriquecidos con la firma de CS3 mostraron una mayor presentación de antígenos, señalización inflamatoria y funciones de barrera epitelial. En contraste, los grupos asociados con la firma de CS1 se parecían a los programas de diferenciación de tipo enterocito o caliciforme característicos de la homeostasis normal de la mucosa (Figuras 4G y 4H y S4C).

La reconstrucción de la trayectoria de pseudotiempo utilizando Monocle3, anclada en el grupo STM, delineó vías de diferenciación epitelial que se bifurcan hacia puntos finales proliferativos o inflamatorios (Figura S4D). El análisis de módulos de genes reveló transiciones transcripcionales dinámicas, desde los primeros programas enriquecidos en replicación del ADN, empalme del ARN y regulación epigenética (módulos 3–4), a través de respuestas intermedias al estrés oxidativo y la hipoxia (módulo 1), hasta estados terminales caracterizados por la actividad mitótica, la presentación de antígenos y la activación de las células T (módulo 2). Los genes de la firma de CS3 se enriquecieron significativamente en el módulo 2, lo que sugiere que los tumores CS3 pueden originarse a partir de poblaciones epiteliales inmunológicamente activas que poseen tanto potencial proliferativo como inmunorregulador (Figura S4E).

El análisis pseudo-bulk a nivel de paciente corroboró aún más estas observaciones. Los pacientes con CS2 exhibieron fuertes firmas proliferativas y reguladoras, los pacientes con CS3 mostraron una activación inmune-inflamatoria dominante y los pacientes con CS1 conservaron características epiteliales homeostáticas (Figura S5A y B).

En conjunto, estos resultados demuestran que los subtipos multi-ómicos corresponden a programas transcripcionales biológicamente coherentes tanto a nivel de célula única como a nivel de paciente. Esta concordancia apoya su utilidad para desentrañar la heterogeneidad del CCRC y guiar las estrategias de inmunoterapia de precisión.

Heterogeneidad funcional inmune de las células mieloides asociadas a CS3

Dado el fenotipo inmune distinto del subtipo CS3, realizamos un análisis exhaustivo a nivel de célula única del compartimento mieloide para caracterizar su contribución a la inmunidad tumoral. El subagrupamiento de alta resolución identificó 16 subpoblaciones mieloides transcripcionalmente distintas (Figura 5A; Figura S6A y B). Entre estas, las firmas CS3 se encontraron significativamente enriquecidas en varios subconjuntos de macrófagos, incluidos MacroISG15, MacroSPP1, MacroC1QC y MacroLYVE1 (Figura 5B). Los análisis de enriquecimiento funcional delinearon funciones inmunológicas especializadas para estos subconjuntos. MacroISG15 se caracterizó por una fuerte señalización de interferón y TNF-α; MacroSPP1 se enriqueció en señalización IL2-STAT5, transición epitelio-mesenquimal (TEM) y programas relacionados con la hipoxia, lo que sugiere un fenotipo proinflamatorio y potencialmente invasivo; MacroC1QC mostró un enriquecimiento en la activación del complemento y la fosforilación oxidativa, lo que indica un estado inflamado crónico y metabólicamente adaptado; y MacroLYVE1 exhibió la activación de las vías TNF-α/NF-κB y apoptosis, lo que refleja un perfil inmunosupresor (Figura 5C).

La estratificación de Mye según la intensidad de la firma CS3 aclaró aún más sus identidades funcionales. Las poblaciones de alta CS3 (HCS3) se compusieron predominantemente de subconjuntos inflamatorios, como MacroINHBA y monocitos CD16+, mientras que las poblaciones de baja CS3 (LCS3) se enriquecieron en células de tipo dendrítico, incluido cDC1CLEC9A (Figura S6C). El análisis de expresión diferencial reveló que las células HCS3 coexpresaban múltiples mediadores proinflamatorios (IL1B, IL6, CXCL9, CCL4) junto con factores inmunosupresores (EREG, CCL18), lo que destaca la coexistencia de la activación inflamatoria y los programas de evasión inmune. En contraste, las células LCS3 expresaron marcadores homeostáticos como CLEC10A y FCER1A (Figura 5D). GSEA respaldó esta dicotomía: HCS3 Mye exhibió una regulación al alza de las vías NF-κB, IL-17 y receptores tipo Toll, mientras que las poblaciones LCS3 se enriquecieron en programas de procesamiento y presentación de antígenos (Figura 5E).

El análisis de TRN utilizando SCENIC identificó la activación preferencial de factores de transcripción inmuno-reguladores en las células HCS3, incluidos STAT1, NFKB1, MITF y FOXP3. Esto sugiere un programa coordinado que impulsa la señalización de interferón, la amplificación inflamatoria y la modulación inmune. Por el contrario, las poblaciones LCS3 estuvieron reguladas por factores de transcripción homeostáticos como REL, SPI1 y TCF4 (Figuras 5F y 5G). El análisis de la puntuación de especificidad regulatoria (RSS) destacó aún más STAT1 y MITF como reguladores clave que impulsan los subconjuntos de macrófagos inflamatorios (MacroSPP1, MacroISG15, Macro_C1QC; Figura S6D).

El análisis de la comunicación célula-célula utilizando CellChat reveló un aumento notable de la señalización intercelular entre HCS3 Mye, mediada por pares de ligandos-receptores como SPP1-CD44, MIF-CD74/CD44, LAMA4-CD44, FN1-CD44 y CXCL-ACKR1 (Figura 5H y S6E y F). Estas interacciones señalan un papel de Mye asociada a CS3 en la modulación inmune, la remodelación de la matriz extracelular y la amplificación de la señalización inflamatoria dentro del microambiente tumoral (MET).

Estos análisis a nivel de célula única revelan una heterogeneidad funcional significativa y una complejidad regulatoria dentro de las poblaciones mieloides del subtipo CS3. Describen un panorama inmune paradójico donde la activación inflamatoria coexiste con la supresión inmune. Esta dualidad ofrece información mecanicista sobre el potencial de evasión inmune en los tumores CS3 y sugiere que la focalización de subconjuntos mieloides específicos podría representar una estrategia terapéutica para el CCRC.

Dinámica de CS3 bajo el bloqueo de puntos de control inmunitario y traslación clínica

Para investigar la relevancia funcional del subtipo CS3 bajo el BIC, integramos dos conjuntos de datos de scRNA-seq de tumores colorrectales tratados con BIC (GSE236581 y GSE205506) (Figura 6A; Figura S7A y B). La cuantificación de la actividad de la firma CS3 en los diferentes compartimentos celulares indicó que el programa CS3 se expresa preferentemente en las líneas celulares mieloides y de células T/NK, lo que sugiere su participación en la coordinación tanto de la inmunidad innata como adaptativa antitumoral (Figura 6B).

A continuación, evaluamos la evolución temporal de la actividad de CS3 durante la terapia. Utilizando la puntuación UCell, rastreamos la distribución espacio-temporal de las células "CS3-altas" en las diferentes etapas del tratamiento y los grupos de respuesta (Figura 6C). En la cohorte GSE236581, los pacientes que lograron una respuesta completa (RC) se caracterizaron por una alta actividad basal de CS3 que disminuyó sustancialmente después del tratamiento, lo que es consistente con la resolución de una respuesta inmune después de la eliminación del tumor. En contraste, aquellos con respuesta parcial (RP) o enfermedad estable (EE) mostraron una actividad basal más baja, con una tendencia creciente durante la terapia, lo que refleja potencialmente una participación inmune retrasada o subóptima (Figuras 6D y 6E). Los análisis comparativos revelaron diferencias significativas en los niveles basales de CS3 entre los grupos de RC y RP/EE, así como trayectorias dinámicas postratamiento distintas (Figura 6F). Estas observaciones respaldan el potencial de la actividad de CS3 como un biomarcador dinámico, que ofrece utilidad predictiva tanto en la línea de base como a lo largo del curso del tratamiento.

El subagrupamiento de alta resolución de las células T/NK (Figura 6G; Figura S7E y F) indicó que la firma CS3 se concentró en los subconjuntos de células T CD8+ activadas, incluidos los subconjuntos agotados (CD8Tex), de memoria efectora (CD8Tem) y estimulados por interferón (Figura S7C y D). La caracterización adicional de los grupos de células T CD8+ enriquecidas con CS3 reveló un fenotipo distinto de "efector citotóxico-agotado". Estas células coexpresaron múltiples receptores inhibitorios (PDCD1, LAG3, TIGIT) al tiempo que exhibían una expresión robusta de moléculas efectoras citotóxicas, incluidas GZMB, PRF1, NKG7 y GNLY (Figura S7E). En contraste con las células progenitoras de tipo tallo agotadas, esta población mostró una expresión insignificante de TCF7 y LEF1. Estos hallazgos sugieren que las características inmunoterapéuticas favorables observadas en CS3 pueden estar impulsadas por la presencia de células T CD8+ preexistentes, altamente citotóxicas pero restringidas por puntos de control, que podrían liberarse funcionalmente mediante el bloqueo de puntos de control.

Para facilitar la traslación clínica, desarrollamos un marco de trabajo pronóstico basado en la firma CS3. Al comparar 118 modelos de supervivencia (101 algoritmos de aprendizaje automático y 17 regresiones de Cox por pasos) en la cohorte TCGA-COAD y dos conjuntos de datos externos (GSE17538, GSE39582), identificamos un modelo híbrido de bosque de supervivencia aleatorio (RSF) + plsRcox como el mejor predictor (Figura 7A; Tabla S6). El modelo final consistió en 11 genes centrales con una importancia pronóstica consistente en las cohortes (Figura 7B; Figura S8A–C).

El modelo final consistió en 11 genes centrales con una importancia pronóstica consistente en las cohortes (Figura 7B; Figura S8A–C). Las puntuaciones de riesgo derivadas de Cox estratificaron a los pacientes en grupos de alto riesgo (HAR) y bajo riesgo (LAR) en los conjuntos de datos, con los pacientes HAR que exhibieron una supervivencia marcadamente peor (Figura 7C; Figura S8D y E). El análisis de enriquecimiento funcional reveló que los tumores HAR estaban dominados por programas proliferativos (punto de control G2M, E2F, MYC) y características agresivas (TEM, hipoxia) (Figura 7D). Además, el perfilado del fenotipo inmune tumoral (TIP) reveló un paisaje inmune distinto excluido en los tumores HAR: aunque la presencia inmune intratumoral fue elevada (paso 5), la eficiencia de reclutamiento deficiente (paso 4) y la prevalencia de vías inflamatorias disfuncionales (Figura 7E) sugieren que estos tumores evaden eficazmente la eliminación inmune a pesar de su apariencia "caliente". En conjunto, estos hallazgos indican que la firma de 11 genes captura tanto la malignidad intrínseca de las células tumorales como la naturaleza supresora del microambiente.

Para explorar las vulnerabilidades terapéuticas en los tumores HAR, integramos datos de sensibilidad a fármacos del Banco de datos de la genómica de la sensibilidad a fármacos en el cáncer (GDSC), el Portal de respuesta terapéutica del cáncer (CTRP) y el perfilado de la inhibición relativa simultánea en mezclas (PRISM). Los tumores HAR mostraron una mayor sensibilidad en múltiples clases de fármacos, incluidos los inhibidores de la quinasa múltiple SRC/BCR-ABL (dasatinib,^[18], bosutinib^[19]), los inhibidores de PI3K/AKT/mTOR (AZD6482,^[20], AZD8186^[21]), los inhibidores de MEK^[22] (trametinib, PD0325901) y un inhibidor de la vía Wnt (WIKI4^[23]) en el conjunto de datos GDSC (Figura S8F). Además, se observó sensibilidad para los agentes inmunomoduladores y antiinflamatorios (partenolida,^[24], PF-04136309,^[25], ABT-702,^[26], bendamustina^[27]), los inhibidores de HDAC (RGFP966, romidepsina^[28]), los inhibidores del ciclo celular (N9-isopropilolomoucina, indisulam^[29]) y los inhibidores de p53-MDM2 (nutlina-3,^[30], GSK2830371^[31]) en los conjuntos de datos CTRP y PRISM (Figura S8G–J). Estos hallazgos sugieren posibles vías para estrategias de combinación racionales para abordar la resistencia a la inmunoterapia en los pacientes HAR.

En conjunto, estos análisis caracterizan a CS3 como un subtipo inmune-activo con comportamientos dinámicos distintos bajo el BIC. Su asociación con estados específicos de células T efectoras-agotadas, una sólida estratificación pronóstica y posibles vulnerabilidades farmacológicas resaltan su valor como un objetivo para estrategias de oncología de precisión en el CCRC.

Discusión

Este estudio desarrolla un marco de trabajo integrador multi-ómico para la subtipificación del CCRC e identifica tres subtipos biológica y clínicamente distintos (CS1–CS3). Al combinar información transcriptómica, epigenética y mutacional, el marco de trabajo captura un rango más amplio de heterogeneidad tumoral y muestra una mayor estabilidad y reproducibilidad en comparación con los sistemas de una sola ómica, como CMS y CRIS. Cada capa de la ómica contribuye con un contexto regulatorio complementario: las características genómicas capturan los impulsores inmunogénicos y evolutivos clave (por ejemplo, los patrones de mutación y el estado de MSI); la metilación del ADN refleja las limitaciones regulatorias a largo plazo que no siempre son aparentes a partir de los niveles de ARNm en estado estacionario; los perfiles transcriptómicos representan estados funcionales más inmediatos; y el ARN no codificante agrega una capa regulatoria no codificante adicional. En consonancia con esto, CS1-CS3 difieren marcadamente en la estabilidad genómica, los patrones de metilación y los programas de ARN no codificante, lo que proporciona un telón de fondo molecular importante para sus distintos fenotipos del MET.

Entre los subtipos identificados, CS3 emerge como una clase altamente inmune-activa y genómicamente inestable. Es importante destacar que nuestro análisis multi-ómico indica que CS3 se extiende más allá del subtipo transcriptómico CMS1 o el estado clínico MSI-H, lo que ofrece un posible refinamiento a estas clasificaciones. Si bien las pruebas estándar de MSI y las asignaciones de CMS1 identifican eficazmente la mayoría de los tumores inmunogénicos, es posible que no capturen por completo un subconjunto específico de tumores "inmune-calientes" dentro de la población clínicamente MSS. El subtipo CS3 pudo identificar estos casos discordantes, que se distinguieron por una carga mutacional ultra alta (>2000 mutaciones). Al resaltar a estos pacientes hipermutados dentro de la población MSS, CS3 sugiere una vía para una estratificación más precisa, que podría extender los beneficios del BIC a los pacientes con alta carga mutacional que de otro modo podrían ser excluidos por las pautas basadas en MSI actuales.

Para explorar su potencial clínico, examinamos si una entrada de datos simplificada podría capturar adecuadamente nuestra clasificación. Si bien el enfoque multi-ómico fue fundamental para establecer una base biológica integral, reconocemos que las aplicaciones clínicas a menudo requieren métodos más accesibles. En la fase de validación, pasamos a un enfoque basado en ARN, lo que podría mejorar la viabilidad. El acuerdo relativamente alto entre las etiquetas multi-ómicas y las predicciones basadas en ARN (Kappa >0,6) sugiere que el secuenciamiento de ARN podría servir como un "requisito mínimo de datos" práctico para identificar pacientes similares a CS3. Este ajuste en la estrategia puede mejorar la utilidad clínica del modelo, al tiempo que se conservan los valiosos conocimientos biológicos proporcionados por el enfoque multi-ómico.

La validación transcriptómica de células individuales respaldó aún más la coherencia biológica de CS3. En dos conjuntos de datos de secuenciación de ARN de células únicas (scRNA-seq) de tumores colorrectales tratados con inmunoterapia combinada (ICB), el compartimento de células T CD8+ enriquecido con CS3 se caracterizó por un estado de "efector citotóxico-agotado". Estas células combinaron un fuerte programa citotóxico (alta expresión de GZMB y PRF1) con una expresión elevada de receptores inhibitorios, lo que es consistente con los efectores con experiencia antigénica bajo restricción de puntos de control inmunitarios. En contraste con las células progenitoras de tipo tronco agotadas, que suelen ser positivas para TCF7 y LEF1 y se mantienen a través de la autorrenovación, esta población mostró una expresión mínima de TCF7 y LEF1. Estas características sugieren un posible vínculo mecanístico entre CS3 y el beneficio de la ICB, donde el bloqueo de los puntos de control inmunitarios podría ayudar a revitalizar los efectores citotóxicos preexistentes, lo que posiblemente contribuya a un control tumoral más rápido.

El equilibrio inmunitario en CS3 parece estar orquestado por una TRN distinta. Los reguladores proinflamatorios, como STAT1 y NFKB1, probablemente impulsan el programa inflamatorio inicial. Simultáneamente, factores como MITF y interacciones específicas ligando-receptor (por ejemplo, SPP1-CD44, MIF-CD74) pueden establecer bucles de retroalimentación que mantienen la inflamación crónica y, al mismo tiempo, facilitan la evasión inmunitaria. Esta red coordinada define el equilibrio característico de activación y supresión observado en el microambiente de CS3.

Los análisis longitudinales de cohortes tratadas con ICB demostraron además que la modulación dinámica de la actividad de CS3 se correlaciona con los resultados del tratamiento. Específicamente, dentro de la cohorte GSE236581, los pacientes con CR se caracterizaron por una alta actividad basal de CS3 que disminuyó sustancialmente después del tratamiento, lo que probablemente refleja la resolución de una respuesta inmune activa después de la eliminación del tumor. Por el contrario, los pacientes que lograron PR o SD mostraron una menor actividad basal de CS3 que aumentó durante la terapia, lo que podría indicar una participación inmunitaria retrasada o subóptima. Estas observaciones respaldan el potencial de la actividad de CS3 como un biomarcador dinámico, que ofrece utilidad predictiva tanto en la línea de base como a lo largo del curso del tratamiento.

Para facilitar la traducción clínica, construimos un modelo pronóstico basado en aprendizaje automático que comprende 11 genes centrales derivados de la firma de CS3. La anotación funcional sugiere que este modelo captura múltiples programas que ocurren simultáneamente en tumores infiltrados por células inmunitarias, incluidos los factores de tráfico inmunitario, así como la remodelación tumoral-estromal y las características de evasión inmunitaria dentro del microambiente tumoral (MTE) (se proporcionan anotaciones detalladas en la Tabla S7). En consonancia con esto, las quimiocinas como CXCL13 fueron protectoras en nuestro modelo, mientras que varios genes asociados con la remodelación o la evasión contribuyeron a un mayor riesgo. Por ejemplo, se ha informado que SPP1 participa en programas asociados con macrófagos y, a menudo, se relaciona con la polarización mieloide inmunosupresora y la remodelación de la matriz que pueden limitar la eficacia de la inmunidad antitumoral. De manera similar, ULBP2 se asoció con el riesgo a pesar de ser un ligando de NKG2D, lo que es compatible con los mecanismos de desprendimiento informados que generan señuelos solubles y disminuyen el reconocimiento de las células NK. En general, la puntuación debe interpretarse como una lectura compuesta del equilibrio entre el reclutamiento/presión inmune y los programas contrarios, como la remodelación estromal y la evasión inmunitaria.

La integración farmacogenómica reveló posibles vulnerabilidades terapéuticas en los tumores HRS, incluidos los inhibidores de múltiples quinasas y los moduladores epigenéticos. Es importante reconocer que nuestras predicciones de sensibilidad a los fármacos se derivan de recursos de líneas celulares de cáncer in vitro, que no replican completamente la compleja dinámica estromal e inmunitaria del MTE. Sin embargo, el fenotipo "inmunoactivo" del subtipo CS3 probablemente esté relacionado con programas intrínsecos a las células tumorales, lo que sugiere que los candidatos identificados pueden capturar dependencias de señalización fundamentales que sustentan la biología de este subtipo.

En particular, varios candidatos, como los moduladores epigenéticos (por ejemplo, romidepsina) y los inhibidores de p53-MDM2 (por ejemplo, nutlin-3), tienen funciones documentadas en el aumento de la inmunogenicidad tumoral a través de la muerte celular inmunogénica o la modulación de la maquinaria de presentación de antígenos.^[32],^[33],^[34],^[35] De manera similar, los inhibidores de quinasas y vías que se dirigen a las vías PI3K/AKT/mTOR, MEK y Wnt se han asociado, en ciertos contextos, con cambios en la señalización inmunosupresora asociada al tumor y, por lo tanto, pueden ser de interés al considerar estrategias terapéuticas con un contexto inmunitario.^[36],^[37],^[38],^[39],^[40] Si bien nuestro análisis actual no captura directamente los efectos de los fármacos dependientes del sistema inmunitario, estos resultados proporcionan un punto de partida valioso para explorar estrategias de combinación en subgrupos de CRC enriquecidos con el sistema inmunitario. La validación posterior en sistemas relevantes para el sistema inmunitario será fundamental para aclarar estas interacciones y refinar la priorización terapéutica.

En conclusión, este estudio propone un marco que puede ayudar a conectar el perfilado multi-ómico con la estratificación orientada a la inmunoterapia en el CRC. Al integrar la subtipificación molecular, la validación de células individuales y los conocimientos farmacogenómicos, caracterizamos CS3 como un subtipo inmunoactivo pero terapéuticamente complejo con potencial relevancia predictiva y pronóstica. Los biomarcadores y los agentes candidatos propuestos pueden proporcionar una base útil para la inmunoterapia de precisión y podrían respaldar el desarrollo continuo de estrategias de tratamiento personalizadas en el CRC.

Materiales y métodos

Adquisición y preprocesamiento de datos

Los datos multi-ómicos de 275 pacientes con CRC se recuperaron de la cohorte TCGA-COAD a través de la plataforma UCSC Xena. El conjunto de datos incluyó la expresión de ARNm, la expresión de ARN no codificante largo (lncRNA), la metilación del ADN y los perfiles de mutación somática, junto con anotaciones clínicas integrales (Tabla S1). Los datos transcriptómicos se sometieron a normalización de transcritos por millón (TPM), seguida de una transformación logarítmica [log2(TPM+0,001)]. Los datos de metilación del ADN se analizaron como matrices de valores beta. Los datos de mutación somática se procesaron utilizando maftools (v2.14.0), conservando los genes mutados en ≥5% de las muestras.^[41] Se obtuvieron dos cohortes de validación independientes (GSE17538,^[42] GSE39582^[43]) de la base de datos GEO.

Selección de características y agrupación multi-ómica

La selección de características se realizó por separado para cada capa ómica. Para los perfiles de ARNm y lncRNA, se conservaron los 3100 ARNm y los 1000 lncRNA principales con la desviación absoluta mediana (MAD) más alta. Para los datos de metilación, se seleccionaron los 10 000 sitios CpG principales en función de MAD. La regresión de riesgos proporcionales de Cox univariada identificó las características que estaban significativamente asociadas con la supervivencia general (OS) (p < 0,05). También se incluyeron las mutaciones somáticas presentes en ≥5% de las muestras.

La agrupación multi-ómica se realizó utilizando el paquete MOVICS,^[44] que integra 10 algoritmos de última generación (CIMLR, ConsensusClustering, SNF, iClusterBayes, PINSPlus, moCluster, NEMO, IntNMF, COCA y LRA) para lograr una clasificación de consenso. El número óptimo de grupos (k) se determinó utilizando múltiples índices estadísticos, incluido el ancho de la silueta, el estadístico de la brecha y el CPI. Las plantillas de expresión específicas del subtipo se derivaron de los genes significativamente sobreexpresados en la cohorte TCGA (Tablas S2 y S3). La validación externa de la asignación de subtipos se realizó en los conjuntos de datos GEO utilizando NTP y PAM, y la concordancia se evaluó en relación con los subtipos de referencia definidos en TCGA.^[45]

Caracterización funcional

Se realizó WGCNA en los 5000 genes clasificados por MAD con una potencia de umbral suave de 6 para identificar los módulos de coexpresión asociados al subtipo,^[46] y se correlacionaron los MEs con las identidades del subtipo para definir las asociaciones módulo-subtipo. Los genes expresados diferencialmente (DEG) se identificaron utilizando limma (v3.54.2). El análisis de enriquecimiento funcional se realizó utilizando GSEA con conjuntos de genes Hallmark de MSigDB, y la actividad de la vía a nivel de muestra se cuantificó mediante el análisis de variación del conjunto de genes (GSVA, v1.46.0).^[47] En paralelo, las TRN para 55 factores de transcripción relacionados con el CRC se infirieron utilizando el paquete Reconstruction of Transcriptional regulatory Networks and analysis of regulons (RTN) (v2.24.0).^[48]

Perfilado del microambiente tumoral inmunitario y genómico

El microambiente tumoral inmunitario (TIME) se caracterizó de manera integral utilizando ssGSEA para estimar la abundancia relativa de 28 poblaciones de células inmunitarias en función de conjuntos de genes relacionados con el sistema inmunitario seleccionados.^[49] Se comparó la expresión de 27 genes de puntos de control inmunitarios y nueve genes HLA entre los subtipos.^[50],^[51] Los patrones de mutación somática se analizaron utilizando maftools (v2.14.0), centrándose en los 20 FMG principales.^[52] Se generaron diagramas de distribución ternaria utilizando ggtern (v3.4.1) para visualizar las frecuencias de mutación entre los subtipos. Los genes impulsores candidatos se identificaron con OncodriveCLUST (p < 0,05; Tabla S4),^[53] y el enriquecimiento mutacional se evaluó aún más en 10 vías de señalización oncogénica canónicas y módulos de DDR.^[54]

Predicción de la respuesta a la inmunoterapia

El potencial inmunoterapéutico se evaluó utilizando TMB, TNB (obtenido de The Cancer Immunome Atlas),^[49] el estado de MSI (inferido mediante MSIsensor) y ITH (cuantificado mediante puntuaciones de heterogeneidad de alelos mutantes [MATH]). Se aplicaron dos enfoques predictivos: TIS, derivado de ssGSEA de 18 genes relacionados con el interferón-γ,^[55] y SubMap,^[56] que comparó los perfiles de expresión del subtipo con cohortes de referencia de melanoma tratadas con anticuerpos anti-PD-1 o anti-CTLA-4. La actividad de TIP se evaluó utilizando ssGSEA en las siete etapas del ciclo de inmunidad contra el cáncer.^[57]

Subtipificación molecular de consenso e integración multi-ómica

Para comparar nuestra clasificación con los subtipos establecidos, las etiquetas CMS se infirieron a partir de los datos de ARNm de TCGA TPM utilizando CMScaller (v2.0.1; RNAseq = TRUE). Los símbolos de los genes se asignaron a los ID de Entrez mediante org.Hs.e.g.,.db; las características duplicadas se combinaron mediante la media aritmética y las predicciones ambiguas se asignaron como no clasificadas (NA). Las etiquetas CMS se armonizaron con las métricas clínicas de MSI (MSIsensor/MANTIS), TMB y las etiquetas CS utilizando los códigos de barras de TCGA, y la concordancia se evaluó utilizando tablas de contingencia y estimaciones de la proporción de subtipos (Tabla S5).

Análisis de secuenciación de ARN de células únicas

Se utilizaron cinco conjuntos de datos de secuenciación de ARN de células únicas (scRNA-seq) de CRC disponibles públicamente (GSE132465,^[58] GSE166555;^[59] GSE200997;^[60] GSE236581;^[61] y GSE205506^[62]) para la validación de células individuales (Tabla S1). Para garantizar la comparabilidad entre cohortes, seleccionamos sistemáticamente los metadatos clínicos y moleculares, abarcando diversos contextos, desde tumores primarios no tratados hasta muestras post-inmunoterapia.

Se aplicó un control de calidad estricto: se excluyeron las células con menos de 200 genes detectados o con un contenido mitocondrial superior al 20 %. Los posibles dobletes se identificaron y eliminaron mediante DoubletFinder (v2.0.4). Para tener en cuenta la variación técnica y, al mismo tiempo, preservar las señales biológicas, se realizó la normalización de los datos utilizando SCTransform dentro del marco de trabajo de Seurat (v4.3.0),^[63],^[64], seguido de la integración de múltiples conjuntos de datos y la corrección de lotes mediante Harmony.^[65] La reducción de la dimensionalidad se realizó utilizando el análisis de componentes principales (PCA)^[66] y la aproximación y proyección de la variedad uniforme (UMAP).^[67] Las principales poblaciones celulares se anotaron inicialmente utilizando marcadores canónicos y se refinaron posteriormente mediante el subagrupamiento de alta resolución y el análisis de correlación canónica (CCA) para garantizar una identificación precisa de la línea celular.

Identificación de los EPC malignos y asignación de subtipos

Los EPC malignos se identificaron utilizando inferCNV (v1.10.1) y CopyKAT (v1.1.0), utilizando los EPC normales como referencia genómica (genoma hg38).^[68],^[69],^[70] Los perfiles de CNV se agruparon mediante k-means (k = 20) y la malignidad se confirmó mediante la concordancia entre los dos clasificadores basados en CNV.

Se asignaron puntuaciones de subtipo (CS1-CS3) a nivel de célula única utilizando UCell (v2.4.0),^[71], utilizando conjuntos de genes de firma derivados de análisis multiómicos a granel. La asignación de subtipos para los subgrupos epiteliales se validó aún más utilizando ssGSEA y NTP, según lo implementado en el paquete MOVICS. El enriquecimiento o la disminución de los subtipos se cuantificaron calculando las frecuencias RO/E, y la significación se determinó mediante pruebas de chi-cuadrado (RO/E > 1 indica enriquecimiento; RO/E < 1 indica disminución).

Dinámica transcripcional y comunicación celular

El análisis de expresión génica diferencial se realizó utilizando la función FindMarkers de Seurat con una tasa de falsos descubrimientos (FDR) < 0,05. El análisis de enriquecimiento funcional se centró en los procesos biológicos GO y las vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) utilizando clusterProfiler. Se realizaron análisis comparativos entre los subgrupos epiteliales enriquecidos con las firmas CS2 y CS3. Las poblaciones mieloides se estratificaron en grupos CS3-alto y CS3-bajo en función de las puntuaciones de UCell y se analizaron utilizando fgsea (v1.24.0) con conjuntos de genes Hallmark.

Se reconstruyeron las trayectorias de pseudotiempo utilizando Monocle3 (v1.3.1) para delimitar las vías de diferenciación epitelial. El grupo epitelial "tipo STM" se definió como la raíz de la trayectoria en función de su enriquecimiento específico de marcadores canónicos de las células madre intestinales (por ejemplo, LGR5 y ASCL2), lo que es consistente con la diferenciación jerárquica conocida del epitelio intestinal.^[72] Las TRN mieloides se infirieron utilizando SCENIC (v1.2.4).^[73] Los patrones de comunicación célula-célula se analizaron utilizando CellChat (v2.1.2) para identificar las interacciones ligando-receptor y las vías de señalización que se activan de forma diferencial entre las poblaciones.^[74]

Construcción de pseudo-bulk y análisis de vías específicas de subtipos

Se generaron perfiles de pseudo-bulk mediante la agregación de células por paciente y tipo de célula, excluyendo a los pacientes con