Aumento de la expresión de un subconjunto de genes dentro de regiones de número de copias reducido en múltiples tipos de cáncer

Múltiples cambios genéticos impulsan la progresión del cáncer, incluyendo variantes de un solo nucleótido (SNV), amplificación o deleción de regiones más grandes del genoma y reordenamientos que crean nuevas fusiones [^[1]–^[3]]. Las alteraciones que afectan a un solo gen, como pequeñas deleciones o inserciones y SNV únicas, pueden resultar en la inactivación de supresores tumorales o la activación de protooncogenes. La activación de oncogenes o la inactivación de supresores tumorales pueden ser los eventos iniciadores clave en muchos tipos de cáncer. Los cambios estructurales, como las amplificaciones o deleciones de un cromosoma entero o una gran región cromosómica, afectan a un gran número de genes, aunque solo uno o unos pocos genes dentro de la región pueden proporcionar la ventaja selectiva a la célula cancerosa [^[2],^[4]]. Los ejemplos clásicos de activación de oncogenes incluyen la activación de KRAS o BRAF por SNV que resultan en cambios de un solo aminoácido, creando variantes constitutivamente activas [^[5],^[6]]. Las SNV afectan con frecuencia al supresor tumoral p53, lo que resulta en la inactivación o alteración de la función [^[7]]. En el cáncer de colon, el supresor tumoral APC se inactiva con frecuencia por una combinación de mutaciones sin sentido o de cambio de marco de lectura y pérdida de heterocigosidad, y este es probablemente el evento iniciador más frecuente en el cáncer de colon [^[8],^[9]]. La pérdida de la función de APC a menudo va seguida de mutaciones activadoras en KRAS y mutación de p53 [^[10]]. Además de alterar la expresión de oncogenes y supresores tumorales bien caracterizados, los cambios en el número de copias pueden alterar la expresión de un número mayor de genes adicionales que aún pueden contribuir al desarrollo tumoral, aunque con un impacto menor que los conocidos impulsores del cáncer.

Las grandes deleciones pueden afectar a cromosomas enteros, lo que resulta en una reducción del número de copias no solo de los supresores tumorales que impulsan la selección para la pérdida, sino también de cientos de otros genes. Por ejemplo, la alteración genética más frecuente en el GBM es la pérdida heterocigótica de la totalidad del cromosoma 10, lo que probablemente se deba a la presencia del supresor tumoral PTEN [^[11]]. En el cáncer de colon, existe una reducción frecuente del número de copias que afecta al cromosoma 18, que alberga genes como SMAD4, SMAD2 y DCC con potencial función supresora tumoral [^[12],^[13]]. Además de los supresores tumorales bien conocidos que probablemente son los principales impulsores de la selección para la pérdida de estas grandes regiones cromosómicas, también es posible que la reducción de la expresión de otros genes dentro de la región delecionada pueda favorecer la aptitud de las células cancerosas. Sin embargo, también es probable que, entre los genes "pasajeros" que se delecionan junto con los supresores tumorales conocidos, existan aquellos que puedan ser necesarios para las funciones celulares básicas o cuya expresión pueda ser beneficiosa para la célula tumoral específicamente.

Los sellos distintivos del cáncer identifican las capacidades funcionales clave de las células cancerosas y describen la complejidad de los cambios genéticos y fenotípicos en el cáncer [^[14],^[15]]. Además de promover la proliferación y suprimir la muerte, estas características incluyen la reprogramación metabólica, la evasión inmune y el aumento de la invasión y la metástasis, entre otras. Por lo tanto, está claro que se producen un gran número de cambios en la expresión génica durante la progresión tumoral, además de las alteraciones tempranas en la expresión o actividad de los oncogenes y los supresores tumorales. La inestabilidad del genoma y el consiguiente aumento de la aneuploidía están relacionados con la progresión tumoral [^[16],^[17]]. El aumento de la aneuploidía puede promover aún más la tumorigénesis, al provocar la pérdida de heterocigosidad de los supresores tumorales, impulsar la amplificación de oncogenes o alterar otros programas de expresión génica que pueden tener efectos específicos del tipo de cáncer [^[17]].

TGIF1 fue identificado por su capacidad para unirse a un elemento de respuesta retinoide específico y puede reprimir la activación por los receptores de ácido retinoico [^[18]]. TGIF1, y el estrechamente relacionado TGIF2, también son capaces de limitar la respuesta transcripcional a la señalización del factor de crecimiento transformante (TGF) β a través de la interacción con los factores de transcripción SMAD activados por TGFβ [^[19],^[20]]. Dada la función supresora tumoral de la señalización de TGFβ en muchos cánceres sólidos [^[21]], se podría esperar que el aumento de la expresión de TGIFs promueva la tumorigénesis al limitar esta vía. En los conjuntos de datos de expresión génica humana, la expresión tanto de TGIF1 como de TGIF2 aumenta significativamente en el cáncer de colon en comparación con el tejido normal, y su expresión también aumenta en los tumores de colon de ratón [^[22]]. En un modelo de ratón mutante de Apc de cáncer intestinal, TGIFs promueve la tumorigénesis, aunque esto parece ser regulando la expresión génica a través de la unión directa al ADN independiente de la señalización de TGFβ [^[22]]. Se ha implicado la función de TGIF1 en la progresión de tipos de cáncer adicionales. El aumento de la expresión de TGIF1 promueve la proliferación en el cáncer de esófago [^[23],^[24]] y se ha implicado en la promoción del adenocarcinoma de pulmón y el glioma [^[25],^[26]]. En contraste, TGIF1 parece ser supresor tumoral en el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). Se demostró que la pérdida de TGIF1 aumenta la señalización de TGFβ y promueve la EMT a través de un mecanismo que puede implicar cambios tanto en la expresión como en la actividad de TWIST1 [^[27]]. Además, se propuso que la pérdida de TGIF1 promueve la EMT al afectar tanto a la señalización de CD44 como a un punto de control inmunitario PD-L1 en el PDAC [^[28]]. Por lo tanto, TGIF1 puede desempeñar funciones dependientes del contexto que pueden ser tanto supresoras tumorales como pro-tumorogénicas.

A pesar del aumento de la expresión de TGIF1 que se observa en los tumores de colon en comparación con el tejido normal, se ha sugerido que la pérdida de función de TGIF1 puede ser un impulsor del cáncer de colon. Se identificaron mutaciones somáticas en TGIF1 en el cáncer de colon en dos estudios, aunque en ambos los principales efectos sobre el gen TGIF1 fueron la reducción del número de copias y un aumento paradójico de la expresión [^[29],^[30]]. Los cambios aparentemente contradictorios en el número de copias y la expresión génica en el cáncer de colon nos llevaron a examinar más a fondo el papel de TGIF1 en este cáncer. De manera más amplia, esta contradicción nos llevó a preguntarnos si existen genes adicionales que se ajusten a este patrón: presentes en regiones genómicas que están sujetas a una frecuente pérdida del número de copias, pero que se expresan en mayor medida en el cáncer que en el tejido normal. Los genes que se reducen en el número de copias debido a la selección para la pérdida de genes supresores tumorales en la misma región cromosómica pueden ser ellos mismos beneficiosos para el tumor, y su regulación al alza puede contribuir a la progresión tumoral. Esta clase de genes podría, por lo tanto, incluir posibles objetivos terapéuticos para el cáncer.

Partiendo de los datos que respaldan un papel pro-tumorogénico de TGIF1 en el cáncer de colon, a pesar de la reducción observada del número de copias, analizamos conjuntos de datos de cáncer adicionales en busca de regiones cromosómicas con una frecuente reducción del número de copias. Mostramos que una pequeña proporción de genes, generalmente menos del 10%, dentro de estas regiones cromosómicas se expresan en mayor medida en el cáncer que en las muestras normales correspondientes. Este conjunto de genes está enriquecido con genes mitóticos y probablemente contiene otros genes que son importantes para la progresión tumoral. Dado el costo para la célula tumoral de aumentar la expresión de un gen con un número de copias reducido, este conjunto de genes limitado puede representar una selección enriquecida de genes que tienen más probabilidades de ser importantes para la progresión tumoral que la mayoría de los genes que se expresan en mayor medida en un cáncer.

RESULTADOS

Frecuente pérdida del número de copias de TGIF1 en el cáncer colorrectal

Anteriormente demostramos que la deleción de los genes que codifican los factores de transcripción Tgif del epitelio intestinal ralentiza el crecimiento de los adenomas tempranos en ratones con una deleción heterocigótica del gen supresor tumoral Apc [^[22]]. La deleción de Tgif1 solo tuvo algún efecto sobre el tamaño del tumor en el intestino delgado (ID), y la combinación de la deleción de Tgif1 y Tgif2 redujo aún más el crecimiento del tumor en el ID y dio como resultado adenomas más pequeños en el colon. El análisis de cáncer a nivel del genoma (TCGA-PanCan; cBioPortal) muestra un aumento relativamente constante del número de copias de TGIF2 en múltiples tipos de tumores sólidos, siendo la alteración en el cáncer colorrectal (CCR) la segunda más frecuente (Fig. 1A). Esto es consistente con un papel pro-tumorogénico de TGIF2 en el CCR. En contraste, los resultados con TGIF1 fueron más complejos, con la mayoría de los tumores sólidos que mostraban una mezcla de pérdida y ganancia (Fig. 1B). Dos excepciones notables fueron el CCR y los tumores de células germinales testiculares (TCGT), en los que la mayoría de los tumores presentaban una pérdida del número de copias de TGIF1. De hecho, al observar solo la pérdida del número de copias de TGIF1, el CCR fue el segundo tipo de tumor más afectado, con casi el 60% de los cánceres que presentaban la pérdida de una copia del gen (Fig. S1A). Se obtuvieron resultados similares en dos conjuntos de datos de cáncer de colon adicionales, con una coocurrencia de la pérdida de TGIF1 y la ganancia de TGIF2 en los tres conjuntos de datos (Fig. S1B).

A continuación, analizamos la expresión génica relativa en función del número de copias tanto de TGIF1 como de TGIF2, esta vez analizando los cánceres de colon y recto por separado. Como se muestra en la Figura 1C, la expresión de TGIF1 fue mayor en las muestras tumorales que en el tejido normal del colon, independientemente del número de copias, con una diferencia mínima entre las muestras diploides y aquellas que habían perdido o ganado una copia de TGIF1. Al igual que con TGIF1, la expresión de TGIF2 fue significativamente mayor en los tumores que en el tejido normal, pero pareció escalar con el número de copias, de modo que los tumores con un mayor número de copias tenían una expresión significativamente mayor que los normales y las muestras tumorales diploides (Fig. 1D). Se obtuvieron resultados similares para ambos genes en el cáncer de recto (Fig. 1E, F). Dada algunas de las limitaciones de nuestro análisis anterior de la tumorigénesis intestinal, que el modelo de ratón abordó solo los adenomas tempranos, y el impulsor Villin-Cre se expresó principalmente en el intestino delgado, queríamos probar los efectos de TGIF1 y TGIF2 en las células de cáncer de colon humano, que representan una forma más avanzada de cáncer.

La deleción de TGIFs ralentiza la proliferación

Como primera prueba de los efectos de TGIFs en el CCR humano, mutamos TGIF1 y/o TGIF2 utilizando CRISPR/Cas9 en la línea celular de cáncer de colon humano, HCT116. Tras la transfección con un plásmido CRISPR/Cas9 y un fragmento de ADN lineal que contiene un marcador seleccionable flanqueado por brazos de homología cortos, se seleccionaron las colonias resistentes y se examinaron para verificar la integración del marcador de resistencia en un alelo y una inserción/deleción (indel) en el otro. Las indels se verificaron mediante la secuenciación de fragmentos de PCR, y la pérdida de la expresión de la proteína se probó mediante Western blot (ver Fig. 2F, G para un ejemplo). Además de los genes TGIF, también creamos clones de control dirigiendo THUMPD3 y seleccionando solo la integración del marcador seleccionable. Como se muestra en la Fig. 2A, la pérdida homocigótica de TGIF1 o TGIF2 redujo el número de células en un ensayo de crecimiento de cinco días, con una reducción adicional en el número de células en el mutante doble TGIF1;TGIF2. En contraste, las células de control dirigidas no fueron diferentes de la línea parental. Para controlar las diferencias clonales, comparamos cuatro mutantes dobles independientes TGIF1;TGIF2 con cuatro clones de control para el crecimiento durante 7 días y encontramos significativamente menos células en los días 4 y 7 (Fig. 2B) y una reducción de la incorporación de EdU, lo que es consistente con menos células que entran en la fase S (Fig. 2C). El cultivo de células a baja densidad en un ensayo de formación de colonias demostró pequeñas disminuciones en el número de colonias para la mutación de TGIF1 o TGIF2, con una disminución adicional en el mutante doble (Fig. 2D). Se obtuvieron resultados similares con el crecimiento en agar blando (Fig. 2E), aunque la mutación de TGIF1 sola no fue significativa en este ensayo y pareció haber un mayor efecto combinatorio del mutante doble.

Como en el modelo de ratón, los resultados anteriores sugieren un efecto combinado de TGIF1 y TGIF2 sobre la proliferación de las células de cáncer de colon humano. El análisis de ARN y proteínas de tumores de colon de ratón mutantes para Apc y de aquellos que también carecen de ambos genes Tgif identificó posibles genes diana de TGIF [^[22]]. Probamos un pequeño número de estos mediante Western blot en clones de control y mutantes dobles TGIF1:TGIF2, y encontramos una regulación al alza similar de ACSS2, PC (Pcx en ratón), ACAT1 y MLYCD en los mutantes dobles (Fig. 2F). Los aumentos en la expresión se debieron en gran medida a la pérdida combinada de ambos TGIF1 y TGIF2, ya que se observaron efectos más mínimos en cualquiera de los mutantes individuales (Fig. 2G). En conjunto, estos resultados sugieren que la pérdida completa de la expresión de TGIF en una línea celular de cáncer de colon humano tiene efectos similares a la deleción en el epitelio intestinal de ratón.

La reducción de la expresión de TGIF ralentiza el crecimiento tumoral

Para modelar mejor la alteración de la expresión de TGIF1 o TGIF2 en lugar de la pérdida completa, dirigimos TGIF1 o TGIF2 con shRNAs validados (shRNAs lentivirales de Mission). Como se muestra en la Fig. 3A, en tres grupos independientes, la transducción de células HCT116 resultó en una reducción de aproximadamente el 60% en la expresión de TGIF1 y una reducción de aproximadamente el 40% en la expresión de TGIF2 en comparación con las células de control. En un ensayo de crecimiento de cinco días, esto resultó en una pequeña pero significativa reducción en el número de células para la inhibición de la expresión de TGIF1 o TGIF2 (Fig. 3B). Para probar los efectos de la reducción de la expresión de TGIF1 o TGIF2 in vivo, generamos xenoinjertos ortotópicos, inyectando células humanas HCT116 en la pared del ciego. Para comparar directamente las células de control y las células con inhibición de la expresión, utilizamos un enfoque en el que cada tipo de célula se etiquetó de manera diferente para su identificación mediante qPCR, se combinaron y se utilizaron para generar tumores mixtos que comprendían tanto células de control como células con inhibición de la expresión en el ciego de ratones Foxn1 desnudos [^[31]]. En la necropsia, la proporción relativa de cada tipo de célula se determinó mediante qPCR y se normalizó con respecto a la proporción en la mezcla inicial (ver Fig. 3C; [^[32]]).

Primero, comparamos una mezcla de tres grupos de inhibición de la expresión de TGIF1 y tres grupos de control shCtrl, mezclados en proporciones iguales. Después de la recolección y el análisis del tumor, las proporciones relativas de células de control y células con inhibición de la expresión de TGIF1 se determinaron mediante qPCR, y la proporción contribuyente de shCtrl o shTGIF1 se comparó mediante la prueba de rangos con signo de Wilcoxon. Como se muestra en la Figura 3D, de los ocho tumores de ratones que fueron inoculados con una mezcla de células con inhibición de la expresión de TGIF1 y células de control, las células de control dominaron en los ocho, con solo uno acercándose a una mezcla equitativa. Luego, realizamos un experimento similar que comparó tumores con una mezcla de células shCtrl y shTGIF2 y, nuevamente, encontramos que las células shCtrl predominaron, con solo dos de 14 tumores que tenían una mayoría de células shTGIF2 (Fig. 3E). Estos resultados sugieren que la reducción de la expresión de TGIF1 o TGIF2 ralentiza el crecimiento de xenoinjertos ortotópicos de CRC humano, lo que es consistente con nuestros datos in vitro. También observamos metástasis espontáneas en el hígado, que es un sitio primario para la metástasis de CRC en humanos. De los ratones generados con una mezcla de células con inhibición de la expresión de TGIF1 y células de control, aislamos 25 metástasis hepáticas individuales, y hubo un enriquecimiento altamente significativo de células de control en estas metástasis (Fig. 3F). Del grupo shTGIF2, solo encontramos cinco metástasis hepáticas, y aunque las células de control dominaron en las cinco, este no fue un número lo suficientemente grande como para alcanzar la significación (Fig. 3G). La comparación de la proporción de células de control a shTGIF1 en las metástasis con la del tumor primario del mismo ratón sugirió que, en la mayoría de los casos, las metástasis eran similares al tumor primario, con una mayor reducción de las células shTGIF1, aunque ocasionalmente la proporción en un sitio metastásico era muy diferente de la proporción final en el tumor primario (Fig. 3H). En conjunto, estos resultados sugieren que, de manera similar a los efectos observados en los adenomas tempranos en modelos de ratón genéticos, el crecimiento de células de cáncer de colon humano más avanzadas como xenoinjertos se ve afectado al reducir la expresión de TGIF1 o TGIF2.

Un subconjunto de genes del cromosoma 18 se sobreexpresa en tumores de colon

Analizamos los cambios en el número de copias para todos los genes en todo el genoma en conjuntos de datos de cáncer de colon y recto de TCGA. Una gran porción del cromosoma 20 se amplificó con frecuencia en ambos tipos de cáncer, lo que es consistente con el aumento del número de copias y la expresión de TGIF2. En contraste, todo el cromosoma 18 muestra un número de copias reducido en ambos tipos de cáncer (Fig. S2). A continuación, preguntamos si otros genes en el cromosoma 18 que se deleta de forma recurrente también se sobreexpresan en los tumores en comparación con el tejido normal o si esto es específico de TGIF1. Como se muestra en la Figura 4A, un número relativamente pequeño de genes en el cromosoma 18 se expresan a niveles significativamente más altos en los tumores de colon, mientras que la mayoría se reducen. Se observaron resultados similares con el cáncer de recto, aunque hay menos muestras normales en este conjunto de datos, por lo que los valores de significación fueron más bajos (datos no mostrados). Un total de 11 genes mostraron una expresión aumentada (p-adj < 0,0001, log2FC > 1,0) en los tumores de colon en comparación con el tejido normal, y parecían estar dispersos a lo largo del cromosoma 18 (Fig. 4B). La relajación del umbral (p-adj < 0,01, log2FC > 0,4) incluyó 15 genes adicionales, que también abarcan la mayoría del cromosoma 18 en lugar de estar ubicados en un solo grupo.

Análisis multicáncer de la expresión génica y el número reducido de copias

TGIF1 es uno de los pocos genes en el cromosoma 18 con una mayor expresión en el CRC que en el tejido normal, y en los modelos de ratón, TGIF1 promueve la tumorigénesis. Esto nos llevó a preguntar si hay genes en otras regiones del genoma que se delean de forma recurrente y que se sobreexpresan en el cáncer, y si es así, si pertenecen a conjuntos de genes específicos. Para ampliar nuestro análisis de la expresión génica y el número de copias, examinamos los datos de diez conjuntos de datos normalizados de TCGA PanCancer (UCSC Xena) y mapeamos las regiones cromosómicas con un número de copias alterado (Fig. S2). Para cada conjunto de datos, dividimos los genes en uno de tres grupos: número de copias aumentado (CNA promedio > +0,4) o reducido (CNA promedio < -0,4) y cambio mínimo (CNA entre -0,4 y +0,4). Luego, determinamos la proporción de genes dentro de cada grupo que se sobreexpresaron o redujeron significativamente en el tumor en comparación con las muestras normales (log2FC > +1,0 o < -1,0). Hubo una proporción significativamente mayor de genes reducidos que de genes sobreexpresados en las regiones con un cambio mínimo en el número de copias, y esta diferencia se perdió en gran medida en las regiones que se amplificaron (Fig. 4C). Sin embargo, la diferencia más significativa fue entre los genes sobreexpresados y reducidos en las regiones con un número de copias reducido, con relativamente pocos que se sobreexpresaron en comparación con el tejido normal. Esto es consistente con la idea de que hay un costo para la célula al aumentar la expresión génica, y que esto puede ser particularmente evidente para los genes con un número de copias reducido. Por lo tanto, los genes con un número de copias reducido que se sobreexpresan en el cáncer pueden sobreexpresarse porque son importantes para la progresión del tumor o la supervivencia celular.

Para identificar los genes que están presentes en regiones más grandes con un número de copias reducido, pero que se sobreexpresan en el tumor en comparación con el tejido normal, se incluyeron como selección inicial las regiones con un CNA promedio de < -0,4 que contienen al menos 100 genes (expresados en el tipo de cáncer o tejido normal relevante) (Fig. S2, S3A). Nuestro razonamiento fue que si hay una selección para la reducción del número de copias, presumiblemente debido a la presencia de genes con función supresora de tumores, las pequeñas deleciones con muy pocos genes adicionales es poco probable que sean informativas para este análisis. También incluimos algunas regiones eliminadas más pequeñas de otros cánceres, siempre que alcanzaran el umbral de CNA y se superpusieran con una de las regiones más grandes identificadas en otro tipo de cáncer. Por ejemplo, se incluyó una región de 67 genes en STAD ya que se superponía con una región de 114 genes de LUSC en el cromosoma 21 (Fig. S3A). Este análisis identificó 47 regiones con un número de copias reducido en 16 cromosomas, con al menos dos regiones por tipo de cáncer en nueve de los diez cánceres analizados (Fig. 4D, S3A). A continuación, identificamos todos los genes con una mayor expresión en el tumor que en el tejido normal (p-adj < 0,0001, log2FC > 1,0) en las 47 regiones. Para la mayoría de estas regiones, menos del 10% de los genes mostraron una expresión aumentada en el tumor versus el tejido normal en este umbral (Fig. S3B). Dado que la mayoría de las regiones con un número de copias reducido se compartieron entre al menos dos cánceres en este conjunto, comparamos los genes sobreexpresados entre los cánceres. Como se muestra en la Figura 6C, la mayoría de los genes con una expresión aumentada eran únicos de un cáncer. Esto fue cierto, incluso en casos como las regiones en los cromosomas 8 y 17 (número de copias reducido en 7 cánceres cada uno), donde más de la mitad de los genes sobreexpresados eran únicos de un solo tipo de cáncer (Fig. 4E, Fig. 5A, C). En el umbral más estricto, no se compartieron genes sobreexpresados entre los siete cánceres para las regiones de los cromosomas 8 y 17 (Fig. 5A-D). La relajación del cambio de pliegue a > 0,4 (log2FC) y el valor de p ajustado a < 0,01 aumentó el número de genes en aproximadamente dos veces, pero no aumentó significativamente el número de genes compartidos entre múltiples cánceres (Fig. 5E, F). También comparamos las regiones en los cromosomas 5 y 10 que se compartieron entre solo dos cánceres cada uno, pero que contenían un número relativamente grande de genes sobreexpresados. Una fracción significativa de los genes presentes en la región con un número de copias reducido en el cromosoma 5 se sobreexpresaron tanto en BLCA como en LUSC (Fig. 5G). En contraste, la superposición en el cromosoma 10 entre GBM y LUSC fue bastante mínima (Fig. 5H). Ampliamos este análisis utilizando el umbral de expresión menos estricto para todas las combinaciones por pares donde se sobreexpresaron al menos 15 genes (log2FC > 0,4, p-adj < 0,01) en ambos tipos de cáncer. La mayoría de estas comparaciones por pares no revelaron una superposición significativa (Fig. S4) o tenían muy pocos genes que se sobreexpresaron dentro de la región con un número de copias reducido para alcanzar la significación. En el cromosoma 8, solo LUAD y LUSC tenían una superposición significativa entre los genes sobreexpresados, al igual que este par para las regiones en los cromosomas 3, 13 y 17. La otra excepción notable fue la similitud entre COAD y READ para los genes en la región del cromosoma 17 (Fig. S4B). Por lo tanto, aunque hay algunos genes sobreexpresados de forma recurrente dentro de estas regiones con un número de copias reducido, parece que en general, este no es el caso para la mayoría de los genes dentro de estas regiones.

Los genes sobreexpresados en las regiones comúnmente eliminadas están enriquecidos para la función mitótica

A continuación, investigamos qué clases de genes se sobreexpresan en las regiones con reducción del número de copias. Al igual que con los genes del cromosoma 18 de COAD (ver Fig. 4B), los genes sobreexpresados en otras regiones cromosómicas con un número reducido de copias no parecían agruparse según su ubicación cromosómica (Fig. S5). Posibles interpretaciones de esto incluyen que los genes sobreexpresados son indicativos de funciones esenciales comunes o representan el resultado de programas transcripcionales específicos relevantes para el cáncer. Alternativamente, también es posible que esto simplemente represente ruido en los programas de expresión génica de estos tipos de cáncer. Para comenzar a abordar esto, comparamos los genes en algunas de las regiones más grandes con un número reducido de copias con la lista de genes esenciales comunes de DepMap [^[33]]. Primero, dividimos los genes dentro de cada región en cuatro grupos: mayor o menor expresión en el tumor que en el tejido normal, subdivididos por si son comunes y esenciales o no, y luego comparamos la diferencia de expresión (log2FC) entre el tumor y el tejido normal entre los cuatro grupos, con la expectativa de que, entre los genes sobreexpresados, los genes comunes y esenciales estén más sobreexpresados. En contraste, observamos que no hay una diferencia estadística en la expresión entre el tumor y el tejido normal entre los genes comunes y esenciales sobreexpresados y el resto de los genes sobreexpresados (rojo y naranja; Fig. 6A-D). De hecho, aunque no es significativo, la tendencia fue algo en la dirección opuesta. Para los genes con menor expresión en el tumor que en el tejido normal, hubo una reducción significativamente menor en la expresión de los genes comunes y esenciales en comparación con el resto de los genes con expresión reducida (Fig. 6A-D). La representación gráfica de la posición de los genes comunes y esenciales a lo largo del continuo de cambio de expresión, desde los más sobreexpresados en el tumor hasta los más subexpresados, respaldó la idea de que los genes comunes y esenciales dentro de estas regiones no eran aquellos que cambian más entre el tumor y el tejido normal (Fig. 6E-H).

Dado que este análisis sugiere que los genes sobreexpresados no se clasifican predominantemente como genes comunes y esenciales, realizamos a continuación un análisis de enriquecimiento en la lista de 435 genes que se sobreexpresaron (p-adj < 0,0001, log2FC > 1,0) en al menos un tipo de cáncer. El análisis de términos GO reveló un enriquecimiento significativo para la mitosis y el ciclo celular (proceso biológico GO) y para el huso mitótico (componente celular GO) como los resultados más destacados (Fig. 7A). Las vías de Reactome también se enriquecieron significativamente para el ciclo celular y la mitosis. La clase más enriquecida de los datos de secuenciación de ChIP de factores de transcripción de ENCODE fue FOXM1, un factor de transcripción clave para impulsar la expresión de los genes mitóticos (Fig. 7A) [^[34]]. Para examinar más a fondo la relación entre el cambio en el número de copias y la expresión, comparamos la diferencia media de expresión (log2) (tumor versus normal) entre los genes con pérdida, ganancia o ningún cambio en el número de copias (CNA > -0,4 y < 0,4). Para este análisis, excluimos PRAD y STAD, ya que pocos genes se vieron afectados por las alteraciones en el número de copias. Como se muestra en la Fig. 7B, la diferencia media de expresión entre el tumor y el tejido normal se correlacionó con el número de copias: la diferencia de expresión (log2) fue significativamente menor con la pérdida del número de copias que para los genes con ganancia del número de copias. Curiosamente, al comparar los genes comunes y esenciales de DepMap, se observó una tendencia similar, pero en los tres grupos, la diferencia de expresión (log2) entre el tumor y el tejido normal fue mayor, de modo que, incluso con un número reducido de copias, la expresión génica media no disminuyó en los tumores (Fig. 7B). En contraste con los resultados con los genes comunes y esenciales, los genes mitóticos se expresaron más en el tumor que en el tejido normal, independientemente del cambio en el número de copias (Fig. 7C). Sorprendentemente, otros conjuntos de genes relacionados con el cáncer, incluidos los genes de la fase S y los genes de reparación del ADN, no mostraron la misma independencia del número de copias en el cambio de la expresión génica (Fig. 7D-F y Fig. S6). En conjunto, estos datos sugieren que, en muchas regiones cromosómicas con un número reducido de copias en múltiples tipos de tumores sólidos, existe un enriquecimiento para la sobreexpresión de los genes mitóticos a pesar de la reducción del número de copias.

Pérdida frecuente del número de copias de TGIF1 en el cáncer colorrectal

Anteriormente demostramos que la deleción de los genes que codifican los factores de transcripción Tgif del epitelio intestinal ralentiza el crecimiento de los adenomas tempranos en ratones con una deleción heterocigota del gen supresor de tumores Apc [^[22]]. La deleción de Tgif1 por sí sola tuvo algún efecto en el tamaño del tumor en el intestino delgado (ID), y la combinación de la deleción de Tgif1 y Tgif2 redujo aún más el crecimiento del tumor en el ID y resultó en adenomas más pequeños en el colon. El análisis pan-cáncer de las alteraciones en el número de copias (TCGA-PanCan; cBioPortal) muestra una ganancia relativamente consistente en el número de copias de TGIF2 en múltiples tipos de tumores sólidos, siendo la alteración en el cáncer colorrectal (CCR) la segunda más frecuente (Fig. 1A). Esto es consistente con un papel pro-tumorogénico de TGIF2 en el CCR. En contraste, los resultados con TGIF1 fueron más complejos, con la mayoría de los tumores sólidos que mostraban una mezcla de pérdida y ganancia (Fig. 1B). Dos excepciones notables fueron el CCR y los tumores de células germinales testiculares (TCGT), en los que la mayoría de los tumores presentaban una pérdida del número de copias de TGIF1. De hecho, al observar solo la pérdida del número de copias de TGIF1, el CCR fue el segundo tipo de tumor más afectado, con casi el 60% de los cánceres que presentaban la pérdida de una copia del gen (Fig. S1A). Se obtuvieron resultados similares en dos conjuntos de datos adicionales de cáncer de colon, con una co-ocurrencia de la pérdida de TGIF1 y la ganancia de TGIF2 en los tres conjuntos de datos (Fig. S1B).

A continuación, analizamos la expresión génica relativa en función del número de copias tanto para TGIF1 como para TGIF2, esta vez analizando los cánceres de colon y recto por separado. Como se muestra en la Figura 1C, la expresión de TGIF1 fue mayor en las muestras de tumor que en el tejido normal del colon, independientemente del número de copias, con una diferencia mínima entre las muestras diploides y aquellas que habían perdido o ganado una copia de TGIF1. Al igual que con TGIF1, la expresión de TGIF2 fue significativamente mayor en los tumores que en el tejido normal, pero pareció ajustarse al número de copias, de modo que los tumores con un número aumentado de copias tenían una expresión significativamente mayor que tanto los tejidos normales como las muestras de tumor diploides (Fig. 1D). Se observaron resultados similares para ambos genes en el cáncer de recto (Fig. 1E, F). Dado algunas de las limitaciones de nuestro análisis previo de la tumorigénesis intestinal (que el modelo de ratón abordó solo los adenomas tempranos, y el impulsor Villin-Cre se expresó principalmente en el intestino delgado), queríamos probar los efectos de TGIF1 y TGIF2 en las células de cáncer de colon humano, que representan una forma más avanzada de cáncer.

La deleción de TGIFs ralentiza la proliferación

Como primera prueba de los efectos de TGIFs en el CCR humano, mutamos TGIF1 y/o TGIF2 utilizando CRISPR/Cas9 en la línea celular de cáncer de colon humano, HCT116. Después de la transfección con un plásmido CRISPR/Cas9 y un fragmento de ADN lineal que contiene un marcador seleccionable flanqueado por brazos de homología cortos, se seleccionaron las colonias resistentes y se examinaron para verificar la integración del marcador de resistencia en un alelo y un indel en el otro. Los indels se verificaron mediante la secuenciación de fragmentos de PCR, y la pérdida de la expresión de la proteína se probó mediante Western blot (ver Fig. 2F, G para un ejemplo). Además de los genes TGIF, también creamos clones de control al dirigir THUMPD3 y seleccionamos solo para la integración del marcador seleccionable. Como se muestra en la Fig. 2A, la pérdida homocigota de TGIF1 o TGIF2 redujo el número de células en un ensayo de crecimiento de cinco días, con una reducción adicional en el número de células en el mutante doble TGIF1; TGIF2. En contraste, las células objetivo de control no fueron diferentes de la línea parental. Para controlar las diferencias clonales, comparamos cuatro mutantes dobles independientes TGIF1; TGIF2 con cuatro clones de control para el crecimiento durante 7 días y encontramos significativamente menos células en los días 4 y 7 (Fig. 2B) y una reducción en la incorporación de EdU, lo que es consistente con menos células que entran en la fase S (Fig. 2C). La siembra de células a baja densidad en un ensayo clonogénico demostró pequeñas disminuciones en el número de colonias para la mutación de TGIF1 o TGIF2, con una disminución adicional en el mutante doble (Fig. 2D). Se obtuvieron resultados similares con el crecimiento en agar blando (Fig. 2E), aunque la mutación de TGIF1 por sí sola no fue significativa en este ensayo y parecía haber un mayor efecto combinatorio del mutante doble.

Como en el modelo de ratón, los resultados anteriores sugieren un efecto combinado de TGIF1 y TGIF2 en la proliferación de las células de cáncer de colon humano. El análisis de ARN y proteínas de los tumores de colon mutantes de Apc y de aquellos que también carecen de ambos genes Tgif identificó posibles genes diana de TGIF [^[22]]. Probamos un pequeño número de estos mediante Western blot en clones de control y mutantes dobles TGIF1: TGIF2, y encontramos una regulación al alza similar de ACSS2, PC (Pcx en ratón), ACAT1 y MLYCD en los mutantes dobles (Fig. 2F). Los aumentos en la expresión se debieron en gran medida a la pérdida combinada de ambos TGIF1 y TGIF2, ya que se observaron efectos mínimos en cualquiera de los mutantes individuales (Fig. 2G). En conjunto, estos resultados sugieren que la pérdida completa de la expresión de TGIFs de una línea celular de cáncer de colon humano tiene efectos similares a la deleción del epitelio intestinal del ratón.

La reducción de la expresión de TGIF ralentiza el crecimiento tumoral

Para modelar mejor la alteración de la expresión de TGIF1 o TGIF2 en lugar de la pérdida completa, dirigimos TGIF1 o TGIF2 con shRNAs validados (shRNAs lentivirales de Mission). Como se muestra en la Fig. 3A, en tres grupos independientes, la transducción de células HCT116 resultó en una reducción de aproximadamente el 60% en la expresión de TGIF1 y una reducción de aproximadamente el 40% en la expresión de TGIF2 en comparación con las células de control. En un ensayo de crecimiento de cinco días, esto resultó en una pequeña pero significativa reducción en el número de células para la reducción de la expresión de TGIF1 o TGIF2 (Fig. 3B). Para probar los efectos de la reducción de la expresión de TGIF1 o TGIF2 in vivo, generamos xenoinjertos ortotópicos, inyectando células humanas HCT116 en la pared del ciego. Para comparar directamente las células de control y las células con reducción de la expresión, utilizamos un enfoque en el que cada tipo de célula se etiquetó de manera diferente para la identificación mediante qPCR, se combinaron y se utilizaron para generar tumores mixtos compuestos por células de control y células con reducción de la expresión en el ciego de ratones Foxn1 desnudos [^[31]]. En la necropsia, la proporción relativa de cada tipo de célula se determinó mediante qPCR y se normalizó con respecto a la proporción en la mezcla inicial (ver Fig. 3C; [^[32]]).

Primero, comparamos una mezcla de tres grupos de células con la expresión de TGIF1 reducida y tres grupos de células control (shCtrl), mezclados en proporciones iguales. Tras la extracción y el análisis de los tumores, se determinaron las proporciones relativas de las células control y las células con la expresión de TGIF1 reducida mediante qPCR, y se comparó la proporción aportada por cada grupo (shCtrl o shTGIF1) mediante la prueba de rangos con signo de Wilcoxon. Como se muestra en la Figura 3D, de los ocho tumores de ratones que fueron inoculados con una mezcla de células con la expresión de TGIF1 reducida y células control, las células control predominaron en los ocho, y solo en uno de ellos la mezcla fue casi equitativa. A continuación, realizamos un experimento similar comparando tumores con una mezcla de células shCtrl y shTGIF2, y nuevamente encontramos que las células shCtrl predominaron, con solo dos de los 14 tumores que presentaban una mayoría de células shTGIF2 (Fig. 3E). Estos resultados sugieren que la reducción de la expresión de TGIF1 o TGIF2 ralentiza el crecimiento de xenoinjertos de CRC ortotópicos humanos, lo que coincide con nuestros datos in vitro. También observamos metástasis espontáneas en el hígado, que es un sitio primario de metástasis de CRC en humanos. De los ratones generados con una mezcla de células con la expresión de TGIF1 reducida y células control, aislamos 25 metástasis hepáticas individuales, y se observó un enriquecimiento altamente significativo de células control en estas metástasis (Fig. 3F). Del grupo mixto shTGIF2, solo encontramos cinco metástasis hepáticas, y aunque las células control predominaron en las cinco, este número no fue lo suficientemente grande como para alcanzar la significación estadística (Fig. 3G). Comparar la proporción de células control con respecto a las células shTGIF1 en las metástasis con la proporción en el tumor primario del mismo ratón sugirió que, en la mayoría de los casos, las metástasis eran similares al tumor primario, con una reducción adicional de las células shTGIF1, aunque ocasionalmente la proporción en un sitio metastásico era muy diferente de la proporción final en el tumor primario (Fig. 3H). En conjunto, estos resultados sugieren que, de manera similar a los efectos observados en los adenomas tempranos en modelos de ratón genéticos, el crecimiento de células de cáncer de colon humano más avanzadas como xenoinjertos se ve afectado al reducir la expresión de TGIF1 o TGIF2.

Un subconjunto de genes del cromosoma 18 se sobreexpresa en tumores de colon

Analizamos los cambios en el número de copias de todos los genes en el genoma en conjuntos de datos de cáncer de colon y recto de TCGA. Una gran parte del cromosoma 20 se amplificó con frecuencia en ambos tipos de cáncer, lo que coincide con el aumento del número de copias y la mayor expresión de TGIF2. En contraste, todo el cromosoma 18 muestra un número de copias reducido en ambos tipos de cáncer (Fig. S2). A continuación, investigamos si otros genes en el cromosoma 18, que se deleta de forma recurrente, también se sobreexpresan en los tumores en comparación con el tejido normal, o si esto es específico de TGIF1. Como se muestra en la Figura 4A, un número relativamente pequeño de genes en el cromosoma 18 se expresan a niveles significativamente más altos en los tumores de colon, mientras que la mayoría se expresan a niveles más bajos. Se observaron resultados similares en el cáncer de recto, aunque hay menos muestras normales en este conjunto de datos, por lo que los valores de significación fueron más bajos (datos no mostrados). Un total de 11 genes mostraron una mayor expresión (p-adj < 0,0001, log2FC > 1,0) en los tumores de colon en comparación con el tejido normal, y parecían estar dispersos a lo largo del cromosoma 18 (Fig. 4B). Relajar el umbral (p-adj < 0,01, log2FC > 0,4) incluyó 15 genes adicionales, que también abarcan la mayor parte del cromosoma 18 en lugar de estar ubicados en un solo grupo.

Análisis multicáncer de la expresión génica y el número reducido de copias

TGIF1 es uno de los pocos genes en el cromosoma 18 que tiene una mayor expresión en el CRC que en el tejido normal, y en modelos de ratón, TGIF1 promueve la tumorigénesis. Esto nos llevó a preguntarnos si existen genes en otras regiones del genoma que se delean de forma recurrente y que están sobreexpresados en el cáncer, y si es así, si pertenecen a conjuntos de genes específicos. Para ampliar nuestro análisis de la expresión génica y el número de copias, examinamos los datos de diez conjuntos de datos normalizados de TCGA PanCancer (UCSC Xena) y mapeamos las regiones cromosómicas con un número de copias alterado (Fig. S2). Para cada conjunto de datos, dividimos los genes en uno de tres grupos: número de copias aumentado (CNA promedio > +0,4) o reducido (CNA promedio < -0,4), y cambio mínimo (CNA entre -0,4 y +0,4). Luego, determinamos la proporción de genes dentro de cada grupo que estaban significativamente sobreexpresados o subexpresados en el tumor en comparación con las muestras normales (log2FC > +1,0 o < -1,0). Hubo una proporción significativamente mayor de genes subexpresados que de genes sobreexpresados en las regiones con un cambio mínimo en el número de copias, y esta diferencia se perdió en gran medida en las regiones que se amplifican (Fig. 4C). Sin embargo, la diferencia más significativa fue entre los genes sobreexpresados y subexpresados en las regiones con un número de copias reducido, con relativamente pocos genes sobreexpresados en comparación con el tejido normal. Esto coincide con la idea de que hay un costo para la célula al aumentar la expresión génica, y que esto puede ser particularmente evidente para los genes con un número de copias reducido. Por lo tanto, los genes con un número de copias reducido que se sobreexpresan en el cáncer pueden estar sobreexpresados porque son importantes para la progresión del tumor o la supervivencia celular.

Para identificar los genes que están presentes en regiones más grandes con un número de copias reducido, pero que están sobreexpresados en el tumor en comparación con el tejido normal, se incluyeron como selección inicial las regiones con un CNA promedio de < -0,4 que contienen al menos 100 genes (expresados en el tipo de cáncer o tejido normal relevante) (Fig. S2, S3A). Nuestro razonamiento fue que si hay una selección para la reducción del número de copias, presumiblemente debido a la presencia de genes con función supresora de tumores, las pequeñas deleciones con muy pocos genes adicionales probablemente no sean informativas para este análisis. También incluimos algunas regiones eliminadas más pequeñas de otros cánceres, siempre que alcanzaran el umbral de CNA y se superpusieran con una de las regiones más grandes identificadas en otro tipo de cáncer. Por ejemplo, se incluyó una región de 67 genes en STAD ya que se superponía con una región de 114 genes de LUSC en el cromosoma 21 (Fig. S3A). Este análisis identificó 47 regiones con un número de copias reducido en 16 cromosomas, con al menos dos regiones por tipo de cáncer en nueve de los diez cánceres analizados (Fig. 4D, S3A). A continuación, identificamos todos los genes con una mayor expresión en el tumor que en el tejido normal (p-adj < 0,0001, log2FC > 1,0) en las 47 regiones. Para la mayoría de estas regiones, menos del 10% de los genes mostraron una mayor expresión en el tumor versus el tejido normal en este umbral (Fig. S3B). Dado que la mayoría de las regiones con un número de copias reducido se compartían entre al menos dos cánceres en este conjunto, comparamos los genes sobreexpresados entre los cánceres. Como se muestra en la Figura 6C, la mayoría de los genes con una mayor expresión eran únicos de un cáncer. Esto fue cierto, incluso en casos como las regiones en los cromosomas 8 y 17 (número de copias reducido en 7 cánceres cada uno), donde más de la mitad de los genes sobreexpresados eran únicos de un solo tipo de cáncer (Fig. 4E, Fig. 5A, C). En el umbral más estricto, no se compartieron genes sobreexpresados entre los siete cánceres para las regiones de los cromosomas 8 y 17 (Fig. 5A–D). Relajar el cambio de pliegue a > 0,4 (log2FC) y el valor de p ajustado a < 0,01 aumentó el número de genes en aproximadamente dos veces, pero no aumentó significativamente el número de genes compartidos entre múltiples cánceres (Fig. 5E, F). También comparamos las regiones en los cromosomas 5 y 10 que se compartían entre solo dos cánceres cada uno, pero que contenían un número relativamente grande de genes sobreexpresados. Una fracción significativa de los genes presentes en la región con un número de copias reducido en el cromosoma 5 se sobreexpresaron tanto en BLCA como en LUSC (Fig. 5G). En contraste, la superposición en el cromosoma 10 entre GBM y LUSC fue bastante mínima (Fig. 5H). Ampliamos este análisis utilizando el umbral de expresión menos estricto para todas las combinaciones por pares donde se sobreexpresaron al menos 15 genes (log2FC > 0,4, p-adj < 0,01) en ambos tipos de cáncer. La mayoría de estas comparaciones por pares no revelaron una superposición significativa (Fig. S4) o tenían muy pocos genes que se sobreexpresaron dentro de la región con un número de copias reducido para alcanzar la significación. En el cromosoma 8, solo LUAD y LUSC tenían una superposición significativa entre los genes sobreexpresados, al igual que este par para las regiones en los cromosomas 3, 13 y 17. La otra excepción notable fue la similitud entre COAD y READ para los genes en la región del cromosoma 17 (Fig. S4B). Por lo tanto, si bien existen algunos genes sobreexpresados de forma recurrente dentro de estas regiones con un número de copias reducido, parece que en general, este no es el caso para la mayoría de los genes dentro de estas regiones.

Los genes sobreexpresados en las regiones comúnmente eliminadas están enriquecidos para la función mitótica

A continuación, investigamos qué clases de genes se sobreexpresan en las regiones con un número de copias reducido. Al igual que los genes en el cromosoma 18 de COAD (ver Fig. 4B), los genes sobreexpresados en otras regiones cromosómicas con un número de copias reducido no parecían agruparse según la ubicación cromosómica (Fig. S5). Posibles interpretaciones de esto incluyen que los genes sobreexpresados son indicativos de funciones esenciales comunes o representan la salida de programas transcripcionales específicos relevantes para el cáncer. Alternativamente, también es posible que esto simplemente represente ruido en los programas de expresión génica de estos tipos de cáncer. Para comenzar a abordar esto, comparamos los genes en algunas de las regiones más grandes con un número de copias reducido con la lista de genes esenciales comunes de DepMap [^[33]]. Primero, dividimos los genes dentro de cada región en cuatro grupos: mayor o menor expresión en el tumor que en el tejido normal, subdivididos en esenciales comunes o no, y luego comparamos el cambio log2FC de tumor versus normal entre los cuatro grupos, con la expectativa de que, entre los genes sobreexpresados, los genes esenciales comunes se sobreexpresaran más. En contraste, no observamos ninguna diferencia estadística en la expresión de tumor versus normal entre los genes esenciales comunes sobreexpresados y el resto de los genes sobreexpresados (rojo y naranja; Fig. 6A–D). De hecho, aunque no fue significativo, la tendencia fue algo en la dirección opuesta. Para los genes con menor expresión en el tumor que en el tejido normal, hubo una reducción significativamente menor en la expresión de los genes esenciales comunes en comparación con el resto de los genes subexpresados (Fig. 6A–D). Trazar la posición de los genes esenciales comunes a lo largo del continuo de cambio de expresión, desde los más sobreexpresados en el tumor hasta los más subexpresados, respaldó la idea de que los genes esenciales comunes dentro de estas regiones no eran los que más cambiaban entre el tumor y el tejido normal (Fig. 6E–H).

Dado que este análisis sugiere que los genes con expresión aumentada no se clasifican predominantemente como genes esenciales comunes, realizamos a continuación un análisis de enriquecimiento en la lista de 435 genes que presentaban una expresión aumentada (p-adj < 0,0001, log2FC > 1,0) en al menos un tipo de cáncer. El análisis de términos GO reveló un enriquecimiento significativo para la mitosis y el ciclo celular (proceso biológico GO) y para el huso mitótico (componente celular GO) como los resultados más destacados (Fig. 7A). Las vías de Reactome también se enriquecieron significativamente para el ciclo celular y la mitosis. La clase más enriquecida de los datos de ChIP-seq de factores de transcripción de ENCODE fue FOXM1, un factor de transcripción clave para impulsar la expresión de los genes mitóticos (Fig. 7A) [^[34]]. Para examinar más a fondo la relación entre el cambio en el número de copias y la expresión, comparamos el cambio medio en log2 (tumor frente a normal) entre los genes con pérdida, ganancia o sin cambio en el número de copias (CNA > -0,4 y < 0,4). Para este análisis, excluimos PRAD y STAD, ya que un número reducido de genes se vio afectado por las alteraciones en el número de copias. Como se muestra en la Fig. 7B, la expresión diferencial media entre el tumor y el tejido normal se correlacionó con el número de copias; el cambio en log2 fue significativamente menor en los genes con pérdida del número de copias que en los genes con ganancia del número de copias. Curiosamente, al comparar los genes esenciales comunes de DepMap, se observó una tendencia similar, pero en los tres grupos, la diferencia en log2 entre el tumor y el tejido normal fue mayor, de modo que, incluso con un número de copias reducido, la expresión génica media no disminuyó en los tumores (Fig. 7B). En contraste con los resultados obtenidos con los genes esenciales comunes, los genes mitóticos se expresaron en mayor medida en el tumor que en el tejido normal, independientemente del cambio en el número de copias (Fig. 7C). Sorprendentemente, otros conjuntos de genes relacionados con el cáncer, incluidos los genes de la fase S y los genes de reparación del ADN, no mostraron la misma independencia del número de copias en el cambio de la expresión génica (Fig. 7D-F y Fig. S6). En conjunto, estos datos sugieren que, en muchas regiones cromosómicas con un número de copias reducido en múltiples tipos de tumores sólidos, existe un enriquecimiento para la sobreexpresión de los genes mitóticos a pesar de la reducción del número de copias.

DISCUSIÓN

Anteriormente, demostramos que la eliminación de Tgif1 solo o de Tgif1 y Tgif2 juntos redujo el número de adenomas más grandes en un modelo de ratón en el que las lesiones se inician por la pérdida del supresor tumoral Apc [^[22]]. Sin embargo, este modelo es limitado, ya que las lesiones no progresan más allá de los adenomas iniciales. Además, debido al promotor de Cre, este modelo da como resultado principalmente un gran número de adenomas en el intestino delgado, con relativamente pocos tumores de colon [^[22],^[35]]. Aunque TGIF1 y TGIF2 se sobreexpresan a nivel de ARN en los cánceres de colon humanos, su función en las líneas celulares o xenoinjertos de cáncer de colon humanos no se ha abordado.

Coherente con el aumento de la expresión de TGIF2 en el CRC humano en comparación con el colon normal, el gen de TGIF2 en el cromosoma 17 está sujeto a una ganancia en el número de copias en la mayoría de los tumores de colon y recto. En contraste, TGIF1 se encuentra en el cromosoma 18, que tiene un número de copias reducido en más de la mitad de los cánceres de colon y recto humanos. A pesar del número de copias reducido, la expresión de TGIF1 es paradójicamente mayor en el cáncer que en el tejido normal cuando se analizan todos los tumores independientemente del número de copias, así como cuando se comparan solo los cánceres con un número de copias reducido con las muestras normales. Esto sugiere que existen mecanismos específicos para aumentar la expresión de TGIF1 en el cáncer de colon que pueden compensar la reducción del número de copias.

La reducción del número de copias de TGIF1 que se observa en el CRC es principalmente el resultado de la pérdida de una sola copia de todo el cromosoma 18. Es probable que esto se seleccione en el cáncer debido a la pérdida de genes supresores tumorales como SMAD4, que se identificó originalmente como un supresor tumoral en el cáncer de páncreas (DPC4; [^[36]]). SMAD4 es un mediador esencial de la señalización TGFβ/SMAD, que es supresora de tumores en varios tipos de cáncer, incluido el cáncer de colon [^[21],^[37]], y la inactivación de la señalización TGFβ es uno de los pasos posteriores en la progresión del cáncer de colon [^[13],^[38]]. Además, SMAD2, que coopera con SMAD4 para transducir las señales de TGFβ, se encuentra en el cromosoma 18. El gen supresor tumoral DCC (Deleted in Colon Cancer) también se encuentra en el cromosoma 18, y la pérdida tanto de DCC como de SMAD4 puede contribuir a la progresión del cáncer de colon [^[12]]. La reducción del número de copias de TGIF1 es probablemente una consecuencia de la selección para la pérdida de los supresores tumorales del cromosoma 18; sin embargo, las células cancerosas aumentan su expresión. Previamente demostramos que el aumento de la expresión de TGIF1 en el epitelio intestinal dio como resultado adenomas más grandes, al menos en el intestino delgado [^[22]]. En apoyo adicional de esto, mostramos que la reducción (en contraste con la pérdida completa en el modelo de ratón Apc) de la expresión de TGIF1 o TGIF2 en una línea celular de cáncer de colon humano da como resultado una modesta disminución de la proliferación in vitro y una reducción significativa del crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto ortotópico. Es importante destacar que hay una reducción en la fracción de células con TGIF1 silenciado tanto en los tumores cecales primarios como en las metástasis hepáticas espontáneas, lo que indica que una mayor expresión de TGIF1 contribuye al crecimiento tumoral. Curiosamente, se han identificado mutaciones puntuales de TGIF1 en análisis a gran escala del genoma del cáncer de colon, con la sugerencia de que estos análisis identifican mutaciones en genes impulsores [^[29],^[30]]. Sin embargo, las mutaciones de TGIF1, algunas de las cuales pueden ser de pérdida de función, no se han validado funcionalmente y son relativamente raras. En este contexto, vale la pena señalar que en análisis previos que examinaron variantes con sentido en TGIF1 en pacientes con holoprosencefalia, también identificamos cerca de la mitad de ellas en la base de datos gnomAD de individuos no afectados [^[39],^[40]]. Por lo tanto, si bien no podemos descartar un papel pro-tumorigénico de las mutaciones de pérdida de función de TGIF1, en un subconjunto de individuos o en una etapa específica del cáncer, parece que es principalmente el aumento de la expresión de TGIF1 lo que contribuye al cáncer de colon. De hecho, las principales alteraciones en TGIF1 en el cáncer de colon son la reducción del número de copias y el aumento de la expresión [^[30]].

En general, nuestro análisis apoya un modelo en el que el aumento de la expresión de TGIF1 contribuye al crecimiento tumoral, a pesar del número de copias reducido que se observa en la mayoría de los tumores de colon y recto. Esto nos llevó a preguntarnos si otros genes en las regiones cromosómicas con reducciones recurrentes del número de copias se expresan a niveles más altos en los tumores que en el tejido normal. La razón es que es probable que haya un costo para la célula cancerosa al aumentar la expresión de los genes por encima de la que existe en el tejido normal, especialmente si esos genes están presentes con un número de copias reducido. Coherente con esto, encontramos que más genes en las regiones con un número de copias reducido se reducen en el cáncer que los que se aumentan, mientras que esta diferencia no se observa en las regiones amplificadas.

Existen varias explicaciones posibles de por qué los genes en las regiones con un número de copias reducido podrían expresarse a un nivel más alto en los tumores que en el tejido normal. Una posibilidad trivial es que esto represente ruido en los datos, posiblemente debido a múltiples tipos de células presentes en las muestras. Alternativamente, la pequeña fracción de genes que se expresan más podría ser un subconjunto de genes que no están sujetos a un estricto control transcripcional en los tumores, por lo que la expresión fluctúa de forma estocástica, y algunos cumplen con nuestros criterios arbitrarios. Aunque excluimos los genes con una expresión muy baja, esta explicación puede aplicarse al extremo inferior del rango de expresión que incluimos. Sin embargo, también es posible que, al menos para algunos de estos genes, la mayor expresión esté impulsada por la biología de los tumores y la función de estos productos génicos. Nuestro análisis de TGIF1, como ejemplo, apoya la idea de que el aumento de la expresión de al menos algunos de estos genes puede contribuir a la tumorigénesis. En términos más generales, se podría esperar que los genes que codifican funciones esenciales tengan una mayor expresión independientemente de su número de copias. Nuestra comparación de los genes con una mayor expresión con la lista de genes esenciales comunes de DepMap contradice esto, ya que los genes esenciales comunes no parecen estar enriquecidos entre los genes más sobreexpresados dentro de las regiones con un número de copias reducido. Los genes esenciales comunes generalmente se sobreexpresan en el cáncer en comparación con el tejido normal, pero como grupo, su expresión relativa parece escalar con el número de copias. Sin embargo, el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes sugiere que existe un enriquecimiento significativo para los genes mitóticos entre los genes con una mayor expresión en el tumor en comparación con el tejido normal en los diez cánceres analizados. Las categorías más enriquecidas incluyen funciones relacionadas con la organización de los microtúbulos, la separación de las cromátidas hermanas y el huso mitótico, así como el ciclo celular en general. Coherente con esto, el factor de transcripción de ENCODE más enriquecido es FOXM1, que es un impulsor clave de la expresión de los genes mitóticos [^[34]]. Además de FOXM1, los factores de transcripción MYBL2 y la familia E2F contribuyen a la expresión de los genes mitóticos, y también se encontró un enriquecimiento para los genes diana de E2F en nuestro análisis. Se ha asociado FOXM1, y los genes mitóticos en general, con un mayor número de alteraciones en el número de copias y cánceres más agresivos, y se cree que la sobreexpresión de los genes mitóticos, en parte debido a la actividad de FOXM1, contribuye a la aneuploidía [^[41],^[42]]. Sorprendentemente, otros conjuntos de genes relacionados con el cáncer, como los genes de la fase S o los genes de reparación del ADN, no muestran el mismo patrón que los genes mitóticos. En general, tienen un cierto aumento en la expresión en el tumor en comparación con el tejido normal, pero, como ocurre con los genes esenciales comunes, los cambios también se correlacionan con el número de copias.

Este enriquecimiento para los genes mitóticos sugiere que, entre los genes que se expresan de forma constante a niveles más altos en las regiones del genoma que tienen un número de copias reducido, puede haber otros genes no relacionados con la mitosis cuya sobreexpresión contribuye a la progresión del cáncer. Nuestro análisis de TGIF1 es coherente con esta idea: la expresión de TGIF1 aumenta en el CRC, se encuentra en una región de pérdida recurrente del número de copias y la reducción de su expresión reduce el crecimiento tumoral en el intestino tanto en modelos genéticos como en modelos de xenoinjerto. Dado que es probable que haya un costo para el tumor al aumentar la expresión de los genes que están presentes con un número de copias reducido, centrarse en tales genes podría ser una forma sencilla de enriquecer los que son pro-tumorigénicos entre el gran número de diferencias en la expresión génica entre el tumor y el tejido normal. Por lo tanto, sería interesante probar funcionalmente otros genes que cumplan con estos criterios, en particular aquellos que se encuentran sobreexpresados en múltiples cánceres.

La mitosis fue la única vía que se encontró claramente enriquecida en el conjunto mínimo de genes identificado como de mayor expresión con reducción del número de copias. Cuando las regiones con reducción del número de copias se compartían entre los diferentes tipos de cáncer, los genes individuales relacionados con la mitosis tendían a encontrarse con una expresión aumentada en múltiples conjuntos de datos de cáncer. Sin embargo, la mayoría de los genes identificados de esta manera no se compartían entre los tipos de cáncer, incluso cuando la región eliminada estaba presente en varios cánceres. Esto sugiere que puede haber requisitos específicos del cáncer para el aumento de la expresión de otros genes de esta clase. Nuestro enfoque generó un conjunto de genes relativamente pequeño, que podría refinarse mediante la comparación con productos génicos que tienen inhibidores de moléculas pequeñas existentes, para reducir aún más los posibles objetivos terapéuticos para tipos de cáncer específicos. En resumen, sugerimos que este enfoque tiene el potencial de identificar un pequeño subconjunto de todos los genes que se sobreexpresan en un tipo de cáncer, y que pueden incluir objetivos terapéuticos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivo celular y deleción con CRISPR/Cas9 y silenciamiento con shRNA

Las células HCT116 se cultivaron en RPMI (Invitrogen) con un 10% de suero bovino fetal (Hyclone). Las células HEK293T se cultivaron en DMEM (Invitrogen) con un 10% de suero bovino fetal (Hyclone) y se transfectaron con PEI (Sigma). La identidad de las células HCT116 se verificó mediante el perfilado STR. El silenciamiento con shRNA se realizó utilizando vectores lentivirales validados de Mission shRNA (Sigma; TRCN0000020153 - TGIF1, TRCN0000273612 - TGIF2). Las células HCT116 se transfectaron con vectores lentivirales en condiciones estándar utilizando polibreno (8 μg/ml), y 24 horas después de la infección, las células se sometieron a selección con 0,15 μg/ml de puromicina. Después de 7 días de selección, los grupos se congelaron para la generación de xenoinjertos y se verificó el silenciamiento mediante Western blot. Los mutantes CRISPR/Cas9 se generaron mediante transfección transitoria en células HCT116 utilizando PEI. Un plásmido Cas9 más gRNA (pX330; Addgene 158973) se cotransfectó con un fragmento de ADN lineal generado por PCR que incluía un marcador seleccionable (puromicina o zeocina) con aproximadamente 25 pares de bases de brazos flanqueantes homólogos a las regiones a ambos lados del objetivo del gRNA. 48 horas después de la transfección, las células se replantaron a baja densidad y se sometieron a selección con puromicina o zeocina. Las colonias resistentes se expandieron y se probaron mediante Western blot y secuenciación de Sanger de fragmentos de PCR que abarcan la secuencia objetivo del gRNA. pX330-gRNA fue un regalo de Charles P. Lai (plásmido Addgene n.º 158973; http://n2t.net/addgene:158973) [^[43]].

Anticuerpos y Western blot

Las células se lisaron directamente en tampón de carga para SDS-PAGE y se hirvieron o se sonicaron utilizando un sonificador digital Branson con microcánula en un 1% de NP-40 en PBS. Los lisados se separaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a Immobilon-P (Millipore) y las proteínas se visualizaron utilizando ECL (Millipore, WBKLS0100). Los anticuerpos primarios fueron contra ACSS2 (Cell Signaling #3658), TGIF1 [^[19]], γ-tubulina (Sigma T6557), ACAT1 (Proteintech 16215–1-AP), MLYCD (Proteintech 15265–1-AP), SUN2 (Abcam ab124916), CDKN2A (Abcam ab80), TGIF2 (Proteintech 67576–1-Ig), β-actina (Proteintech 66009–1-Ig) y α-catenina (Epitomics 2028). PC se detectó utilizando HRP conjugado con neutravidina (ThermoFisher). Las señales se cuantificaron en un sistema de imagen BIO-RAD ChemiDoc MP y con el software BIO-RAD Image Lab.

Ensayos de proliferación y colonias

Los ensayos de proliferación se llevaron a cabo contando las células después de 1, 3 y 7 días en cultivo, o mediante un ensayo de cristal violeta: las células en placas de 12 pocillos se lavaron con PBS, se tiñeron con cristal violeta (0,2% de cristal violeta [Sigma, C6158], 2% de etanol en agua destilada) durante 10 minutos y se lavaron dos veces con agua. A continuación, las células teñidas se solubilizaron en un 1% de SDS y se midió la absorbancia a 570 nm. Para el etiquetado con EdU, las células se sembraron en portaobjetos de cámara de 4 pocillos y se trataron según lo descrito. Las células se etiquetaron con 10 μM de EdU durante 45 minutos, luego se fijaron con un 4% de paraformaldehído (PFA). El EdU se detectó utilizando el kit Click-iT EdU (Invitrogen C10339) siguiendo el protocolo del fabricante y se visualizó según lo descrito [^[44]]. Las colonias en los ensayos clonogénicos en placas de 6 pocillos se tiñeron con cristal violeta según lo descrito anteriormente, luego se secaron y se visualizaron en un sistema de imagen BIO-RAD ChemiDoc MP. Para el crecimiento en agar blando, las células se sembraron a 1000-5000 células por pocillo en un 0,3% de agar final sobre una capa de agar del 0,5% en placas de cultivo de 6 pocillos, se cultivaron durante 3-4 semanas, se tiñeron con cristal violeta y se visualizaron como se indicó anteriormente.

Xenoinjertos ortotópicos

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Virginia, que está totalmente acreditado por la AAALAC. Las células HCT116 con pLX304-PCR-tags y los constructos de Mission shRNA introducidos mediante infección lentiviral se recogieron como grupos dentro de las 2 semanas posteriores a la introducción del shRNA. Las células se mezclaron en proporciones iguales un día antes de la generación del xenoinjerto y se cultivaron juntas durante la noche. Las células se recogieron mediante tripsinización y se resuspendieron en un medio sin antibióticos a 16,67 × 106/ml. Se inyectaron ratones nudosos atímicos de ocho semanas de edad (Jackson 007850) con un total de 1 × 106 células en la pared del ciego en seis sitios (10 μl cada uno) utilizando una jeringa Hamilton con tres inyecciones por lado [^[31]]. Se permitió que los tumores progresaran hasta que se alcanzaron los puntos finales humanitarios y luego se congelaron antes de la homogeneización utilizando un homogeneizador Polytron a 300 mg/ml en PBS. El ADN genómico se preparó mediante HotSHOT [^[45]] y se normalizó mediante qPCR utilizando 1 μl para qPCR con cebadores comunes. Después de la normalización y 12 ciclos de preamplificación con cebadores comunes, se realizó qPCR utilizando el 2% del producto preamplificado (SensiMix SYBR + FITC PCR Mix [Bioline], termociclador myIQ [BIO-RAD]). Las proporciones de cada PCR-Tag se calcularon mediante 2ΔCt utilizando la mezcla de células en el tiempo cero como referencia [^[32]].

Conjuntos de datos y análisis de expresión versus número de copias

Los gráficos de CNA en todos los conjuntos de datos de TCGA PanCancer se generaron en cBioPortal [^[46]]. Los análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes se realizaron utilizando Enrichr (https://maayanlab.cloud/Enrichr/) [^[47],^[48]]. Para todos los demás análisis de número de copias y expresión, los conjuntos de datos de TCGA PanCancer (CNA con umbral gistic2 y datos de expresión IlluminaHiSeq) se descargaron de UCSC Xena (https://xena.ucsc.edu/) [^[49]]. Los conjuntos de datos se recortaron para incluir solo las muestras presentes en ambos y para eliminar las muestras normales (utilizadas para generar la comparación de expresión con las muestras tumorales). Las listas de genes se recortaron para eliminar los genes con una expresión promedio que no fuera superior a 2 (log2) en el tumor o en las muestras normales y se alinearon con el mapa de sondas hg19 de gencode para la ubicación cromosómica. Para CNA, se trazó el número promedio de copias en todas las muestras para un cáncer en particular por gen, y la expresión génica relativa se analizó comparando el tumor con el normal, incluyendo todas las muestras tumorales con datos de CNA, independientemente del número de copias. Las regiones cromosómicas con un número reducido de copias se seleccionaron inicialmente si contenían al menos 100 genes y el CNA promedio era -0,4 o menos. En otros cánceres, se incluyeron las regiones con menos de 100 genes con CNA < -0,4 si se superponían completamente con una región en otro cáncer que cumplía con el criterio principal. Además, si la mayoría de una región con un número reducido de copias tenía un CNA < -0,4 y no era el selector principal de esta región, se toleraron las subregiones intercaladas con un CNA > -0,4, pero menor que -0,35. Para los análisis que comparan la expresión con el cambio en el número de copias en todo el genoma (Figuras 5A, B, 9B-F), todos los genes que cumplen con el criterio de nivel de expresión se separaron en función del cambio en el número de copias y se determinó la proporción con un log2FC de T-N > +/− 1 para cada conjunto de datos o el log2FC promedio de T-N para un conjunto de genes específico. Para la comparación de la expresión de genes esenciales comunes (Figura 6), se comparó la expresión génica promedio (log2FC de T-N) (prueba t de Student) para los genes dentro de las regiones indicadas con un número reducido de copias. La expresión génica promedio (Figura 7B-F) se comparó (prueba t de Student) para conjuntos de genes específicos entre todos los genes con ganancia o pérdida del número de copias en todo el genoma. La comparación con los genes esenciales comunes utilizó una lista de genes esenciales comunes basados en CRISPR de DepMap [^[33]].

Cultivo celular y deleción con CRISPR/Cas9 y silenciamiento con shRNA

Las células HCT116 se cultivaron en RPMI (Invitrogen) con un 10% de suero bovino fetal (Hyclone). Las células HEK293T se cultivaron en DMEM (Invitrogen) con un 10% de suero bovino fetal (Hyclone) y se transfectaron con PEI (Sigma). La identidad de las células HCT116 se verificó mediante el perfilado STR. El silenciamiento con shRNA se realizó utilizando vectores lentivirales validados de Mission shRNA (Sigma; TRCN0000020153 - TGIF1, TRCN0000273612 - TGIF2). Las células HCT116 se transfectaron con vectores lentivirales en condiciones estándar utilizando polibreno (8 μg/ml), y 24 horas después de la infección, las células se sometieron a selección con 0,15 μg/ml de puromicina. Después de 7 días de selección, los grupos se congelaron para la generación de xenoinjertos y se verificó el silenciamiento mediante Western blot. Los mutantes CRISPR/Cas9 se generaron mediante transfección transitoria en células HCT116 utilizando PEI. Un plásmido Cas9 más gRNA (pX330; Addgene 158973) se cotransfectó con un fragmento de ADN lineal generado por PCR que incluía un marcador seleccionable (puromicina o zeocina) con aproximadamente 25 pares de bases de brazos flanqueantes homólogos a las regiones a ambos lados del objetivo del gRNA. 48 horas después de la transfección, las células se replantaron a baja densidad y se sometieron a selección con puromicina o zeocina. Las colonias resistentes se expandieron y se probaron mediante Western blot y secuenciación de Sanger de fragmentos de PCR que abarcan la secuencia objetivo del gRNA. pX330-gRNA fue un regalo de Charles P. Lai (plásmido Addgene n.º 158973; http://n2t.net/addgene:158973) [^[43]].

Anticuerpos y Western blot

Las células se lisaron directamente en tampón de carga para SDS-PAGE y se hirvieron o se sonicaron utilizando un sonificador digital Branson con microcánula en un 1% de NP-40 en PBS. Los lisados se separaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a Immobilon-P (Millipore) y las proteínas se visualizaron utilizando ECL (Millipore, WBKLS0100). Los anticuerpos primarios fueron contra ACSS2 (Cell Signaling #3658), TGIF1 [^[19]], γ-tubulina (Sigma T6557), ACAT1 (Proteintech 16215–1-AP), MLYCD (Proteintech 15265–1-AP), SUN2 (Abcam ab124916), CDKN2A (Abcam ab80), TGIF2 (Proteintech 67576–1-Ig), β-actina (Proteintech 66009–1-Ig) y α-catenina (Epitomics 2028). PC se detectó utilizando HRP conjugado con neutravidina (ThermoFisher). Las señales se cuantificaron en un sistema de imagen BIO-RAD ChemiDoc MP y con el software BIO-RAD Image Lab.

Ensayos de proliferación y colonias

Los ensayos de proliferación se llevaron a cabo contando las células después de 1, 3 y 7 días en cultivo, o mediante un ensayo de cristal violeta: las células en placas de 12 pocillos se lavaron con PBS, se tiñeron con cristal violeta (0,2% de cristal violeta [Sigma, C6158], 2% de etanol en agua destilada) durante 10 minutos y se lavaron dos veces con agua. A continuación, las células teñidas se solubilizaron en un 1% de SDS y se midió la absorbancia a 570 nm. Para el etiquetado con EdU, las células se sembraron en portaobjetos de cámara de 4 pocillos y se trataron según lo descrito. Las células se etiquetaron con 10 μM de EdU durante 45 minutos, luego se fijaron con un 4% de paraformaldehído (PFA). El EdU se detectó utilizando el kit Click-iT EdU (Invitrogen C10339) siguiendo el protocolo del fabricante y se visualizó según lo descrito [^[44]]. Las colonias en los ensayos clonogénicos en placas de 6 pocillos se tiñeron con cristal violeta según lo descrito anteriormente, luego se secaron y se visualizaron en un sistema de imagen BIO-RAD ChemiDoc MP. Para el crecimiento en agar blando, las células se sembraron a 1000-5000 células por pocillo en un 0,3% de agar final sobre una capa de agar del 0,5% en placas de cultivo de 6 pocillos, se cultivaron durante 3-4 semanas, se tiñeron con cristal violeta y se visualizaron como se indicó anteriormente.

Xenoinjertos ortotópicos

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Virginia, que está totalmente acreditado por la AAALAC. Las células HCT116 con etiquetas pLX304-PCR y constructos shRNA de Mission introducidos mediante infección lentiviral se recogieron en grupos dentro de las 2 semanas posteriores a la introducción del shRNA. Las células se mezclaron en proporciones iguales un día antes de la generación del xenoinjerto y se cultivaron juntas durante la noche. Las células se recogieron mediante tripsinización y se resuspenden en medios sin antibióticos a 16,67 × 106/ml. Se inyectaron ratones atímicos desnudos de ocho semanas de edad (Jackson 007850) con un total de 1 × 106 células en la pared del ciego en seis sitios (10 µl cada uno) utilizando una jeringa Hamilton con tres inyecciones por lado [^[31]]. Se permitió que los tumores progresaran hasta que se alcanzaron los puntos finales humanitarios y, a continuación, se congelaron antes de la homogeneización utilizando un homogeneizador Polytron a 300 mg/ml en PBS. El ADN genómico se preparó mediante HotSHOT [^[45]] y se normalizó mediante qPCR utilizando 1 µl para qPCR con cebadores comunes. Tras la normalización y 12 ciclos de preamplificación con cebadores comunes, se realizó qPCR utilizando el 2% del producto preamplificado (SensiMix SYBR + FITC PCR Mix [Bioline], termociclador myIQ [BIO-RAD]). Las proporciones de cada etiqueta PCR se calcularon mediante 2ΔCt utilizando la mezcla de células en el tiempo cero como referencia [^[32]].

Conjuntos de datos y análisis de la expresión frente al número de copias

Los gráficos de CNA de todos los conjuntos de datos TCGA PanCancer se generaron en cBioPortal [^[46]]. Los análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes se realizaron utilizando Enrichr (https://maayanlab.cloud/Enrichr/) [^[47],^[48]]. Para todos los demás análisis del número de copias y la expresión, se descargaron los conjuntos de datos TCGA PanCancer (CNA con umbral gistic2 y datos de expresión IlluminaHiSeq) de UCSC Xena (https://xena.ucsc.edu/) [^[49]]. Los conjuntos de datos se recortaron para incluir solo las muestras presentes en ambos y para eliminar las muestras normales (utilizadas para generar la comparación de la expresión con las muestras tumorales). Las listas de genes se recortaron para eliminar los genes con una expresión media que no superara los 2 (log2) en el tumor o en las muestras normales y se alinearon con gencode hg19 probemap para la ubicación cromosómica. Para CNA, se trazó la copia número media en todas las muestras para un cáncer en particular por gen, y se analizó la expresión génica relativa comparando el tumor con el normal, incluyendo todas las muestras tumorales con datos de CNA, independientemente del número de copias. Las regiones cromosómicas con un número de copias reducido se seleccionaron inicialmente si contenían al menos 100 genes y la CNA media era de −0,4 o menos. En cánceres adicionales, se incluyeron regiones con menos de 100 genes con CNA < −0,4 si se superponían completamente con una región en otro cáncer que cumplía el criterio principal. Además, si la mayoría de una región con un número de copias reducido tenía una CNA < −0,4 y no era el selector principal de esta región, se toleraron subregiones intercaladas con una CNA > −0,4, pero menor que −0,35. Para los análisis que comparan la expresión con el cambio en el número de copias en todo el genoma (Figuras 5A, B, 9B-F), todos los genes que cumplían el criterio del nivel de expresión se separaron en función del cambio en el número de copias y se determinó la proporción con un log2FC T-N >+/− 1 para cada conjunto de datos o el log2FC T-N medio para un conjunto de genes específico. Para la comparación de la expresión de genes esenciales comunes (Figura 6), se comparó la expresión génica media (log2FC T-N) (prueba t de Student) para los genes dentro de las regiones indicadas con un número de copias reducido. Se comparó la expresión génica media (Figura 7B-F) (prueba t de Student) para conjuntos de genes específicos entre todos los genes con ganancia o pérdida del número de copias en todo el genoma. La comparación con los genes esenciales comunes utilizó una lista de genes esenciales comunes basados en CRISPR de DepMap [^[33]].