La emergencia de plasticidad oncofetal es ubicua en los cánceres colorrectales tempranos.

La formación de metástasis se considera clásicamente un evento en etapa tardía de la evolución del cáncer colorrectal. Sin embargo, el momento y el patrón espacial en el que se adquiere la capacidad metastásica siguen siendo poco conocidos1,2. Aquí demostramos que los estados de células oncofetales asociadas a la metástasis ya aparecen en las etapas más tempranas del cáncer colorrectal, de forma concurrente con la formación del frente invasor. No obstante, aunque son necesarios para la metástasis, los detectamos de forma ubicua en los cánceres no metastásicos en etapa temprana, lo que pone de manifiesto otros factores limitantes, como la evasión inmune. Para comprender cómo surgen inicialmente las células oncofetales, generamos modelos de organoides multirregionales que reflejan las etapas sucesivas de la progresión tumoral dentro de los cánceres colorrectales en etapa temprana. El secuenciamiento del genoma completo y los ensayos de dependencia de factores de crecimiento excluyen los rasgos adquiridos intrínsecos a las células tumorales. Por el contrario, los atlas espaciales de células individuales del microambiente tumoral antes y después de la transformación maligna revelaron un patrón estereotípico de subtipos de fibroblastos que se asemeja a la arquitectura del tejido normal, lo que da como resultado microambientes regionales distintos. Al inicio del crecimiento maligno hacia la submucosa, los primeros fibroblastos asociados al cáncer que aparecen se asemejan mucho a los trofocitos de la submucosa y se colocan en la misma ubicación que los estados de células oncofetales en los frentes invasores. Funcionalmente, los cocultivos de fibroblastos y organoides confirman que estos fibroblastos asociados al cáncer similares a los trofocitos inducen una transición plástica hacia los estados oncofetales. Por lo tanto, las interacciones entre el tumor y los fibroblastos de la submucosa inmediatamente después de la transformación maligna determinan el momento y la ubicación en los que se produce inicialmente la plasticidad oncofetal durante la progresión del cáncer colorrectal. Contenido similar que están viendo otros usuarios

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El cáncer colorrectal (CRC) sirve como prototipo para el estudio de la progresión tumoral, con vías de señalización bien caracterizadas afectadas por mutaciones impulsoras. Estos factores impulsores se adquieren típicamente en las primeras etapas de la progresión tumoral3,4,5,6, mientras que los factores impulsores genéticos de la formación de metástasis no se han identificado7. De hecho, los fenotipos invasivos son policlonales8 y las mutaciones sub-clonales parecen estar en gran medida no relacionadas con los fenotipos de las células tumorales9. Además, desde una perspectiva clínica, una fracción sustancial de los genes que predicen un alto riesgo de recurrencia del CRC se expresan en las células del microambiente tumoral (TME)10,11,12. Estas observaciones indican un papel dominante del TME en la adquisición de la capacidad metastásica13. Al mismo tiempo, la inducción de estados regenerativos similares a los fetales dentro de las células cancerosas es esencial para el éxito de la siembra metastásica14,15. Aunque los mecanismos moleculares que subyacen a esta plasticidad oncofetal están bajo intensa investigación, aún no se comprende bien cuándo, dónde y cómo surgen estos fenotipos por primera vez durante la progresión tumoral1,2. De hecho, las metástasis se asocian generalmente con cánceres en etapas avanzadas, pero la capacidad metastásica puede adquirirse en etapas tempranas. En particular, alrededor del 10% de los CRC ya presentan metástasis en una etapa temprana, inmediatamente después de la formación de los frentes invasivos (estadio T1)16,17. Además, las reconstrucciones evolutivas de los CRC metastásicos en etapas avanzadas indicaron que la siembra metastásica generalmente comenzaba en etapas tempranas, años antes del diagnóstico6.

Desafortunadamente, el estudio de la evolución del comportamiento y los fenotipos celulares durante las etapas tempranas del tumor es un desafío, particularmente en humanos18. Tradicionalmente, ha existido un fuerte sesgo de muestreo hacia los cánceres en etapas avanzadas, ya que las etapas tempranas a menudo pasan desapercibidas. Además, el muestreo longitudinal en etapas secuenciales de la progresión tumoral para obtener una descripción temporal de los eventos clave es prácticamente inviable para la mayoría de los tipos de cáncer. Por último, a diferencia de la iniciación del adenoma y el crecimiento del cáncer en etapas avanzadas con diseminación metastásica, existe una falta de modelos experimentales para estudiar las interacciones entre las células tumorales y el estroma durante la transición de precáncer a cáncer después de la transformación maligna. En consecuencia, el momento, el patrón y los mecanismos por los cuales la competencia metastásica14,19,20 surge por primera vez durante la línea de tiempo evolutiva de los CRC aún no se han dilucidado.

Para investigar la iniciación de la competencia metastásica en el CRC, caracterizamos aquí la arquitectura tisular y la heterogeneidad celular espacial en los CRC en etapas tempranas, y complementamos estos conjuntos de datos con modelos de organoides multirregionales experimentales para diferenciar los factores intrínsecos y extrínsecos de las células tumorales que inducen fenotipos asociados con la metástasis.

Mapeo de fenotipos en el cáncer colorrectal en etapas tempranas

Para caracterizar los fenotipos divergentes que siguen a la transformación maligna, realizamos transcriptómica espacial (Nanostring GeoMx) en CRC en etapas tempranas. Para ello, seleccionamos 19 tumores en estadio T1, ya que representan la etapa más temprana de invasión, con células tumorales invasivas que han penetrado a través de la muscularis mucosae, pero que aún están confinadas a la submucosa (Fig. 1a y Fig. 1a complementaria, consulte "Disponibilidad de datos" para obtener un panel interactivo). Para generar un conjunto de datos completo que abarque la arquitectura tumoral completa, colocamos regiones de interés (ROI) a lo largo de las etapas secuenciales de la progresión tumoral, es decir, tejido normal adyacente al tumor, componente tumoral adenomatoso, núcleo tumoral y frente invasivo (Fig. 1b y Fig. 1b complementaria). A continuación, obtuvimos perfiles de expresión específicos del epitelio y específicos del microambiente por ROI (Fig. 1c), evaluados con un atlas de transcriptómica específico del cáncer (CTA) con alta sensibilidad para genes individuales o un atlas de transcriptómica completa (WTA) con alta utilidad para análisis de conjuntos de genes (Fig. 1c).

Fig. 1: Firmas asociadas a la metástasis en el frente invasivo del cáncer colorrectal en etapas tempranas.

El texto alternativo para esta imagen puede haber sido generado utilizando IA.

Fig. 1a, Transcriptómica espacial en 19 CRC en estadio T1 con paneles de sondas específicas del cáncer (CTA; 373 segmentos; 5 sondas por gen) y de transcriptómica completa (WTA; 281 segmentos; 1 sonda por gen). Se indica el estado de los ganglios linfáticos (N) y las metástasis a distancia (M). b, Ejemplo de la colocación de ROI en CRC en estadio T1. c, Ampliación de una ROI representativa (frente invasivo n.º 2 que se muestra en b), que muestra la segmentación epitelial y del estroma para un perfilado separado. La línea discontinua muestra el borde del tumor. d, Partición de varianza de un conjunto de datos de transcriptómica espacial (WTA; n = 2000 genes más variables; cuadros, rango intercuartílico; barras negras, mediana; bigotes, 1,5 × rango intercuartílico). e, Gráfico de violín de las correlaciones por pares entre pares de segmentos estroma-estroma (azul) o epitelio-epitelio (rojo) dentro o entre pacientes (n = 104 comparaciones de regiones en 9 pacientes; cuadros, rango intercuartílico; barras negras, mediana; bigotes, 1,5 × rango intercuartílico; ANOVA P = 2,31 × 10−11, prueba de diferencia honesta de Tukey (HSD)). f, Mapa de calor que muestra la expresión relativa (cambio de pliegue log2) de los genes expresados diferencialmente (los 10 valores de Padj más bajos con Padj < 0,05; prueba de suma de rangos de Wilcoxon con corrección de Bonferroni) en los segmentos epiteliales (n = 140) para cada región histopatológica (CTA). La fuente en negrita muestra los marcadores fetales. g, Matriz de correlación de la firma del núcleo tumoral (fuente roja) y la firma del frente invasivo (fuente amarilla) de este estudio frente a las firmas de CRC publicadas dentro del núcleo tumoral (n = 42) y el frente invasivo (n = 43) de los segmentos epiteliales (WTA). h, Firma EpiHR en los segmentos epiteliales de las regiones histopatológicas indicadas de los 19 CRC en estadio T1 perfilados espacialmente. Los puntos conectados denotan la mediana del paciente. La firma EpiHR se seleccionó para los genes sondeados tanto en los paneles de sondas CTA como WTA (cuadros, rango intercuartílico; barras negras, mediana; bigotes, 1,5 × rango intercuartílico; prueba t). i, Inmunofluorescencia que muestra el marcador oncofetal LAMC2 en el frente invasivo del CRC en estadio T1 (n = 2 tumores). j, Inmunofluorescencia para las células tumorales oncofetales LAMC2+ y los CAF FAP+ en un microarreglo de tejidos de 232 CRC en estadio T1 con un seguimiento clínico de 5 años. k, Análisis de composición de j. l, GSEA de los segmentos del frente invasivo epitelial de los tumores metastásicos frente a los no metastásicos. Los procesos biológicos de la ontología génica relacionados con la inmunidad significativos se resaltan en azul (prueba basada en permutaciones, corregida por Benjamini-Hochberg). Ade, adenoma; núcleo, núcleo tumoral; CSC, célula madre cancerosa; GO, ontología génica; inv, frente invasivo; NES, puntuación de enriquecimiento normalizada; nor, normal; NS, no significativo; pt, paciente; TMA, microarreglo de tejidos. Barras de escala, 1 mm (b); 200 μm (c, i). La ilustración en a se reproduce de NIH BioArt (https://bioart.niaid.nih.gov/bioart/212); las ilustraciones en j se adaptan de NIH BioArt (https://bioart.niaid.nih.gov/bioart/214 y https://bioart.niaid.nih.gov/bioart/232).

Datos fuente

El agrupamiento no supervisado (Fig. 1c y 1d complementarias) y la partición de varianza (Fig. 1d) revelaron la separación más fuerte entre los segmentos epiteliales y del estroma en ambos ensayos, con la varianza específica del paciente más pronunciada en los segmentos de cáncer epitelial (Fig. 1e y Fig. 1e complementaria). Esto probablemente es una consecuencia de los antecedentes genéticos específicos del tumor21. Por el contrario, la remodelación del estroma es más uniforme con menores efectos específicos del paciente durante la progresión tumoral (Fig. 1e y Fig. 1c-1e complementarias).

La clasificación molecular del CRC por subtipos moleculares de consenso (CMS) se utiliza con frecuencia para predecir la progresión de la enfermedad, y los tumores CMS4, caracterizados por un alto contenido de estroma, tienen un pronóstico particularmente desfavorable22. Investigamos la variabilidad entre las diferentes regiones histopatológicas con respecto a CMS y confirmamos que CMS puede ser específico de la región dentro de un solo tumor9,23 (Fig. 1f y 1g complementarias). En particular, las regiones clasificadas como CMS4 mostraron mayores cantidades de núcleos de estroma, lo que subraya que esta clasificación de la transcriptómica masiva está determinada predominantemente por el contenido del estroma (Fig. 1h complementaria). Para evitar esto, también predijimos clasificaciones epiteliales (iCMS)24. Como se esperaba, este análisis mostró una fuerte concordancia de iCMS entre los segmentos dentro de los CRC en estadio T1 individuales (Fig. 1i complementaria).

A continuación, realizamos un análisis de expresión diferencial entre los segmentos de células tumorales (Pan-citoqueratina, PanCK+) de las cuatro regiones histopatológicas utilizando el conjunto de datos CTA sensible (Fig. 1f). Las células tumorales del frente invasivo mostraron una alta expresión de marcadores asociados con estados regenerativos y fetales, como MMP7, LAMC2 y ANXA1 (refs. 14, 25, 26). El núcleo tumoral, sin embargo, mostró la expresión de genes asociados con el ciclo celular, como MYC y PCNA. Para examinar los programas de transcripción en las células tumorales, extrajimos firmas de genes epiteliales del núcleo y el frente invasivo (earlyCRCcore y earlyCRCinv, Tabla 2 complementaria) del conjunto de datos WTA. Los patrones de expresión específicos del núcleo tumoral se correlacionaron con las firmas clásicas de células madre intestinales (cáncer)26,27,28,29 y proliferativas29,30,31. Por el contrario, observamos una fuerte superposición entre la firma del frente invasivo y las firmas regenerativas14,25,26,31,32,33 y similares a las fetales34, que están asociadas con estados celulares plásticos cruciales para la resistencia a los fármacos y la capacidad metastásica14,15,20,31,35,36 (Fig. 1g y Fig. 1j complementaria).

Entre estas firmas asociadas a la metástasis se encuentran las firmas de células de alta recurrencia (HRC) documentadas recientemente (coreHRC y epitelial High Relapse (epiHR))14. Las HRC son un estado celular dinámico detectado originalmente en CRC en etapas avanzadas. Están enriquecidas en los frentes invasivos y son la fuente de recurrencia metastásica en ratones, mientras que su abundancia predice el riesgo de recurrencia en los pacientes. Un examen detallado de nuestros conjuntos de datos espaciales reveló la expresión de la firma HRC en los frentes invasivos de la mayoría de los CRC en estadio T1, a pesar de que la mitad de ellos no eran metastásicos (Fig. 1h). La restricción de los fenotipos HRC al frente invasivo del CRC en etapas tempranas se confirmó con inmunofluorescencia contra la laminina subunidad gamma 2 (LAMC2) (Fig. 1i y Fig. 1k complementaria), uno de los marcadores HRC más representativos14 (Fig. 2a-2f complementaria). Para corroborar el sorprendente hallazgo de que los programas de transcripción asociados con la metástasis surgen en etapas tempranas de la progresión del cáncer, validamos su presencia casi uniforme en los frentes invasivos de 232 especímenes de CRC en estadio T1 recolectados en microarreglos de tejidos37 (Fig. 1j, k). Además, la información de seguimiento clínico de 5 años de estos tumores corroboró nuestro hallazgo de que la expresión temprana de las firmas HRC no equivale automáticamente al éxito metastásico (Fig. 1k). Para comprender esta aparente discrepancia, analizamos el programa de expresión HRC en conjuntos de datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) publicados y observamos que este programa permanece en gran medida estable en las células oncofetales durante la progresión de la enfermedad (Fig. 2g complementaria). En cambio, la proporción de células oncofetales aumenta en los tumores en etapas avanzadas, probablemente como consecuencia de la expansión de la masa tumoral y el tamaño del frente invasivo (Fig. 2g, h complementaria). A continuación, reanalizamos nuestros conjuntos de datos espaciales de CRC en etapas tempranas, que se seleccionaron para incluir tumores no metastásicos (T1N0M0) y tumores metastásicos T1 (T1N1M0 y T1N0M1) (Fig. 1a). La investigación de las diferencias entre estos dos grupos reveló la regulación a la baja de los programas de expresión relacionados con la inmunidad en los frentes invasivos metastásicos (Fig. 1l y Fig. 1l complementaria). 1l), lo que sugiere una evasión inmune adquirida, un sello distintivo conocido de la enfermedad metastásica33,38,39,40. En conclusión, si bien la carga metastásica es principalmente un fenómeno de los cánceres en etapa tardía, la aparición de fenotipos oncofetales asociados con la metástasis no lo es. Sin embargo, la diseminación metastásica en los CRC en etapa temprana sigue siendo poco frecuente, lo que destaca otros factores limitantes, como la coadquisición de propiedades de evasión inmune. Origen no genético de los fenotipos invasivos. Para investigar las diferencias fenotípicas locales en los CRC en etapa temprana, generamos un biobanco de organoides multirregionales (Fig. 2a y Fig. S1). Utilizando biopsias de punción en los CRC en etapa temprana resecados quirúrgicamente, se derivaron un total de 73 líneas de organoides de 16 pacientes con muestras emparejadas de regiones normales, adenoma, núcleo tumoral y frente invasivo. La precisión de la identidad de la biopsia regional se confirmó mediante el examen histopatológico del tumor procesado restante, fijado en formalina e incluido en parafina (FFPE) (Fig. 2a, b). La tasa de éxito de la derivación de organoides a partir de biopsias con identidad confirmada fue superior al 90%, siendo la inaccesibilidad o la ausencia de regiones tumorales el principal factor que contribuyó al muestreo incompleto (Fig. 2b). El biobanco consta de adenocarcinomas, incluidos dos carcinomas mucinosos y uno medular, este último de los cuales, hasta donde sabemos, no se ha incluido en ningún biobanco de organoides de CRC. Fig. 2: Los fenotipos de las células tumorales del frente invasivo no están determinados genéticamente. El texto alternativo para esta imagen puede haber sido generado utilizando IA. Imagen a tamaño completo a, Descripción general de la derivación de organoides a partir de biopsias de punción regionales en los CRC en etapa temprana. Las biopsias se procesan en fragmentos de tejido y se dividen en alícuotas para el cultivo de organoides y la criopreservación. La identidad regional de las biopsias se confirmó histológicamente en el CRC muestreado (FFPE) por un patólogo (los círculos denotan las ubicaciones de la punción en hematoxilina y eosina). b, Descripción general del biobanco de organoides multirregionales de CRC en etapa temprana. c, Paisaje de genes impulsores en los organoides de CRC en etapa temprana. Se muestran los genes impulsores con una prevalencia de más del 4% en la ref. 49 y una puntuación de probabilidad de gen impulsor de más de 0,8. d, Árbol filogenético representativo (paciente 14) que muestra una relación evolutiva entre las regiones histopatológicas basada en los datos de secuenciación del genoma completo (WGS). Se anotan las mutaciones y la etapa de adquisición. e, CNA en los organoides de CRC en etapa temprana. Arriba, perfil medio de CNA de nuestras muestras y el conjunto de datos de referencia de CRC primario de PCAWG (dMMR y WGD excluidos, la comparación estadística es la correlación de Pearson r con el valor de P y la similitud del coseno). f, Diagrama de caja que muestra las similitudes del coseno por pares de los perfiles de CNA inferidos (inferCNV) dentro del conjunto de datos de transcriptómica espacial de los CRC en etapa temprana. Los puntos representan comparaciones por pares entre regiones (cajas, rango intercuartílico; barras negras, mediana; bigotes, 1,5 × rango intercuartílico). g, Método de cuantificación para la eficiencia de crecimiento de organoides en diversas condiciones de cultivo utilizando OrganoSeg64. Se evaluó el área total del organoide en imágenes de campo claro como medida de la eficiencia de crecimiento y se observó una fuerte correlación en el comportamiento del crecimiento entre los organoides emparejados del núcleo y el frente invasivo (Fig. 2h, i), lo que coincide con su paisaje de genes impulsores idéntico. En conjunto, estas perspectivas experimentales excluyen los rasgos intrínsecos de las células tumorales como impulsores de la heterogeneidad fenotípica entre los núcleos tumorales y los frentes invasivos de los CRC en etapa temprana. Patrón de fibroblastos espaciales en el CRC A continuación, centramos nuestra atención en el microambiente tumoral (TME) como un posible instigador de la plasticidad fenotípica en el CRC en etapa temprana. Utilizando la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en material dividido de las mismas biopsias de punción multirregionales utilizadas para la derivación de organoides, caracterizamos la composición del tipo celular de los diversos microambientes en los CRC en etapa temprana (Fig. 3a, b, Fig. S4 y Fig. S2, consulte "Disponibilidad de datos" para obtener un panel interactivo). Observamos diferencias extremas en la localización espacial dentro del compartimento de fibroblastos. Los fibroblastos estromales 1 previamente descritos44,45 se restringieron al tejido normal, mientras que los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) que expresan FAP se encontraron exclusivamente en el cáncer (Fig. S4e, f). Además, dentro de los tejidos cancerosos, detectamos un subtipo de fibroblastos (SFRP2+, GREM1+, RSPO3+) que reside exclusivamente en el frente invasivo y que corresponde a los llamados trofocitos (o fibroblastos S3), que se sabe que se localizan alrededor de los fondos de las criptas normales donde apoyan la función de las células madre44,46 (Fig. 3b, c). A la inversa, los telocitos (o fibroblastos S2), un subtipo de fibroblastos (SOX6+, BMP4+ y WNT5A+) que reside hacia los extremos superiores de las criptas en el colon normal, fueron más abundantes en el núcleo tumoral44. Fig. 3: CAF similares a trofocitos en el frente invasivo. El texto alternativo para esta imagen puede haber sido generado utilizando IA. Imagen a tamaño completo a, Identificación del tipo celular basada en scRNA-seq en el TME de CRC en etapa temprana. b, UMAP de los datos de scRNA-seq de biopsias regionales de los biobancos de CRC (pt5, pt11, pt13, pt14 y pt16 (Fig. 2b)). Izquierda, anotación del tipo celular. Derecha, contribución relativa de las biopsias del núcleo y el frente invasivo por grupo. c, Nivel de expresión del gen marcador en los subtipos de fibroblastos de los CRC en etapa temprana y el tejido normal adyacente al tumor. Colores, nivel de expresión; tamaño del punto, porcentaje de células que expresan el transcripto. d, Puntuaciones de la firma TME-HR14 en los diferentes tipos de células del TME en los CRC en etapa temprana (n = 1612 células; 5 pacientes). Paneles de la derecha, las células (puntos negros) con las puntuaciones de la firma TME-HR más altas entre los CAF y los trofocitos provienen de las biopsias del frente invasivo (cajas, rango intercuartílico; barras negras, mediana; bigotes, 1,5 × rango intercuartílico; prueba t). e, Expresión de la firma CD8 T en tumores con el estado metastásico indicado a partir del conjunto de datos de transcriptómica espacial de WTA de CRC en etapa temprana (Fig. 1) (n = 9 pacientes; cajas, rango intercuartílico; barras negras, mediana; bigotes, 1,5 × rango intercuartílico; ANOVA P = 0,0015, prueba de Tukey). f, Supervivencia libre de enfermedad de los pacientes con CMS4 (ref. 49) estratificada por baja o media (66% inferior) frente a alta (33% superior) expresión de las firmas de los subtipos de fibroblastos indicados (100 marcadores específicos de la región, Tabla S5) (prueba de rango logarítmico). g, Matriz de correlación de células a células de scRNA-seq de fibroblastos de biopsias del núcleo y el frente invasivo. Se pueden reconocer tres subtipos de CAF (tonos verdes) dentro del grupo de CAF FAP+ (la escala de color representa la similitud del transcriptoma entre células (coeficiente de correlación de Pearson calculado sobre los 8000 genes más variables). Pistas inferiores, puntuaciones de la firma de telocitos y trofocitos para cada célula. h, Nivel de expresión de los marcadores entre los subtipos de fibroblastos. Colores, nivel de expresión; tamaño del punto, porcentaje de células que expresan los transcritos. Benjamini-Hochberg. i, GSEA de los perfiles de expresión masiva de GeoMx (WTA; n = 9 CRC T1; prueba de permutación con FDR) entre el núcleo tumoral y el frente invasivo utilizando firmas específicas del tipo celular de scRNA-seq. La longitud del lollypop, puntuación de enriquecimiento normalizada; tamaño del punto, probabilidad nominal (-log[P]). j, Inmunofluorescencia para el marcador de trofocitos SFRP2 (magenta) en el frente invasivo del CRC en etapa temprana (n = 4 tumores). Células tumorales en verde (PanCK+), núcleos en azul (SYTO13). Los paneles superiores muestran acercamientos de las regiones indicadas. La línea discontinua muestra el borde del tumor. k, Inmunofluorescencia contra FAP (púrpura) y el marcador de HRC LAMC2 (rojo) en el frente invasivo del CRC en etapa temprana (n = 3 tumores). Células tumorales en verde (PanCK), núcleos en gris (SYTO13). La tinción de PanCK y LAMC2 se muestra en amarillo. La línea discontinua blanca muestra el borde del tumor. l, Transcriptómica espacial de una sola célula de un espécimen de CRC T1 que muestra células oncofetales (alta expresión de la firma de alta recurrencia, verde brillante)14 y células cancerosas (células madre) impulsadas por WNT (verde oscuro)29. La línea discontinua muestra el borde del tumor. m, Como en l, pero que muestra trofocitos (naranja) y telocitos (amarillo). La línea discontinua muestra el borde del tumor. n, Como en l, pero que muestra los subtipos de CAF FAP+. B, célula B; IQR, rango intercuartílico; linfocitos proliferativos; MΦ, macrófago; mio, miofibroblasto; NES, puntuación de enriquecimiento normalizada; NS, no significativo; oncofetal; S1, estroma 1; SMC, célula del músculo liso; TCD8+, célula T CD8+; TCD4+, célula T CD4+; transcriptómica; Treg, célula T reguladora. Barras de escala, 200 μm (j, k); 1 mm (l–n). Datos de origen. La secuenciación del genoma completo (WGS) de cultivos de organoides de pasaje temprano de ocho pacientes reveló que las mutaciones somáticas en los genes impulsores del CRC canónico ya estaban presentes en esta etapa temprana, incluidos APC, TP53, KRAS y la pérdida heterocigota de SMAD4, lo que es consistente con observaciones anteriores4,5,41 (Fig. 2c y Tabla S4). En particular, en todos los pacientes, los frentes invasivos no presentaban mutaciones adicionales en los genes impulsores en comparación con su núcleo tumoral correspondiente (Fig. 2c, d y Fig. S3a). Del mismo modo, los cariotipos de los organoides de CRC en etapa temprana mostraron patrones típicos de ganancias y pérdidas cromosómicas conocidos para los CRC42 y fueron similares entre los organoides emparejados del núcleo tumoral y el frente invasivo (Fig. 2e). Para corroborar estos resultados, derivamos cariotipos de nuestro conjunto de datos de transcriptómica espacial de los CRC en etapa temprana. Nuevamente, a pesar de la divergencia regional en los fenotipos de las células tumorales, las células tumorales del núcleo y el frente invasivo mostraron una alta similitud en sus niveles de aneuploidía de los brazos cromosómicos, mientras que la variación dentro de las regiones de adenoma fue mayor43 (Fig. 2f y Fig. S3b, c). Para realizar una investigación funcional de la independencia regional adquirida de los factores de crecimiento externos, probamos la sensibilidad de los organoides a las perturbaciones en las vías de señalización de WNT, P53, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), BMP y TGFβ (Fig. 2g y Fig. S3d, e). Evaluamos el área total del organoide en las imágenes de campo claro como medida de la eficiencia de crecimiento y observamos una fuerte correlación en el comportamiento del crecimiento entre los organoides emparejados del núcleo y el frente invasivo (Fig. 2h, i), lo que coincide con su paisaje de genes impulsores idéntico. En conjunto, estas perspectivas experimentales excluyen los rasgos intrínsecos de las células tumorales como impulsores de la heterogeneidad fenotípica entre los núcleos tumorales y los frentes invasivos de los CRC en etapa temprana. Patrón de fibroblastos espaciales en el CRC A continuación, centramos nuestra atención en el TME como un posible instigador de la plasticidad fenotípica en el CRC en etapa temprana. Utilizando la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en material dividido de las mismas biopsias de punción multirregionales utilizadas para la derivación de organoides, caracterizamos la composición del tipo celular de los diversos microambientes en los CRC en etapa temprana (Fig. 3a, b, Fig. S4 y Fig. S2, consulte "Disponibilidad de datos" para obtener un panel interactivo). Observamos diferencias extremas en la localización espacial dentro del compartimento de fibroblastos. Los fibroblastos estromales 1 previamente descritos44,45 se restringieron al tejido normal, mientras que los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) que expresan FAP se encontraron exclusivamente en el cáncer (Fig. S4e, f). Además, dentro de los tejidos cancerosos, detectamos un subtipo de fibroblastos (SFRP2+, GREM1+, RSPO3+) que reside exclusivamente en el frente invasivo y que corresponde a los llamados trofocitos (o fibroblastos S3), que se sabe que se localizan alrededor de los fondos de las criptas normales donde apoyan la función de las células madre44,46 (Fig. 3b, c). A la inversa, los telocitos (o fibroblastos S2), un subtipo de fibroblastos (SOX6+, BMP4+ y WNT5A+) que reside hacia los extremos superiores de las criptas en el colon normal, fueron más abundantes en el núcleo tumoral44. Fig. 3: CAF similares a trofocitos en el frente invasivo. El texto alternativo para esta imagen puede haber sido generado utilizando IA. Imagen a tamaño completo a, Identificación del tipo celular basada en scRNA-seq en el TME de CRC en etapa temprana. b, UMAP de los datos de scRNA-seq de biopsias regionales de los biobancos de CRC (pt5, pt11, pt13, pt14 y pt16 (Fig. 2b)). Izquierda, anotación del tipo celular. Derecha, contribución relativa de las biopsias del núcleo y el frente invasivo por grupo. c, Nivel de expresión del gen marcador en los subtipos de fibroblastos de los CRC en etapa temprana y el tejido normal adyacente al tumor. Colores, nivel de expresión; tamaño del punto, porcentaje de células que expresan el transcripto. d, Puntuaciones de la firma TME-HR14 en los diferentes tipos de células del TME en los CRC en etapa temprana (n = 1612 células; 5 pacientes). Paneles de la derecha, las células (puntos negros) con las puntuaciones de la firma TME-HR más altas entre los CAF y los trofocitos provienen de las biopsias del frente invasivo (cajas, rango intercuartílico; barras negras, mediana; bigotes, 1,5 × rango intercuartílico; prueba t). e, Expresión de la firma CD8 T en tumores con el estado metastásico indicado a partir del conjunto de datos de transcriptómica espacial de WTA de CRC en etapa temprana (Fig. 1) (n = 9 pacientes; cajas, rango intercuartílico; barras negras, mediana; bigotes, 1,5 × rango intercuartílico; ANOVA P = 0,0015, prueba de Tukey). f, Supervivencia libre de enfermedad de los pacientes con CMS4 (ref. 49) estratificada por baja o media (66% inferior) frente a alta (33% superior) expresión de las firmas de los subtipos de fibroblastos indicados (100 marcadores específicos de la región, Tabla S5) (prueba de rango logarítmico). g, Matriz de correlación de células a células de scRNA-seq de fibroblastos de biopsias del núcleo y el frente invasivo. Se pueden reconocer tres subtipos de CAF (tonos verdes) dentro del grupo de CAF FAP+ (la escala de color representa la similitud del transcriptoma entre células (coeficiente de correlación de Pearson calculado sobre los 8000 genes más variables). Pistas inferiores, puntuaciones de la firma de telocitos y trofocitos para cada célula. h, Nivel de expresión de los marcadores entre los subtipos de fibroblastos. Colores, nivel de expresión; tamaño del punto, porcentaje de células que expresan los transcritos. Benjamini-Hochberg. i, GSEA de los perfiles de expresión masiva de GeoMx (WTA; n = 9 CRC T1; prueba de permutación con FDR) entre el núcleo tumoral y el frente invasivo utilizando firmas específicas del tipo celular de scRNA-seq. La longitud del lollypop, puntuación de enriquecimiento normalizada; tamaño del punto, probabilidad nominal (-log[P]). j, Inmunofluorescencia para el marcador de trofocitos SFRP2 (magenta) en el frente invasivo del CRC en etapa temprana (n = 4 tumores). Células tumorales en verde (PanCK+), núcleos en azul (SYTO13). Los paneles superiores muestran acercamientos de las regiones indicadas. La línea discontinua muestra el borde del tumor. k, Inmunofluorescencia contra FAP (púrpura) y el marcador de HRC LAMC2 (rojo) en el frente invasivo del CRC en etapa temprana (n = 3 tumores). Células tumorales en verde (PanCK), núcleos en gris (SYTO13). La tinción de PanCK y LAMC2 se muestra en amarillo. La línea discontinua blanca muestra el borde del tumor. l, Transcriptómica espacial de una sola célula de un espécimen de CRC T1 que muestra células oncofetales (alta expresión de la firma de alta recurrencia, verde brillante)14 y células cancerosas (células madre) impulsadas por WNT (verde oscuro)29. La línea discontinua muestra el borde del tumor. m, Como en l, pero que muestra trofocitos (naranja) y telocitos (amarillo). La línea discontinua muestra el borde del tumor. n, Como en l, pero que muestra los subtipos de CAF FAP+. B, célula B; IQR, rango intercuartílico; linfocitos proliferativos; MΦ, macrófago; mio, miofibroblasto; NES, puntuación de enriquecimiento normalizada; NS, no significativo; oncofetal; S1, estroma 1; SMC, célula del músculo liso; TCD8+, célula T CD8+; TCD4+, célula T CD4+; transcriptómica; Treg, célula T reguladora. Barras de escala, 200 μm (j, k); 1 mm (l–n). Datos de origen. Para relacionar los estados transcripcionales en el TME con la enfermedad metastásica, utilizamos la firma TME-alta recurrencia (TME-HR) previamente descrita y calculamos las puntuaciones de expresión para cada tipo de célula estromal14 (Fig. 3d). La firma TME-HR representa el contraparte estromal de la epiHR y predice la recurrencia. Como se esperaba, las poblaciones de células inmunitarias adaptativas, como las células T CD8+, presentaron bajas puntuaciones de la firma TME-HR, lo que sugiere una asociación inversa con la enfermedad metastásica14,47,48. Además, la deconvolución de nuestros conjuntos de datos de transcriptómica espacial pseudo-masiva (Fig. 1) con las firmas de tipo celular derivadas de scRNA-seq (Fig. S4g), reveló una disminución de la expresión de la firma de las células T CD8+ en los frentes invasivos de los CRC T1 metastásicos (Fig. 3e). Esto está en línea con la regulación a la baja de los procesos relacionados con la inmunidad en las células tumorales metastásicas (Fig. 1l). A continuación, centramos nuestra atención en los tipos de células del TME que estaban asociados positivamente con la enfermedad metastásica y que podrían estar involucrados en la inducción de fenotipos oncofetales en el CRC en etapa temprana. Las puntuaciones de TME-HR más altas se encontraron en los CAF y los trofocitos del frente invasivo. Para investigar aún más la relevancia clínica de estas subpoblaciones de fibroblastos, evaluamos su valor pronóstico en una gran cohorte de CRC49. El enriquecimiento relativo tanto de la firma de CAF del frente invasivo como de la firma de trofocitos coincidió con una menor supervivencia libre de enfermedad, incluso en los tumores CMS4 (n = 239), que se sabe que tienen un alto 4h). Para investigar el origen y la naturaleza de los CAF en las etapas iniciales del CRC, ensamblamos una matriz de correlación célula-célula de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) que contenía todos los fibroblastos de nuestras biopsias de cáncer (Fig. 3g). Además de los grupos de fibroblastos que se asemejan a trofocitos y telocitos, esto reveló tres subgrupos dentro de la población general de CAF. Si bien uno de los subgrupos de CAF mostró un claro enriquecimiento de la firma de telocitos (CAF similares a telocitos), los otros dos subgrupos de CAF fueron más similares a los trofocitos, lo que nos llevó a referirnos a ellos colectivamente como CAF similares a trofocitos (Fig. 3g y Fig. 4i, j de los datos suplementarios). Ambos subgrupos de CAF similares a trofocitos expresaron los marcadores de trofocitos SFRP2 y GREM1, además de la proteína de activación de fibroblastos (FAP), pero mostraron una expresión diferencial de los remodeladores de la matriz extracelular MMP1 y MMP3 (Fig. 3h). Para evaluar el patrón espacial de los cinco subgrupos de fibroblastos, extrajimos sus firmas de expresión (Tabla suplementaria 5) y determinamos el enriquecimiento del subtipo de fibroblastos en nuestro conjunto de datos de transcriptómica espacial de CRC T1 (Fig. 1). Al igual que el enriquecimiento de trofocitos en las biopsias del frente invasor, la firma de CAF similares a trofocitos se enriqueció significativamente en el frente invasor en el conjunto de datos de transcriptómica espacial (Fig. 3i y Fig. 5a de los datos suplementarios). Además, la inmunofluorescencia contra SFRP2, un marcador compartido por los trofocitos y las poblaciones de CAF similares a trofocitos, confirmó el enriquecimiento en el frente invasor (Fig. 3j y Fig. 5b de los datos suplementarios). Las células oncofetales LAMC2+ se colocalizaron con los CAF FAP+ (Fig. 3k), lo que se corroboró mediante el coenriquecimiento local de las firmas de oncofetos y CAF similares a trofocitos en las regiones del frente invasor de los CRC T1 examinados espacialmente (Fig. 5c de los datos suplementarios).

Para aumentar aún más la resolución espacial, realizamos una transcriptómica espacial unicelular (Nanostring CosMx) en un CRC T1 de nuestro biobanco de organoides regionales (pt5). Utilizando nuestro conjunto de datos de scRNA-seq de CRC en etapa temprana como referencia, pudimos asignar de manera confiable identidades de tipo celular a aproximadamente 630.000 células individuales (Fig. 6a, b de los datos suplementarios, consulte "Disponibilidad de datos" para obtener un panel de control interactivo). El mapa espacial unicelular resultante corroboró la presencia de células oncofetales (firma HRC, aproximadamente el 5% de todas las células tumorales) en el frente invasor (Fig. 3l y Fig. 6b-e de los datos suplementarios). Además, observamos nuevamente el patrón regional de los subtipos de fibroblastos, con los telocitos restringidos al núcleo del tumor y los trofocitos que pueblan la submucosa debajo del frente invasor (Fig. 3m y Fig. 6f de los datos suplementarios), lo que recuerda a la arquitectura del tejido normal (Fig. 6a de los datos suplementarios). Es interesante destacar que los CAF similares a trofocitos (MMP−) eran muy abundantes en un cinturón estrecho y confinado en el lado estromal de la interfaz del frente invasor, mientras que la población de CAF similares a trofocitos que residía en el lado tumoral expresaba MMP (MMP+) y se colocalizaba más fuertemente con las células oncofetales (Fig. 3n y Fig. 6g de los datos suplementarios).

En conjunto, el patrón espacial de los subtipos de fibroblastos a lo largo del eje radial del tumor en los CRC en etapa temprana se asemeja a la zonificación de los subtipos de fibroblastos a lo largo de los ejes de las criptas en el intestino normal. En particular, los trofocitos y los CAF similares a trofocitos se enriquecen en el frente invasor de los CRC en etapa temprana y están asociados con los estados de las células tumorales oncofetales, las altas firmas de TME-HR y el mal pronóstico del paciente.

Los CAF similares a trofocitos inducen plasticidad

Para probar funcionalmente si los CAF de los CRC en etapa temprana pueden inducir estados de células tumorales oncofetales, realizamos una secuenciación de ARN a granel en cocultivos de nuestros organoides T1 y líneas de fibroblastos derivadas en paralelo con los organoides (Fig. 4a y Fig. 7a, b de los datos suplementarios). Los fibroblastos se cultivaron tanto en plástico (bidimensional, 2D) como en Matrigel (tridimensional, 3D), ya que este último método puede forzar los fenotipos asociados a la invasión50. El análisis de expresión diferencial mostró una clara inducción de los programas oncofetales en los organoides tumorales cocultivados, lo que recuerda a los frentes invasores en los CRC en etapa temprana (Fig. 4b, c y Fig. 7c, d de los datos suplementarios). La inducción más fuerte se observó en el cocultivo 3D, donde los fibroblastos fenocopieron los patrones de expresión estromal de los frentes invasores de la manera más precisa, incluido la firma de CAF inflamatorios (Fig. 4d y Fig. 7e de los datos suplementarios). Por lo tanto, si bien se reduce la complejidad de todas las interacciones celulares dentro del TME en el frente invasor, nuestros cocultivos de organoides y fibroblastos in vitro recapitulan el cruce paracrino entre las células tumorales y los fibroblastos en el frente invasor.

Fig. 4: Los CAF similares a trofocitos inducen la plasticidad oncofetal a los estados de células tumorales EMP1+.
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a, Esquema del experimento de cocultivo. b, GSEA de la firma principal de HRC en organoides en diferentes condiciones de cultivo (prueba de permutación con FDR). Izquierda, 2D (n = 6) frente a monocultivo (n = 7). Derecha, 3D (n = 6) frente a 2D (n = 6). c, El cambio de registro 2 en la expresión de los genes expresados diferencialmente en el cocultivo. Se anotan los marcadores oncofetales. d, Firma de fibroblastos 3D (los 100 genes expresados diferencialmente principales clasificados por el cambio de registro 2, Padj < 0,01) expresión en las regiones de GeoMx (WTA; n = 9 pacientes). Cajas, rango intercuartílico; barras negras, mediana; bigotes, 1,5 × rango intercuartílico; prueba t). e, Genes expresados diferencialmente en 3D (n = 6) frente a 2D (n = 6) fibroblastos cocultivados. Se anotan los genes de señalización mediados por ligandos (prueba de Wald con corrección de Benjamini-Hochberg). f, Arriba, esquema de inserción de reportero de EMP1 mediado por CRISPR. Abajo, imagen de fluorescencia del organoide del reportero EMP1. g, Cribado basado en organoides para inductores del estado oncofetal. h, Arriba, cambio en las células EMP1-mNeon+ (%) frente al control. Puntos, experimentos independientes (el n exacto se muestra mediante el número de puntos de datos; barras de error, DE). Abajo, diagrama de puntos de scRNA-seq de los ligandos examinados en las biopsias del frente invasor (Fig. 3) (PGE2, PTGES; PGD2, PTGDS). i, Porcentaje de células EMP1-mNeon+ en diferentes condiciones. Prostaglandina, PGD2 + PGE2. TGFβ, TGFβ1 + TGFβ3 (n = 5; media + DE; ANOVA, corrección de Bonferroni). j, GSEA de las firmas oncofetales y de células madre cancerosas (CSC) en organoides tratados con TGFβ (TGFβ1 + TGFβ3) y prostaglandinas (PGD2 + PGE2) (n = 2 pacientes; 3 réplicas; prueba basada en permutación, corrección de Benjamini-Hochberg). k, Similar a j, pero expresión relativa de los genes de la firma principal de HRC. l, qPCR de los marcadores oncofetales y LGR5, después de 24 horas de tratamiento con PGD2, PGE2, TGFβ1 y TGFβ3 en 7 líneas de organoides independientes de 4 CRC en etapa temprana. Valores normalizados a DMSO, media + DE. Puntos, mediciones independientes (n = 3; *P < 0,05, prueba t pareada de razón). La ilustración en g se adaptó de NIH BioArt (https://bioart.niaid.nih.gov/bioart/160); la ilustración en l se reprodujo de NIH BioArt (https://bioart.niaid.nih.gov/bioart/661). DMSO, dimetilsulfóxido; IRES, sitio de entrada ribosómica interna, mono, monocultivo; NLS, señal de localización nuclear; pA, poli(A); PuroR, casete de resistencia a la puromicina. Barra de escala, 20 μm (f).
Datos de origen

Para identificar los ligandos que inducen la plasticidad oncofetal, aprovechamos el hecho de que las condiciones de cultivo de fibroblastos 3D produjeron una inducción más fuerte del programa oncofetal que la condición 2D. Los fibroblastos tridimensionales mostraron una mayor expresión de TGFB3 (Fig. 4e), que también se sobreexpresa en los trofocitos y los CAF similares a trofocitos del frente invasor in vivo (Fig. 8a, b de los datos suplementarios) y, junto con TGFB1, se predijo que sería un potente regulador de los programas oncofetales como HRC en un análisis de comunicación célula-célula que utiliza la inferencia de ligandos y objetivos (NicheNet)26 (Fig. 8c de los datos suplementarios). Además de la expresión de TGFβ, los fibroblastos 3D fenocopieron los CAF similares a trofocitos in vivo al expresar la prostaglandina sintasa 2 (PTGS2, también conocida como COX2) (Fig. 4e y Fig. 8b de los datos suplementarios), que es una enzima limitante de la velocidad para la producción de prostaglandinas51. Se ha implicado que las prostaglandinas, ausentes en NicheNet, inducen estados regenerativos y fetales en las células epiteliales52,53 y, por lo tanto, también representan un posible regulador de la plasticidad oncofetal en el frente invasor.

Para probar experimentalmente los posibles estímulos de la plasticidad oncofetal (Fig. 8c de los datos suplementarios), editamos los organoides del frente invasor de los CRC en etapa temprana con un reportero fluorescente mediado por CRISPR en el locus EMP1 (Fig. 4f, g, Fig. 8d de los datos suplementarios y Fig. 3 suplementaria), el gen marcador que se utilizó para validar el papel esencial de los HRC en la recurrencia metastásica14. Entre los estímulos estromales probados, el tratamiento con TGFβ y prostaglandinas indujo el mayor aumento en la fracción de células EMP1+ (Fig. 4h), lo que produjo los resultados más altos y consistentes cuando se combinaron los dos (Fig. 4i y Fig. 8e, f de los datos suplementarios). Por el contrario, los factores secretados por los telocitos (BMP2, BMP4, WNT5a y CXCL14), las citocinas inflamatorias (factor de necrosis tumoral, interleucina-1b (IL-1b), IL-27, IL-36a, IL-36b) (Fig. 4h) o la exposición al colágeno (Fig. 8g de los datos suplementarios) no indujeron células EMP1+. Validamos la inducción del estado de las células oncofetales por TGFβ y prostaglandinas con la secuenciación de ARN (Fig. 4j, k) y la inmunofluorescencia contra LAMC2 (Fig. 8h de los datos suplementarios). De acuerdo con nuestros hallazgos anteriores, observamos que el programa oncofetal se podía inducir tanto en los organoides del frente invasor como en el núcleo tumoral (Fig. 4l y Fig. 2e de los datos suplementarios), lo que subraya que la plasticidad oncofetal se induce de forma extrínseca. Además, los niveles del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHCI) no fueron diferentes entre las células EMP1+ y EMP1− (Fig. 8i-k de los datos suplementarios), lo que apoya la noción de que la plasticidad oncofetal parece estar desconectada de la adquisición de propiedades inmunoevasivas.

En conjunto, nuestros experimentos in vitro confirman que los gradientes de señalización, establecidos por el patrón espacial de los subtipos de fibroblastos, contribuyen a la primera inducción y confinamiento local de la plasticidad oncofetal en los frentes invasores en las etapas más tempranas del CRC.

Mapeo del nacimiento de la plasticidad del CRC

Para dilucidar el momento y el origen de las diversas poblaciones de CAF que identificamos, realizamos una transcriptómica espacial unicelular adicional en 11 especímenes de CRC en etapa temprana que se capturaron en momentos críticos justo antes y después de la transformación maligna. Específicamente, analizamos aproximadamente 1,25 millones de células (panel de 6000 sondas de genes) en 3 subetapas pseudo-longitudinales que delimitan el inicio de la malignidad, es decir, antes de la formación del frente invasor en la submucosa (carcinoma intramucoso, n = 3), inmediatamente después (T1 sm1, n = 5) y una vez que el frente invasor se establece de forma robusta más allá de la muscularis mucosae (T1 sm3, n = 3) (Fig. 5a, b y Fig. 9a de los datos suplementarios).

Fig. 5: Los CAF similares a trofocitos y la plasticidad oncofetal surgen simultáneamente en el nacimiento de la malignidad.
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a, Transcriptómica espacial unicelular pseudo-longitudinal de 11 CRC en etapa temprana (CosMx; panel de 6000 sondas). b, UMAP de los compartimentos epiteliales (izquierda) y microambientales (derecha). c, Abundancia relativa (%) de los tipos de células tumorales y los fibroblastos en la transcriptómica espacial unicelular de los especímenes intramucosos (n = 3), T1 sm1 (n = 5) y T1 sm3 (n = 3). d, Diagramas espaciales unicelulares que muestran la localización de las células cancerosas (células madre cancerosas, CSC, verde oscuro), las células oncofetales (verde brillante, firma HRC), los trofocitos (naranja) y los CAF similares a trofocitos (púrpura) en los especímenes representativos intramucosos, T1 sm1 y T1 sm3. e, Porcentaje de células tumorales LAMC2+ oncofetales (dentro del epitelio PanCK+) y CAF FAP+ (dentro del estroma PanCK−) justo antes del carcinoma intramucoso (n = 3) y poco después (T1 sm1 n = 3 y T1 sm3 n = 3) de la transformación maligna. f, Inmunofluorescencia de los especímenes tumorales justo antes y después de la transformación maligna. Núcleos (gris, SYTO13), células epiteliales (verde, PanCK), células tumorales oncofetales (rojo, LAMC2) y CAF (púrpura, FAP) están teñidos. Naranja, coexpresión de PanCK y LAMC2. Línea discontinua blanca, muscularis mucosae. g, Composición diferencial de los tipos de células de los vecindarios oncofetales y de CSC (radio de 50 μm; n = 11 pacientes). Bigotes, intervalo creíble del 95%, codificado por colores según la significación (FDR < 0,05). h, puntuaciones ssGSEA para las vías de señalización de TGFβ y las prostaglandinas en los microentornos estromales de las células tumorales oncofetales y CSC, según el estadio tumoral (n = 11 pacientes; cuadros, rango intercuartílico; barras grises, mediana; bigotes, 1,5 × rango intercuartílico). i, UMAP de los conjuntos de datos de secuenciación de ARN de células únicas del microentorno tumoral de CRC integrados45,54,55 (n = 110 pacientes). Izquierda, agrupación no supervisada y anotaciones de tipos de células. Derecha, ampliación de fibroblastos, divididos en tejido normal y tumoral. j, UMAP de fibroblastos de la secuenciación de ARN de células únicas integrada, con líneas de flujo que muestran las trayectorias inferidas de Monocle, Slingshot y CytoTRACE en el tiempo. k, Contribución relativa de los subtipos de fibroblastos al compartimento total de fibroblastos en el tejido normal, y en los CRC en estadio temprano (I-II) y avanzado (III-IV). Im, intramucoso; MM, muscularis mucosae. Barras de escala, 1 mm (d); 200 μm (f). Datos fuente. La asignación detallada de los tipos de células basada en el transcriptoma (Fig. 5c, d), y la confirmación mediante inmunofluorescencia (Fig. 5e, f y Fig. 9b del material suplementario), indicaron que estas muestras capturan el momento preciso en el que emergen los estados de células tumorales oncofetales LAMC2+ y los CAF FAP+, y ambos tipos de células están ausentes en los carcinomas intramucosos y están cada vez más presentes en los frentes invasivos de T1 sm1 a T1 sm3. Los CAF de tipo trofocítico se encontraron primero inmediatamente después de la transformación maligna (T1 sm1), mientras que los carcinomas intramucosos solo contenían trofocitos residentes en el tejido (Fig. 5c, d y Fig. 9c del material suplementario). Dentro de la población de CAF de tipo trofocítico, los fibroblastos MMP+ parecen surgir más tarde, con una alta abundancia en los frentes completamente desarrollados de los cánceres T1 sm3 (Fig. 5c, d y Fig. 9c del material suplementario). En particular, ambas poblaciones de CAF en estadio temprano (MMP− y MMP+) se encontraron predominantemente en el microentorno espacial de los estados de células tumorales oncofetales (Fig. 5g y Fig. 9d del material suplementario), lo que coincide con la elevación local de la señalización de TGFβ y las prostaglandinas (Fig. 5h y Fig. 9e del material suplementario). A continuación, utilizamos los numerosos fibroblastos identificados en estas muestras de CRC en estadio temprano (aproximadamente 40.000) para estudiar las posibles relaciones y transiciones entre los subtipos de fibroblastos. Observamos muchas células que constituyen intermediarios entre los trofocitos residentes en el tejido y los CAF de tipo trofocítico (Fig. 9f del material suplementario), lo que sugiere una posible transición entre estos estados. El parecido fenotípico de los CAF de tipo trofocítico con los trofocitos, junto con su aparición en la submucosa rica en trofocitos en el estadio T1 sm1, sugiere que los trofocitos submucosos son una fuente celular importante de CAF y probablemente sus primeras células de origen. Este modelo está aún más respaldado por los análisis de inferencia de trayectorias en conjuntos de datos de secuenciación de ARN de células únicas publicados45,54,55 del microentorno de CRC (Fig. 5i, j y Fig. 10a-d del material suplementario), que atribuyen el mayor potencial de diferenciación a los trofocitos residentes en el tejido (Fig. 10e del material suplementario) y confirman la trayectoria de diferenciación de los trofocitos a los CAF (Fig. 5i, j). Por último, utilizando este conjunto de datos de secuenciación de ARN de células únicas integrado, observamos la misma diversidad de subtipos de fibroblastos en los CRC en estadio temprano y tardío, mientras que las proporciones relativas de los subtipos de fibroblastos divergieron (Fig. 5k y Fig. 10f del material suplementario). En general, nuestros datos muestran que los estados de células tumorales oncofetales emergen poco después de la disolución de la muscularis mucosae, en las primeras etapas de la formación del frente invasor. Además, esta plasticidad oncofetal temprana coincide con y está impulsada por la transición de los trofocitos submucosos hacia fenotipos similares a los CAF (Fig. 10g del material suplementario).

Discusión

Aunque se dedican muchos recursos a comprender y combatir la enfermedad metastásica, es sorprendente lo poco que entendemos sobre el momento y los mecanismos por los cuales surge inicialmente la competencia metastásica durante la progresión tumoral. Aquí proporcionamos una caracterización funcional de la etapa más temprana de CRC en pacientes, que se caracteriza por la formación del frente invasor tras la transformación maligna. En prácticamente todos los CRC en estadio temprano examinados, encontramos evidencia clara de estados celulares que se asocian clásicamente con la competencia metastásica. Además, utilizando modelos de organoides multirregionales emparejados, proporcionamos evidencia funcional de que estos estados celulares de novo en el frente invasor son el resultado de la plasticidad oncofetal que es iniciada por factores ambientales.

La observación de que la adquisición temprana de estados de células oncofetales es una característica común en lugar de una excepción, junto con el hecho de que la mayoría de los CRC en estadio temprano no muestran signos de siembra metastásica, indica que las células oncofetales pueden ser esenciales pero no suficientes para el éxito metastásico. De hecho, la comparación de tumores con y sin siembra metastásica temprana sugirió la coadquisición de propiedades inmunoevasivas como un requisito adicional importante3,6. El momento y los mecanismos por los cuales aparecen las propiedades inmunoevasivas, y si continúan evolucionando a medida que el cáncer progresa a etapas más avanzadas, merecen una mayor investigación. Asimismo, es necesario explorar si el aumento relativo de las células oncofetales durante la progresión de la enfermedad se debe a la evolución de los microentornos tumorales o a la hipersensibilidad intrínseca de las células para las señales de reprogramación de tipo fetal35,39,56.

Aunque las investigaciones previas subrayan el importante papel de los CAF en el CRC52,57,58,59,60, el momento en que emergen, su origen y cómo la heterogeneidad dentro de la población de CAF se relaciona con la función, han seguido siendo en gran medida esquivos. Nuestro análisis de los pseudoestadios temporales que rodean la transformación maligna indica que los CAF de tipo trofocítico y la plasticidad oncofetal surgen casi simultáneamente en el espacio y el tiempo. En particular, la capacidad de los CAF de tipo trofocítico para inducir estos fenotipos, junto con la observación de que los tumores FAP+ sin LAMC2 eran más comunes que los tumores LAMC2+ sin FAP (Fig. 1k, n = 35 frente a n = 3, respectivamente), sugieren que los CAF de tipo trofocítico generalmente aparecen primero.

La heterogeneidad y el patrón de los subtipos de fibroblastos orquestan los gradientes de señalización que regulan el destino celular en el epitelio intestinal44,46,61,62,63. De manera similar, encontramos una gran diversidad de subtipos de fibroblastos en los CRC en estadio temprano, incluidos los fibroblastos residentes en el tejido, como los trofocitos en la submucosa, y los telocitos hacia el lado luminal del cáncer. Lo más sorprendente es la diversidad dentro de la población de fibroblastos que se denomina comúnmente CAF. Esta población de CAF muestra subtipos que se asemejan a los trofocitos y telocitos mencionados anteriormente. Además de su similitud fenotípica, muestran un patrón dentro del tumor similar al de la mucosa normal, con CAF de tipo trofocítico concentrados en la interfaz tumor-estroma del frente invasor y CAF de tipo telocítico que residen en el núcleo del tumor hacia el lado luminal.

Las relaciones transcriptómicas entre los estados de los fibroblastos y su aparición sucesiva en los atlas espaciales de células únicas con tiempo simulado que capturan el inicio de la malignidad respaldan una trayectoria de diferenciación en la que los trofocitos residentes en el tejido hacen la transición hacia los CAF de tipo trofocítico durante las primeras etapas de la formación del frente invasor. Si bien los trofocitos parecen ser los primeros en hacer la transición, nuestros datos indican que los telocitos también pueden ser susceptibles a la transición a los CAF (CAF de tipo telocítico). Es de gran interés estudiar si el mismo patrón de subtipos de CAF observado en los CRC en estadio temprano se mantiene en las etapas más avanzadas de CRC y si los mismos ejes de señalización que gobiernan el patrón de los fibroblastos en el tejido normal, como la señalización de BMP63, son responsables del patrón de los subtipos de fibroblastos en el cáncer. Además, será importante comprender las señales que participan en la primera transformación de las poblaciones de fibroblastos residentes en el tejido hacia los subtipos de CAF, ya que la interferencia en este proceso puede representar una estrategia terapéutica indirecta para afectar los estados de las células tumorales y la competencia metastásica.

Las limitaciones prácticas han obstaculizado el progreso científico en los CRC en estadio temprano. Los modelos de organoides, junto con los atlas de células únicas que describen los estados y la arquitectura de las células in vivo, proporcionan recursos funcionales para comenzar a comprender las primeras etapas que siguen a la transformación maligna de un precáncer a un cáncer y el origen de la enfermedad metastásica.

Métodos

Este estudio fue aprobado por el comité de ética del Centro Médico Universitario (UMC) de Utrecht, se llevó a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones éticas y todos los pacientes proporcionaron el consentimiento informado por escrito. Se solicitaron y se obtuvieron muestras de FFPE para inmunohistoquímica y transcriptómica espacial del departamento de patología del UMC de Utrecht. La inclusión de pacientes en el biobanco de organoides fue gestionada por la Plataforma de Organoides de Utrecht (https://uport.umcutrecht.nl/researcher/en/). Los participantes del biobanco fueron 16 pacientes sospechosos de tener CRC en estadio temprano que se sometieron a cirugía para la extirpación del tumor primario, en lugar de la extirpación endoscópica, debido a la inaccesibilidad del tumor. Los datos clínicos de los pacientes incluidos en este estudio se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 1.

Transcriptómica espacial masiva GeoMx

Los experimentos de Nanostring GeoMx se llevaron a cabo en la Instalación de Secuenciación de Utrecht (USEQ) y se realizaron según lo descrito anteriormente en la ref. 65. En resumen, se analizaron 10 CRC en estadio T1 (5 × T1N0M0 y 5 × T1N1M0) utilizando el panel GeoMx CTA (Cancer Transcriptome Atlas) y 9 CRC en estadio T1 (3 × T1N0M0, 3 × T1N1M0 y 3 × T1N0M1) se analizaron utilizando el panel GeoMx WTA. Los especímenes analizados por CTA se seleccionaron de tal manera que los factores de riesgo, incluidos la invasión linfovascular, la gemación tumoral, la ubicación y la morfología, fueran similares entre los tumores metastásicos y no metastásicos primarios. Los especímenes se tiñeron con PanCK (Novus Biologicals, NBP2-33200AF532, 2 μg ml−1) para visualizar el epitelio, CD45 (Novus Biologicals, NBP2-34528AF594, 5 μg ml−1) para visualizar las células inmunitarias y SYTO13 (Invitrogen, S7575, 500 nM) para visualizar los núcleos. Se colocaron ROI que contenían de 100 a 1.000 núcleos en 4 regiones histopatológicas por tumor: tejido normal adyacente al tumor, componente tumoral adenomatoso, núcleo tumoral y frente invasor. Los ROI del frente invasor se colocaron de manera consistente, con hebras de tumor epitelial que penetraban en el tejido de soporte durante aproximadamente tres cuartas partes del borde del ROI perpendicular al borde del tumor. Después de la colocación del ROI, la inmunofluorescencia de PanCK se utilizó para segmentar los compartimentos epiteliales (PanCK+) y estromales (PanCK−) para el perfilado transcriptómico separado. Para la cohorte de CTA, las áreas negativas y positivas para CD45 dentro del compartimento estromal se perfilaron por separado, pero se sumaron durante el análisis para la comparabilidad con el experimento de WTA. Se aplicó un control de calidad estándar (umbral de control de calidad unificado) a ambos experimentos y se puede ver en los Informes Suplementarios 1 y 2. En total, se muestrearon 426 (CTA) y 285 (WTA) ROI en todos los especímenes, de los cuales se retuvieron 373 y 281 ROI después del control de calidad para los experimentos de CTA y WTA, respectivamente. A nivel del gen, se retuvieron 1.781 de 1.812 y 18.441 de 18.677 genes después del control de calidad para los experimentos de CTA y WTA, respectivamente. Los recuentos de sondas se agregaron por gen objetivo, se normalizaron con Q3, se corrigieron por lotes (con "nombre de la diapositiva" como el lote a corregir) y se transformaron logarítmicamente. Para todos los análisis posteriores, se excluyó la muestra pt17 (T1NANO013), porque se clasifica como un tumor T3. Para el análisis de partición de varianza, se utilizó el paquete R VariancePartition66 (v.1.38.1). Para comparar diferentes regiones de tejido dentro de un espécimen y entre diferentes especímenes, utilizamos un enfoque de modelo lineal mixto para modelar la expresión normalizada por separado para los segmentos epiteliales y estromales: log2(gen) ~ región de tejido + (1 + región de tejido | ID del paciente). Para el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA), se aplicaron dos métodos: GSEA preranked (fgsea67 v.1.24.0) y GSEA de una sola muestra (ssGSEA68 implementado en GSVA v.1.46.0). Los conjuntos de genes analizados se obtuvieron de MsigDB (https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb), del presente estudio o de la literatura publicada (resumido en la Tabla Suplementaria 3). Las regiones del cohortes WTA se utilizaron para la clasificación CMS19 e iCMS20. Para la clasificación CMS, se sumaron los recuentos de transcritos brutos de los segmentos adyacentes PanCK+ y PanCK− por área de interés y, posteriormente, se sumaron por ID de paciente y región tisular. El paciente F fue excluido de este análisis, ya que los segmentos PanCK− y PanCK+ no se encontraban en las mismas áreas de interés. Estas muestras pseudo-a granel se utilizaron como entrada para CMScaller19 (v.2.0.1), que se ejecutó con ‘RNAseq = TRUE’ junto con los parámetros predeterminados. Finalmente, se calculó la fracción de núcleos estromales para cada área de interés. Para la clasificación iCMS, CMScaller se ejecutó solo con los recuentos de genes PanCK+ brutos y ‘RNAseq = TRUE’. Los conjuntos de genes Up de CMS2 e iCMS320 se utilizaron como plantillas para clasificar los segmentos.

Predicción de CNA de GeoMx
Los perfiles de alteración del número de copias (CNA) de las células epiteliales de las diferentes regiones histopatológicas se estimaron utilizando inferCNV (v.1.14.2; ‘cutoff = 0.1’; utilizando tejido normal como grupo de referencia y excluyendo los cromosomas XY y los genes mitocondriales). Las ganancias y pérdidas de los brazos cromosómicos se definieron como una expresión residual media de más de 1.1 o menos de 0.9 en todos los genes de ese brazo, respectivamente. Se excluyeron los brazos cortos de los cromosomas acrocéntricos (13p, 14p, 15p, 21p, 22p) y ambos brazos de los cromosomas sexuales. Para calcular las similitudes coseno por pares entre las ROI del mismo tumor, la expresión residual media por brazo cromosómico se redondeó al decimal más cercano.

Inmunohistoquímica de CCRC
Los hallazgos de la transcriptómica espacial se validaron mediante la tinción por inmunohistoquímica en cortes consecutivos de los tumores T1 seleccionados. Aquí, se montaron secciones tumorales de 5 µm incrustadas en parafina en portaobjetos de vidrio y se incubaron a 60 °C durante 1 hora. La desparafinización y rehidratación se realizaron de la siguiente manera: xileno (3 min, 1 cambio), etanol al 96 % (3 min, 1 cambio), etanol al 70 % (3 min, 1 cambio), lavado en agua desionizada y lavado en agua del grifo. Se realizó una recuperación de antígenos mediada por calor durante 20 minutos en un tampón de Tris/EDTA 50 mM/1 mM pH 9.4 a 95 °C. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: SFRP2 (PA5-29390, Invitrogen, 1:200), LAMC2 (AMAb91098, Atlas Antibodies, 1:500), PanCK (conjugado con AlexaFluor 532; NBP2-33200 Novus 1:500 y NBP3-08398 Novus 1:300) y DNA Syto 13 (S7575, Invitrogen, 1:10 000). Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios: Alexa 594 anti-conejo (Invitrogen A11037; 2 µg ml−1) y Alexa 594 anti-ratón (Invitrogen A11032; 2 µg ml−1). Los portaobjetos se escanearon en el GeoMx Digital Spatial Profiler (Nanostring) con un objetivo de 0,45 de apertura numérica ×20 y se analizaron utilizando la extensión Instanseg (v.0.6.0) de QuPath69. En resumen, cuantificamos todas las células dentro del frente invasor (1 mm de profundidad, medido desde el borde del tumor), independientemente del ancho del tumor. Dentro de los frentes invasores, los núcleos y los cuerpos celulares epiteliales se segmentaron en función de las intensidades de los píxeles de Syto13 y PanCK, después de lo cual se calcularon los porcentajes de células LAMC2+ (en el epitelio) y los porcentajes de células SFRP2+ y FAP+ (en el estroma). Las cuantificaciones se visualizaron con GraphPad Prism (v.10.4.1).

Microarreglo de tejido de CCRC T1
Se seleccionó un cohortes de 261 pacientes con CCRC T1 no pediculados de un estudio de cohortes multicéntrico de CCRC holandés37. Este cohortes de casos consta de un 50 % de pacientes seleccionados aleatoriamente de un cohortes T1 más amplio, complementado con un 50 % de pacientes con un punto final de interés (metástasis ganglionares y/o recurrencia), como se describió anteriormente. Para cada muestra de tumor, se obtuvieron tres núcleos (Ø 0,6 mm) tanto del centro del tumor como del frente invasor y se colocaron en bloques de parafina utilizando un microarreglo de tejidos automatizado. Los bloques de microarreglo de tejidos se cortaron en secciones de 4 µm de grosor y se tiñeron con anticuerpos contra el núcleo, PanCK, LAMC2 y FAP, como se describe en la sección "Inmunohistoquímica de CCRC". Después del control de calidad, se analizaron y cuantificaron 232 tumores (175 N0M0, 44 N+, 13 M+), utilizando el software QuPath (v.0.6.0) para la visualización y GraphPad Prism (v.10.4.1) para la visualización.

Biobanco de organoides
Se generaron cultivos de organoides a partir de biopsias obtenidas con punzón (Ø de aproximadamente 3 mm) de CCRC quirúrgicamente extirpados. Las regiones histopatológicas muestreadas incluyeron: tejido normal adyacente al tumor, componente tumoral adenomatosa, núcleo tumoral (carcinoma) y frente invasor. Después de la toma de muestras de un tumor fresco mediante biopsias con punzón, las muestras tumorales restantes se fijaron, se incluyeron en parafina, se cortaron y se tiñeron con H&E para validar el muestreo preciso mediante el examen histopatológico del tejido que rodea los orificios resultantes de las biopsias con punzón. Para la derivación de organoides, las biopsias con punzón se picaron con tijeras y se sometieron a una digestión enzimática a 37 °C durante 15 a 25 minutos con 1 mg ml−1 de colagenasa (Sigma C9407) y 1 mg ml−1 de Dispase II (Gibco 11510536) en un medio basal (advanced DMEM (Gibco) suplementado con un 1 % de tampón HEPES (Gibco), un 1 % de GlutaMAX (Gibco) y un 1 % de penicilina/estreptomicina (Lonza)). Los fragmentos de tejido resultantes se lavaron 3 veces mediante centrifugación (500 g, 4 min) y resuspensión en 2 ml de medio basal, y luego se dividieron en una fracción utilizada para la preservación criogénica en Recovery Medium (Gibco, 11560446) y una fracción utilizada para la derivación de organoides. Esta última se resuspendió en Matrigel frío (Corning) y se colocó en forma de cúpulas en placas de cultivo de plástico precalentadas. Tras la solidificación (37 °C, 15 min) del Matrigel, se añadió el medio de cultivo de organoides (medio basal con 0,5 nM de proteína de fusión sustituta de Wnt-FC (U-Protein Express), 20 % de medio acondicionado R-spondin (producción interna), 10 % de medio acondicionado Noggin (producción interna), 1 × B27 (Invitrogen), 1,25 mM de N-acetilcisteína (Sigma-Aldrich), 50 ng ml−1 de factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (Invitrogen), 50 ng ml−1 de factor de crecimiento similar a la insulina humano recombinante (IGF1) (Biolegend), 50 ng ml−1 de factor de crecimiento de fibroblastos humano recombinante (FGF2, FGF-básico, Peprotech) y 500 nM de A83-01 (Tocris)), suplementado con 100 µg ml−1 de Primocin (InvivoGen) y un inhibidor de la quinasa Rho de 10 µM Y-27632 (Gentaur). Los organoides se mantuvieron en medio de cultivo sin Primocin a 37 °C con 5 % de CO2 y se pasaron semanalmente mediante tripsinización (37 °C, 1-4 min, tripsina-EDTA, Sigma T3924). Después de la tripsinización para el pasaje, se añadió medio suplementado con Y-27632 durante 3 días. Las culturas se analizaron periódicamente para detectar contaminación por micoplasma.

La disponibilidad de las líneas de organoides que se han generado en este estudio está restringida por el comité de ética de la UMC Utrecht. Para recibir estas líneas de organoides, se debe presentar una solicitud con los formularios correspondientes a este comité, que determinará si la solicitud se corresponde con el consentimiento informado del paciente.

Ensayos de dependencia de factores de crecimiento de organoides
Para evaluar la dependencia de los factores de crecimiento de las líneas de organoides, los organoides se colocaron como células individuales y se cultivaron durante 9 días en presencia o ausencia de los factores de crecimiento e inhibidores indicados (Nutlin-3 (Sanbio 10004372), 5 ng ml−1 de factor de crecimiento transformador beta humano recombinante (TGFB1) (Immunotools 11343160), 20 ng ml−1 de factor de crecimiento de células madre óseas humano recombinante (BMP2) (Immunotools 11343273) y 20 ng ml−1 de factor de crecimiento de células madre óseas humano recombinante (BMP4) (Immunotools 11345043), 1 µM de afatinib (SelleckChem)). En resumen, los organoides se tripsinizaron con tripsina-EDTA, se filtraron con un tamiz celular de 30 µm (Sysmex), se sembraron a 3000 células por condición en gotas de 10 µl de Matrigel (Corning) en placas de cultivo e imagen de 96 pocillos con fondo de vidrio (IBIDI) y se cubrieron con 70 µl de medio. El medio se renovó en los días 3 y 6 después de la siembra. El crecimiento de los organoides se controló mediante imagen de campo claro utilizando un sistema de imagen EVOS (Invitrogen). Para evaluar la eficiencia de crecimiento por condición, se determinó el área total de los organoides en las imágenes de campo claro del noveno día después de la siembra. Para ello, las imágenes se segmentaron con el software OrganoSeg64 y se analizaron con una macro personalizada de ImageJ/Fiji.

WGS de organoides
Para el WGS, se extrajo el ADN de los cultivos de organoides lo antes posible (siempre antes del octavo pasaje) utilizando el kit de ADN micro (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. La preparación de la biblioteca Truseq DNA nano WGS y la secuenciación (Illumina NovaSeq 6000 o X; 2 × 150 pb; cobertura 15-30×) se realizaron en USEQ. Los variantes somáticos se identificaron utilizando la implementación nf-core (oncoanalyser v.1.0.0: https://github.com/nf-core/oncoanalyser del pipeline de la Fundación Médica Hartwig (https://github.com/hartwigmedical/pipeline5). El pipeline se ejecutó en modo TUMOR_GERMLINE (‘mode’, ‘wgts’). Los datos de referencia relevantes, los índices precompilados y el genoma de referencia (genoma de referencia humano Hartwig GRCh38) se descargaron del repositorio público antes de ejecutar el pipeline. La pérdida heterocigótica de SMAD4 se anotó manualmente en función de los datos de CNA del cromosoma 18q.

Para la construcción de árboles filogenéticos de linaje, se identificaron y filtraron los variantes compartidos por muchas muestras del mismo paciente utilizando la llamada de variantes conjunta por GATK HaplotypeCaller (v.4.1.3, parte del pipeline NF-IAP; https://github.com/UMCUGenetics/NF-IAP). SMuRF (v.3.02, https://github.com/ToolsVanBox/SMuRF) se utilizó para filtrar los variantes somáticos (ausentes en las muestras normales) de los archivos VCF de múltiples muestras. Se incluyeron los variantes somáticos pequeños de alta confianza con una frecuencia de variantes de más de 0,25 en al menos 1 muestra para generar una tabla de mutaciones binaria. El paquete R ape (v.5.8) se utilizó para construir y visualizar los árboles de linaje.

scRNA-seq basado en placas
Para caracterizar la composición del tipo celular en el CRC en etapa temprana, realizamos scRNA-seq en fragmentos de tejido de cinco CCRC que se criopreservaron en paralelo con el establecimiento de organoides de las biopsias con punzón mencionadas en la sección "Biobanco de organoides". Para ello, los fragmentos de tejido se descongelaron, se lavaron con medio basal y se tripsinizaron hasta obtener suspensiones de células individuales utilizando TrypLE (Gibco 12604013) suplementado con 10 µM de Y-27632 durante 5 minutos a 37 °C. Para distinguir las poblaciones de células epiteliales, inmunitarias y estromales y ordenar cantidades iguales de estas tres poblaciones, las suspensiones de células individuales se tiñeron con DRAQ7 (Invitrogen, 1:200), ficoeritrina anti-humano CD326 (EpCAM) (324205 9C4, Biolegend, 1:200) y fluoresceína isotiocianato (FITC) anti-CD45 (368507 2D1, Biolegend, 1:200) en advanced DMEM/F12 durante 30 minutos sobre hielo. Las células viables (DRAQ7−) se ordenaron (BD FACSAria III) en placas de captura de células de 384 pocillos de Single Cell Discoveries, que contienen una gota de 50 nl de cebadores específicos del pocillo y 10 µl de aceite mineral (Sigma M8410). Después del ordenamiento, las placas se centrifugaron brevemente (500 g) y luego se mantuvieron sobre hielo seco hasta su posterior almacenamiento a −80 °C. Single Cell Discoveries realizó scRNA-seq según una versión adaptada del protocolo SORT-seq70 con cebadores descritos en la ref. 71. Las células se lisiaron por calor a 65 °C seguido de la síntesis de ADN complementario (ADNc). Después de la síntesis de la segunda cadena de ADNc, todo el material con código de barras de una placa se agrupó en una biblioteca y se amplificó mediante la transcripción in vitro. Tras la amplificación, se preparó la biblioteca siguiendo el protocolo CEL-Seq272 para preparar una biblioteca de ADNc para la secuenciación utilizando cebadores TruSeq small RNA (Illumina). La biblioteca de ADN se secuenció mediante secuenciación de apareamiento en un Illumina NextSeq 500, alto rendimiento, con un kit Illumina de 1 × 75 pb (lectura 1, 26 ciclos; lectura de índice, 6 ciclos; lectura 2, 60 ciclos).

Análisis de scRNA-seq
Para la alineación de las lecturas, se utilizó una versión adaptada del pipeline nf-core scrnaseq (v.2.4.0)73 (https://github.com/gowanaka/nf-core-scrnaseq). En resumen, STARsolo (v.2.7.10b) se utilizó para alinear las lecturas a un transcriptoma humano GRCh38 personalizado que incluye los controles de picos ERCC. Tras el mapeo, se generaron matrices de recuento con STARsolo (v.2.7.10b). Se analizó la expresión génica utilizando Seurat (v.5.0.1)74. Se seleccionaron para el análisis posterior las células con menos del 25% de contenido mitocondrial, menos del 25% de contenido exógeno de ERCC (spike-in), más de 1000 recuentos de transcritos (nCountRNA) y más de 500 genes únicos detectados (nFeatureRNA). Los recuentos de transcritos mitocondriales se eliminaron antes de la normalización y el escalado de los recuentos mediante las funciones Seurat NormalizeData y ScaleData, respectivamente. Se utilizó un agrupamiento no supervisado para agrupar las células según el flujo de trabajo estándar de Seurat. Los puntajes de la firma de expresión génica se calcularon con la función Seurat AddModuleScore. El análisis de expresión diferencial se realizó con la función FindAllMarkers.

CosMx, transcriptómica espacial unicelular

Para mapear la distribución espacial de los tipos de células identificados con scRNA-seq, realizamos una transcriptómica espacial unicelular Nanostring CosMx75 en un CRC T1 incluido en el biobanco de organoides (pt5/ptD; Panel de caracterización celular universal humano CosMx; 1000 genes objetivo; Fig. 3) y 11 muestras de CRC temporalmente cercanas al momento de la transformación maligna (3 × carcinoma intramucoso, 5 × T1 sm1 y 3 × T1 sm3; Panel de descubrimiento CosMx 6000 humano; 6000 genes objetivo, Fig. 5). Las láminas se tiñeron con marcadores de segmentación (Kit de segmentación celular universal humano, ARN, Bruker Spatial Biology, 531-121500020) para los núcleos (4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)), las membranas celulares (CosMx Hs CD298/B2M Segmentation Marker Mix, Ch2 RNA), las células epiteliales e inmunitarias (CosMx Hs PanCK/CD45 Marker Mix Ch3/Ch4, ARN, Bruker Spatial Biology) y los macrófagos (CosMx Hs CD68 A La Carte Marker, Ch5 RNA, Bruker Spatial Biology, 531-121500022, solo en el segundo experimento). Después de la filtración basada en el control de calidad estándar, las células se etiquetaron según el tipo de célula predicho utilizando la transferencia de etiquetas del paquete Seurat (v.5.0.1)74, con nuestro conjunto de datos de scRNA-seq de CRC en etapa temprana como referencia. Los conjuntos de datos de consulta y referencia se redujeron para incluir solo los genes objetivo superpuestos antes de la transferencia de etiquetas, y ambos se normalizaron y escalaron utilizando el método SCTransform. Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) para los datos de scRNA-seq. Se utilizaron FindTransferAnchor() y TransferData() para anclar los datos de referencia de PCA de scRNA-seq a los datos de consulta de CosMx y transferir las etiquetas de tipo de célula. Después de la transferencia de etiquetas, los datos brutos de CosMx se normalizaron y escalaron nuevamente utilizando SCTransform. Se realizó PCA en los datos normalizados. Se utilizó la aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) (30 componentes principales, min.dist = 0.01) para la reducción de dimensionalidad. Se construyeron gráficos de vecinos más cercanos utilizando los primeros 30 componentes principales. Se realizó un agrupamiento no supervisado utilizando la implementación predeterminada del algoritmo de Louvain de Seurat (resolución 0.7). En los gráficos donde se muestran las etiquetas de tipo de célula, solo se muestran las células que fueron anotadas con prediction.score.max ≥ 0.6.

Subagrupamiento de CAFs FAP+ y grupos epiteliales (pt5; Fig. 3) se realizó utilizando el algoritmo de Louvain con resoluciones de 0.2 y 0.05, respectivamente. Los subgrupos de CAF FAP+ se asignaron a un subtipo de CAF en función de la expresión del gen marcador. El subgrupo epitelial HRC se anotó en función de la expresión del gen marcador. El subagrupamiento epitelial de las otras 11 muestras de CRC se restringió a los grupos epiteliales cancerosos identificados mediante el agrupamiento por muestra (resolución 0.7). Seleccionamos los grupos con alta expresión del programa HRC dentro de cada muestra por separado mediante el reagrupamiento del epitelio canceroso (resolución 0.7 y 0.2). No detectamos un grupo HRC en las muestras T1NANO022 (frente invasor incompleto), T1NANO030 y T1NANO031 (ambos carcinomas intramuscosos). Para los gráficos de trama espacial de células epiteliales, las células se filtraron por la intensidad de la tinción de PanCK (se excluyó el décimo percentil inferior).

Análisis de vecindad

Para perfilar el contexto espacial de las células cancerosas, realizamos un análisis de vecindad celular para las células oncofetales y las células madre cancerosas de las 11 muestras de CRC analizadas con el panel de 6000 genes Nanostring CosMx. En resumen, ejecutamos la función nn2() de RANN por muestra para encontrar los vecinos de una célula cancerosa dentro de un radio de 50 µm. La matriz de salida de células × grupos se utilizó para contar los tipos de células vecinas para el análisis de composición (sccomp76), sumar los perfiles de expresión en todos los vecinos para el análisis de expresión diferencial de vecindad y agrupar las células en función de la composición de las células vecinas utilizando el agrupamiento de k medias (k = 10).

Análisis de NicheNet

Se realizó un análisis de NicheNet en los segmentos de frente invasor de GeoMx WTA y las células 'niche3' de CosMx (nicho oncofetal) con nichenetr77 (v.2.0.0; receptores = segmentos epiteliales; emisores = segmentos estromales). Los genes con expresión por debajo del percentil 25 en todos los segmentos de emisores o receptores se excluyeron. Los ligandos de interés se priorizaron en función del potencial interactivo acumulado en todos los genes coreHRC.

Inmortalización y cultivo de fibroblastos

Se derivaron líneas de fibroblastos de cultivos de biopsias de punción en etapa temprana que se utilizaron para establecer organoides ('sección Biobanco de organoides'). En resumen, los fibroblastos que se adherían al fondo de plástico de las placas de cultivo de organoides se mantuvieron con DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (Bodinco) y 1% de penicilina/estreptomicina (Lonza) después de la eliminación del organoide para el pasaje y se sometieron a transducción lentiviral simultánea con hTERT (adaptación de tercera generación de Addgene no. 85140) y BMI1 (no. 12240) durante la noche78. Las líneas de fibroblastos se pasaron semanalmente mediante tripsinización.

Cocultivos de organoides y fibroblastos

Los organoides se cocultivaron con fibroblastos en un sistema de transwell (insertos de cultivo celular de policarbonato con tamaño de poro de 0.4 µm en un formato de placa de seis pocillos, ThermoFisher) durante 48 h en un medio con factores de crecimiento reducidos (medio basal, B27 (Invitrogen) y 1.25 mM de N-acetilcisteína (Sigma-Aldrich)) después de la eliminación del organoide. Los fibroblastos se tripsinizaron, se contaron y se sembraron como una suspensión de células individuales (300 000 células por pocillo) en un medio de cultivo de fibroblastos (anterior) sobre plástico o en 200 µl de Matrigel (Corning) 1 día antes del cocultivo para permitir la adhesión al sustrato de plástico. Para iniciar el cocultivo, se sembraron organoides de 5 días de edad en 150 µl de Matrigel (Corning) sobre la membrana de transwell. Para recolectar ARN, se retiraron los insertos de cultivo de transwell con organoides y los organoides y los fibroblastos se lisaron por separado, seguido de la extracción de ARN utilizando el kit de aislamiento de ARN Nucleospin (Macherey-Nagel 740955), según las instrucciones del fabricante. Para investigar los efectos inducidos por la matriz y los efectos paracrinos, los organoides y los fibroblastos se sembraron simultáneamente en mezclas de colágeno-Matrigel (25%/25%) (Colágeno tipo I Corning 354236) y se cocultivaron en un medio con factores de crecimiento reducidos durante 2 días o 5 días antes de la cuantificación por citometría de flujo de las células EMP1-mNeon+.

RNA-seq de cocultivos de organoides y fibroblastos

La preparación de la biblioteca de RNA-seq se realizó por USEQ según el protocolo Illumina TruSeq stranded PolyA. Las bibliotecas se secuenciaron en dos ejecuciones en un Illumina NextSeq 2000 (ejecución 1: 20 muestras, secuenciación pareada de 2 × 50 pb, índice 1: 17 ciclos, lectura 1: 50 ciclos, índice 2: 8 ciclos, lectura 2: 50 ciclos y ejecución 2: 11 muestras, secuenciación de un solo extremo de 1 × 50 pb, índice 1: 17 ciclos, lectura 1: 50 ciclos, índice 2: 8 ciclos). Para la alineación de las lecturas, se utilizó la canalización nf-core RNA-seq (v.3.14.0) (https://doi.org/10.5281/zenodo.1400710, ref. 79) con la opción 'starsalmon'. En resumen, los archivos FASTQ se sometieron a control de calidad (FastQC v.0.12.1), se recortaron los adaptadores (Trim Galore! v.0.6.7), las lecturas se alinearon al transcriptoma de referencia humano GRCh38 (STAR v.2.7.9a) y se generó una matriz de expresión génica (Salmon v.1.10.1). El análisis de expresión diferencial a nivel de gen y de conjunto de genes (ssGSEA/GSEA) se realizó utilizando DESeq2 (v.1.38.3). Se retuvieron los genes que tenían al menos un recuento de 10 en al menos 4 muestras, se normalizaron VST y se realizó un PCA. Las muestras de organoides y fibroblastos se corrigieron por lotes mediante la ejecución de secuenciación y LineID, respectivamente.

Generación de organoides EMP1 mNeon knock-in

Los organoides EMP1mNeon knock-in (pt5 inv) se generaron mediante el direccionamiento en tándem de Cas9, como se describe en la ref. 80. Los vectores de expresión locus-específica de SpCas9 (Addgene no. 48139) se generaron de acuerdo con los protocolos publicados81 (guía 5'-TCCTGAGAAAGAAATAAGGC-3'). El vector de direccionamiento se generó introduciendo 449 nucleótidos de brazos de homología y secuencias guía EMP1 flanqueantes en un vector personalizado (IRES-mNeon-NLS-P2A-iCasp9-WPRE-pA-PGK-PuroR-pA; Addgene no. 251175) utilizando el ensamblaje de puerta dorada. Para la transfección, los organoides se tripsinizaron hasta obtener grupos de células que contenían aproximadamente 5 células (alrededor de 1 × 106 células en total) y se coelectroporaron con 4 µg de ADN de SpCas9 y 11 µg de vector de direccionamiento utilizando el electroportador NEPA21 Super (Nepagene) siguiendo las condiciones descritas en la ref. 82. Los grupos de células electroportadas se sembraron en Matrigel superpuesto con un medio de cultivo de organoides suplementado con 10 µM de inhibidor de Rho-quinasa Y-27632 durante los primeros 3 días. Las células diana se seleccionaron utilizando 1 µg/ml de puromicina y se mantuvieron como poblaciones policlonales. Para confirmar la fluorescencia EMP1-mNeon-NLS y la localización nuclear, los organoides vivos se incubaron con Hoechst 33342 (ThermoFisher Scientific 62249, 1:5000, 30 min, 37 °C con 5% de CO2) para visualizar los núcleos y se visualizaron con un microscopio confocal de escaneo Leica SP8 utilizando el software LAS X (v.3.5.7.23225).

Ensayo basado en el reportero de organoides EMP1 mNeon

Para examinar los ligandos que inducen estados de células tumorales oncofetales, los organoides EMP1mNeon se tripsinizaron (TrypLE), se sembraron como células individuales (300 células por µl, filtradas con un tamiz de 40 µm) y se trataron con ligandos candidatos 5 días después de la siembra. Se añadieron estímulos o combinaciones de estímulos individuales en un medio con factores de crecimiento reducidos (medio basal con B27 (Invitrogen) y 1.25 mM de N-acetilcisteína (Sigma-Aldrich)) después de 2 lavados con medio basal e incluyeron: TGFβ1 (5 ng/ml; Immunotools 11343160), TGFβ3 (5 ng/ml; Immunotools 11344483), PGE2 (10 µM; Tocris 2296), PGD2 (10 µM; Merck 538909), CXCL12 (40 ng/ml; Immunotools 11343363), FGF2 (50 ng/ml; Peprotech 100-18B), IGF1 (50 ng/ml; Biolegend 590904), FGF7 (50 ng/ml; Peprotech 100-19), GREM1 (100 ng/ml; Peprotech 120-42-50UG), SFRP1 (100 ng/ml; Peprotech 120-29), SFRP2 (100 ng/ml; Biotechne 1169-FR-025), GDNF (50 ng/ml; ThermoFisher 450-10-10UG), IL-36A (50 ng/ml; ThermoFisher 200-36A-2UG), IL-36B (50 ng/ml; ThermoFisher 200-36B-2UG), CXCL14 (40 ng/ml; Immunotools 11345190), BMP2 (20 ng/ml; Immunotools 11343273), BMP4 (20 ng/ml; Immunotools 11345043), factor de crecimiento hepatocitario (50 ng/ml; ThermoFisher 100-39-10UG), factor de crecimiento endotelial vascular (50 ng/ml; ThermoFisher 100-20-2UG), WNT5A (20 ng/ml; Biotechne 645-WN-010), IL-6 (100 ng/ml; Stem Cell Technologies 78050.1), OSM (50 ng/ml; R&D Systems 295-OM-010), IL-1B (20 ng/ml; ThermoFisher 200-01B-10UG), factor de necrosis tumoral (10 ng/ml; Knoll AG), IL-27 (100 ng/ml; ThermoFisher 200-38-2UG) e interferón-gamma (100 ng/ml, ThermoFisher 300-02-20UG). El porcentaje de células EMP1mNeon positivas entre las células vivas se midió 24 h después de la adición de los estímulos candidatos, como se describe a continuación.

Citometría de flujo

Se prepararon suspensiones de células de organoides individuales mediante tripsinización con tripsina-EDTA durante 5 min a 37 °C. Las mediciones de citometría de flujo se realizaron en un analizador de células BD FACSCelesta. Se seleccionaron las células vivas individuales (DAPI−) en el canal BV421, se midió la fluorescencia de mNeon y ficoeritrina en los canales FITC-A y PE-A, respectivamente. Se establecieron las compuertas en función de las muestras de control negativo, es decir, la línea de organoides parental o las suspensiones de células no teñidas. Para separar las células de organoides y fibroblastos en los cocultivos paracrinos (Figura de datos suplementarios 8g), las células se tiñeron con anti-humano CD326 (EpCAM) de ficoeritrina (324205 9C4, Biolegend, 1:400). Para medir los niveles de MHCI (Figura de datos suplementarios 8i, j), las células se tiñieron con anti-humano HLA A/B/C de ficoeritrina (311405 W6/32, Biolegend, 1:400). Los datos de citometría de flujo se analizaron y visualizaron utilizando el software BD FACSdiva y la herramienta en línea gratuita https://floreada.io. Inmunofluorescencia de organoides. Los organoides formados en experimentos de cocultivo se inmunotintaron para determinar los niveles de proteína LAMC2, como se describió previamente83. En resumen, los organoides se separaron de las matrices de Matrigel mediante incubación en medio basal suplementado con 1 mg/ml de dispasa durante 30 minutos a 37 °C/5% de CO2 y se centrifugaron después de varios ciclos de lavado con medio basal. Los organoides se fijaron en un 4% de paraformaldehído en PBS sobre hielo durante 45 minutos. Los organoides fijados se transfirieron a placas repelentes (Greiner Bio-One). Los pasos de permeabilización, bloqueo e incubación con anticuerpos se realizaron con tampón de lavado de organoides (0,1% de Triton X-100 en PBS y -0,2% p/v de BSA) a 4 °C en un agitador. Anticuerpos primarios utilizados: LAMC2 (AMAb91098, Atlas Antibodies, 1:500) y beta-catenina (C2206, Sigma-Aldrich, 1:500). Anticuerpos secundarios utilizados: Alexa 647 anti-ratón (Invitrogen A21236; 1:500) y Alexa 568 anti-conejo (Invitrogen A11011; 1:1000) y Hoechst. Los organoides se montaron en solución de aclaramiento (ddH2O, 60% (v/v) de glicerol y 2,5 M de fructosa) y se visualizaron en un microscopio confocal láser de barrido Zeiss LSM880 a un aumento de ×40. Las imágenes se procesaron en el software Fiji. Hoechst se utilizó como marcador nuclear y la beta-catenina para marcar los límites celulares, lo que permitió la cuantificación de LAMC2 a nivel de célula individual. El análisis estadístico se realizó en GraphPad Prism (v.10.4.1). RNA-seq y qPCR de organoides tratados con TGFβ y prostaglandinas. Los organoides se trataron con una combinación de TGFβ1 (5 ng/ml; Immunotools 11343160), TGFβ3 (5 ng/ml; Immunotools 11344483), PGE2 (10 μM; Tocris 2296) y PGD2 (10 μM; Merck 538909) en un medio con factores de crecimiento reducidos (medio basal con B27 (Invitrogen) y 1,25 mM de N-acetilcisteína (Sigma-Aldrich) después de 2 lavados con medio basal, 5 días después de la tripsinización a células individuales. Después de 24 horas de inducción, se extrajo el ARN utilizando el kit de aislamiento de ARN Nucleospin (Macherey-Nagel 740955), según las instrucciones del fabricante. La preparación de la biblioteca (ARN mensajero direccional; enriquecimiento de poli-A) y el secuenciamiento (NovaSeq X Plus Series PE150) se realizaron en Novogene y los datos se analizaron con DESeq2 (v.1.38.3) y clusterProfiler (v.4.8.3) con el método fgsea (v.1.24.0). El análisis de expresión diferencial se corrigió para el ID del paciente. Para la PCR cuantitativa (qPCR), el ADNc se generó a partir del ARN utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad). Para la qPCR, se mezclaron 20 ng de ADNc con 0,5 μM de cebador directo y cebador inverso y 5 μl de PowerTrack SYBR Green (Applied Biosystems) por pocillo. La qPCR se realizó en el Bio-Rad CFX96 y los resultados se analizaron con Microsoft Excel (v.16.95) utilizando el método ΔΔCt con ACTB y PBGD como genes de referencia. Las secuencias de los cebadores utilizados para la qPCR se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 8. Análisis de datos de scRNA-seq publicados. Los datos de scRNA-seq de CRC humanos publicados en las referencias 45, 55 y 54 (consulte "Disponibilidad de datos" para obtener los códigos de acceso) se integraron utilizando el paquete Seurat (v.5.0.1)74 en R (v.4.2.0) con la integración de harmony según el flujo de trabajo estándar. Los grupos se anotaron utilizando las anotaciones de tipo celular incluidas en los conjuntos de datos publicados y los genes marcadores de los grupos. Para los análisis de inferencia de trayectoria, se utilizaron los paquetes R Monocle3 (ref. 84) (v.1.4.26), CytoTRACE2 (ref. 85) (v.1.1.0) y Slingshot86 (v.2.16.0) para calcular las puntuaciones de potencia de célula única y el pseudotiempo. El kernel CytoTRACE de CellRank87 (v.2.0.7) se utilizó para calcular una matriz de transición y construir diagramas de flujo basados en el pseudotiempo que se muestran en la Fig. 5j. El 2% inferior de las áreas de baja densidad en el espacio UMAP se excluyeron de estos análisis. Estadística y reproducibilidad. El análisis estadístico se realizó según se indica en las leyendas de las figuras utilizando R (R base (v.4.2.0 o posterior), ggplot2 (v.3.5.1), ggpubr (v.0.6.0), Seurat (v.5.0.1)) y GraphPad Prism (v.10.4.1). Se asumió que la distribución de los datos era normal, pero esto no se comprobó formalmente. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos colas. Cuando no se indicó, se consideró que un valor de P < 0,05 o una tasa de descubrimiento falso (FDR) < 0,05 era estadísticamente significativo. Se utilizó el método de Benjamini-Hochberg para corregir el valor de P para las pruebas múltiples. Para las comparaciones entre más de dos grupos de muestra, se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía, utilizando la prueba de Tukey HSD para el análisis post hoc. Los datos se presentan como media ± desviación estándar, a menos que se indique lo contrario en la leyenda de la figura. Para los resultados de GSEA, se consideró que una FDR < 0,25 era estadísticamente significativa, en línea con la ref. 88. Las imágenes representativas (Fig. 4f y Figuras de datos ampliadas 7a y 9b) muestran resultados consistentes que se observaron en al menos dos experimentos independientes. Resumen del informe. Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo. Disponibilidad de datos

Los datos de secuenciación del genoma completo (WGS) de organoides derivados de pacientes (EGAD50000002204), los datos de secuenciación de ARN (RNA-seq) de organoides y cocultivos de organoides y fibroblastos (EGAD50000002202) y los datos de secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) de CRC en etapa temprana (EGAD50000002203) están disponibles a través del European Genome–Phenome Archive (EGA) con el número de acceso EGAS50000001532. Una versión adaptada del flujo de trabajo nf-core scrnaseq está disponible en GitHub (https://github.com/gowanaka/nf-core-scrnaseq). Los datos de transcriptómica espacial a granel (Nanostring GeoMx) y de célula única (Nanostring CosMx) de CRC T1 y los datos de expresión procesados (RNA-seq de organoides y cocultivos de organoides y fibroblastos, y scRNA-seq de biopsias de CRC en etapa temprana) están disponibles en Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.17671259)89. Los datos de expresión (scRNA-seq, Nanostring GeoMx CTA, Nanostring CosMx fig. 3) se pueden acceder a través de un panel interactivo en https://snippertlab.nl/resources. Los datos de scRNA-seq publicados de CRC humanos se obtuvieron de GSE144735 y GSE132465 (ref. 45); GSE201349 (ref. 55) y GSE178341 (ref. 54). Los datos fuente se proporcionan con este artículo. Referencias Turajlic, S. & Swanton, C. Metástasis como un proceso evolutivo. Science 352, 169–175 (2016). Artículo CAS Google Scholar Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R. & Weinberg, R. A. Principios biológicos emergentes de la metástasis. Cell 168, 670–691 (2017). Artículo CAS PubMed Central Google Scholar Sottoriva, A. et al. Un modelo de "Big Bang" del crecimiento del tumor de cáncer colorrectal humano. Nat. Genet. 47, 209–216 (2015). Artículo CAS PubMed Central Google Scholar Cross, W. et al. El panorama evolutivo de la tumorigénesis del cáncer colorrectal. Nat. Ecol. Evol. 2, 1661–1672 (2018). 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USEQ está subvencionada por el Centro Médico Universitario de Utrecht y la Iniciativa X-ómica de los Países Bajos (proyecto NWO n.º 184.034.019). Estamos agradecidos a todos los pacientes que participaron en este estudio. Este trabajo ha sido apoyado por subvenciones de investigación del programa ZonMw NWO VIDI (subvención n.º 09150172010017 a H.J.G.S.), ERC consolidator (TRANSFORMATION, subvención n.º 101125393 a H.J.G.S.) y la Sociedad Holandesa contra el Cáncer (subvención n.º EXPL2024/1 16037 a H.J.G.S.). Este trabajo forma parte del Instituto Oncode, que está financiado en parte por la Sociedad Holandesa contra el Cáncer. Información del autor Notas del autor Julian R. Buissant des Amorie, Joris H. Hageman, Sascha R. Brunner, Suzanne E. M. van der Horst, Inge van Lierop, Sjors Middelkamp, Sander Mertens, David S. Cavigelli, Ingrid Verlaan-Klink y Hugo J. G. Snippert. Dirección actual: Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, Utrecht, Países Bajos. Estos autores contribuyeron por igual: Julian R. Buissant des Amorie, Joris H. Hageman, Sascha R. Brunner, Suzanne E. M. van der Horst. Autores y afiliaciones Centro de Medicina Molecular, Centro Médico Universitario de Utrecht, Utrecht, Países Bajos: Julian R. Buissant des Amorie, Joris H. Hageman, Sascha R. Brunner, Suzanne E. M. van der Horst, Maria C. Puschhof, Arne van Hoeck, Inge van Lierop, Sjors Middelkamp, Robin Geene, Sander Mertens, David S. Cavigelli, Ingrid Verlaan-Klink y Hugo J. G. Snippert. Instituto Oncode, Utrecht, Países Bajos: Julian R. Buissant des Amorie, Joris H. Hageman, Sascha R. Brunner, Suzanne E. M. van der Horst, Maria C. Puschhof, Arne van Hoeck, Inge van Lierop, Sjors Middelkamp, Sander Mertens, David S. Cavigelli, Ingrid Verlaan-Klink y Hugo J. G. Snippert. Departamento de Patología, Centro Médico Universitario de Utrecht, Utrecht, Países Bajos: Lisa van der Schee, Sven van Kempen, Folkert Morsink y Miangela M. Laclé. Unidad de Secuenciación de Utrecht, Centro Médico Universitario de Utrecht, Utrecht, Países Bajos: Robin Geene. Investigador independiente, Utrecht, Países Bajos: Lianne J. Kraaier. Plataforma de Organoides de Utrecht, Utrecht, Países Bajos: Jorieke Salij, Renate Bezemer y Onno Kranenburg. Departamento de Gastroenterología y Hepatología, Centro Médico Universitario de Utrecht, Utrecht, Países Bajos: Leon M. G. Moons. Autores Julian R. Buissant des Amorie, Joris H. Hageman, Sascha R. Brunner, Suzanne E. M. van der Horst, Maria C. Puschhof, Arne van Hoeck, Inge van Lierop, Sjors Middelkamp, Lisa van der Schee, Sven van Kempen, Folkert Morsink, Robin Geene, Sander Mertens, David S. Cavigelli, Ingrid Verlaan-Klink, Lianne J. Kraaier, Jorieke Salij, Renate Bezemer, Onno Kranenburg, Miangela M. Laclé, Leon M. G. Moons y Hugo J. G. Snippert. Contribuciones J.R.B.d.A., J.H.H., S.R.B. y S.E.M.v.d.H. contribuyeron por igual a este trabajo. J.R.B.d.A., J.H.H., S.R.B. y S.E.M.v.d.H. analizaron e interpretaron los datos. J.R.B.d.A., J.H.H., S.E.M.v.d.H. e I.V.-K. establecieron y caracterizaron el biobanco de organoides. J.R.B.d.A., J.H.H., I.v.L., D.S.C. y S. Mertens realizaron experimentos in vitro con organoides y fibroblastos. J.H.H. diseñó y creó la línea de reportero de organoides. S.E.M.v.d.H. realizó y cuantificó la inmunofluorescencia en especímenes y organoides de CRC. S.R.B. analizó los datos de transcriptómica espacial y ARN-seq a granel. J.R.B.d.A., J.H.H., S.E.M.v.d.H. y M.C.P. generaron los datos de scRNA-seq de CRC en etapa temprana. J.R.B.d.A. y J.H.H. analizaron los datos de scRNA-seq de CRC en etapa temprana. J.R.B.d.A. integró los datos de scRNA-seq públicos y analizó los datos de expresión de CRC públicos a granel. L.J.K. construyó un panel de control de datos. S.R.B., A.v.H. y S. Middelkamp analizaron los datos de WGS. R.G. proporcionó apoyo con la secuenciación, la transcriptómica espacial y la imagen de portaobjetos. J.S., R.B. y O.K. obtuvieron el consentimiento de los pacientes. L.v.d.S. seleccionó las muestras de tejido para la transcriptómica espacial. S.v.K. y F.M. prepararon las muestras de tejido para la transcriptómica espacial. M.M.L. proporcionó el examen histopatológico. M.M.L., L.M.G.M. y H.J.G.S. concibieron el estudio. H.J.G.S. supervisó el estudio. J.R.B.d.A., J.H.H. y S.R.B. visualizaron los datos. J.R.B.d.A., J.H.H. y H.J.G.S. redactaron el artículo con las contribuciones y la aprobación de todos los autores. H.J.G.S. y L.M.G.M. obtuvieron financiación. Autor de correspondencia Correspondencia a Hugo J. G. Snippert. Declaraciones éticas

Conflictos de intereses
S.E.M.v.d.H., M.M.L., L.M.G.M. y H.J.G.S. son inventores de una patente relacionada con los biomarcadores de la enfermedad metastásica. Los demás autores declaran no tener conflictos de intereses. Revisión por pares.

Información sobre la revisión por pares.
Nature agradece a Philip Dunne y a los demás revisores anónimos su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles. Información adicional. Nota del editor: Springer Nature mantiene una postura neutral con respecto a las reclamaciones jurisdiccionales en los mapas publicados y las afiliaciones institucionales. Datos ampliados: figuras y tablas. Figura de datos ampliados 1. Transcriptómica espacial a granel de CRCs en etapa temprana. a) Descripción general de la muestra del experimento de perfilamiento espacial. Se indica la ubicación de las regiones de interés (ROI) en las regiones histopatológicas definidas por el patólogo, el estado TNM del tumor y el panel de sondas por tumor. Se analizaron 19 CRCs T1 (CTA: n = 10 y WTA: n = 9). b) Tinción con H&E de la muestra de CRC T1 que se muestra en la figura 1b. Un patólogo anotó las regiones histopatológicas (nor, ade, core e inv). c) UMAP de los perfiles de expresión génica de todos los segmentos (puntos) en la cohorte CTA. Los colores de los puntos representan el tipo de segmento (panCK+ o panCK-), la región histopatológica o el paciente. d) UMAP de los perfiles de expresión génica de todos los segmentos (puntos) en la cohorte WTA. Los colores de los puntos representan el tipo de segmento (panCK+ o panCK-), la región histopatológica o el paciente. e) Gráfico de violín que muestra la varianza explicada por el paciente por gen (n = 16.000) en los segmentos epiteliales (rojo) y estromales (azul) para cada región histopatológica (WTA; cuadros: rango intercuartílico; barras negras: mediana, bigotes: 1,5 veces el rango intercuartílico). f) Diagrama de flujo de Sankey de los subtipos CMS asignados al núcleo tumoral (rojo) y a las ROI del frente invasor (amarillo). g) Distribución de los subtipos CMS en tumores heterogéneos (n = 5). Tenga en cuenta que todos los tumores con múltiples subtipos incluyen un componente CMS4. h) El análisis de 94 ROI de 9 pacientes muestra una alta densidad de células estromales en el subtipo CMS4 (cuadros: rango intercuartílico; barras negras: mediana, bigotes: 1,5 veces el rango intercuartílico; ANOVA, Tukey HSD). i) Diagrama de flujo de Sankey de los subtipos iCMS asignados al núcleo tumoral (rojo) y a los segmentos epiteliales del frente invasor (amarillo). j) GSEA de varias firmas asociadas a las células madre intestinales, la regeneración, el oncofeto y la metástasis entre los segmentos del núcleo (n = 42) y el frente invasor (n = 43) epiteliales (PanCK+). El tamaño del punto representa la significación (valores p ajustados, gris: valor p ajustado > 0,01; prueba de permutación con FDR). NES: puntuación de enriquecimiento normalizada. k) Tinción inmunofluorescente que muestra la presencia local del gen marcador HRC LAMC2 (rojo, n = 2 tumores) en el frente invasor de los CRCs en etapa temprana (etapa T2). La línea discontinua indica el borde del tumor. Células epiteliales PanCK+ (verde). Núcleos SYTO13+ (azul). l) Puntuaciones de módulo por estado metastásico para los términos GO indicados (n = 43 segmentos PanCK+; cuadros: rango intercuartílico; barras negras: mediana, bigotes: 1,5 veces el rango intercuartílico; ANOVA, Tukey HSD). Fuente de datos. Figura de datos ampliados 2. Análisis integrado de secuenciación de ARN de una sola célula de células tumorales de cáncer colorrectal. a) UMAP de las células epiteliales (>300.000) del conjunto de datos integrado de 5 estudios de secuenciación de ARN de una sola célula de CRC45,54,55. Los colores representan el origen del estudio (izquierda), la región histopatológica (centro) o los estados epiteliales tumorales (epitelio tumoral: el grupo contiene 0,6, Métodos) en función de los grupos de tipos de células identificados con los datos de secuenciación de ARN de una sola célula de CRCs en etapa temprana (conjunto de datos de referencia) (figura 3b). El inserto muestra la zonificación estereotípica de los trofocitos y los telocitos en el tejido tumoral adyacente indicado (la línea discontinua indica el borde de la mucosa/submucosa). b) UMAP de las células perfiladas por CosMx anotadas por los tipos de células predichos. c) Subagrupamiento de las células epiteliales de CosMx (de b) en oncofeto (alta expresión de la firma de células de alta recurrencia; n = 5.078), células madre cancerosas (CSC; n = 119.019), no definido (n = 194.491) y epitelio normal (n = 41.221). d) Gráfico de caja de las puntuaciones de la firma WNT/CSC29 y coreHRC14 entre las células de los grupos CSC (n = 119.019) y oncofeto (n = 5.078) de la figura 3l y la figura de datos ampliados 6c y e (cuadros: rango intercuartílico; barras negras: mediana, bigotes: 1,5 veces el rango intercuartílico; *** P < 0,001, prueba t). e) Trama espacial de una sola célula de los subgrupos epiteliales de c. El inserto muestra la expresión relativa (gradiente de color) del marcador oncofetal MMP7 en el frente invasor (figura 1f). f) Tramas espaciales de una sola célula por el tipo de célula predicho indicado. g) Trama de puntos de una sola célula que visualiza los niveles de expresión génica de los genes marcadores del subtipo CAF en los subtipos CAF identificados en el conjunto de datos de CosMx. Los colores indican el nivel de expresión relativa. El tamaño del punto representa el porcentaje de células en las que se identificó el transcrito. Figura de datos ampliados 7. Secuenciación de ARN de co-cultivos de organoides y fibroblastos de CRC en etapa temprana. a) Imágenes representativas de campo brillante de las líneas de fibroblastos derivadas de los pacientes y las regiones indicadas. Nor: normal, Inv: frente invasor. b) Análisis de componentes principales del experimento de co-cultivo mediante secuenciación de ARN. Izquierda: transcriptomas de organoides (organoides del frente invasor pt5); derecha: transcriptomas de fibroblastos. Las muestras se colorean según el grupo de co-cultivo: monocultivo de organoides (morado), co-cultivo con fibroblastos en plástico (verde) y co-cultivo con fibroblastos en Matrigel (azul). Anotación de fibroblastos: ‘Fib’, seguido del número de paciente del biobanco y el sustrato de cultivo (plástico (PL) o Matrigel (MG)). Se muestran el componente principal (PC) 1 y 2 en los ejes x e y, respectivamente. c) Diagrama de caja que muestra el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes en una sola muestra (ssGSEA) de varios conjuntos de genes regenerativos, metastásicos, proliferativos y de células madre en muestras de secuenciación de ARN de organoides (ninguno: n = 7; plástico: n = 6; MG: n = 6) agrupadas por condición de co-cultivo (ninguno: monocultivo de organoides; plástico: co-cultivado con fibroblastos en plástico; y MG: co-cultivado con fibroblastos en Matrigel). Los cuadros representan el rango intercuartílico y las barras negras representan los valores medianos de todos los segmentos de las regiones anatómicas indicadas (ANOVA con Tukey’s HSD, se indican los valores p). d) Diagrama de puntos que muestra el GSEA (prueba de permutación con FDR) de conjuntos de genes epiteliales regenerativos, metastásicos, proliferativos y de células madre en muestras de secuenciación de ARN de organoides de co-cultivos con fibroblastos en plástico (n = 6) frente a Matrigel (MG; n = 6). e) GSEA de las firmas myCAF e iCAF50 in vivo (WTA GeoMX: segmentos del núcleo tumoral frente a segmentos del frente invasor) y in vitro (co-cultivo 3D (fibroblastos en Matrigel; n = 6) frente a co-cultivo 2D (fibroblastos en plástico; n = 6)). Se muestran la puntuación de enriquecimiento normalizada (NES) y la tasa de descubrimiento falso (FDR) como recuadros en cada gráfico. Fuente de datos. Figura de datos extendida 8. Cribado basado en organoides para inductores de plasticidad oncofetal. a) Análisis de expresión diferencial del compartimento estromal del frente invasor (n = 40) frente al núcleo tumoral (n = 38) (CD45-PanCK-) del conjunto de datos de transcriptómica espacial masiva de CTA GeoMx. El color del punto denota el nivel de significación (prueba de Wald, FDR). b) Expresión relativa (colores) de genes relacionados con TGFβ y prostaglandinas en subtipos de fibroblastos (scRNA-seq integrado del microambiente tumoral de CRC). El tamaño del punto: porcentaje de células que expresan el transcrito. c) Mapa de calor de NicheNet que muestra los 50 ligandos principales con el mayor potencial regulador predicho del programa coreHRC (conjunto de datos de WTA; n = 43 segmentos del frente invasor epitelial – receptores; n = 43 segmentos del frente invasor estromal – emisores). El gradiente de color representa el potencial regulador. d) Estrategia de inserción CRISPR en trans para etiquetar las células EMP1+ con mNeonGreen nuclear. IRES: sitio de entrada ribosómico interno, NLS: señal de localización nuclear, pA: poli(A), PuroR: casete de resistencia a la puromicina. e) Mapa de calor que muestra la inducción de células EMP1-mNeon+ utilizando combinaciones de ligandos potentes identificados en la Fig. 4g,h. El gradiente de color representa el porcentaje de células EMP1+ (%) medido mediante citometría de flujo después de 24 horas de inducción. EIF: EGF + IGF1 + FGF2; C: CXCL12; TT: TGFβ1 + TGFβ3; PP: PGE2 + PGD2. f) Porcentaje de células EMP1-mNeon+ (%) tras las combinaciones de estímulos más potentes en e. Los datos se presentan como valores medios + DE (n = 3, ANOVA, Tukey HSD). g) Izquierda: porcentaje de células EMP1-mNeon+ (%) en Matrigel (MG), mezcla de 25% Matrigel-25% colágeno (CN) y tras el tratamiento con TGFβ/prostaglandinas tras 2 días de exposición (n = 3, ANOVA P = 0,008, TukeyHSD). Derecha: porcentaje de células EMP1-mNeon+ (%) en mezcla de 25% Matrigel-25% colágeno (CN) en co-cultivos parácrinos y yuxtacrinos. La línea discontinua representa el co-cultivo parácrino indirecto en transwell con organoides y fibroblastos en Matrigel (como en la Fig. 4a, co-cultivo 3D; n = 3, prueba t). Los datos se presentan como valores medios + DE. h) Inmunofluorescencia representativa para LAMC2 (morado) en organoides EMP1-mNeonGreen-nls (verde) tratados con PGD2, PGE2, TGFβ1 y TGFβ3. Las membranas celulares se visualizaron con tinción de β-catenina (β-cat, azul). Flecha blanca: organoide con alta expresión de LAMC2 y EMP1. i) Niveles de MHCI en 4 líneas de organoides derivadas de pacientes tras el tratamiento con TGFβ1 + 3 y prostaglandinas (PGE2 + PGD2) o IFNγ (cuadros: rango intercuartílico; barras negras: mediana; bigotes: 1,5 veces el rango intercuartílico; ANOVA, Tukey HSD). j) Niveles de MHCI en organoides EMP1-mNeon KI pt5 tras el tratamiento con TGFβ1 + 3 y prostaglandinas (PGE2 + PGD2) o IFNγ. Los datos se presentan como valores medios + DE (n = 3, ANOVA, Tukey HSD). k) GSEA de procesos biológicos GO relacionados con el sistema inmunitario (presentados en la Figura de datos extendida 1l) en la secuenciación de ARN de organoides tratados con TGFβ y prostaglandinas (PGD2 y PGE2. TGF-β: TGF-β1 y TGF-β3) (n = 2 pacientes; 3 réplicas; prueba basada en permutaciones, corrección de Benjamini-Hochberg). Fuente de datos. Figura de datos extendida 9. Transcriptómica espacial de una sola célula de especímenes de CRC en etapa temprana, temporalmente alrededor del inicio del crecimiento tumoral invasivo. a) 11 especímenes tumorales distribuidos en 2 portaobjetos utilizados para la transcriptómica espacial de una sola célula (CosMx, panel de sondas de 6000 genes). Los colores indican la subetapa: carcinoma intramucoso (azul, n = 3); T1 sm1 (rosa, n = 5) y T1 sm3 (morado, n = 3). b) Imágenes generales de la inmunofluorescencia de especímenes tumorales temporalmente alrededor del momento de la transformación maligna, incluido un carcinoma intramucoso (arriba), un T1 sm1 (centro) y un T1 sm3 (abajo). Los especímenes se tiñeron con SYTO13 (núcleos, gris), PanCK (verde, epitelio), LAMC2 (rojo, células tumorales regenerativas) y FAP (fibroblastos asociados al cáncer, morado). Las células tumorales regenerativas son amarillas (PanCK+LAMC2+). c) Análisis estadístico de los cambios en la proporción de fibroblastos entre T1 sm1 (n = 5) frente a intramucoso (n = 3) y T1 sm3 (n = 3) frente a intramucoso (n = 3). Los bigotes denotan el intervalo de credibilidad del 95% y se colorean según la significación indicada. d) Diagrama de barras que muestra las frecuencias de los tipos de células dentro de la vecindad directa (radio de 50 µm) de las células madre cancerosas (CSC) y las células oncofetales (onf, alta expresión de la firma de células de alta recurrencia). e) Mapa de calor de NicheNet que muestra los 50 ligandos estromales principales con el mayor potencial regulador predicho de los genes coreHRC (conjunto de datos Nanostring CosMx, nicho del frente invasor, n = 11 tumores). El gradiente de color representa el potencial regulador. f) Mapa de calor que muestra las correlaciones de Pearson célula a célula de los fibroblastos de la transcriptómica espacial de una sola célula (se muestran 100 fibroblastos seleccionados aleatoriamente por subgrupo (agrupamiento jerárquico)). El diagrama de barras en la parte superior del mapa de calor indica la proporción de células en cada grupo que provienen de especímenes intramucosos, T1 sm1 y T1 sm3. La caja negra anota tres subgrupos de CAF similares a trofoblastos de MMP que son intermedios entre los trofoblastos y los CAF similares a trofoblastos de MMP+. Fuente de datos. Figura de datos extendida 10. Conjunto de datos integrado de scRNA-seq del microambiente tumoral de CRC. a) UMAP del conjunto de datos integrado de scRNA-seq del microambiente tumoral de CRC que contiene datos de Lee et al.45 (GSE144735 y GSE132465), Becker et al.55 (GSE201349), Pelka et al.54 (GSE178341) y este estudio, superpuesto con codificación por colores que destaca las células del CRC en etapa temprana (este estudio), indicando el estudio original, el tejido, los grupos de tipos de células, la etapa tumoral y la puntuación de la firma TME-High Relapse14. b) Subgrupo de fibroblastos aislado del UMAP de scRNA-seq integrado de a, superpuesto con las puntuaciones de la firma de subtipos de fibroblastos. c) Expresión de la puntuación de la firma de subtipos de fibroblastos por grupo de fibroblastos del conjunto de datos integrado de scRNA-seq del microambiente tumoral de CRC (n = 10.324 fibroblastos; cuadros: rango intercuartílico; barras negras: mediana; bigotes: 1,5 veces el rango intercuartílico). d) Diagrama de puntos de una sola célula que visualiza los niveles de expresión génica de los marcadores de subtipos de CAF en el conjunto de datos integrado de scRNA-seq. Los colores indican el nivel de expresión. El tamaño del punto representa el porcentaje de células en las que se detectó el transcrito indicado. e) Diagrama de violín que muestra las puntuaciones de potencia de CytoTRACE por grupo de fibroblastos (n = 10.324 fibroblastos; cuadros: rango intercuartílico; barras: mediana; bigotes: 1,5 veces el rango intercuartílico). La puntuación de potencia representa el potencial de desarrollo/células madre. Las puntuaciones altas se atribuyen a células menos diferenciadas con la capacidad de desarrollarse en otros tipos de células. f) Diagrama de caja que muestra la frecuencia de cada subtipo de fibroblastos en diferentes etapas de la enfermedad de CRC. Los puntos individuales representan muestras de tumores (n = 147) codificados por colores según el estudio (cuadros: rango intercuartílico; barras negras: mediana; bigotes: 1,5 veces el rango intercuartílico; ANOVA, Tukey HSD). Tenga en cuenta que los fibroblastos asociados al cáncer solo se encuentran en los tumores. g) Modelo propuesto que describe la aparición de fibroblastos asociados al cáncer similares a trofoblastos y estados de células tumorales oncofetales durante las etapas más tempranas de la formación del frente invasor en el cáncer colorrectal. Fuente de datos. Información complementaria. Figuras complementarias (descargar PDF). Este archivo contiene las Figuras complementarias 1-3. Resumen de la información (descargar PDF). Tablas complementarias (descargar XLSX). Este archivo contiene las Tablas complementarias 1-8. Informe complementario 1. Informe de control de calidad de Nanostring GeoMx CTA en formato HTML. Informe complementario 2. Informe de control de calidad de Nanostring GeoMx WTA en formato HTML. Archivo de revisión por pares (descargar PDF). Fuente de datos. Figura de datos 1 (descargar XLSX). Fuente de datos. Figura de datos 2 (descargar XLSX). Fuente de datos. Figura de datos 3 (descargar XLSX). Fuente de datos. Figura de datos 4 (descargar XLSX). Fuente de datos. Figura de datos 5 (descargar XLSX). Fuente de datos. Figura de datos extendida 1 (descargar XLSX). Fuente de datos. Figura de datos extendida 2 (descargar XLSX). Fuente de datos. Figura de datos extendida 3 (descargar XLSX). Fuente de datos. Figura de datos extendida 4 (descargar XLSX). Fuente de datos. Figura de datos extendida 5 (descargar XLSX). Fuente de datos. Figura de datos extendida 7 (descargar XLSX). Fuente de datos. Figura de datos extendida 8 (descargar XLSX). Fuente de datos. Figura de datos extendida 9 (descargar XLSX). Fuente de datos. Figura de datos extendida 10 (descargar XLSX). Derechos y permisos. Acceso abierto. Este artículo se publica bajo una licencia Creative Commons Atribución 4.0 Internacional, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito adecuado al autor o autores originales y a la fuente, se proporcione un enlace a la licencia Creative Commons y se indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros incluidos en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en la leyenda del material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y el uso previsto no está permitido por la normativa aplicable o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para consultar una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Reimpresiones y permisos. Acerca de este artículo. Citar este artículo. Buissant des Amorie, J.R., Hageman, J.H., Brunner, S.R. et al. La aparición de la plasticidad oncofetal es ubicua en los cánceres colorrectales en etapa temprana. Nature (2026). https://doi.org/10.1038/s41586-026-10344-7. Descargar cita. Recibido: 7 de marzo de 2025. Aceptado: 2 de marzo de 2026. Publicado: 15 de abril de 2026. Versión del registro: 15 de abril de 2026. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-026-10344-7.