El régimen basado en 5-fluorouracilo, FOLFOX (5-fluorouracilo, ácido folínico, oxaliplatino), es la quimioterapia de primera línea para pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Por otro lado, la planta medicinal Patrinia villosa (Thunb.) Dufr. [Caprifoliaceae] se prescribe habitualmente por los médicos de medicina tradicional china a pacientes con cáncer colorrectal en los últimos años.
Por lo tanto, existe la posibilidad de que se utilice P. villosa en combinación con FOLFOX.
El presente estudio tuvo como objetivo investigar si el extracto acuoso de P. villosa interferiría con el metabolismo y la eficacia antitumoral del régimen de quimioterapia FOLFOX en modelos preclínicos de cáncer de colon. Se establecieron modelos de ratón con xenoinjertos humanos HCT-116 y modelos de ratón con tumores ortotópicos murinos Colon-26, y se les administró FOLFOX y/o extracto acuoso de PV durante 3 semanas. FOLFOX se administró por vía intravenosa una vez por semana y el extracto acuoso de PV se administró diariamente por vía oral, excepto el día de la administración de FOLFOX. Se determinaron los niveles de las enzimas metabolizadoras dihidropirimidina deshidrogenasa (para 5-fluorouracilo), serina hidroximetiltransferasa (para ácido folínico), así como las moléculas, cisteína, metionina y glutatión reducido, implicadas en la biotransformación del oxaliplatino, en el plasma de los ratones con xenoinjertos que recibieron tratamiento con FOLFOX y/o extracto acuoso de PV.
También se evaluó la progresión tumoral, la metástasis y el microambiente tumoral en los ratones. El tratamiento con extracto acuoso de PV no afectó a los niveles plasmáticos de las enzimas metabolizadoras del 5-fluorouracilo y el ácido folínico, ni a los niveles plasmáticos de cisteína, metionina y glutatión reducido en los ratones con xenoinjertos HCT-116. Por otro lado, el tratamiento combinado con FOLFOX y extracto acuoso de PV inhibió el crecimiento tumoral tanto de HCT-116 como de Colon-26, siendo el peso tumoral de HCT-116 en el grupo de FOLFOX más extracto acuoso de PV el más bajo de todos los grupos tratados. El tratamiento con extracto acuoso de PV pudo potenciar aún más el efecto antiangiogénico, apoptótico e inmunomodulador de FOLFOX en los tumores de colon.
Este es el primer informe que demuestra que no se observa ninguna interferencia inducida por el extracto acuoso de PV en los niveles plasmáticos de las enzimas metabolizadoras seleccionadas y las moléculas precursoras de los fármacos componentes de FOLFOX en ratones con tumores de colon. El uso combinado de FOLFOX más extracto acuoso de PV produjo una mejor eficacia antitumoral en los modelos de ratón con cáncer de colon que el tratamiento único por separado. Los beneficios potenciales del uso combinado de FOLFOX y extracto acuoso de PV han sido verificados científicamente, lo que apoya su uso clínico en el tratamiento del cáncer de colon.
El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres más frecuentes, con una alta incidencia a nivel mundial ([Bray et al., 2024]). En la actualidad, los regímenes basados en 5-fluorouracilo (5-FU), como FOLFOX, FOLFIRI y FOLFOXIRI, se consideran las modalidades terapéuticas de primera línea para pacientes con CCR metastásico ([Cervantes et al., 2023]). El régimen FOLFOX es una combinación de 5-FU, ácido folínico (también conocido como leucovorina) y oxaliplatino. Debido a la variada tasa de respuesta de los pacientes a FOLFOX (estimada en alrededor del 50%) ([Pourghasemian et al., 2020]) y a la aparición de notables efectos adversos inducidos por el 5-FU, existe una necesidad persistente de buscar tratamientos alternativos, como medicamentos herbales, como terapia adyuvante en el CCR, para permitir una posible reducción de la dosis del régimen FOLFOX y disminuir los efectos secundarios. No obstante, la posible interferencia de los medicamentos herbales en el tratamiento con FOLFOX sería una de las principales preocupaciones para los oncólogos, los clínicos y los pacientes con cáncer.
En presencia de timidina fosforilasa y timidina quinasa, el 5-FU se convierte en fluorodesoxiuridina monofosfato (FdUMP), que a su vez forma un complejo ternario con timidilato sintasa y 5,10-metilenotetrahidrofolato (5,10-MTHF). El ácido folínico potencia la actividad del 5-FU al estabilizar el complejo mediante el aumento de la concentración de 5,10-MTHF ([Deyme et al., 2019]). La unión de la timidilato sintasa al complejo inhibe la formación de timidina y, en consecuencia, la síntesis de ADN. Por otro lado, el 5-FU es metabolizado por la orotato fosforribosil transferasa para formar 5-fluorouridina trifosfato (FUTP), que se incorpora al ARN como una base fraudulenta para interferir con la síntesis de ARN ([Miura et al., 2010]). El oxaliplatino, un agente quimioterapéutico a base de platino con un ligando portador de 1,2-diaminociclohexano (DACH), induce la formación de aductos de ADN bis, lo que dificulta la replicación del ADN y da como resultado la detención del ciclo celular o la apoptosis ([Di Francesco et al., 2002]). Se propuso que el mecanismo del sinergismo de FOLFOX implica la supresión de la ATPasa, la sobreexpresión de los exportadores de glutatión y la disminución de los niveles de glutatión por el metabolito del oxaliplatino, el oxalato, todo lo cual está mediado por el 5-FU ([Theile et al., 2009]).
A pesar de poseer una eficacia clínica destacada en el cáncer de colon en estadio II o III ([Andre et al., 2009]), los regímenes basados en 5-FU a menudo se asocian con efectos secundarios como diarrea, alopecia, anemia, leucopenia y neuropatía periférica. Las toxicidades asociadas al 5-FU se agravan o incluso son letales en pacientes que presentan deficiencia de dihidropirimidina deshidrogenasa ([Johnson y Diasio, 2001]; [Dhelens et al., 2016]). La dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD) es la enzima inicial y limitante de la velocidad responsable del catabolismo del 5-FU. Después de su administración al organismo humano, solo el 1-3% del 5-FU se activa en metabolitos citotóxicos como FdUMP y FUTP, mientras que más del 80% del 5-FU se degrada rápidamente a dihidrofluorouracilo (FUH2), un metabolito inactivo, por la DPD ([Mattison et al., 2002]). Por lo tanto, la DPD desempeña un papel vital en la determinación de la respuesta de un paciente al 5-FU. Una actividad reducida de la DPD da como resultado una vida media del 5-FU sustancialmente prolongada y un mayor riesgo de toxicidad grave ([van Kuilenburg et al., 2012]; [Sharma et al., 2019]). En relación con la conversión del ácido folínico en su forma activa, el 5,10-MTHF, la reacción está catalizada por la serina hidroximetiltransferasa (SHMT), dependiente de la vitamina B6, con la conversión simultánea de la serina en glicina ([Ducker et al., 2017]). Por lo tanto, las enzimas DPD y SHMT desempeñan un papel crucial en el metabolismo del 5-FU y del ácido folínico, respectivamente. Por otro lado, el oxaliplatino se somete a una rápida biotransformación no enzimática para formar monocloro-, dicloro- o diaquo-DACH, que interfiere con la síntesis de ADN. Sin embargo, en presencia de cisteína, metionina o glutatión reducido, el oxaliplatino se convierte en especies químicamente inreactivas ([Di Francesco et al., 2002]).
Los medicamentos herbales se consumen con frecuencia en pacientes con cáncer y supervivientes en las comunidades chinas. Uno de los fármacos botánicos que a menudo recetan los médicos de medicina tradicional china a los pacientes con CCR en China continental y en la Región Administrativa Especial de Hong Kong, Baijiangcao, se seleccionó para evaluar su posible influencia en el tratamiento con FOLFOX en modelos de ratón con cáncer de colon en el presente estudio. Un metaanálisis mostró que Baijiangcao es uno de los medicamentos herbales más utilizados en combinación con la quimioterapia basada en 5-FU para el tratamiento del CCR ([Chen et al., 2019]). Según la literatura farmacológica clásica china, las partes aéreas de las especies vegetales P. scabiosaefolia Link [Caprifoliaceae] y Patrinia villosa (Thunb.) Dufr. [Caprifoliaceae] se consideran generalmente Patriniae Herba (Baijiangcao) ([He et al., 2017]). Un estudio previo informó que el extracto etanólico de Patrinia scabiosaefolia podría inhibir las células de carcinoma colorrectal resistentes al 5-FU ([Huang et al., 2019]). Dada la popularidad y disponibilidad actuales, P. villosa (PV) se vende con mayor frecuencia como Baijiangcao que otras especies relacionadas, como P. scabiosaefolia ([Chen et al., 2020]), en los mercados de hierbas en las partes central y sur de China y a menudo se prescribe a pacientes con CCR y supervivientes. Por lo tanto, PV, en el que se han identificado más de doscientos metabolitos conocidos, principalmente flavonoides, ácidos orgánicos e iridoides ([He et al., 2017]; [Gong et al., 2021]), se utilizó en el presente estudio. Se han informado los efectos antitumorales de las saponinas de PV en modelos de ratón con cáncer de cuello uterino y cáncer de colon ([Zhang et al., 2008]; [Xia et al., 2018]). El extracto de etanol de PV también exhibió un efecto terapéutico en ratones con cáncer de colon inducido por azoximetano/sulfato de dextrano ([Wang et al., 2022]; [Li et al., 2023]). Sin embargo, la forma tradicional de preparar los medicamentos herbales chinos es hervirlos en agua y los pacientes consumen el decocción. Por lo tanto, nuestro estudio previo también reveló por primera vez que el extracto acuoso caliente de PV ejerció efectos antitumorales y antimetaestásicos en células de cáncer de colon y modelos de ratón con tumores, mediante la modulación de las vías TGF-β R1-smad2/3-E-caderina y FAK-RhoA-cofilina ([Yang et al., 2023]).
De hecho, dado que los extractos de hierbas pueden ser utilizados por pacientes con CCR que se someten a quimioterapia con FOLFOX, es esencial determinar si los extractos de hierbas interferirán con el metabolismo de los fármacos componentes de FOLFOX. Aquí, se evaluó la influencia del tratamiento con extracto acuoso de PV sobre los niveles de dihidropirimidina deshidrogenasa (para 5-FU), serina hidroximetiltransferasa (para ácido folínico) y cisteína, metionina y glutatión reducido (para oxaliplatino) en ratones con tumores de colon. También se investigó la posible sinergia entre el tratamiento con FOLFOX y el extracto acuoso de PV en los aspectos de los efectos antitumorales y antimetaestásicos en modelos de ratón con xenoinjertos de colon humano, así como en modelos de ratón con tumores de colon sinérgicos.
Materiales y métodos
Materiales
Agentes quimioterapéuticos
El 5-fluorouracilo en forma de polvo se compró a Sigma-Aldrich (MA, Estados Unidos), mientras que su forma líquida para inyección se compró a Ebewe Pharma (Austria). El ácido folínico y el oxaliplatino se compraron a Wako Chemicals (Tokio, Japón).
Materiales herbales
Se compró un lote único de hierba seca de P. villosa (PV) a un proveedor de renombre en Hong Kong y se almacenó en una sala de almacenamiento con temperatura y humedad controladas. Los materiales herbales (Figura 1A) se autenticaron utilizando la metodología integral de autenticación morfológica, química y molecular establecida en nuestro laboratorio ([Wong et al., 2024]). El espécimen de PV autenticado (número 3705) se depositó en el museo del Instituto de Medicina China de la Universidad China de Hong Kong. El extracto acuoso caliente de PV se preparó y se liofilizó en forma de polvo para los experimentos. Este método de extracción recapitula exactamente el método de preparación tradicional, ya que los materiales herbales de PV se extrajeron con agua caliente, sin utilizar ningún disolvente orgánico. Se remojaron 500 g de hierba seca de PV en agua destilada (5 L) durante 1 hora y luego se hirvieron a 100 °C bajo reflujo dos veces. Después de la extracción, el extracto acuoso combinado se filtró con gasa para eliminar las partículas insolubles. El sobrenadante filtrado se recogió y se evaporó bajo presión reducida hasta que se secó. El porcentaje de rendimiento es del 20,8% (p/p).
Se realizó la estandarización del extracto de hierbas, en la que se registró el perfil químico y se determinaron cuantitativamente los marcadores químicos representativos mediante HPLC, como se describió anteriormente ([Yang et al., 2023]). En resumen, se añadieron 50 mg de polvo de extracto acuoso de PV a 1 ml de metanol al 70% en agua y luego se sometieron a sonicación durante 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se centrifugó durante 15 minutos a 14.000 rpm. El sobrenadante claro (3 ml) se inyectó en un sistema HPLC Agilent 1.100 equipado con un detector DAD (Agilent Technologies, CA, Estados Unidos). Se utilizó una columna Grace™ Alltech™ Alltima™ C18 (250 mm × 4,6 mm i.d., tamaño de partícula de 5 µm) con elución en gradiente a un caudal de 0,8 ml/min para realizar las separaciones cromatográficas. La fase móvil del sistema de LC fue: (A) agua Milli-Q con 0,1% de ácido fórmico y (B) acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico; gradiente: 0-4 min, 2% B; 4-25 min, 2%-15% B; 25-35 min, 15%-30% B; 35-40 min, 30% B; 40-48 min, 30%-98% B; 48-55 min, 98% B. Los espectros se registraron de 190 a 400 nm. Los contenidos de los cinco marcadores químicos identificados, a saber, ácido gálico, ácido protocatecuico, ácido clorogénico, ácido cafeico e ácido isoclorogénico A, se cuantificaron en el extracto acuoso de PV, como se muestra en la Tabla 1. El ácido gálico, el ácido clorogénico y el ácido cafeico para la cuantificación química se compraron a Sigma-Aldrich (MA, Estados Unidos), mientras que el ácido protocatecuico y el ácido isoclorogénico A se compraron a MedChemExpress (NJ, Estados Unidos). Los perfiles de HPLC del extracto acuoso de PV con los marcadores químicos identificados se muestran en la Figura 1B.
Animales y líneas celulares
Los ratones nude y los ratones BALB/c fueron proporcionados por el Centro de Servicios de Animales de Laboratorio de la Universidad China de Hong Kong. El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética de Experimentación con Animales de la Universidad China de Hong Kong (Ref. No. 21-259-HMF). Las líneas celulares de cáncer de colon humano HCT-116, HT-29, SW480 y la línea celular de cáncer de colon de ratón Colon-26 se compraron a American Type Culture Collection (VA, Estados Unidos). Las células HCT-116 y HT-29 se cultivaron en medio McCoy's 5A, mientras que las células SW480 y Colon-26 se mantuvieron en medio DMEM o RPMI-1640, respectivamente. Los medios de cultivo se complementaron con 10% (v/v) de suero fetal bovino y 1% de penicilina/estreptomicina. Todas las líneas celulares y los suplementos se compraron a Thermo Fisher Scientific (MA, Estados Unidos).
Modelo de ratón con xenoinjerto de colon humano
Se inyectaron células HCT-116 (5 × 106 células) por vía subcutánea en el flanco de ratones desnudos (de 6 a 8 semanas de edad). Después de 8 a 10 días, se midió el tamaño de los xenoinjertos palpables utilizando un calibrador. Los ratones portadores de xenoinjertos se asignaron aleatoriamente a diferentes grupos y luego se trataron con FOLFOX y/o extracto acuoso de PV durante 22 días (el protocolo de tratamiento se muestra en la Figura 2A). Se realizaron tres series de experimentos, y el número inicial de ratones por grupo fue de 15. Durante el período de tratamiento, algunos ratones alcanzaron el punto final de sufrimiento y fueron sacrificados antes del final de los experimentos. Por lo tanto, el número final de ratones en cada grupo fue: grupo control (n = 11), grupo de tratamiento con PV (n = 13), grupo de tratamiento con FOLFOX (n = 15), grupo de tratamiento con FOLFOX + PV (n = 13). El peso corporal y el tamaño de los xenoinjertos se midieron dos veces por semana. Al final del período de tratamiento, se anestesiaron los ratones y se recolectó sangre mediante punción cardíaca. Se obtuvo plasma por centrifugación y se almacenó a -80 °C hasta el análisis de varias enzimas/moléculas clave involucradas en el metabolismo de los fármacos componentes de FOLFOX. Los tumores se extirparon de los ratones después de la dislocación cervical para el análisis histológico.
Modelo de ratón con tumor de colon ortotópico sinérgico
Se evaluaron los efectos de FOLFOX y el extracto acuoso de PV en un modelo de ratón con tumor de colon ortotópico sinérgico, en el cual se pudieron dilucidar los cambios en el microambiente tumoral después del tratamiento farmacológico ([Li et al., 2018]). Se inyectaron células tumorales Colon-26 de ratón (5 × 104 células por 50 µL de PBS) en la pared posterior del recto de ratones BALB/c bajo anestesia. Tres días después de la inoculación de las células, los ratones se asignaron aleatoriamente a diferentes grupos y comenzaron a recibir los tratamientos (igual que en los ratones portadores de xenoinjertos HCT-116) durante 22 días. Se realizaron tres series de experimentos, y el número inicial de ratones por grupo fue de 15. Durante el período de tratamiento, algunos ratones alcanzaron el punto final de sufrimiento y fueron sacrificados antes del final de los experimentos. Por lo tanto, el número final de ratones en cada grupo fue: grupo control (n = 11), grupo de tratamiento con PV (n = 12), grupo de tratamiento con FOLFOX (n = 13), grupo de tratamiento con FOLFOX + PV (n = 15). Al final del período de tratamiento, se anestesiaron los ratones y se recolectó sangre en tubos heparinizados mediante punción cardíaca. Se obtuvo plasma por centrifugación y se almacenó a -80 °C hasta la determinación de los niveles de enzimas plasmáticas [transaminasa aspártica (AST) y transaminasa alanina (ALT) para la función hepática, creatina quinasa (CK) para el daño tisular] utilizando kits de enzimas según los procedimientos del fabricante (Stanbio Laboratory, TX, Estados Unidos). Los tumores, los pulmones y los hígados se extirparon de los ratones después de la dislocación cervical para un análisis histológico adicional. La proliferación celular (tinción con Ki67), la apoptosis (tinción con TUNEL) y la angiogénesis (tinción con CD31) en las secciones tumorales se evaluaron mediante análisis inmunohistoquímico como se describió previamente ([Li et al., 2017]). Los hígados y los pulmones se sometieron a un examen histológico para la evaluación del nivel de metástasis. Además, se determinaron los cambios en la población de macrófagos intratumorales y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC), así como las células T reguladoras (Treg) aisladas de los ganglios linfáticos mediante citometría de flujo, como se describió en nuestro estudio anterior ([Yang et al., 2023]).
Tratamiento con FOLFOX y/o extracto acuoso de PV
FOLFOX se administra ampliamente mediante infusión continua para tratar a pacientes con CRC. Por lo tanto, la vía de administración de FOLFOX se mantuvo intravenosa en el presente estudio en animales, mientras que el extracto acuoso de PV se administró a los ratones por vía gástrica para simular la situación de los pacientes con cáncer que toman decocciones de medicina china por vía oral. FOLFOX, que consiste en 5-fluorouracilo (50 mg/kg), oxaliplatino (1,75 mg/kg), ácido folínico (8,3 mg/kg), se administró por vía intravenosa el día 1 de cada semana, mientras que PV (1,6 g/kg) se administró por vía gástrica los días 2 a 7 de cada semana. El tratamiento duró 22 días.
Medición de las enzimas/moléculas metabolizadoras de los fármacos componentes de FOLFOX
Se utilizaron muestras de sangre e hígado recolectadas de ratones portadores de xenoinjertos HCT-116 para la determinación de la dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD), la serina hidroximetiltransferasa (SHMT) y la cisteína/metionina/glutatión reducido, que son responsables del catabolismo o la transformación del 5-fluorouracilo, el ácido folínico y el oxaliplatino, respectivamente. Los niveles de DPD y SHMT se determinaron utilizando kits ELISA (MyBioSource, CA, Estados Unidos), y los niveles de cisteína/metionina/glutatión reducido se midieron utilizando kits de ensayo (Sigma-Aldrich, MO, Estados Unidos o Cell Biolabs, CA, Estados Unidos).
Durante el tratamiento de 3 semanas con FOLFOX con o sin extracto acuoso de PV, se recolectó un lote de muestras de sangre e hígado (que se etiquetaron como 1 ciclo) de ratones portadores de xenoinjertos que recibieron un tratamiento de 1 semana. Grupo control (n = 8), grupo de tratamiento con PV (n = 9), grupo de tratamiento con FOLFOX (n = 9), grupo de tratamiento con FOLFOX + PV (n = 9). Otro lote de ratones portadores de xenoinjertos, que recibieron un tratamiento de 3 semanas, se sacrificó para la recolección de muestras de sangre e hígado (etiquetado como 3 ciclos). Grupo control (n = 8), grupo de tratamiento con PV (n = 9), grupo de tratamiento con FOLFOX (n = 9), grupo de tratamiento con FOLFOX + PV (n = 11). Ambos lotes de muestras se sometieron a la determinación de las enzimas/moléculas metabolizadoras de los fármacos componentes de FOLFOX utilizando los kits de ensayo según las instrucciones del fabricante.
Medición de 5-FU y ácido folínico en plasma y tumor mediante LC-MS
Además, con el fin de controlar los niveles plasmáticos en estado estacionario de los fármacos componentes de FOLFOX en ratones portadores de xenoinjertos HCT-116, al final del tratamiento con FOLFOX y/o PV, se recolectó un lote de ratones que recibieron una inyección intravenosa de FOLFOX, y se recolectaron sangre y tejidos tumorales 15 minutos después de la administración de FOLFOX. Este punto de tiempo seleccionado se basó en la vida media de eliminación de 5-FU, con una vida media de aproximadamente 13 minutos. Se midieron los niveles de los fármacos componentes de FOLFOX en el plasma y el tumor de ratones tratados solo con FOLFOX (n = 7) y con extracto acuoso de PV más FOLFOX (n = 6).
Reactivos
Los análisis de LC-MS se realizaron con reactivos de grado LC-MS, incluidos el acetonitrilo y el metanol de RCI Labscan Limited (Bangkok, Tailandia) y el ácido fórmico de Fisher Chemicals (PA, Estados Unidos). Se obtuvo agua ultrapura (18,2 MΩ a 25 °C) de un sistema de agua ultrapura Millipore® Milli-Q® Academic® (MA, Estados Unidos).
Preparación de muestras de plasma
Para 20-50 µL de la muestra de plasma, se añadió un volumen de MeOH 4 veces mayor. Después de agitar en un vórtice durante un minuto, las muestras se centrifugaron a 14.000 rpm durante 5 minutos. Luego, el sobrenadante se cargó en cartuchos Oasis PRiME HLB (1 cc, 30 mg) (Waters Corporation, MA, Estados Unidos), se dejó pasar y se recolectó en tubos de Eppendorf de 1,7 mL. Al precipitado de proteínas, se añadió 200 µL de 80 % de MeOH (v/v). Después de la sonicación durante 3 minutos y la centrifugación a 14.000 rpm durante 5 minutos, el sobrenadante se pasó a través de los cartuchos SPE y se recolectó, después de lo cual los cartuchos se enjuagaron con 100 µL de 80 % de MeOH (v/v) y se recolectaron. El eluido de SPE se centrifugó luego durante 10 minutos a 14.000 rpm. El sobrenadante se concentró luego utilizando un concentrador de vacío Gyrozen HyperVAC-LITE (Kyonggi-do, Corea del Sur) a 50 °C y 1900 rpm durante una hora. Los extractos secos se redisolvieron en 200-500 µL de 10 % de MeOH (v/v) y se filtraron a través de filtros de jeringa Acrodisc® de 0,22 µm con membrana wwPTFE (Pall Corporation, NY, Estados Unidos), antes del análisis por LC-MS.
Preparación de muestras de tejido tumoral
Las muestras de tejido tumoral (20 mg) se pesaron con precisión en tubos de Eppendorf de 2,0 mL y se mezclaron con 500 µL de MeOH. Después de la homogeneización utilizando un QIAGEN TissueRuptor (Hilden, Alemania), se añadió un volumen adicional de MeOH para alcanzar una relación muestra-disolvente de 1:50. Después de agitar en un vórtice durante 1 minuto seguido de la centrifugación a 14.000 rpm a 4 °C durante 20 minutos para la eliminación de proteínas, se secaron 800 µL del sobrenadante utilizando un concentrador de vacío a 50 °C y 1900 rpm durante una hora. Los extractos secos se redisolvieron en 160 µL de 10 % de MeOH (v/v) y se filtraron a través de filtros de jeringa Acrodisc® de 0,22 µm con membrana de PTFE antes del análisis por LC-MS.
Instrumentación
Las separaciones cromatográficas se llevaron a cabo en un sistema Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS (Waters Corporation) utilizando una columna Agilent InfinityLab Poroshell 120 Aq-C18 (3,0 × 100 mm, 2,7 µm) con una columna de protección correspondiente (3,0 mm × 5 mm, 2,7 µm) (Agilent Technologies, CA, Estados Unidos) mediante elución en gradiente a una velocidad de flujo de 0,5 mL/min.
El sistema UPLC funcionó a 35 °C de la siguiente manera: fase móvil (A) agua milli-Q con 0,1 % de ácido fórmico y (B) acetonitrilo con 0,1 % de ácido fórmico; gradiente: 0-2 min, 1 % B; 2-5 min, 1-30 % B; 5-6 min, 30-98 % B; 6-7,5 min, 98 % B; 7,5-8 min, 98-1 % B; 8-10 min, 1 % B. La temperatura del autosensor se mantuvo a 18 °C. El volumen de inyección fue de 0,5 µL.
El análisis de MS se realizó utilizando un detector Waters SQ 2 con fuente de ionización por electrospray en modo de iones negativos. La optimización de los parámetros de MS se realizó mediante la infusión directa de soluciones estándar de 5-FU y ácido folínico en el MS. Los voltajes de cono de muestreo de MS para los metabolitos se optimizaron automáticamente con el uso del software Waters IntelliStart™. El MS se operó con las siguientes condiciones: temperatura de la fuente, 150 °C; temperatura del gas de desolvatación, 500 °C; flujo de gas de desolvatación, 1000 L/h; voltaje del capilar, -2,5 kV; voltaje del cono de muestreo, -34 y -54 V para 5-FU y ácido folínico, respectivamente. Se empleó el modo de monitoreo de iones seleccionados para la adquisición de iones pseudo-moleculares desprotonados [M-H-] con relaciones masa-carga (m/z) de 128,92 y 472,16 para el análisis de 5-FU y ácido folínico, respectivamente. El tiempo de permanencia fue de 0,128 s. Los datos de masa se recolectaron de 1,5 a 6 min. El software Waters MassLynx™ (versión 4.2) se utilizó para el control del instrumento y la adquisición de datos, mientras que el software TargetLynx™ se utilizó para el análisis cuantitativo (Waters Corporation).
Medición del contenido de platino en plasma y tumores
Las muestras de plasma (400 µL) y las muestras de lisados de tejido tumoral (400 µL) de cada ratón tratado con FOLFOX y/o extracto acuoso de PV se enviaron a Chemical Testing Services, Hong Kong Baptist University, para la determinación del contenido de platino. Las muestras se sometieron a digestión ácida y luego se midió el contenido de platino utilizando espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS).
Tinción histológica e inmunohistoquímica
Los tumores, los pulmones y los hígados extraídos de los ratones se fijaron en formaldehído al 10 % y se procesaron para la inclusión en parafina. Las muestras de pulmón e hígado incluidas en parafina se cortaron en secciones de 5 µm y luego se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Las secciones tumorales se sometieron a tinción inmunohistoquímica de Ki67 para la proliferación celular, CD31 para la angiogénesis y tinción TUNEL para la apoptosis, como se describió previamente ([Jiang et al., 2022]). Los hígados y los pulmones se sometieron a un examen histológico para la evaluación del nivel de metástasis. Además, se determinaron los cambios en la población de macrófagos intratumorales y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC), así como las células T reguladoras (Treg) aisladas de los ganglios linfáticos mediante citometría de flujo, como se describió en nuestro estudio anterior ([Yang et al., 2023]).
RT-qPCR en tiempo real de tejidos tumorales
Se extrajeron tejidos tumorales recolectados de ratones portadores de xenoinjertos HCT-116 para obtener ARN total utilizando el reactivo TRIzol (Thermo Fisher Scientific, MA, Estados Unidos). El ARN (1 µg) se transcribió inversamente utilizando EasyScript® One-Step SuperMix (TransGen, Beijing, China). Se realizó una reacción de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) con el SYBR Green Master Mix for qPCR (Thermo Fisher Scientific) en un instrumento LightCycler® 480 Instrument II (Applied Roche, CA, Estados Unidos). Los cebadores se sintetizaron en Integrated DNA Technologies (Singapur) y la Tabla 2 muestra las secuencias. Los niveles de ARNm de los genes diana se normalizaron con los niveles de GAPDH.
Análisis estadístico
Los datos de todos los experimentos con animales se expresaron como media + E.E.M. Las diferencias entre los grupos de tratamiento y control se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) de una vía, seguido de pruebas post hoc, según la distribución de los datos. En todas las comparaciones, se consideró que un valor de p < 0,05 indicaba significación estadística. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software, CA, Estados Unidos).
Materiales
Agentes quimioterapéuticos
El 5-fluorouracilo en forma de polvo se adquirió de Sigma-Aldrich (MA, Estados Unidos), mientras que su forma líquida para inyección se adquirió de Ebewe Pharma (Austria). El ácido fólico y el oxaliplatino se adquirieron de Wako Chemicals (Tokio, Japón).
Materiales herbales
Se adquirió un lote único de hierba seca de P. villosa (PV) de un proveedor reconocido en Hong Kong y se almacenó en una sala de almacenamiento con temperatura y humedad controladas. Los materiales herbales (Figura 1A) se autenticaron utilizando la metodología integral de autenticación morfológica, química y molecular establecida en nuestro laboratorio ([Wong et al., 2024]). Se depositó un espécimen de PV autenticado (n.º 3705) en el museo del Instituto de Medicina China, de la Universidad China de Hong Kong. Se preparó un extracto acuoso de PV y se liofilizó en forma de polvo para los experimentos. Este método de extracción replicó exactamente el método de preparación tradicional, ya que los materiales herbales de PV se extrajeron con agua caliente, sin utilizar ningún disolvente orgánico. Se sumergieron 500 g de hierba seca de PV en agua destilada (5 L) durante 1 h y luego se hirvieron a 100 °C bajo reflujo dos veces. Después de la extracción, el extracto acuoso combinado se filtró con gasa para eliminar las partículas insolubles. El sobrenadante filtrado se recogió y se evaporó bajo presión reducida hasta que se secó. El porcentaje de rendimiento es del 20,8 % (p/p).
Se realizó la estandarización del extracto herbal, en la que se registró el perfil químico y se determinaron cuantitativamente los marcadores químicos representativos utilizando HPLC, como se describió anteriormente ([Yang et al., 2023]). En resumen, se añadieron 50 mg de polvo de extracto acuoso de PV a 1 ml de metanol al 70 % en agua y luego se sometieron a sonicación durante 30 min a temperatura ambiente. La mezcla se centrifugó durante 15 min a 14 000 rpm. Se inyectaron 3 ml del sobrenadante claro en un sistema HPLC Agilent 1100 equipado con un detector DAD (Agilent Technologies, CA, Estados Unidos). Se utilizó una columna Grace™ Alltech™ Alltima™ C18 (250 mm × 4,6 mm i.d., tamaño de partícula de 5 µm) con elución en gradiente a un caudal de 0,8 ml/min para realizar las separaciones cromatográficas. La fase móvil del sistema de LC fue: (A) agua Milli-Q con 0,1 % de ácido fórmico y (B) acetonitrilo con 0,1 % de ácido fórmico; gradiente: 0–4 min, 2 % B; 4–25 min, 2 %–15 % B; 25–35 min, 15 %–30 % B; 35–40 min, 30 % B; 40–48 min, 30 %–98 % B; 48–55 min, 98 % B. Los espectros se registraron de 190 a 400 nm. Se cuantificaron los contenidos de los cinco marcadores químicos identificados, a saber, ácido gálico, ácido protocatecuico, ácido clorogénico, ácido cafeico e ácido isoclorogénico A, en el extracto acuoso de PV, como se muestra en la Tabla 1. El ácido gálico, el ácido clorogénico y el ácido cafeico para la cuantificación química se adquirieron de Sigma-Aldrich (MA, Estados Unidos), mientras que el ácido protocatecuico y el ácido isoclorogénico A se adquirieron de MedChemExpress (NJ, Estados Unidos). Los perfiles de HPLC del extracto acuoso de PV con los marcadores químicos identificados se muestran en la Figura 1B.
Animales y líneas celulares
Los ratones nude y los ratones BALB/c fueron proporcionados por el Centro de Servicios de Animales de Laboratorio de la Universidad China de Hong Kong. El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética de Experimentación con Animales de la Universidad China de Hong Kong (Ref. n.º 21-259-HMF). Las líneas celulares de cáncer de colon humano HCT-116, HT-29, SW480 y la línea celular de cáncer de colon de ratón Colon-26 se adquirieron de American Type Culture Collection (VA, Estados Unidos). Las células HCT-116 y HT-29 se cultivaron en medio McCoy's 5A, mientras que las células SW480 y Colon-26 se mantuvieron en medio DMEM o RPMI-1640, respectivamente. Los medios de cultivo se complementaron con 10 % (v/v) de suero bovino fetal y 1 % de penicilina/estreptomicina. Estas líneas celulares se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5 % de CO2. Todos los medios de cultivo y suplementos se adquirieron de Thermo Fisher Scientific (MA, Estados Unidos).
Agentes quimioterapéuticos
El 5-fluorouracilo en forma de polvo se adquirió de Sigma-Aldrich (MA, Estados Unidos), mientras que su forma líquida para inyección se adquirió de Ebewe Pharma (Austria). El ácido fólico y el oxaliplatino se adquirieron de Wako Chemicals (Tokio, Japón).
Materiales herbales
Se adquirió un lote único de hierba seca de P. villosa (PV) de un proveedor reconocido en Hong Kong y se almacenó en una sala de almacenamiento con temperatura y humedad controladas. Los materiales herbales (Figura 1A) se autenticaron utilizando la metodología integral de autenticación morfológica, química y molecular establecida en nuestro laboratorio ([Wong et al., 2024]). Se depositó un espécimen de PV autenticado (n.º 3705) en el museo del Instituto de Medicina China, de la Universidad China de Hong Kong. Se preparó un extracto acuoso de PV y se liofilizó en forma de polvo para los experimentos. Este método de extracción replicó exactamente el método de preparación tradicional, ya que los materiales herbales de PV se extrajeron con agua caliente, sin utilizar ningún disolvente orgánico. Se sumergieron 500 g de hierba seca de PV en agua destilada (5 L) durante 1 h y luego se hirvieron a 100 °C bajo reflujo dos veces. Después de la extracción, el extracto acuoso combinado se filtró con gasa para eliminar las partículas insolubles. El sobrenadante filtrado se recogió y se evaporó bajo presión reducida hasta que se secó. El porcentaje de rendimiento es del 20,8 % (p/p).
Se realizó la estandarización del extracto herbal, en la que se registró el perfil químico y se determinaron cuantitativamente los marcadores químicos representativos utilizando HPLC, como se describió anteriormente ([Yang et al., 2023]). En resumen, se añadieron 50 mg de polvo de extracto acuoso de PV a 1 ml de metanol al 70 % en agua y luego se sometieron a sonicación durante 30 min a temperatura ambiente. La mezcla se centrifugó durante 15 min a 14 000 rpm. Se inyectaron 3 ml del sobrenadante claro en un sistema HPLC Agilent 1100 equipado con un detector DAD (Agilent Technologies, CA, Estados Unidos). Se utilizó una columna Grace™ Alltech™ Alltima™ C18 (250 mm × 4,6 mm i.d., tamaño de partícula de 5 µm) con elución en gradiente a un caudal de 0,8 ml/min para realizar las separaciones cromatográficas. La fase móvil del sistema de LC fue: (A) agua Milli-Q con 0,1 % de ácido fórmico y (B) acetonitrilo con 0,1 % de ácido fórmico; gradiente: 0–4 min, 2 % B; 4–25 min, 2 %–15 % B; 25–35 min, 15 %–30 % B; 35–40 min, 30 % B; 40–48 min, 30 %–98 % B; 48–55 min, 98 % B. Los espectros se registraron de 190 a 400 nm. Se cuantificaron los contenidos de los cinco marcadores químicos identificados, a saber, ácido gálico, ácido protocatecuico, ácido clorogénico, ácido cafeico e ácido isoclorogénico A, en el extracto acuoso de PV, como se muestra en la Tabla 1. El ácido gálico, el ácido clorogénico y el ácido cafeico para la cuantificación química se adquirieron de Sigma-Aldrich (MA, Estados Unidos), mientras que el ácido protocatecuico y el ácido isoclorogénico A se adquirieron de MedChemExpress (NJ, Estados Unidos). Los perfiles de HPLC del extracto acuoso de PV con los marcadores químicos identificados se muestran en la Figura 1B.
Animales y líneas celulares
Los ratones nude y los ratones BALB/c fueron proporcionados por el Centro de Servicios de Animales de Laboratorio de la Universidad China de Hong Kong. El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética de Experimentación con Animales de la Universidad China de Hong Kong (Ref. n.º 21-259-HMF). Las líneas celulares de cáncer de colon humano HCT-116, HT-29, SW480 y la línea celular de cáncer de colon de ratón Colon-26 se adquirieron de American Type Culture Collection (VA, Estados Unidos). Las células HCT-116 y HT-29 se cultivaron en medio McCoy's 5A, mientras que las células SW480 y Colon-26 se mantuvieron en medio DMEM o RPMI-1640, respectivamente. Los medios de cultivo se complementaron con 10 % (v/v) de suero bovino fetal y 1 % de penicilina/estreptomicina. Estas líneas celulares se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5 % de CO2. Todos los medios de cultivo y suplementos se adquirieron de Thermo Fisher Scientific (MA, Estados Unidos).
Modelo de ratón con xenoinjerto de colon humano
Se inyectaron 5 × 106 células de HCT-116 por vía subcutánea en el flanco de ratones nude (de 6 a 8 semanas de edad). Después de 8 a 10 días, se midió el tamaño de los xenoinjertos palpables con un calibrador. Los ratones con xenoinjertos se aleatorizaron en diferentes grupos y luego se trataron con FOLFOX y/o extracto acuoso de PV (dosis descritas en la Sección 2.4) durante 22 días (protocolo de tratamiento que se muestra en la Figura 2A). Se realizaron tres lotes de experimentos, con un número inicial de 15 ratones por grupo. Durante el período de tratamiento, algunos ratones alcanzaron el punto final de eutanasia y fueron sacrificados antes del final de los experimentos. Por lo tanto, los números finales de ratones en cada grupo fueron: grupo de control (n = 11), grupo de tratamiento con PV (n = 13), grupo de tratamiento con FOLFOX (n = 15), grupo de tratamiento con FOLFOX + PV (n = 13). Se midió el peso corporal y el tamaño de los xenoinjertos dos veces por semana. Al final del período de tratamiento, se anestesiaron los ratones y se recogió sangre mediante punción cardíaca. Se obtuvo plasma por centrifugación y se almacenó a -80 °C hasta su análisis para determinar varios enzimas/moléculas clave implicadas en el metabolismo de los fármacos componentes de FOLFOX. Los tumores se extirparon de los ratones después de la disección cervical para su análisis histológico.
Modelo de ratón sinérgico con tumor de colon ortotópico
Se evaluaron los efectos de FOLFOX y el extracto acuoso de PV en un modelo de ratón sinérgico con tumor de colon ortotópico, en el que se pudo dilucidar los cambios en el microambiente tumoral después del tratamiento con fármacos ([Li et al., 2018]). Se inyectaron células tumorales de Colon-26 de ratón (5 × 104 células por 50 µL de PBS) en la pared posterior del recto de ratones BALB/c bajo anestesia. Tres días después de la inoculación de las células, se aleatorizaron los ratones en diferentes grupos y se inició el tratamiento (igual que en los ratones con xenoinjertos de HCT-116) durante 22 días. Se realizaron tres lotes de experimentos, con un número inicial de 15 ratones por grupo. Durante el período de tratamiento, algunos ratones alcanzaron el punto final de eutanasia y fueron sacrificados antes del final de los experimentos. Por lo tanto, los números finales de ratones en cada grupo fueron: grupo de control (n = 11), grupo de tratamiento con PV (n = 12), grupo de tratamiento con FOLFOX (n = 13), grupo de tratamiento con FOLFOX + PV (n = 15). Al final del período de tratamiento, se anestesiaron los ratones y se recogió sangre en un tubo con heparina mediante punción cardíaca. Se obtuvo plasma por centrifugación y se almacenó a -80 °C hasta la determinación de los niveles de enzimas plasmáticas [transaminasa oxalacética (AST) y transaminasa alanina (ALT) para la función hepática, creatina quinasa (CK) para el daño tisular] utilizando kits de enzimas según los procedimientos del fabricante (Stanbio Laboratory, TX, Estados Unidos). Se extirparon los tumores, los pulmones y los hígados de los ratones después de la disección cervical para su posterior análisis histológico. Se evaluó la proliferación celular (tinción con Ki67), la apoptosis (tinción con TUNEL) y la angiogénesis (tinción con CD31) en las secciones tumorales mediante análisis inmunohistoquímico, como se describió anteriormente ([Li et al., 2017]). Los hígados y los pulmones se sometieron a un examen histológico para evaluar el nivel de metástasis. Además, se determinaron los cambios en la población de macrófagos y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC), así como de células T reguladoras (Treg) aisladas de los ganglios linfáticos mediante citometría de flujo, como se describió en nuestro estudio anterior ([Yang et al., 2023]).
Tratamiento con FOLFOX y/o extracto acuoso de PV
FOLFOX se administra ampliamente mediante infusión continua para tratar a pacientes con CRC. Por lo tanto, la vía de administración de FOLFOX se mantuvo intravenosa en el presente estudio en animales, mientras que el extracto acuoso de PV se administró a los ratones por gavage para simular la situación de los pacientes con cáncer que toman una decocción de medicina china por vía oral. FOLFOX, que consiste en 5-fluorouracilo (50 mg/kg), oxaliplatino (1,75 mg/kg), ácido folínico (8,3 mg/kg), se administró por vía intravenosa el día 1 de cada semana, mientras que PV (1,6 g/kg) se administró por vía oral mediante gavage durante los días 2 a 7 de cada semana. El tratamiento duró 22 días.
Medición de las enzimas/moléculas metabolizadoras de los fármacos componentes de FOLFOX
Se utilizaron muestras de sangre e hígado recolectadas de ratones portadores de xenoinjertos HCT-116 para la determinación de la dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD), la serina hidroximetiltransferasa (SHMT) y la cisteína/metionina/glutatión reducido, que son responsables del catabolismo o la transformación del 5-fluorouracilo, el ácido folínico y el oxaliplatino, respectivamente. Los niveles de DPD y SHMT se determinaron utilizando kits ELISA (MyBioSource, CA, Estados Unidos), y los niveles de cisteína/metionina/glutatión reducido se midieron utilizando kits de ensayo (Sigma-Aldrich, MO, Estados Unidos o Cell Biolabs, CA, Estados Unidos).
Durante el tratamiento de 3 semanas con FOLFOX, con o sin el extracto acuoso de PV, se recolectó un lote de muestras de sangre e hígado (que se etiquetaron como 1 ciclo) de ratones portadores de xenoinjertos que recibieron un tratamiento de 1 semana. Grupo control (n = 8), grupo de tratamiento con PV (n = 9), grupo de tratamiento con FOLFOX (n = 9), grupo de tratamiento con FOLFOX + PV (n = 9). Otro lote de ratones portadores de xenoinjertos, que recibieron un tratamiento de 3 semanas, se sacrificó para la recolección de muestras de sangre e hígado (etiquetado como 3 ciclos). Grupo control (n = 8), grupo de tratamiento con PV (n = 9), grupo de tratamiento con FOLFOX (n = 9), grupo de tratamiento con FOLFOX + PV (n = 11). Ambos lotes de muestras se sometieron a la determinación de las enzimas/moléculas metabolizadoras de los fármacos componentes de FOLFOX utilizando los kits de ensayo según las instrucciones del fabricante.
Medición de 5-FU y ácido folínico en plasma y tumor mediante LC-MS
Además, con el fin de controlar los niveles plasmáticos en estado estacionario de los fármacos componentes de FOLFOX en ratones portadores de xenoinjertos HCT-116, al final del tratamiento con FOLFOX y/o extracto acuoso de PV, se administró por vía intravenosa FOLFOX a un lote de ratones, y se recolectaron muestras de sangre y tejidos tumorales 15 minutos después de la administración de FOLFOX. Este punto de tiempo seleccionado se basó en la vida media de 5-FU, con una vida media de eliminación del plasma de alrededor de 13 minutos. Se midieron los niveles de los fármacos componentes de FOLFOX en el plasma y el tumor de ratones tratados con FOLFOX solo (n = 7) y con extracto acuoso de PV más FOLFOX (n = 6).
Reactivos
Los análisis de LC-MS se realizaron con reactivos de grado LC-MS, incluidos el acetonitrilo y el metanol de RCI Labscan Limited (Bangkok, Tailandia), y el ácido fórmico de Fisher Chemicals (PA, Estados Unidos). Se obtuvo agua ultrapura (18,2 MΩ·cm a 25 °C) de un sistema de agua ultrapura Millipore® Milli-Q® Academic® (MA, Estados Unidos).
Preparación de muestras de plasma
Para 20-50 µL de la muestra de plasma, se añadió un volumen de MeOH 4 veces mayor. Después de agitar vigorosamente durante un minuto, las muestras se centrifugaron a 14.000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se cargó luego en cartuchos Oasis PRiME HLB (1 cc, 30 mg) (Waters Corporation, MA, Estados Unidos), se dejó pasar y se recolectó en tubos Eppendorf de 1,7 mL. Al precipitado de proteínas, se añadió 200 µL de 80 % de MeOH (v/v). Después de la sonicación durante 3 minutos y la centrifugación a 14.000 rpm durante 5 minutos, el sobrenadante se pasó a través de los cartuchos SPE y se recolectó, después de lo cual los cartuchos se enjuagaron con 100 µL de 80 % de MeOH (v/v) y se recolectaron. El eluido SPE se centrifugó luego durante 10 minutos a 14.000 rpm. El sobrenadante se concentró luego utilizando un concentrador de vacío Gyrozen HyperVAC-LITE (Kyonggi-do, Corea del Sur) que funcionó a 50 °C y 1900 rpm durante una hora. Los extractos secos se redisolvieron en 200-500 µL de 10 % de MeOH (v/v) y se filtraron a través de filtros de jeringa Acrodisc® de 0,22 µm con membrana wwPTFE (Pall Corporation, NY, Estados Unidos), antes del análisis por LC-MS.
Preparación de muestras de tejido tumoral
Las muestras de tejido tumoral (20 mg) se pesaron con precisión en tubos Eppendorf de 2,0 mL y se mezclaron con 500 µL de MeOH. Después de la homogeneización utilizando un QIAGEN TissueRuptor (Hilden, Alemania), se añadió un volumen adicional de MeOH para alcanzar una relación muestra-disolvente de 1:50. Después de agitar vigorosamente durante 1 minuto seguido de la centrifugación a 14.000 rpm a 4 °C durante 20 minutos para la eliminación de proteínas, se secaron 800 µL del sobrenadante utilizando un concentrador de vacío que funcionó a 50 °C y 1900 rpm durante una hora. Los extractos secos se redisolvieron en 160 µL de 10 % de MeOH (v/v) y se filtraron a través de filtros de jeringa Acrodisc® de 0,22 µm con membrana de PTFE antes del análisis por LC-MS.
Instrumentación
Las separaciones cromatográficas se llevaron a cabo en un sistema Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS (Waters Corporation) utilizando una columna Agilent InfinityLab Poroshell 120 Aq-C18 (3,0 × 100 mm, 2,7 µm) con una columna de protección correspondiente (3,0 mm × 5 mm, 2,7 µm) (Agilent Technologies, CA, Estados Unidos) mediante elución en gradiente a un caudal de 0,5 mL/min.
El sistema UPLC funcionó a 35 °C de la siguiente manera: fase móvil (A) agua milli-Q con 0,1 % de ácido fórmico y (B) acetonitrilo con 0,1 % de ácido fórmico; gradiente: 0-2 min, 1 % B; 2-5 min, 1-30 % B; 5-6 min, 30-98 % B; 6-7,5 min, 98 % B; 7,5-8 min, 98-1 % B; 8-10 min, 1 % B. La temperatura del autosensor se mantuvo a 18 °C. El volumen de inyección fue de 0,5 µL.
El análisis de MS se realizó utilizando un detector Waters SQ Detector 2 con fuente de ionización por electrospray que funcionó en modo de iones negativos. La optimización de los parámetros de MS se realizó mediante la infusión directa de soluciones estándar de 5-FU y ácido folínico en el MS. Los voltajes del cono de muestreo de MS para los metabolitos se optimizaron automáticamente con el uso del software Waters IntelliStart™. El MS funcionó con las siguientes condiciones: temperatura de la fuente, 150 °C; temperatura del gas de desolvatación, 500 °C; caudal del gas de desolvatación, 1000 L/h; voltaje del capilar, -2,5 kV; voltaje del cono de muestreo, -34 y -54 V para 5-FU y ácido folínico, respectivamente. Se empleó el modo de monitoreo de iones seleccionados para la adquisición de iones pseudo-moleculares desprotonados [M-H-] con relaciones masa-carga (m/z) de 128,92 y 472,16 para el análisis de 5-FU y ácido folínico, respectivamente. El tiempo de permanencia fue de 0,128 s. Los datos de masa se recolectaron de 1,5 a 6 min. El software Waters MassLynx™ (versión 4.2) se utilizó para el control del instrumento y la adquisición de datos, mientras que el software TargetLynx™ se utilizó para el análisis cuantitativo (Waters Corporation).
Reactivos
Los análisis de LC-MS se realizaron con reactivos de grado LC-MS, incluidos el acetonitrilo y el metanol de RCI Labscan Limited (Bangkok, Tailandia), y el ácido fórmico de Fisher Chemicals (PA, Estados Unidos). Se obtuvo agua ultrapura (18,2 MΩ·cm a 25 °C) de un sistema de agua ultrapura Millipore® Milli-Q® Academic® (MA, Estados Unidos).
Preparación de muestras de plasma
Para 20-50 µL de la muestra de plasma, se añadió un volumen de MeOH 4 veces mayor. Después de agitar vigorosamente durante un minuto, las muestras se centrifugaron a 14.000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se cargó luego en cartuchos Oasis PRiME HLB (1 cc, 30 mg) (Waters Corporation, MA, Estados Unidos), se dejó pasar y se recolectó en tubos Eppendorf de 1,7 mL. Al precipitado de proteínas, se añadió 200 µL de 80 % de MeOH (v/v). Después de la sonicación durante 3 minutos y la centrifugación a 14.000 rpm durante 5 minutos, el sobrenadante se pasó a través de los cartuchos SPE y se recolectó, después de lo cual los cartuchos se enjuagaron con 100 µL de 80 % de MeOH (v/v) y se recolectaron. El eluido SPE se centrifugó luego durante 10 minutos a 14.000 rpm. El sobrenadante se concentró luego utilizando un concentrador de vacío Gyrozen HyperVAC-LITE (Kyonggi-do, Corea del Sur) que funcionó a 50 °C y 1900 rpm durante una hora. Los extractos secos se redisolvieron en 200-500 µL de 10 % de MeOH (v/v) y se filtraron a través de filtros de jeringa Acrodisc® de 0,22 µm con membrana wwPTFE (Pall Corporation, NY, Estados Unidos), antes del análisis por LC-MS.
Preparación de muestras de tejido tumoral
Las muestras de tejido tumoral (20 mg) se pesaron con precisión en tubos Eppendorf de 2,0 mL y se mezclaron con 500 µL de MeOH. Después de la homogeneización utilizando un QIAGEN TissueRuptor (Hilden, Alemania), se añadió un volumen adicional de MeOH para alcanzar una relación muestra-disolvente de 1:50. Después de agitar vigorosamente durante 1 minuto seguido de la centrifugación a 14.000 rpm a 4 °C durante 20 minutos para la eliminación de proteínas, se secaron 800 µL del sobrenadante utilizando un concentrador de vacío que funcionó a 50 °C y 1900 rpm durante una hora. Los extractos secos se redisolvieron en 160 µL de 10 % de MeOH (v/v) y se filtraron a través de filtros de jeringa Acrodisc® de 0,22 µm con membrana de PTFE antes del análisis por LC-MS.
Instrumentación
Las separaciones cromatográficas se llevaron a cabo en un sistema Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS (Waters Corporation) utilizando una columna Agilent InfinityLab Poroshell 120 Aq-C18 (3,0 × 100 mm, 2,7 µm) con una columna de protección correspondiente (3,0 mm × 5 mm, 2,7 µm) (Agilent Technologies, CA, Estados Unidos) mediante elución en gradiente a un caudal de 0,5 mL/min.
El sistema UPLC funcionó a 35 °C de la siguiente manera: fase móvil (A) agua milli-Q con 0,1 % de ácido fórmico y (B) acetonitrilo con 0,1 % de ácido fórmico; gradiente: 0-2 min, 1 % B; 2-5 min, 1-30 % B; 5-6 min, 30-98 % B; 6-7,5 min, 98 % B; 7,5-8 min, 98-1 % B; 8-10 min, 1 % B. La temperatura del autosensor se mantuvo a 18 °C. El volumen de inyección fue de 0,5 µL.
El análisis de MS se realizó utilizando un detector Waters SQ Detector 2 con fuente de ionización por electrospray que funcionó en modo de iones negativos. La optimización de los parámetros de MS se realizó mediante la infusión directa de soluciones estándar de 5-FU y ácido folínico en el MS. Los voltajes del cono de muestreo de MS para los metabolitos se optimizaron automáticamente con el uso del software Waters IntelliStart™. El MS funcionó con las siguientes condiciones: temperatura de la fuente, 150 °C; temperatura del gas de desolvatación, 500 °C; caudal del gas de desolvatación, 1000 L/h; voltaje del capilar, -2,5 kV; voltaje del cono de muestreo, -34 y -54 V para 5-FU y ácido folínico, respectivamente. Se empleó el modo de monitoreo de iones seleccionados para la adquisición de iones pseudo-moleculares desprotonados [M-H-] con relaciones masa-carga (m/z) de 128,92 y 472,16 para el análisis de 5-FU y ácido folínico, respectivamente. El tiempo de permanencia fue de 0,128 s. Los datos de masa se recolectaron de 1,5 a 6 min. El software Waters MassLynx™ (versión 4.2) se utilizó para el control del instrumento y la adquisición de datos, mientras que el software TargetLynx™ se utilizó para el análisis cuantitativo (Waters Corporation).
Medición del contenido de platino en plasma y tumores
Las muestras de plasma (400 µL) y las muestras de lisados de tejido tumoral (400 µL) de cada ratón tratado con FOLFOX y/o extracto acuoso de PV se enviaron a Chemical Testing Services, Hong Kong Baptist University, para la determinación del contenido de platino. Las muestras se sometieron a digestión ácida y luego se midió el contenido de platino utilizando espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS).
Tinción histológica e inmunohistoquímica
Los tumores, los pulmones y los hígados extraídos de los ratones se fijaron en formaldehído al 10 % y se procesaron para la inclusión en parafina. Las muestras de pulmón e hígado incluidas en parafina se cortaron en secciones de 5 µm y luego se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Las secciones de tumores se sometieron a tinción de inmunohistoquímica de Ki67 para la proliferación celular, CD31 para la angiogénesis y tinción TUNEL para la apoptosis, como se describió previamente ([Jiang et al., 2022]).
PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) de tejidos tumorales
Se extrajeron tejidos tumorales de ratones portadores de xenoinjertos HCT-116 para obtener ARN total utilizando el reactivo TRIzol (Thermo Fisher Scientific, MA, Estados Unidos). Se realizó la transcripción inversa del ARN (1 µg) utilizando EasyScript® One-Step SuperMix (TransGen, Beijing, China). Se llevó a cabo una PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) con el SYBR Green Master Mix para qPCR (Thermo Fisher Scientific) en un instrumento LightCycler® 480 Instrument II (Applied Roche, CA, Estados Unidos). Los cebadores fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies (Singapur) y la Tabla 2 muestra las secuencias. Los niveles de ARNm de los genes diana se normalizaron con respecto a los de GAPDH.
Análisis estadístico
Los datos de todos los experimentos con animales se expresaron como media + E.S.M. Las diferencias entre los grupos de tratamiento y control se analizaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de pruebas post hoc, según la distribución de los datos. En todas las comparaciones, se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software, CA, Estados Unidos).
Resultados
Efecto del tratamiento con extracto acuoso de PV sobre los niveles plasmáticos de enzimas metabolizadoras de 5-FU y ácido fólico en ratones portadores de xenoinjertos de colon humano
Para determinar si el tratamiento con extracto acuoso de PV afecta el metabolismo de 5-FU y ácido fólico, se midieron los niveles plasmáticos de DPD (para 5-FU) y SHMT (para ácido fólico) en ratones portadores de xenoinjertos HCT-116. Como se muestra en la Figura 2B, la administración oral de extracto acuoso de PV durante 1 o 3 ciclos no alteró los niveles plasmáticos de DPD. Por lo tanto, no tendría efectos adversos sobre el metabolismo de 5-FU.
La conversión de ácido fólico en su forma activa, 5,10-MTHF, está catalizada por la SHMT dependiente de la vitamina B6, con la conversión simultánea de serina en glicina. Como se muestra en la Figura 2C, la administración oral de extracto acuoso de PV o la administración intravenosa de FOLFOX durante 1 o 3 ciclos aumentó ligeramente el nivel de SHMT, sin una diferencia significativa entre los grupos de tratamiento. En contraste, el tratamiento combinado de extracto acuoso de PV y FOLFOX parece revertir el aumento de los niveles plasmáticos de SHMT, pero su efecto fue insignificante en comparación con el del grupo tratado solo con FOLFOX.
Efecto del tratamiento con extracto acuoso de PV sobre los niveles plasmáticos de moléculas que afectan la conversión de oxaliplatino en ratones portadores de xenoinjertos de colon humano
El oxaliplatino sufre una biotransformación rápida y no enzimática para formar monocloro-, dicloro- o diaquo-DACH, que interfiere con la síntesis de ADN. Sin embargo, en presencia de cisteína, metionina o glutatión reducido (GSH), el oxaliplatino se convierte en especies químicamente inreactivas. Se determinaron los niveles plasmáticos de estas moléculas en ratones portadores de xenoinjertos HCT-116. Como se muestra en la Figura 2, la cisteína (Figura 3A) y la metionina (Figura 3B), así como los niveles de GSH hepático (Figura 3C), no se vieron afectados significativamente por la intervención con extracto acuoso de PV. No hubo diferencia estadística entre los grupos FOLFOX y FOLFOX más PV. Esto implica que el extracto acuoso de PV no aumentaría ni disminuiría las formas inactivas de oxaliplatino.
Por lo tanto, en conjunto, la administración oral de extracto acuoso de PV a la dosis probada no afectaría el metabolismo de FOLFOX en ratones portadores de xenoinjertos HCT-116.
Efecto del tratamiento con extracto acuoso de PV sobre las concentraciones de los fármacos componentes de FOLFOX en plasma y tumores
Para monitorear aún más los niveles plasmáticos en estado estacionario de los fármacos componentes de FOLFOX en ratones portadores de xenoinjertos HCT-116, al final del tratamiento (día 23), a los ratones de los grupos FOLFOX solo y FOLFOX más PV se les administró FOLFOX por vía intravenosa. Se recolectaron sangre y tejidos tumorales 15 minutos después de la administración de FOLFOX. Los niveles plasmáticos de los fármacos componentes de FOLFOX se determinaron utilizando HPLC (5-FU y ácido fólico) y ICP-MS (oxaliplatino en forma de platino). Los resultados mostraron que no hay una diferencia significativa en los niveles de 5-FU, ácido fólico y platino en el plasma de los ratones tratados con o sin extracto acuoso de PV (Figuras 4A–C). Además, los niveles de 5-FU y ácido fólico en el lisado de tejido tumoral no fueron diferentes en el grupo FOLFOX solo y el grupo FOLFOX más PV. Sin embargo, el nivel de platino en el lisado de tejido tumoral estuvo por debajo del límite de detección (0,01 ppm). Estos datos sugieren que la presencia de extracto acuoso de PV no afectó las concentraciones de los fármacos componentes de FOLFOX en ratones portadores de xenoinjertos de colon, lo que indica que la cantidad de fármacos componentes de FOLFOX no se vería afectada por la administración oral de extracto acuoso de PV durante 3 semanas.
Eficacia de los tratamientos con FOLFOX y/o extracto acuoso de PV en ratones portadores de xenoinjertos de colon humano
Además del metabolismo de FOLFOX, también se evaluó la posible influencia del extracto acuoso de PV sobre la eficacia de FOLFOX. Se determinaron las respuestas antiproliferativas de las células de cáncer de colon humano (HCT-116, HT-29, SW480) frente al extracto acuoso de PV y se compararon utilizando el ensayo MTT. Los valores de CI50 del extracto acuoso de PV en las líneas celulares HCT-116, HT-29 y SW480 fueron de 393,0 ± 34,8 µg/mL, 751,1 ± 27,5 µg/mL, 689,7 ± 23,9 µg/mL, respectivamente. Se demostró que HCT-116 fue la línea celular más sensible con el valor de CI50 más bajo entre todas las líneas celulares probadas. Por lo tanto, se utilizaron las células HCT-116 para establecer xenoinjertos en ratones desnudos, que recibieron tratamientos con FOLFOX y/o extracto acuoso de PV. Los resultados mostraron que los tratamientos de 3 semanas no causaron un cambio significativo en el peso corporal de los ratones en todos los grupos, como se muestra en las Figuras 5A y 5B. El volumen tumoral en los ratones tratados con FOLFOX más PV disminuyó significativamente a partir del día 9 (p < 0,05), mientras que FOLFOX y PV solos exhibieron un efecto inhibidor leve sobre el crecimiento tumoral (Figura 5C). Después del tratamiento de 3 semanas, se sacrificaron los ratones y se recolectaron los tumores. Se encontró que los pesos tumorales finales en todos los grupos de tratamiento se redujeron significativamente en comparación con el control no tratado (p < 0,05), lo que indica los efectos inhibidores de PV y/o FOLFOX sobre el crecimiento del xenoinjerto HCT-116. En particular, el peso tumoral final del grupo FOLFOX más PV fue el más bajo y fue significativamente menor que el de los grupos de tratamiento con FOLFOX o PV solos (p < 0,05), lo que sugiere que fue el régimen más eficaz.
Además, se evaluó la proliferación celular y el nivel de apoptosis en las secciones tumorales de los ratones de todos los grupos mediante tinción inmunohistoquímica. Como se muestra en las Figuras 6A y 6B, el número de células teñidas positivas para Ki67 (células proliferativas) se redujo significativamente en los grupos PV solo, FOLFOX solo y FOLFOX más PV (p < 0,05), mientras que el número de células teñidas positivas para TUNEL (células apoptóticas) aumentó significativamente solo en el grupo FOLFOX más PV en comparación con el grupo de control (Figuras 6A y 6C). Aunque no hubo diferencia estadística entre los grupos PV solo, FOLFOX solo y el grupo de tratamiento combinado, se pudo observar una actividad antitumoral más potente del tratamiento combinado.
Dado que nuestros estudios anteriores informaron que el extracto acuoso de Herba Patriniae (incluido PV) podría reducir la expresión de EGFR, PI3K, AKT, FAK y cofilina en las células HCT-116 ([Yang et al., 2021]), se determinaron las expresiones de ARNm de estos genes en los xenoinjertos HCT-116 utilizando qRT-PCR. Los resultados mostraron que los xenoinjertos HCT-116 de ratones tratados con PV solo tienen una menor expresión de EGFR, PIK3CA, AKT1 y Cofilin, con una diferencia significativa de aquellos de los ratones de control no tratados (p < 0,05, Figuras 6D–F, H). El tratamiento con FOLFOX solo suprimió ligeramente la expresión de ARNm de EGFR y PI3K y AKT1. Si bien la presencia de PV en el tratamiento combinado no cambió significativamente la expresión de estos genes.
Eficacia de los tratamientos con FOLFOX y/o extracto acuoso de PV en ratones portadores de tumores ortotópicos de colon sinérgico
En ratones portadores de tumores Colon-26, los resultados mostraron que los pesos tumorales finales en todos los grupos de tratamiento se redujeron significativamente en comparación con el control no tratado (p < 0,01, Figura 7B), lo que indica los efectos inhibidores de PV y/o FOLFOX sobre el crecimiento del tumor Colon-26. Además, la proliferación celular y el nivel de apoptosis en las secciones tumorales de los grupos PV solo, FOLFOX solo y FOLFOX más PV se evaluaron aún más mediante tinción inmunohistoquímica. Como se muestra en las Figuras 7A y 7C, el número de células teñidas positivas para TUNEL (células apoptóticas) aumentó en los grupos PV solo y FOLFOX más PV en comparación con el grupo de control, aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas. No obstante, el número de células teñidas positivas para Ki67 (células proliferativas, Figura 7D) y células endoteliales positivas para CD31 (Figura 7E) se redujo significativamente en los grupos FOLFOX más PV (p < 0,05).
Además, también se evaluaron los niveles de metástasis en los pulmones y el hígado de los ratones portadores de tumores. Los resultados mostraron que los tratamientos con PV solo, FOLFOX solo y FOLFOX más PV redujeron significativamente la metástasis pulmonar (p < 0,05, Figura 7F). Sin embargo, se observó una disminución aparente de la metástasis hepática en los grupos PV solo y FOLFOX más PV (p < 0,05), pero no en el grupo FOLFOX solo (Figura 7G).
Para la inmunomodulación en ratones portadores de tumores, se determinaron las poblaciones de macrófagos intratumorales y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC), así como las células T reguladoras en los ganglios linfáticos, utilizando citometría de flujo. Los resultados mostraron que el porcentaje de MDSC en los tumores se redujo significativamente después del tratamiento con FOLFOX más PV en comparación con los grupos de control y PV solo (p < 0,001) y fue marginalmente significativo en comparación con el grupo FOLFOX solo (p = 0,07, Figura 8A). Si bien el porcentaje de macrófagos tumorales en los grupos FOLFOX solo y FOLFOX más PV fue menor que en los grupos de control y PV solo, no se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa (Figura 8B). En contraste, las células T reguladoras (Treg) en los ganglios linfáticos de los ratones portadores de tumores aumentaron significativamente en el grupo FOLFOX solo en comparación con el grupo de control (p < 0,05), mientras que el porcentaje de Treg fue menor en los grupos PV y FOLFOX más PV en comparación con el grupo FOLFOX solo (Figura 8C).
Por otro lado, se obtuvo plasma de la sangre mediante centrifugación. Se determinaron los niveles enzimáticos plasmáticos [transaminasa aspártica (AST) y transaminasa alanina (ALT) para la función hepática, creatina quinasa (CK) para el daño tisular]. Los resultados mostraron que no hubo diferencia estadística en los niveles de las enzimas ALT y AST entre los grupos de control, PV solo, FOLFOX solo y el grupo de tratamiento FOLFOX más PV (Figuras 8D y 8E). Sin embargo, FOLFOX solo disminuyó significativamente el nivel plasmático de CK (Figura 8F), mientras que el tratamiento con FOLFOX más PV revirtió dicho cambio.
Efecto del tratamiento con extracto acuoso de PV sobre los niveles plasmáticos de enzimas metabolizadoras de 5-FU y ácido fólico en ratones portadores de xenoinjertos de colon humano
Para determinar si el tratamiento con extracto acuoso de PV afecta el metabolismo de 5-FU y ácido fólico, se midieron los niveles plasmáticos de DPD (para 5-FU) y SHMT (para ácido fólico) en ratones portadores de xenoinjertos HCT-116. Como se muestra en la Figura 2B, la administración oral de extracto acuoso de PV durante 1 o 3 ciclos no alteró los niveles plasmáticos de DPD. Por lo tanto, no tendría efectos adversos sobre el metabolismo de 5-FU.
La conversión de ácido fólico en su forma activa, 5,10-MTHF, está catalizada por la SHMT dependiente de la vitamina B6, con la conversión simultánea de serina en glicina. Como se muestra en la Figura 2C, la administración oral de extracto acuoso de PV o la administración intravenosa de FOLFOX durante 1 o 3 ciclos aumentó ligeramente el nivel de SHMT, sin una diferencia significativa entre los grupos de tratamiento. En contraste, el tratamiento combinado de extracto acuoso de PV y FOLFOX parece revertir el aumento de los niveles plasmáticos de SHMT, pero su efecto fue insignificante en comparación con el del grupo tratado solo con FOLFOX.
Efecto del tratamiento con extracto acuoso de PV sobre los niveles plasmáticos de moléculas que afectan la conversión de oxaliplatino en ratones portadores de xenoinjertos de colon humano
El oxaliplatino sufre una rápida biotransformación no enzimática para formar monocloro-, dicloro- o diaquo-DACH, que interfiere con la síntesis de ADN. Sin embargo, en presencia de cisteína, metionina o glutatión reducido (GSH), el oxaliplatino se convierte en especies químicamente inreactivas. Se determinaron los niveles plasmáticos de estas moléculas en ratones portadores de xenoinjertos HCT-116. Como se muestra en la Figura 2, la cisteína (Figura 3A) y la metionina (Figura 3B), así como los niveles de GSH hepático (Figura 3C) no se vieron afectados significativamente por la intervención con el extracto acuoso de PV. No hubo diferencia estadística entre los grupos FOLFOX y FOLFOX más PV. Esto implica que el extracto acuoso de PV no aumentaría ni disminuiría las formas inactivas de oxaliplatino.
Por lo tanto, en conjunto, la administración oral de extracto acuoso de PV a la dosis probada no afectaría el metabolismo de los fármacos de FOLFOX en ratones portadores de xenoinjertos HCT-116.
Efecto del tratamiento con extracto acuoso de PV sobre las concentraciones de los fármacos componentes de FOLFOX en plasma y tumores
Para monitorear aún más los niveles plasmáticos en estado estacionario de los fármacos componentes de FOLFOX en ratones portadores de xenoinjertos HCT-116, al final del tratamiento (día 23), a los ratones de ambos grupos (solo FOLFOX y FOLFOX más PV) se les administró FOLFOX por vía intravenosa. Se recolectaron sangre y tejidos tumorales 15 minutos después de la administración de FOLFOX. Los niveles plasmáticos de los fármacos componentes de FOLFOX se determinaron mediante HPLC (5-FU y ácido folínico) y ICP-MS (oxaliplatino en forma de platino). Los resultados mostraron que no hay una diferencia significativa en los niveles de 5-FU, ácido folínico y platino en el plasma de los ratones tratados con o sin extracto acuoso de PV (Figuras 4A-C). Además, los niveles de 5-FU y ácido folínico en el lisado de tejido tumoral no fueron diferentes en el grupo solo FOLFOX y el grupo FOLFOX más PV. Sin embargo, el nivel de platino en el lisado de tejido tumoral estuvo por debajo del límite de detección (0,01 ppm). Estos datos sugieren que la presencia de extracto acuoso de PV no afectó las concentraciones de los fármacos componentes de FOLFOX en ratones portadores de xenoinjertos de colon, lo que indica que la cantidad de fármacos componentes de FOLFOX no se vería afectada por la administración oral de extracto acuoso de PV durante 3 semanas.
Eficacia de los tratamientos con FOLFOX y/o extracto acuoso de PV en ratones portadores de xenoinjertos humanos de colon
Además del metabolismo de FOLFOX, también se evaluó la posible influencia del extracto acuoso de PV sobre la eficacia de FOLFOX. Se determinaron y compararon las respuestas antiproliferativas de las células de cáncer de colon humano (HCT-116, HT-29, SW480) frente al extracto acuoso de PV utilizando el ensayo MTT. Los valores de CI50 del extracto acuoso de PV en las líneas celulares HCT-116, HT-29 y SW480 fueron de 393,0 ± 34,8 µg/mL, 751,1 ± 27,5 µg/mL y 689,7 ± 23,9 µg/mL, respectivamente. Se demostró que HCT-116 fue la línea celular más sensible con el valor de CI50 más bajo entre todas las líneas celulares probadas. Por lo tanto, se utilizaron células HCT-116 para establecer xenoinjertos en ratones desnudos, que recibieron tratamientos con FOLFOX y/o extracto acuoso de PV. Los resultados mostraron que los tratamientos de 3 semanas no causaron un cambio significativo en el peso corporal de los ratones en todos los grupos, como se muestra en las Figuras 5A y 5B. El volumen tumoral en los ratones tratados con FOLFOX más PV disminuyó significativamente a partir del día 9 (p < 0,05), mientras que FOLFOX y PV solos exhibieron un efecto inhibidor leve sobre el crecimiento tumoral (Figura 5C). Después del tratamiento de 3 semanas, se sacrificaron los ratones y se recolectaron los tumores. Se encontró que los pesos tumorales finales en todos los grupos de tratamiento se redujeron significativamente en comparación con el control no tratado (p < 0,05), lo que indica los efectos inhibidores de PV y/o FOLFOX sobre el crecimiento de xenoinjertos HCT-116. En particular, el peso tumoral final del grupo FOLFOX más PV fue el más bajo y fue significativamente menor que el de los tratamientos con FOLFOX o PV solos (p < 0,05), lo que sugiere que fue el régimen más eficaz.
Además, se evaluó la proliferación celular y el nivel de apoptosis en las secciones tumorales de los ratones de todos los grupos mediante tinción inmunohistoquímica. Como se muestra en las Figuras 6A y 6B, el número de células teñidas positivas para Ki67 (células proliferativas) se redujo significativamente en los grupos PV solo, FOLFOX solo y FOLFOX más PV (p < 0,05), mientras que el número de células teñidas positivas para TUNEL (células apoptóticas) aumentó significativamente solo en el grupo FOLFOX más PV en comparación con el grupo de control (Figuras 6A y 6C). Aunque no hubo diferencia estadística entre los grupos PV solo, FOLFOX solo y el grupo de tratamiento combinado, se pudo observar una actividad antitumoral más potente del tratamiento combinado.
Dado que nuestros estudios previos informaron que el extracto acuoso de Herba Patriniae (incluido PV) podría reducir la expresión de EGFR, PI3K, AKT, FAK y cofilina en las células HCT-116 ([Yang et al., 2021]), se determinaron las expresiones de ARNm de estos genes en los xenoinjertos HCT-116 utilizando qPCR. Los resultados mostraron que los xenoinjertos HCT-116 de ratones tratados con PV solo tienen una menor expresión de EGFR, PIK3CA, AKT1 y Cofilin, con una diferencia significativa de los de los ratones de control no tratados (p < 0,05, Figuras 6D-F y 6H). El tratamiento con FOLFOX solo suprimió ligeramente la expresión de ARNm de EGFR y P13K y AKT1. Si bien la presencia de PV en el tratamiento combinado no cambió significativamente la expresión de estos genes.
Eficacia de los tratamientos con FOLFOX y/o extracto acuoso de PV en ratones portadores de tumores ortotópicos de colon sinérgicos
En ratones portadores de tumores de colon-26, los resultados mostraron que los pesos tumorales finales en todos los grupos de tratamiento se redujeron significativamente en comparación con el control no tratado (p < 0,01, Figura 7B), lo que indica los efectos inhibidores de PV y/o FOLFOX sobre el crecimiento del tumor de colon-26. Además, la proliferación celular y el nivel de apoptosis en las secciones tumorales de los grupos PV solo, FOLFOX solo y FOLFOX más PV se evaluaron aún más mediante tinción inmunohistoquímica. Como se muestra en las Figuras 7A y 7C, el número de células teñidas positivas para TUNEL (células apoptóticas) aumentó en los grupos PV solo y FOLFOX más PV en comparación con el grupo de control, aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas. No obstante, el número de células teñidas positivas para Ki67 (células proliferativas, Figura 7D) y células teñidas positivas para CD31 (células endoteliales, Figura 7E) se redujo significativamente en los grupos FOLFOX más PV (p < 0,05).
Además, también se evaluaron los niveles de metástasis en los pulmones e hígados de los ratones portadores de tumores. Los resultados mostraron que los tratamientos con PV solo, FOLFOX solo y FOLFOX más PV redujeron significativamente la metástasis pulmonar (p < 0,05, Figura 7F). Sin embargo, se observó una disminución aparente de la metástasis hepática en los grupos PV solo y FOLFOX más PV (p < 0,05), pero no en el grupo FOLFOX solo (Figura 7G).
Para la inmunomodulación en ratones portadores de tumores, se determinaron las poblaciones de macrófagos intratumorales y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC), así como las células T reguladoras en los ganglios linfáticos, utilizando citometría de flujo. Los resultados mostraron que el porcentaje de MDSC en los tumores se redujo significativamente después del tratamiento con FOLFOX más PV en comparación con los grupos de control y PV solo (p < 0,001) y fue marginalmente significativo en comparación con el grupo FOLFOX solo (p = 0,07, Figura 8A). Si bien el porcentaje de macrófagos tumorales en los grupos FOLFOX solo y FOLFOX más PV fue menor que en los grupos de control y PV solo, no se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa (Figura 8B). En contraste, las células T reguladoras (Treg) en los ganglios linfáticos de los ratones portadores de tumores aumentaron significativamente en el grupo FOLFOX solo en comparación con el grupo de control (p < 0,05), mientras que el porcentaje de Treg fue menor en los grupos PV y FOLFOX más PV en comparación con el grupo FOLFOX solo (Figura 8C).
Por otro lado, se obtuvo plasma de la sangre mediante centrifugación. Se determinaron los niveles de enzimas plasmáticas [aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) para la función hepática, creatina quinasa (CK) para el daño tisular]. Los resultados mostraron que no hubo diferencia estadística en los niveles de las enzimas ALT y AST entre los grupos de control, PV solo, FOLFOX solo y el grupo de tratamiento FOLFOX más PV (Figuras 8D y 8E). Sin embargo, FOLFOX solo disminuyó significativamente el nivel de CK en el plasma (Figura 8F), mientras que el tratamiento con FOLFOX más PV revirtió este cambio.
Discusión
En las comunidades chinas de todo el mundo, los médicos de medicina tradicional china a menudo recetan medicamentos herbales a los pacientes con cáncer. Sin embargo, los médicos y oncólogos tienen grandes preocupaciones sobre el uso de medicamentos herbales durante la quimioterapia debido a la interacción desconocida entre hierbas y fármacos. Este estudio intentó proporcionar una respuesta a la pregunta: ¿el tratamiento con medicamentos herbales afecta el metabolismo de los fármacos quimioterapéuticos? Aquí, tomando el tratamiento del CRC como ejemplo, se aplicó el régimen quimioterapéutico FOLFOX en modelos de ratón con cáncer de colon semanalmente, mientras que el extracto acuoso de PV se administró a los ratones diariamente, excepto el día de la inyección de FOLFOX. Luego, se determinaron los niveles plasmáticos de las enzimas metabólicas seleccionadas y las moléculas precursoras de los fármacos componentes de FOLFOX en los ratones, así como la eficacia antitumoral después de los tratamientos. Nuestro estudio reveló por primera vez que el tratamiento con el extracto herbal PV durante 3 semanas no mostró una interferencia significativa en los niveles de la enzima metabólica de 5-FU y el ácido folínico, así como en las moléculas reguladoras involucradas en la conversión de oxaliplatino. Además, se demostraron los resultados beneficiosos de los tratamientos combinados con FOLFOX y extracto acuoso de PV en ratones portadores de tumores de colon en términos de inhibir la progresión tumoral y la metástasis, y modular el microambiente tumoral.
El protocolo de tratamiento en este estudio (Figura 2A) se diseñó para imitar la situación clínica de los pacientes con CRC que se someten a quimioterapia con FOLFOX y toman el medicamento herbal PV al mismo tiempo. Al diseñar los intervalos de dosificación entre FOLFOX y el extracto acuoso de PV, se consideró la vida media de los fármacos FOLFOX. Entre los tres fármacos componentes de FOLFOX, la vida media de 5-FU es la más corta, con una vida media de eliminación del plasma de alrededor de 13 minutos, con un rango de 5 a 27 minutos. Debido a la rápida eliminación metabólica, 5-FU ya no es detectable después de 2 horas de la inyección intravenosa ([Heggie et al., 1987]). Además, la vida media de eliminación del ácido folínico también es corta, que oscila entre 0,9 y 1,9 horas ([Greiner et al., 1989]). Por otro lado, la vida media de oxaliplatino es relativamente larga. Se observó una vida media terminal larga para el platino ultrafiltrable (9,32-29,17 horas) ([Cho et al., 2006]; [Burz et al., 2009]). Sin embargo, 24 horas después de la administración, el platino está casi completamente conjugado con aminoácidos de bajo peso molecular, lo que probablemente no sea clínicamente relevante ([Delord et al., 2003]). Por lo tanto, se consideró que 24 horas serían suficientes para espaciar el FOLFOX y el extracto acuoso de PV durante el tratamiento. En otro aspecto, la medición de 5-FU, ácido folínico y platino en un solo punto temporal (15 minutos después de la dosis) puede no ser capaz de evaluar la exposición o la eliminación general de los fármacos, lo que podría considerarse una limitación del protocolo actual.
Durante los tratamientos de 3 semanas con FOLFOX y/o extracto acuoso de PV, se recolectaron muestras de sangre para determinar los niveles de DHD (para 5-FU), SHMT (para ácido folínico), así como cisteína, metionina y glutatión reducido (para oxaliplatino) después del primer ciclo de tratamiento, con el fin de evaluar si el tratamiento con PV afectaría a estas enzimas/moléculas en un corto período de tiempo. Al final del tratamiento (3 ciclos), se recolectaron muestras de sangre para examinar la posible influencia del tratamiento con PV sobre el metabolismo de los fármacos componentes de FOLFOX y la eficacia de FOLFOX en este estudio. Los resultados mostraron que los niveles de las enzimas/moléculas metabolizadoras de los fármacos componentes de FOLFOX no se vieron afectados por el tratamiento con PV. Aunque un estudio previo informó que el metabolito luteolina, presente en el extracto de PV ([Yan et al., 2016]), podría disminuir el nivel de ARNm de la dihidropirimidina deshidrogenasa (DHD) en células de hepatocarcinoma ([Xu et al., 2016]), los niveles plasmáticos de esta enzima no se vieron afectados por el tratamiento con extracto acuoso de PV en nuestros ratones con tumores de colon. Además, se midieron las concentraciones de 5-FU, ácido folínico y platino en plasma y tumores después de 3 ciclos de tratamiento, y tampoco se observó ninguna diferencia significativa entre los grupos que recibieron FOLFOX solo y FOLFOX más extracto acuoso de PV. Sin embargo, los parámetros farmacocinéticos de FOLFOX no se evaluaron más a fondo en el presente estudio, lo que constituye una limitación del mismo. Nuestros datos pueden no sustituir por completo una evaluación cuantitativa de los parámetros farmacocinéticos, que reflejan directamente la exposición sistémica al fármaco y son fundamentales para evaluar el riesgo de interacción entre hierbas y fármacos.
Hubo algunas limitaciones en el diseño experimental original, en el que se midieron los niveles de las enzimas y moléculas precursoras seleccionadas de los fármacos componentes de FOLFOX en el plasma de ratones tratados y no tratados con PV (y en el lisado hepático para GSH). Se entendió que el hígado es el principal órgano responsable del catabolismo del 5-FU y, por lo tanto, el sitio primario de la actividad de la DPD. En una prueba piloto, intentamos medir los niveles de DPD en el homogenado hepático y en las muestras de plasma obtenidas de ratones con tumores que recibieron tratamiento con FOLFOX. Sin embargo, los niveles de DPD en el homogenado hepático eran demasiado bajos/inestables para ser detectados. Por otro lado, los niveles de DPD en el plasma se pudieron medir fácilmente utilizando el mismo kit ELISA. En cuanto al oxaliplatino, su degradación en sangre total desempeña un papel clave en la eliminación del fármaco. Una vez administrado por vía intravenosa, el oxaliplatino sufre una biotransformación rápida y no enzimática para formar monocloro-, dicloro- o diaquo-DACH, que interfiere con la síntesis de ADN. Sin embargo, también reacciona fácilmente con especies endógenas de bajo peso molecular, como la cisteína, la metionina y el glutatión reducido (GSH), para formar especies químicamente inreactivas. Al principio, planeamos medir los niveles plasmáticos de cisteína, metionina y GSH. Sin embargo, los niveles de GSH de algunas muestras de plasma de ratón fueron muy bajos [por debajo del límite de detección del kit de ensayo (0,5 nmol/mL)]. Por lo tanto, se detectó el GSH hepático en su lugar. Es posible que el plasma no sea la fuente biológica más adecuada para todos los aspectos. Sin embargo, podemos interpretar los datos de las enzimas/moléculas implicadas en el metabolismo de los fármacos componentes de FOLFOX como información complementaria a los resultados de los metabolitos obtenidos mediante LC-MS o ICP-MS. Además, para futuros estudios clínicos, la medición de los parámetros plasmáticos será relativamente más factible para el seguimiento continuo de las interacciones entre hierbas y fármacos en pacientes que reciben PV y el régimen FOLFOX.
Además del metabolismo de los fármacos componentes de FOLFOX, la eficacia antitumoral del tratamiento combinado con FOLFOX y extracto acuoso de PV también sería crucial para justificar el uso de dicha combinación. Los resultados obtenidos en ratones con xenoinjertos de la línea celular de colon humano HCT-116 mostraron que el tratamiento con extracto acuoso de PV mejoró la eficacia antitumoral de la dosis baja de FOLFOX (que es 1/16 de la dosis clínica), con un aumento de las células apoptóticas en los tumores, como se muestra en la tinción TUNEL. Aunque algunos genes relacionados con la proliferación, EGFR, PIK3CA, AKT1 y Cofilin, se regularon a la baja en los tumores del grupo tratado solo con PV, no se observó dicha disminución en los grupos FOLFOX ni FOLFOX más PV; es posible que FOLFOX a dosis bajas no pueda inducir la regulación de estos genes o que estos genes no sean los principales objetivos de los fármacos componentes de FOLFOX. No obstante, varios estudios informaron sobre los efectos potenciadores de algunos metabolitos principales (por ejemplo, cuatro de los cinco marcadores químicos identificados en nuestro extracto acuoso de PV, a saber, ácido gálico, ácido protocatecuico, ácido clorogénico y ácido cafeico) sobre el 5-FU o el oxaliplatino, los fármacos componentes de FOLFOX. Por ejemplo, se demostró que el ácido gálico se co-cristaliza con el 5-FU y exhibe una actividad antitumoral sinérgica en el cáncer de mama in vivo ([Hao et al., 2023]). Mientras que en las células de adenocarcinoma gástrico, el ácido protocatecuico combinado con el 5-FU puede promover la apoptosis a través de las vías de señalización p53 y Bcl-2 ([Motamedi et al., 2020]). Además, se demostró que el ácido clorogénico mejora la disminución de la proliferación inducida por el 5-FU en las células de carcinoma hepatocelular, mediante la supresión de la activación de ERK a través de la sobreproducción de ROS ([Yan et al., 2015]). Un estudio reciente también mostró que el ácido clorogénico redujo la mucositis intestinal en ratones causada por el 5-FU al alterar la vía de estrés oxidativo mediada por la señalización de SIRT1 ([Lin et al., 2025]). En presencia de una baja concentración de ácido clorogénico, la actividad del oxaliplatino en las células de cáncer de cuello uterino puede mejorarse ([Catanzaro et al., 2016]). Por último, se demostró que el ácido cafeico mejora la apoptosis de las células de cáncer de colon HCT-116 cuando se combina con oxaliplatino ([Lim et al., 2024]). De hecho, la preparación del extracto acuoso de PV siguió la forma tradicional de preparar los medicamentos herbales chinos, es decir, se hierve en agua y los pacientes consumen el decocción. En conjunto, el extracto acuoso de PV que contiene los metabolitos puede ejercer cierta potenciación sobre la eficacia antitumoral de FOLFOX, como se observó en los ratones con tumores de colon en este estudio.
En vista del régimen de dosificación de FOLFOX para ratones, se calculó a partir de las dosis clínicas ([Maindrault-Goebel et al., 2001]): 5-fluorouracilo (2400 mg/m2), oxaliplatino (85 mg/m2), ácido folínico (400 mg/m2) a la dosis teórica para ratón de 5-fluorouracilo (800 mg/kg), oxaliplatino (28 mg/kg), ácido folínico (133 mg/kg), según la tabla de conversión que figura en la guía de la FDA de EE. UU. ([Center for Drug Evaluation and Research, 2005]). En la práctica clínica, la dosificación de FOLFOX es un ciclo de 14 días durante 12 veces en 6 meses. Sin embargo, debido a la progresión relativamente rápida de los tumores de colon en los modelos de ratón (generados utilizando células Colon 26 o MC38), los tratamientos pueden no durar más de 4 semanas (ya que los tumores superarán el punto final humano). Por lo tanto, FOLFOX se administra habitualmente mediante inyección intraperitoneal una vez por semana durante 3-4 semanas en los modelos de ratón ([Robinson et al., 2013]; [Guan et al., 2020]). Además, un estudio previo sugirió la conversión de la edad del ratón adulto y la humana, es decir, 1 día de ratón equivaldrá a 30 días humanos ([Wang et al., 2020]). Nuestro programa de dosificación semanal durante 21 días en ratones con tumores podría tener la eficacia de FOLFOX durante 600 días en pacientes. La eficacia antitumoral de FOLFOX se examinó en ratones con xenoinjertos de HCT-116 en nuestros estudios piloto. Los resultados mostraron que FOLFOX a 1X la dosis teórica, 1/2 de la dosis teórica, 1/4 de la dosis teórica, causaron la muerte en los ratones, mientras que el tratamiento con 1/10 y 1/16 de las dosis teóricas de FOLFOX pudo exhibir efectos antitumorales aparentes sin causar la muerte. Dado que el presente estudio tuvo como objetivo evaluar el uso combinado de FOLFOX y extracto acuoso de PV en modelos de ratón con tumores de colon, se eligió 1/16 de la dosis teórica de FOLFOX, es decir, 5-fluorouracilo (50 mg/kg), oxaliplatino (1,75 mg/kg), ácido folínico (8,3 mg/kg), para el presente estudio de combinación. No obstante, el uso de esta dosis baja de FOLFOX (1/16 de la dosis teórica) podría aún diferir de los protocolos preclínicos estándar, lo que puede ser otra limitación del presente estudio.
En cuanto a la dosis de extracto acuoso de PV, la dosis clínica de la hierba P. villosa es de 9-15 g/persona/día según la Farmacopea China (versión de 1977) y las normas locales en China ([Gong et al., 2021]), la dosis clínica (15 g/persona/día) de la hierba PV fue equivalente a 0,4 g/kg en ratón. En nuestro estudio anterior ([Yang et al., 2023]), se evaluaron 0,4, 0,8 y 1,6 g/kg de extracto acuoso de PV para la eficacia antitumoral y antimetastásica en ratones con tumores de colon, siendo 1,6 g/kg la dosis más potente. Por lo tanto, se aplicó PV (1,6 g/kg) en el presente estudio.
Por otro lado, los resultados del modelo de ratón con tumor de colon sinérgico también demostraron que el extracto acuoso de PV no afectaría la eficacia antitumoral de FOLFOX en ratones inmunocompetentes, mientras que la eficacia antimetastásica en el hígado y la eficacia antiangiogénica del tratamiento combinado con PV y FOLFOX fueron mejores que las de los tratamientos con PV o FOLFOX solos. Curiosamente, se descubrió que el tratamiento con PV alteraba la población de MDSC y macrófagos tumorales, así como las células T reguladoras del ganglio linfático en el grupo tratado con FOLFOX más PV. Estos hallazgos sugieren que el tratamiento con PV podría mejorar aún más el efecto antitumoral de FOLFOX modulando el microambiente tumoral, lo que merece ser investigado más a fondo.
En resumen, el presente estudio dilucidó la posible influencia del extracto de hierbas PV sobre el metabolismo del régimen quimioterapéutico FOLFOX, así como la eficacia antitumoral de FOLFOX en ratones con xenoinjertos de colon humano y ratones inmunocompetentes, lo que proporcionaría más evidencia científica sobre el uso combinado del extracto acuoso de P. villosa durante el tratamiento con FOLFOX en el cáncer de colon.
Conclusión
El presente estudio reveló por primera vez que no se observó ninguna interferencia inducida por el tratamiento con extracto acuoso de PV sobre los niveles plasmáticos de las enzimas metabolizadoras seleccionadas y las moléculas precursoras de los fármacos componentes de FOLFOX en ratones con tumores de colon. Además, el uso combinado de FOLFOX y extracto acuoso de PV podría dar como resultado una mejor eficacia antitumoral y antimetastásica en modelos de ratón con tumores de colon. Por lo tanto, los beneficios potenciales del uso combinado de FOLFOX y extracto acuoso de PV se han verificado científicamente, lo que puede respaldar el uso clínico en el tratamiento del cáncer de colon.
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