Una nanopartícula híbrida con membrana que mimetiza y modula la respuesta inmune mediante fototermia inhibe el crecimiento y la metástasis del cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) ocupa el segundo lugar entre las neoplasias a nivel mundial, con la cuarta tasa de mortalidad más alta atribuible al cáncer en China ([Bray et al., 2024]; [Han et al., 2024]). La cirugía es el tratamiento de primera línea para el CCR. Sin embargo, los pacientes que se someten a una cirugía radical siguen teniendo una alta probabilidad de recurrencia y metástasis en un plazo de cinco años ([Ciardiello et al., 2022]). La quimioterapia y la radioterapia se utilizan habitualmente en la práctica clínica para inhibir la recurrencia y la metástasis postoperatorias, pero la quimioterapia o la radioterapia sistémicas pueden provocar fácilmente tolerancia y efectos secundarios sistémicos ([Wei et al., 2021]). Aunque la inmunoterapia ha logrado avances en el campo del tratamiento antitumoral, su eficacia terapéutica se ha visto limitada en el tratamiento de tumores sólidos, especialmente el CCR ([Wang et al., 2023]). Por lo tanto, se necesitan urgentemente métodos más seguros y eficaces para inhibir el CCR y prevenir la recurrencia y la metástasis.

La terapia fototérmica (TFT) presenta ventajas distintas en el tratamiento del cáncer, que incluyen la ablación tumoral eficaz, la no invasividad y los efectos secundarios mínimos ([Liu et al., 2024a]). Además de erradicar directamente las células tumorales mediante la hipertermia, la TFT puede provocar una respuesta inmunitaria al facilitar la muerte celular inmunogénica (MCI) y la liberación de antígenos asociados al tumor (AAT) ([Li et al., 2024]; [Zeting et al., 2023]). La presentación de antígenos también puede potenciarse mediante adyuvantes inmunitarios. Entre los diversos adyuvantes, el imiquimod (R837), un adyuvante inmunitario aprobado por la FDA, puede inducir la maduración de las células dendríticas (CD) mediante la activación del receptor tipo Toll 7/8 (TLR7/8) ([Liu et al., 2024b]; [Sanlorenzo et al., 2025]). La TFT combinada con un adyuvante inmunitario puede lograr un efecto terapéutico antitumoral sinérgico ([Niu et al., 2024]; [Yang et al., 2024]; [Yuan et al., 2023]). Sin embargo, el R837 tiene una farmacocinética limitada y una baja solubilidad en agua, lo que podría causar toxicidad sistémica.

Las nanopartículas de óxido férrico, que han obtenido la aprobación de la FDA, poseen una respuesta magnética única y efectos fototérmicos, lo que las convierte en un tema de investigación exhaustiva para aplicaciones en la TFT y la resonancia magnética (RM) para el diagnóstico y el tratamiento del cáncer ([Li et al., 2020a]; [Li et al., 2024]). La modificación de estas nanopartículas de Fe₃O₄ con polidopamina (PDA) puede ser fundamental para prevenir la agregación ([Luo et al., 2023]). Además, la PDA es un potente absorbedor de infrarrojo cercano (NIR) con una alta eficiencia de conversión fototérmica del 40% ([Si et al., 2024]). Los estudios han revelado que la nanopartícula de Fe₃O₄ modificada con PDA (Fe₃O₄@PDA) puede tener efectos sinérgicos y aumentar la eficacia fototérmica. Además, los grupos funcionales de la superficie de la PDA le permiten interactuar con otras moléculas, lo que facilita la encapsulación del R837 ([Meng et al., 2022]). En general, la aplicación de nanopartículas exógenas está limitada por la rápida eliminación durante la circulación sanguínea.

Afortunadamente, la tecnología de recubrimiento con membrana celular biónica se ha destacado ampliamente para evitar la eliminación por el sistema inmunitario de las nanopartículas sintéticas administradas sistémicamente ([Fang et al., 2023]). Las nanopartículas biomiméticas resultantes conservan las propiedades fisicoquímicas de las nanopartículas sintéticas y heredan las funcionalidades de las células de origen ([Cheng et al., 2023]; [Jiang et al., 2023]). Además, en comparación con las membranas celulares monotípicas, las membranas celulares híbridas pueden dotar a las nanopartículas sintéticas de múltiples biofunciones derivadas de las membranas celulares naturales ([Liu et al., 2023]; [Spanjers y Städler, 2020]; [Zhao et al., 2024b]). Las membranas de las células cancerosas son candidatos ideales para camuflar las nanopartículas debido a su orientación homóloga y su baja capacidad de eliminación por el sistema inmunitario, y se han utilizado como nanotransportadores para mejorar la administración de fármacos y la TFT localizada ([Chen et al., 2020], [Chen et al., 2022]; [Wang et al., 2024]). Además, los macrófagos asociados al tumor (MAT) son células inmunitarias cruciales que desempeñan un papel clave en la determinación de la captación y la distribución intratumoral de las nanopartículas dentro del microentorno tumoral ([Toledo et al., 2024]). Los recubrimientos de membrana de MAT pueden proteger las nanopartículas sintéticas de ser engullidas por las células inmunitarias y pueden dirigirse directamente a los tejidos tumorales ([Chen et al., 2021]; [Du et al., 2022]; [Wu et al., 2022]; [Zhang et al., 2023b]). Zhao et al. fusionaron membranas de células cancerosas de mama 4T1 derivadas de ratón con membranas de RAW264.7, creando un recubrimiento biomimético híbrido de nanopartículas de Fe3O4 (RIFe@TRM), que exhibió una importante autorreconocimiento celular específico para las células tumorales, lo que condujo a una prolongación notable de la vida media en la circulación y a un aumento de las capacidades de orientación in vivo en el cáncer de mama ([Zhang et al., 2023a]). En particular, en comparación con los MAT inmunosupresores, los nanovesículos extracelulares (VE) derivados de los MAT no solo poseen las ventajas naturales de una alta seguridad biológica, un tiempo de circulación prolongado, la evasión inmunitaria y una extraordinaria capacidad para dirigirse a las células tumorales similar a sus células progenitoras, sino que también tienen el potencial de estimular la inmunidad antitumoral ([Cianciaruso et al., 2019]). Además, en comparación con las membranas de macrófagos, los VE conservan los componentes de la membrana de la célula progenitora al tiempo que eliminan la mayoría de los contenidos citoplasmáticos y nucleares, lo que reduce el número de componentes inmunogénicos y disminuye la eliminación por el sistema inmunitario ([Xu et al., 2025]; [Zhou et al., 2021]).

En este estudio, se construyeron meticulosamente nanovesículas biomiméticas híbridas innovadoras que combinan membranas celulares de CT26 (Cm) y membranas de vesículas extracelulares derivadas de Raw 264.7 (Rm) que contienen nanopartículas de Fe3O4@PDA cargadas con R837 (R837@MfNP) para la combinación de la TFT y la inmunoterapia. Debido a las propiedades heredadas de las células de origen, la R837@MfNP puede acumularse eficazmente en los sitios tumorales. Tras la exposición a la irradiación láser, las nanopartículas de Fe3O4@PDA cargadas con R837 liberadas experimentan una transición de la absorción de NIR a la generación de hipertermia, lo que sirve para erradicar las células tumorales y liberar los AAT, lo que, a su vez, activa la MCI. Al mismo tiempo, el R837 liberado puede promover aún más la maduración de las CD, activando así una respuesta inmunitaria de las células T antitumorales. Esta cascada de eventos culmina suprimiendo significativamente el crecimiento tanto del tumor primario como del tumor distante e inhibiendo la metástasis pulmonar. Por lo tanto, esperamos que la R837@MfNP, que integra la TFT con un adyuvante inmunitario, ofrezca nuevas perspectivas y allane el camino para el desarrollo de estrategias de tratamiento seguras y eficaces para el CCR.

Sección experimental

Materiales

El imiquimod (R837) se adquirió de Selleck Chemicals. El clorhidrato de dopamina se obtuvo de Adamas. El cloruro de hierro hexahidratado se compró a Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. El kit de recuento de células CCK-8 y el kit de tinción doble Calcein-AM/PI se obtuvieron de Dojindo. El anticuerpo E-caderina, el anticuerpo CD47 y el anticuerpo CD9 se obtuvieron de CST. El anticuerpo F4/80 y el anticuerpo Na+/K+-ATPasa se obtuvieron de ABclonal. El IR775 se adquirió de Sigma Aldrich. La cumarina 6 (C6) y el anticuerpo CD8 se compraron a Thermo Fisher Scientific. El kit ELISA HMGB1 se obtuvo de Arigo Biolaboratories. El kit de ensayo de ATP, la membrana, el kit de extracción de proteínas del citosol y el Hoechst 33342 se compraron todos a Beyotime Biotechnology. El kit de ensayo de apoptosis TUNEL se adquirió de Roche Diagnostics. El anticuerpo Ki67, el anticuerpo CD4 (EPR19514) y el anticuerpo Alexa Fluor 488-CRT se obtuvieron todos de Abcam.

Líneas celulares y animales

La línea celular de CCR de ratón CT26 y RAW264.7 se compraron al Banco de Células de la Academia China de Ciencias. Las células CT26 se cultivaron en medio RPMI 1640, y las células RAW264.7 se cultivaron en medio DMEM, suplementado con un 10% de FBS, 100 mg/mL de estreptomicina y 100 U/mL de penicilina.

Los ratones BALB/c (macho, 6-8 semanas, 18-22 g) se compraron a Shanghai Bikaikeyi Biotechnology Co., Ltd. Se alojaron en grupos de hasta 5 por jaula en jaulas de ventilación individual (IVC) con lecho de virutas de madera, se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas a 22 ± 2 °C y 50 ± 10% de humedad relativa. Tenían acceso libre a pienso estándar y agua filtrada. Para el procedimiento quirúrgico, los ratones se anestesiaron con un 3% de isoflurano administrado a través de un vaporizador de precisión y se mantuvo a un 1,5% de isoflurano para garantizar una profundidad de anestesia suficiente. La eutanasia se realizó mediante asfixia con CO2, seguida de dislocación cervical para confirmar la muerte. Todos los procedimientos de los experimentos con animales siguieron las directrices ARRIVE (Investigación de animales: Informe de experimentos in vivo) y fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Central del Distrito de Putuo de Shanghái (n.º DWEC-A-2024-15-1-85).

Aislamiento de la membrana celular CT26

Las membranas celulares CT26 se aislaron utilizando un kit de extracción de proteínas de membrana de Beyotime Biotechnology. Inicialmente, las células CT26 se desprendieron utilizando un raspador de células y se sometieron a centrifugación a 1200 rpm durante 5 minutos. Las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se centrifugaron de nuevo a 1200 rpm durante 1 minuto. A continuación, las células se resuspendieron suavemente en el reactivo de extracción de proteínas de membrana A, que contenía 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), y se incubaron en hielo durante 15 minutos. La suspensión celular se sometió a una homogeneización repetida utilizando un homogeneizador de vidrio y se centrifugó secuencialmente a 1200 g, 3000 g y 5000 g durante 10 minutos. A continuación, el sobrenadante se centrifugó a 14000 g durante 30 minutos. El pellet resultante se recogió y se resuspendió en PBS para obtener la solución de membrana celular CT26. La concentración de proteínas se cuantificó utilizando el método del ácido bicinquinónico (BCA), y la solución se almacenó a -80 °C para su posterior análisis.

Aislamiento de la membrana de vesículas celulares RAW264.7

Cuando la confluencia de las células RAW264.7 alcanzó el 70%, el medio de cultivo se reemplazó por un medio libre de suero para inducir la privación celular durante 48 horas. Después de este período, el cultivo se centrifugó a 1200 rpm durante 5 minutos y a 10 000 g durante 30 minutos. El sobrenadante se recogió cuidadosamente y se filtró a través de un filtro de membrana de 0,22 μm. Este sobrenadante se sometió a ultracentrifugación a 100 000 g durante 2 horas, y el pellet se lavó suavemente con PBS y se ultracentrifugó una vez más durante 2 horas en las mismas condiciones. Los pellets se resuspendieron en PBS para obtener la solución de membrana de vesículas celulares RAW264.7.

SDS-PAGE

Las proteínas de la membrana celular se recogieron, se sometieron a electroforesis mediante SDS-PAGE (8%) y, a continuación, se tiñeron con azul de Coomassie, tras lo cual el gel se decoloró durante la noche antes de la observación.

Western blot

Las proteínas de la membrana celular se sometieron a electroforesis mediante SDS-PAGE (10%) y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con un 5% de leche descremada y se incubaron con anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios conjugados con HRP. Por último, las bandas de proteínas se visualizaron con quimioluminiscencia ECL.

Preparación y caracterización de nanopartículas

Las nanopartículas de Fe₃O₄ se prepararon mediante síntesis solvotérmica ([Fan et al., 2019]). La PDA (1, 2, 5 y 10 mg) se disolvió en 5 ml de tampón Tris (pH 8,5) y, a continuación, se añadió gota a gota a 5 ml de solución de nanopartículas de Fe₃O₄ (1 mg/ml). La mezcla se agitó a 200 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las nanopartículas de Fe₃O₄ recubiertas con PDA (Fe₃O₄@PDA, NP) se obtuvieron mediante centrifugación a 12 000 rpm durante 15 minutos.

Tras obtener dos membranas celulares CT26 (Cm) y membranas de vesículas RAW264.7 (Rm) distintas, las membranas de vesículas RAW264.7 recubiertas con Fe₃O₄@PDA (RfNP), las membranas celulares CT26 recubiertas con Fe₃O₄@PDA (CfNP) y las nanopartículas de Fe₃O₄ recubiertas con membrana híbrida (MfNP) se fabricaron mediante la encapsulación de Fe₃O₄@PDA.

Para R837@MfNP, la membrana de fusión mixta se preparó inicialmente con una relación proteína/proteína de 3:1 entre Cm y Rm. En detalle, se disolvieron 9 mg de lecitina (PC) y 1 mg de DSPE-mPEG en 5 mL de cloroformo. A continuación, el cloroformo se eliminó mediante evaporación al vacío a 40 °C para formar una película delgada. Por separado, se disolvieron 10 mg de R837 en 2 mL de DMSO y se sometieron a sonicación durante 5 minutos para crear una solución madre de R837 (5 mg/mL). Se preparó una solución mixta que contenía 15 mg de Fe₃O₄@PDA, 3,5 mg de R837, 3,75 mg de membrana de CT26 y 1,25 mg de membrana de vesículas de RAW264.7. Este sistema de membrana híbrida se incubó en un baño de agua a 45 °C durante 20 minutos, se sometió a sonicación con un homogeneizador celular durante 10 minutos y, a continuación, se dejó incubar durante 24 horas adicionales. Después de este período, el precipitado se recogió mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 15 minutos y se resuspendió para obtener el R837@MfNP. El tamaño de partícula, el potencial zeta y el índice de polidispersidad (PDI) de las nanopartículas se caracterizaron mediante dispersión dinámica de luz (Nano ZS90, Malvern, Reino Unido).

Ensayo de captación celular

Se utilizó Cumarina 6 (C6), un tinte fluorescente, en lugar de R837 en las nanopartículas cargadas con fármaco. Las células CT26, a una densidad de 2 × 10⁵ células por placa, se cultivaron en placas de microscopía confocal durante 24 horas. Posteriormente, se añadieron 0,5 mL de medio de cultivo que contenía Fe₃O₄@PDA cargado con C6 (C6@NP), Fe₃O₄@PDA recubierto con membrana de vesículas de RAW264.7 cargado con C6 (C6@RfNP), Fe₃O₄@PDA recubierto con membrana de células CT26 cargado con C6 (C6@CfNP) y Fe₃O₄@PDA recubierto con membrana híbrida cargado con C6 (C6@MfNP) a cada placa, con una concentración de C6 de 5 μg/mL. Después de una incubación de 4 horas, las células se lavaron y se tiñeron con Hoechst 33342 (10 μg/mL). A continuación, la captación celular de las nanopartículas cargadas con C6 por las células CT26 se visualizó mediante microscopía confocal láser (CSU-W1Sora, Nikon, Japón).

Ensayo de citotoxicidad

La citotoxicidad de la terapia fototérmica mediada por R837@MfNP sobre las células CT26 se detectó utilizando el kit de recuento celular-8 y el kit Calceína-AM/PI. Las células CT26 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10⁵ células/mL y se cultivaron durante 24 horas. NP, MfNP, R837@NP y R837@MfNP (0, 50, 100, 200 μg/mL) se añadieron al medio celular durante 6 horas a 37 °C. El grupo NIR se irradió (1,0 W/cm², 5 minutos) con un sistema láser acoplado a fibra de 808 nm (ADR-1805, Changchun, China). A continuación, el PBS se reemplazó con medio fresco y se incubó durante 24 horas. Después de 24 horas, la viabilidad celular se determinó mediante el kit CCK-8.

La apoptosis/necrosis inducida por la terapia fototérmica mediada por R837@MfNP en las células CT26 también se detectó utilizando un kit Calceína-AM/PI. Las células se tiñeron y se observaron con un microscopio de fluorescencia invertido (Ti—S, Nikon, Japón).

Ensayo de inmunogenicidad celular (ICD)

Las células CT26 se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante la noche. NP, MfNP, R837@NP y R837@MfNP se añadieron al medio celular. A continuación, las células se irradiaron con luz NIR de 808 nm durante 30 segundos y se incubaron durante 24 horas. El sobrenadante del cultivo se recogió para la detección de ATP utilizando un kit de ensayo de ATP. Mientras tanto, las células tratadas se recogieron para la detección de HMGB1 utilizando un kit ELISA de HMGB1. En el ensayo de exposición a CRT, las células CT26 se incubaron con el anticuerpo CRT. Se utilizó microscopía confocal láser (CSU-W1Sora, Nikon, Japón) para observar la ectopía de CRT en la superficie de la membrana celular.

Rendimiento fototérmico in vitro

Las propiedades fototérmicas de R837@MfNP se caracterizaron mediante el control del cambio de temperatura de la solución de R837@MfNP (0, 50, 100, 200, 400 μg/mL) utilizando luz NIR de 808 nm (1 W/cm²). Además, la estabilidad fototérmica de R837@MfNP se determinó irradiando la solución de R837@MfNP (400 μg/mL) en 5 ciclos repetidos de 5 minutos de irradiación ON y 5 minutos de irradiación OFF. La temperatura de la solución se registró continuamente mediante termografía infrarroja (DT-9868, Shenzhen, China). La eficiencia de conversión fototérmica (η) se calculó según el método publicado ([Xie et al., 2025]):

h es el coeficiente de transferencia de calor; s es el área de la superficie del recipiente. representa el calor disipado por el láser mediado por el disolvente y el recipiente. I es la potencia del láser y A es la absorbancia a 808 nm.

Resonancia magnética in vitro

Se añadieron soluciones de R837@MfNP (0, 20, 40, 60, 80 y 100 μg/mL) a EP (1,5 mL) y se agitaron en un vórtice durante 3 minutos. A continuación, se utilizó un escáner de RM de 3,0 T para examinar la RM in vitro. (tiempo de repetición (TR): 1100,0 ms, tiempo de eco (TE): 28,7 ms, campo de visión (FOV): 150 × 250 mm y corte: 2,5 mm).

Establecimiento de un modelo de tumor murino de CCRC

Para los modelos de ratón Balb/c portadores de tumores CT26, se inyectó por vía subcutánea 200 μL de una célula CT26 marcada con luciferasa (1 × 10⁷ células/mL) en el flanco derecho de ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad. Una vez que el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 50-80 mm³, los ratones se dividieron aleatoriamente en ocho grupos de tratamiento distintos (n = 6): (1) solución salina, (2) R837 solo (1,0 mg/kg), (3) Fe₃O₄@PDA más láser (NP + L), (4) Fe₃O₄@PDA cargado con R837 más láser (R837@NP + L), (5) Fe₃O₄@PDA recubierto con membrana de células CT26 cargado con R837 más láser (R837@CfNP + L), (6) Fe₃O₄@PDA recubierto con membrana híbrida cargado con R837 sin láser (R837@MfNP), (7) Fe₃O₄@PDA recubierto con membrana híbrida más láser (MfNP + L) y (8) Fe₃O₄@PDA recubierto con membrana híbrida cargado con R837 más láser (R837@MfNP + L). El grupo de tratamiento se administró por vía intravenosa, una vez cada dos días, durante un total de tres veces. 24 horas después de la administración, los respectivos grupos se expusieron a la irradiación con láser de 808 nm (1,0 W/cm², 5 minutos). El tamaño del tumor y el peso corporal se midieron cada 2 días. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula: volumen del tumor = 0,5 × longitud × anchura². Después del tratamiento, los ratones se sacrificaron mediante asfixia con dióxido de carbono, y se recogieron los ganglios linfáticos para el análisis de citometría de flujo, así como los tumores para la tinción de inmunocitoquímica (IHC) y la tinción de inmunofluorescencia (IF). Además, se recogieron tejidos del corazón, el hígado, el bazo, los pulmones y los riñones para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E).

Para el modelo de ratón con tumores bilaterales, los ratones Balb/c portadores de tumores CT26 con tumores primarios y distantes se asignaron aleatoriamente a tres grupos (n = 5): (1) solución salina, (2) MfNP más luz NIR (MfNP + NIR) y (3) MfNP cargado con R837 más luz NIR (R837@MfNP + NIR). Los métodos de tratamiento fueron los mismos que los anteriores. Se controló el volumen del tumor, el peso corporal y la tasa de supervivencia. El día 15, se sacrificaron los ratones y se recogieron el bazo y los tumores para el análisis de citometría de flujo, así como los tumores para la tinción de IHC y la tinción de IF. Además, se recogieron muestras de suero de cada grupo para determinar los niveles de INF-γ y TNF-α.

Para el modelo de metástasis pulmonar en ratones, los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos (n = 5): (1) solución salina, (2) MfNP más luz NIR (MfNP + NIR) y (3) MfNP cargado con R837 más luz NIR (R837@MfNP + NIR). El día -7, se inyectaron 200 μL de células CT26 marcadas con luciferasa (2,5 × 10⁷ células/mL) en la vena de la cola de los ratones, seguidas de una inyección subcutánea de suspensión de células CT26 (1 × 10⁷ células/mL) en el flanco derecho. Las nanopartículas se administraron por la vena de la cola los días 0, 2 y 4, y se aplicó la exposición a la luz NIR (808 nm, 1 W/cm², 5 minutos) los días 1, 3 y 5. El día 14, las metástasis pulmonares se visualizaron mediante el sistema IVIS Spectrum (PerkinElmer, EE. UU.). Se registraron el tamaño del tumor y el peso corporal cada 2 días, y se evaluó el número y el área de los nódulos pulmonares. Después del tratamiento, se sacrificaron los ratones y se recogieron los tejidos pulmonares para la tinción con H&E y la tinción con IF.

Efecto fototérmico in vivo

Después del establecimiento de ratones portadores de tumores CT26, se inyectaron por vía intravenosa diferentes nanopartículas cuando los tumores alcanzaron los 200-300 mm³. Después de 24 horas, los tejidos tumorales se irradiaron con luz NIR de 808 nm (0, 1, 2, 3, 4 y 5 minutos), y los cambios de temperatura durante el proceso de irradiación se registraron simultáneamente con termografía infrarroja.

Respuesta inmune antitumoral in vivo mediante citometría de flujo

Se recogieron los tumores, los ganglios linfáticos y los bazo de cada grupo, y los tejidos se cortaron y se filtraron suavemente a través de un filtro celular de 70 μm. Las suspensiones celulares se incubaron con Fc-Block (BioLegend) durante 5 minutos sobre hielo para evitar la unión inespecífica. A continuación, las células se tiñeron con anticuerpos en la oscuridad durante 30 minutos sobre hielo. Para el análisis de las células T en los tumores y los bazo, las suspensiones celulares se tiñeron con CD3-PE (BioLegend), CD4-FITC (BD Pharmingen) y CD8a-APC (BD Pharmingen). Para el análisis de las células dendríticas maduras en los ganglios linfáticos, las suspensiones celulares se tiñeron con CD11c-PerCP-Cy5.5 (BioLegend), CD80-APC (BioLegend) y CD86-FITC (Invitrogen). Por último, las células se resuspendieron en el tampón de tinción y se analizaron mediante citometría de flujo (Beckman, EE. UU.).

Inmunohistoquímica, inmunofluorescencia y ensayos TUNEL

Para el ensayo de inmunohistoquímica, se recogieron secciones de tumores, se fijaron en formaldehído al 10% y se realizaron secciones de tejido incluidas en parafina. Después del bloqueo y la permeabilización, las secciones de tumores se tiñeron con el anticuerpo Ki67 (ab15580), se lavaron en PBS 3 veces y, a continuación, se incubaron con el anticuerpo secundario de inmunoglobulina G (IgG) de cabra durante 30 minutos. Las láminas se incubaron con DAB (Abcam) para la visualización después del lavado con PBS. A continuación, las láminas se lavaron con agua, se tiñeron con hematoxilina durante 15 segundos, se volvieron a lavar con agua y se sellaron para la observación microscópica.

Para la tinción de inmunofluorescencia, se recogieron secciones de tumores y se permeabilizaron durante 20 minutos, se incubaron con anticuerpos primarios CD8 (ab217344) durante la noche a 4 °C, seguidas del anticuerpo secundario de IgG de burro durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se tiñó con DAPI y se selló. Para el ensayo TUNEL, las láminas se tiñeron con la técnica TUNEL en el kit de detección de muerte celular in situ según las instrucciones del fabricante. Las imágenes fluorescentes se adquirieron utilizando un microscopio confocal láser (CLSM) (Leica, Heidelberg, Alemania).

Resonancia magnética in vivo

Cuando el volumen del tumor de los ratones alcanzó los 500-800 mm³, se realizó un escáner de RM de 3,0 T para evaluar la RM in vivo. Se inyectaron por vía intravenosa 200 μL de solución de R837@MfNP (1 mg/mL) en el ratón a través de la vena de la cola. La RM ponderada en T2 se volvió a registrar en diferentes momentos (0, 24 y 48 horas) (TR: 2500 ms, TE: 90 ms, FOV: 100 mm, grosor de la fina sección: 3 mm).

Análisis estadístico

Todos los datos experimentales se presentan como la media ± desviación estándar (DE), obtenidos de un mínimo de tres experimentos independientes. Para determinar la significación estadística de las diferencias entre los grupos experimentales, se utilizó la prueba t de Student. El análisis de los datos se realizó utilizando el software GraphPad Prism 8.0, lo que facilitó el cálculo de los niveles de significación entre los grupos, y se consideró que un valor de p inferior a 0,05 era estadísticamente significativo. Los niveles de significación se indicaron de la siguiente manera: *p < 0,05, p < 0,01 y *p < 0,001.

Materiales

El imiquimod (R837) se adquirió de Selleck Chemicals. El clorhidrato de dopamina se obtuvo de Adamas. El cloruro de hierro hexahidratado se compró a Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. El kit de recuento celular-8 (CCK-8) y el kit de tinción doble Calceína-AM/PI se obtuvieron de Dojindo. El anticuerpo E-caderina, el anticuerpo CD47 y el anticuerpo CD9 se obtuvieron de CST. El anticuerpo F4/80 y el anticuerpo Na+/K+-ATPasa se obtuvieron de ABclonal. El IR775 se adquirió de Sigma Aldrich. La cumarina 6 (C6) y el anticuerpo CD8 se compraron a Thermo Fisher Scientific. El kit ELISA de HMGB1 se obtuvo de Arigo Biolaboratories. El kit de ensayo de ATP, la membrana, el kit de extracción de proteínas del citosol y el Hoechst 33342 se compraron todos a Beyotime Biotechnology. El kit de ensayo de apoptosis TUNEL se adquirió de Roche Diagnostics. El anticuerpo Ki67, el anticuerpo CD4 (EPR19514) y el anticuerpo Alexa Fluor 488-CRT se obtuvieron todos de Abcam.

Líneas celulares y animales

La línea celular de CCRC de ratón CT26 y RAW264.7 se compraron al Banco de Células de la Academia China de Ciencias. Las células CT26 se cultivaron en medio RPMI 1640, y las células RAW264.7 se cultivaron en medio DMEM, suplementado con un 10% de FBS, 100 mg/mL de estreptomicina y 100 U/mL de penicilina.

Se adquirieron ratones BALB/c (macho, 6-8 semanas, 18-22 g) de Shanghai Bikaikeyi Biotechnology Co., Ltd. Se alojaron en grupos de hasta 5 por jaula en jaulas de ventilación individual (IVC) con sustrato de virutas de madera, y se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas a 22 ± 2 °C y 50 ± 10% de humedad relativa. Tenían acceso libre a pienso estándar y agua filtrada. Para el procedimiento quirúrgico, los ratones fueron anestesiados con 3% de isoflurano administrado a través de un vaporizador de precisión y se mantuvo a 1,5% de isoflurano para asegurar una profundidad de anestesia suficiente. La eutanasia se realizó utilizando asfixia por CO2, seguida de dislocación cervical para confirmar la muerte. Todos los procedimientos de los experimentos con animales siguieron las directrices ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) y fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Central del Distrito de Putuo de Shanghái (No. DWEC-A-2024-15-1-85).

Aislamiento de la membrana celular CT26

Las membranas celulares CT26 se aislaron utilizando un kit de extracción de proteínas de membrana de Beyotime Biotechnology. Inicialmente, las células CT26 se separaron utilizando un raspador celular y se sometieron a centrifugación a 1200 rpm durante 5 minutos. Las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se centrifugaron nuevamente a 1200 rpm durante 1 minuto. Luego, las células se resuspendieron suavemente en el reactivo de extracción de proteínas de membrana A, que contenía un mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), y se incubaron en hielo durante 15 minutos. La suspensión celular se sometió a una homogeneización repetida utilizando un homogeneizador de vidrio y se centrifugó secuencialmente a 1200 g, 3000 g y 5000 g durante 10 minutos. Posteriormente, el sobrenadante se centrifugó a 14000 g durante 30 minutos. El pellet resultante se recogió y se resuspendió en PBS para obtener la solución de membrana celular CT26. La concentración de proteína se cuantificó utilizando el método del ácido bicinconínico (BCA) y la solución se almacenó a -80 °C para su posterior análisis.

Aislamiento de la membrana vesicular celular RAW264.7

Cuando la confluencia de las células RAW264.7 alcanzó el 70%, el medio de cultivo se reemplazó con un medio libre de suero para inducir la privación celular durante 48 horas. Después de este período, el cultivo se centrifugó a 1200 rpm durante 5 minutos y a 10000 g durante 30 minutos. El sobrenadante se recogió cuidadosamente y se filtró a través de un filtro de membrana de 0,22 μm. Este sobrenadante se ultracentrifugó luego a 100000 g durante 2 horas, y el pellet se lavó suavemente con PBS y se ultracentrifugó una vez más durante 2 horas en las mismas condiciones. Los pellets se resuspendieron en PBS para obtener la solución de membrana vesicular celular RAW264.7.

SDS-PAGE

Las proteínas de la membrana celular se recolectaron, se sometieron a electroforesis mediante SDS-PAGE (8%) y luego se tiñeron con azul de Coomassie, después de lo cual el gel se decoloró durante la noche antes de la observación.

Western blotting

Las proteínas de la membrana celular se sometieron a electroforesis mediante SDS-PAGE (10%) y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con 5% de leche descremada y se incubaron con anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios conjugados con HRP. Finalmente, las bandas de proteína se visualizaron con quimioluminiscencia ECL.

Preparación y caracterización de nanopartículas

Las nanopartículas de Fe₃O₄ se prepararon mediante síntesis solvotérmica ([Fan et al., 2019]). El PDA (1, 2, 5 y 10 mg) se disolvió en 5 mL de tampón Tris (pH 8,5) y luego se añadió gota a gota a 5 mL de solución de nanopartículas de Fe₃O₄ (1 mg/mL). La mezcla se agitó a 200 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las nanopartículas de Fe₃O₄ recubiertas con PDA (Fe₃O₄@PDA, NP) se obtuvieron mediante centrifugación a 12000 rpm durante 15 minutos.

Después de obtener dos membranas celulares CT26 (Cm) y membranas vesiculares RAW264.7 (Rm) individuales, las membranas vesiculares RAW264.7 recubiertas con Fe₃O₄@PDA (RfNP), las membranas celulares CT26 recubiertas con Fe₃O₄@PDA (CfNP) y las nanopartículas de Fe₃O₄ recubiertas con membrana híbrida (MfNP) se fabricaron encapsulando Fe₃O₄@PDA.

Para R837@MfNP, primero se preparó una membrana de fusión mixta con una relación de proteínas de 3:1 de Cm y Rm. En detalle, 9 mg de lecitina (PC) y 1 mg de DSPE-mPEG se disolvieron en 5 mL de cloroformo. Luego, el cloroformo se eliminó por evaporación al vacío a 40 °C para formar una película delgada. Por separado, 10 mg de R837 se disolvieron en 2 mL de DMSO y se sonicaron durante 5 minutos para crear una solución madre de R837 (5 mg/mL). Se preparó una solución mixta que contenía 15 mg de Fe₃O₄@PDA, 3,5 mg de R837, 3,75 mg de membrana CT26 y 1,25 mg de membrana vesicular RAW264.7. Este sistema de membrana híbrida se incubó en un baño de agua a 45 °C durante 20 minutos, se sonicó con un triturador celular durante 10 minutos y luego se dejó incubar durante 24 horas adicionales. Después de este período, el precipitado se recogió mediante centrifugación a 14000 rpm durante 15 minutos y se resuspendió para obtener el R837@MfNP. El tamaño de partícula, el potencial zeta y el índice de polidispersidad (PDI) de las nanopartículas se caracterizaron utilizando dispersión dinámica de luz (Nano ZS90, Malvern, Reino Unido).

Ensayo de captación celular

Se utilizó Cumarina 6 (C6), un tinte fluorescente, en lugar de R837 en las nanopartículas cargadas con fármaco. Las células CT26, a una densidad de 2 × 10⁵ células por placa, se cultivaron en placas de microscopía confocal durante 24 horas. Posteriormente, se añadieron 0,5 mL de medio de cultivo que contenía Fe₃O₄@PDA cargado con C6 (C6@NP), Fe₃O₄@PDA recubierto con membrana vesicular RAW264.7 cargado con C6 (C6@RfNP), Fe₃O₄@PDA recubierto con membrana celular CT26 cargado con C6 (C6@CfNP) y Fe₃O₄@PDA recubierto con membrana híbrida cargado con C6 (C6@MfNP) a cada placa, con una concentración de C6 de 5 μg/mL. Después de la incubación durante 4 horas, las células se lavaron y se tiñeron con Hoechst 33342 (10 μg/mL). La captación celular de nanopartículas cargadas con C6 por las células CT26 se visualizó utilizando microscopía confocal láser (CSU-W1Sora, Nikon, Japón).

Ensayo de citotoxicidad

La citotoxicidad de R837@MfNP mediada por PTT en las células CT26 se detectó utilizando el kit de recuento celular-8 y el kit Calcein-AM/PI. Las células CT26 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10⁵ células/mL y se cultivaron durante 24 horas. NP, MfNP, R837@NP y R837@MfNP (0, 50, 100, 200 μg/mL) se añadieron al medio celular durante 6 horas a 37 °C. El grupo NIR se irradió (1,0 W/cm², 5 min) con un sistema láser acoplado a fibra de 808 nm (ADR-1805, Changchun, China). Luego, el PBS se reemplazó con medio fresco y se incubó durante 24 horas. Después de 24 horas, la viabilidad celular se determinó mediante el kit CCK-8.

La apoptosis/necrosis inducida por PTT mediada por R837@MfNP de las células CT26 también se detectó utilizando un kit Calcein-AM/PI. Las células se tiñeron y se observaron con un microscopio de fluorescencia invertido (Ti—S, Nikon, Japón).

Ensayo de ICD

Las células CT26 se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante la noche. NP, MfNP, R837@NP y R837@MfNP se añadieron al medio celular. Luego, las células se irradiaron con luz NIR de 808 nm durante 30 segundos y se incubaron durante 24 horas. El sobrenadante del cultivo se recogió para la detección de ATP utilizando un kit de ensayo de ATP. Mientras tanto, las células tratadas se recogieron para la detección de HMGB1 utilizando un kit ELISA de HMGB1. En el ensayo de exposición a CRT, las células CT26 se incubaron con el anticuerpo CRT. Se utilizó microscopía confocal láser (CSU-W1Sora, Nikon, Japón) para observar la ectopía de CRT en la superficie de la membrana celular.

Rendimiento fototérmico in vitro

Las propiedades fototérmicas de R837@MfNP se caracterizaron mediante el control del cambio de temperatura de la solución de R837@MfNP (0, 50, 100, 200, 400 μg/mL) utilizando luz NIR de 808 nm (1 W/cm²). Además, la estabilidad fototérmica de R837@MfNP se determinó irradiando la solución de R837@MfNP (400 μg/mL) en 5 ciclos repetidos de 5 minutos de irradiación ON y 5 minutos de irradiación OFF. La temperatura de la solución se registró continuamente mediante termografía infrarroja (DT-9868, Shenzhen, China). La eficiencia de conversión fototérmica (η) se calculó según el método informado ([Xie et al., 2025]):

h es el coeficiente de transferencia de calor; s es el área de la superficie del recipiente. representa el calor disipado por el láser mediado por el disolvente y el recipiente. I es la potencia del láser y A es la absorbancia a 808 nm.

Imagen de resonancia magnética in vitro

Se añadieron soluciones de R837@MfNP (0, 20, 40, 60, 80 y 100 μg/mL) a EP (1,5 mL) y se agitaron durante 3 minutos. Luego, se empleó un escáner de RM de 3,0 T para examinar la imagen de RM in vitro. (tiempo de repetición (TR): 1100,0 ms, tiempo de eco (TE): 28,7 ms, campo de visión (FOV): 150 × 250 mm y corte: 2,5 mm).

Establecimiento de un modelo tumoral de ratones con CRC

Para los modelos de ratones BALB/c portadores de tumores CT26, se inyectaron por vía subcutánea 200 μL de células CT26 marcadas con luciferasa (1 × 10⁷ células/mL) en el flanco derecho de ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad. Una vez que el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 50-80 mm³, los ratones se dividieron aleatoriamente en ocho grupos de tratamiento distintos (n = 6): (1) solución salina, (2) R837 solo (1,0 mg/kg), (3) Fe₃O₄@PDA más láser (NP + L), (4) Fe₃O₄@PDA cargado con R837 más láser (R837@NP + L), (5) Fe₃O₄@PDA recubierto con membrana celular CT26 cargado con R837 más láser (R837@CfNP + L), (6) Fe₃O₄@PDA recubierto con membrana híbrida cargado con R837 sin láser (R837@MfNP), (7) Fe₃O₄@PDA recubierto con membrana híbrida más láser (MfNP + L) y (8) Fe₃O₄@PDA recubierto con membrana híbrida cargado con R837 más láser (R837@MfNP + L). El grupo de tratamiento se administró por vía intravenosa, una vez cada dos días, durante un total de tres veces. 24 horas después de la administración, los respectivos grupos se expusieron a la irradiación con láser de 808 nm (1,0 W/cm², 5 min). El tamaño del tumor y el peso corporal se midieron cada 2 días. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula: volumen del tumor = 0,5 × longitud × ancho². Después del tratamiento, los ratones fueron sacrificados por asfixia con dióxido de carbono, y se recolectaron los ganglios linfáticos para el análisis de citometría de flujo, así como los tumores para la tinción de inmunocitoquímica (IHC) y la tinción de inmunofluorescencia (IF). Además, se recolectaron tejidos del corazón, el hígado, el bazo, los pulmones y los riñones para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E).

Para el modelo de ratones con tumores bilaterales, los ratones portadores de tumores CT26 con tumores primarios y distantes se asignaron aleatoriamente a tres grupos (n = 5): (1) solución salina, (2) MfNP más luz NIR (MfNP + NIR) y (3) MfNP cargado con R837 más luz NIR (R837@MfNP + NIR). Los métodos de tratamiento fueron los mismos que los anteriores. Se controló el volumen del tumor, el peso corporal y la tasa de supervivencia. El día 15, se sacrificaron los ratones y se recogieron el bazo y los tumores para el análisis de citometría de flujo, así como los tumores para la tinción de IHC y la tinción de IF. Además, se recogieron muestras de suero de cada grupo para determinar los niveles de INF-γ y TNF-α.

Para el modelo de metástasis pulmonar en ratones, los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos (n = 5): (1) solución salina, (2) MfNP más luz NIR (MfNP + NIR) y (3) MfNP cargado con R837 más luz NIR (R837@MfNP + NIR). El día -7, se inyectaron por vía intravenosa 200 μL de células CT26 marcadas con luciferasa (2,5 × 10⁷ células/mL) en la vena de la cola de los ratones, seguidas de una inyección subcutánea de suspensión de células CT26 (1 × 10⁷ células/mL) en el flanco derecho. Las nanopartículas se administraron por vía intravenosa los días 0, 2 y 4, y la exposición a la luz NIR (808 nm, 1 W/cm², 5 min) se aplicó los días 1, 3 y 5. El día 14, las metástasis pulmonares se visualizaron mediante el sistema IVIS Spectrum (PerkinElmer, EE. UU.). Se registraron el tamaño del tumor y el peso corporal cada 2 días, y se evaluó el número y el área de los nódulos pulmonares. Después del tratamiento, se sacrificaron los ratones y se recogieron los tejidos pulmonares para la tinción con H&E y la tinción de IF.

Efecto fototérmico in vivo

Después del establecimiento de ratones portadores de tumores CT26, se inyectaron por vía intravenosa diferentes nanopartículas cuando los tumores alcanzaron los 200-300 mm³. Después de 24 horas, los tejidos tumorales se irradiaron con luz NIR de 808 nm (0, 1, 2, 3, 4 y 5 min), y los cambios de temperatura durante el proceso de irradiación se registraron simultáneamente con termografía infrarroja.

Respuesta inmune antitumoral in vivo mediante citometría de flujo

Se recolectaron tumores, ganglios linfáticos y bazo de cada grupo, y los tejidos se cortaron y filtraron suavemente a través de un filtro celular de 70 μm. Las suspensiones celulares se incubaron con Fc-Block (BioLegend) durante 5 minutos sobre hielo para evitar la unión inespecífica. Posteriormente, las células se tiñeron con anticuerpos en la oscuridad durante 30 minutos sobre hielo. Para el análisis de las células T en los tumores y el bazo, las suspensiones celulares se tiñeron con CD3-PE (BioLegend), CD4-FITC (BD Pharmingen) y CD8a-APC (BD Pharmingen). Para el análisis de las células dendríticas maduras en los ganglios linfáticos, las suspensiones celulares se tiñeron con CD11c-PerCP-Cy5.5 (BioLegend), CD80-APC (BioLegend) y CD86-FITC (Invitrogen). Finalmente, las células se resuspenden en el tampón de tinción y se analizan mediante citometría de flujo (Beckman, EE. UU.).

Inmunohistoquímica, inmunofluorescencia y ensayos TUNEL

Para el ensayo de inmunohistoquímica, se recolectaron secciones de tumores, se fijaron en formaldehído al 10 % y se realizaron secciones de tejido incluidas en parafina. Después del bloqueo y la permeabilización, las secciones de tumores se tiñeron con el anticuerpo Ki67 (ab15580), se lavaron en PBS tres veces y luego se incubaron con inmunoglobulina G (IgG) de cabra secundaria anti-conejo durante 30 minutos. Las láminas se incubaron con DAB (Abcam) para la visualización después del lavado con PBS. Posteriormente, las láminas se lavaron con agua, se tiñeron con hematoxilina durante 15 segundos, se volvieron a lavar con agua y se sellaron para la observación microscópica.

Para la tinción de inmunofluorescencia, se recolectaron secciones de tumores y se permeabilizaron durante 20 minutos, se incubaron con anticuerpos primarios CD8 (ab217344) durante la noche a 4 °C, seguido de la inmunoglobulina G de burro secundaria anti-conejo durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, se tiñó con DAPI y se selló. Para el ensayo TUNEL, las láminas se tiñeron con la técnica TUNEL utilizando el kit de detección de muerte celular in situ según las instrucciones del fabricante. Las imágenes fluorescentes se adquirieron utilizando CLSM (Leica, Heidelberg, Alemania).

Imagen por resonancia magnética in vivo

Cuando el volumen tumoral de los ratones alcanzó los 500-800 mm³, se realizó una exploración de resonancia magnética de 3,0 T para evaluar la resonancia magnética in vivo. Se inyectó por vía intravenosa 200 μL de solución de R837@MfNP (1 mg/mL) en el ratón a través de una vena de la cola. La resonancia magnética ponderada en T2 se volvió a registrar en diferentes momentos (0, 24 y 48 horas) (TR: 2500 ms, TE: 90 ms, FOV: 100 mm, grosor de la fina sección: 3 mm).

Análisis estadístico

Todos los datos experimentales se presentan como la media ± desviación estándar (DE), obtenidos de un mínimo de tres experimentos separados. Para determinar la significancia estadística de las diferencias entre los grupos experimentales, se utilizó la prueba t de Student. El análisis de datos se realizó utilizando el software GraphPad Prism 8.0, lo que facilitó el cálculo de los niveles de significancia entre los grupos, y se consideró estadísticamente significativo un valor p inferior a 0,05. Los niveles de significancia se indicaron de la siguiente manera: *p < 0,05, p < 0,01 y *p < 0,001.

Resultados

Preparación y caracterización de R837@MfNP

La construcción de R837@MfNP incluyó tres pasos: (1) preparación de nanopartículas de Fe₃O₄ modificadas con PDA cargadas con R837 (R837@NP), (2) obtención de una membrana de fusión mixta (Mf) de membranas de CT26 (Cm) y membranas de vesículas extracelulares derivadas de RAW264.7 (Rm), y (3) recubrimiento de Mf sobre R837@NP (R837@MfNP) (Fig. S1). Para validar la fusión entre los dos tipos de membranas, se utilizó la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). Como se muestra en la Fig. 1A, un aumento en la proporción de Cm condujo a una disminución en la intensidad de fluorescencia a 590 nm (PE-RhB) y a una recuperación concomitante en la intensidad de fluorescencia a 535 nm (PE-NBD). Esta observación indicó que la incorporación de Cm atenuó la interacción FRET entre PE-NBD y PE-RhB, confirmando así que Cm y Rm se fusionaron. Además, para demostrar aún más la fusión exitosa de Cm con Rm para formar membranas híbridas, Cm y Rm se etiquetaron con los colorantes fluorescentes DiO y DiI, respectivamente, antes de mezclarlos. Posteriormente, se monitoreó la captación de MfNP por las células CT26 utilizando CLSM. Como se muestra en la Fig. 1B, se observó fluorescencia verde proveniente de DiO y fluorescencia roja proveniente de DiI dentro de las células CT26. Esta importante superposición de fluorescencia indicó claramente que los diferentes tipos de membranas se mezclaron con éxito. El MfNP resultante, con una relación de peso de proteínas de 1:3 de Rm a Cm, se utilizó para experimentos posteriores.

La evasión inmune y las capacidades de direccionamiento homólogo se atribuyen principalmente a los diversos antígenos presentes en estos dos tipos de membranas celulares. El análisis de proteínas SDS-PAGE reveló que MfNP posee las características tanto de las membranas de CT26 como de las membranas de vesículas extracelulares derivadas de RAW264.7. Como se ilustra en la Fig. 1C, MfNP presentó de hecho bandas de proteínas características heredadas tanto de Cm como de Rm, lo que implicó la fusión exitosa de Cm y Rm en la membrana híbrida. El análisis de Western blot verificó además que MfNP expresó los marcadores de Cm E-caderina y CD47, los marcadores de vesículas extracelulares CD9 y el marcador de macrófagos F4/80 (Fig. S2).

La Tabla 1 resume el tamaño de partícula, el potencial zeta, el índice de polidispersidad (PDI) y la eficiencia de carga de fármacos (LE) de las diversas nanopartículas. R837 es capaz de unirse covalentemente a Fe₃O₄@PDA a través de sus grupos amino inherentes mediante una reacción de base de Schiff, o puede adsorberse en la superficie de Fe₃O₄@PDA a través de interacciones no covalentes, como el apilamiento π-π y los enlaces de hidrógeno. Tras la carga con R837, el tamaño de R837@NP aumentó ligeramente a 121,5 ± 1,9 nm, y el potencial zeta se desplazó a -22,3 ± 1,5 mV (Fig. 1D y E). La carga negativa en la superficie de R837@NP repele la carga negativa del compuesto de membrana, lo que garantiza que las proteínas de la membrana estén orientadas hacia el exterior y estén bien recubiertas en la superficie de las nanopartículas bajo tratamiento ultrasónico. Se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) para examinar la morfología de las nanopartículas, como se muestra en la Fig. 1F y la Fig. S3. R837@MfNP mostró una estructura núcleo-cáscara distinta, una forma esférica y una buena dispersión, con un tamaño de partícula de 136,0 ± 2,0 nm, un potencial zeta de -15,7 ± 0,8 mV y un PDI de 0,18 ± 0,03.

Como se muestra en la Fig. 1G, el perfil de liberación in vitro de fármacos de R837@MfNP se evaluó en diversas condiciones de pH (pH 5,5 y pH 6,8). Cuando se sometió a irradiación láser NIR, la velocidad de liberación de R837 en el tampón de pH 5,5 después de 48 horas fue notablemente mayor, del 68,5 %, que en el tampón de pH 6,8, del 16,8 %. Esta liberación de fármacos dependiente del pH se puede atribuir a la protonación de los grupos amino en PDA en condiciones ácidas, lo que interrumpe las interacciones de apilamiento π-π entre R837 y PDA. Además, R837, una base débil con un pKa de 7,3, es más soluble en ambientes ácidos que a pH fisiológico (Fig. S4). Además, la irradiación láser NIR mejoró significativamente la liberación de R837, probablemente debido a la conversión de la energía de la luz en calor por MfNP bajo la irradiación NIR. Este aumento de la temperatura de la solución local interrumpe los enlaces de hidrógeno entre R837 y PDA y promueve el movimiento térmico molecular, lo que conduce a la rápida liberación de R837.

Además, la estabilidad de R837@MfNP se evaluó monitoreando los cambios en el tamaño de partícula utilizando la dispersión de luz dinámica (DLS). Como se muestra en la Fig. 1H y la Fig. S5, no se detectó ninguna fluctuación evidente en el tamaño de partícula de R837@MfNP durante la incubación durante 14 días en PBS y FBS al 10 %, lo que confirmó la alta estabilidad de R837@MfNP.

Rendimiento de conversión fototérmica y rendimiento de resonancia magnética de R837@MfNP

La capacidad de conversión fototérmica superior y la estabilidad fototérmica son cruciales para la aplicación de nanomateriales fototérmicos en la ablación tumoral ([Aboeleneen et al., 2022]). El efecto fototérmico in vitro de R837@MfNP se evaluó utilizando una cámara termográfica infrarroja. Como se muestra en la Fig. 2A-C, en comparación con el grupo de control, el efecto fototérmico de R837@MfNP (50, 100, 200 y 400 μg/mL) aumentó gradualmente con el aumento de las concentraciones de R837@NP cargadas en la mezcla. En particular, la temperatura de R837@MfNP (400 μg/mL) aumentó a 49 °C en 5 minutos después de la irradiación NIR de 808 nm, lo que indica su capacidad de conversión fototérmica superior. Además, durante los cinco ciclos de irradiación con láser encendido y apagado, la temperatura de R837@MfNP (400 μg/mL) aumentó repetidamente a aproximadamente 49 °C, similar a la del primer ciclo, lo que indica una excelente estabilidad fototérmica (Fig. 2D-E y Fig. S6). La eficiencia de conversión fototérmica de R837@MfNP alcanzó el 35,6 %.

La resonancia magnética es una de las herramientas de diagnóstico médico más utilizadas debido a su no invasividad y sus capacidades tomográficas ([Li et al., 2020b]). Los nanosistemas basados en Fe₃O₄ pueden funcionar como agentes de contraste de resonancia magnética ponderada en T₂ ([Zhao et al., 2024a]). Como se muestra en la Fig. 2F, los bucles de histéresis de Fe₃O₄ y R837@MfNP se midieron a 300 K, y ambos materiales mostraron remanencia y coercitividad cero, lo que indica que R837@MfNP presenta un comportamiento superparamagnético. La magnetización de saturación de Fe₃O₄ se registró en 59,66 emu/g, mientras que la de R837@MfNP fue de 50,94 emu/g. Aunque hubo una disminución en la magnetización de saturación de Fe₃O₄ después de la encapsulación con PDA y la membrana híbrida, el valor siguió siendo suficiente para aplicaciones de resonancia magnética in vivo. Además, R837@MfNP se pudo atraer fácilmente con un imán y redispersar en 30 segundos después de una suave agitación (Fig. 2G). Los datos anteriores indicaron que R837@MfNP se puede utilizar como un agente de contraste en la resonancia magnética y como una fuente de calentamiento en la termoterapia localizada.

Captación celular de MfNP

Este estudio exploró además la captación celular de MfNP por las células CT26 utilizando microscopía de fluorescencia. MfNP se etiquetó con la cumarina 6 (C6) para el seguimiento visual. Como se muestra en la Fig. S7, en comparación con el grupo de C6 libre, C6@CfNP exhibió una intensidad de fluorescencia más fuerte debido a la capacidad de adhesión homotípica de la membrana CT26. En particular, en comparación con los tratamientos con C6@RfNP y C6@CfNP, la intensidad de fluorescencia del tratamiento con C6@MfNP fue la más fuerte, lo que demostró una eficiencia de captación superior debido a la capacidad de la membrana CT26 y la membrana de vesículas extracelulares derivadas de macrófagos de Raw 264.7 para dirigirse entre sí dos veces más (Fig. S7). Estos hallazgos sugieren que MfNP sirve como una plataforma nanoefectiva para dirigirse a las células de cáncer colorrectal.

Toxicidad fototérmica de la termoterapia mediada por R837@MfNP en las células de cáncer colorrectal

Los efectos citotóxicos de la termoterapia mediada por R837 y R837@MfNP en las células de cáncer colorrectal se evaluaron mediante un ensayo CCK-8. Primero, la citotoxicidad de R837 aumentó ligeramente con el aumento de la concentración de R837, y la viabilidad de CT26 fue de aproximadamente el 85,9 % cuando la dosis de R837 fue de 40 μg/mL, lo que demostró que R837 no tiene una toxicidad evidente para las células tumorales. Además, las células incubadas con MfNP sin exposición a la luz tenían una alta tasa de supervivencia (89,7 %), incluso a 400 μg/mL, lo que indicó que MfNP tiene una buena biocompatibilidad (Fig. S8). Además, las células CT26 se trataron con NP, MfNP, R837@NP o R837@MfNP a varias concentraciones (0, 50, 100 o 200 μg/mL) con o sin irradiación NIR, seguido de una incubación de 24 horas. Como se muestra en la Fig. 3A, los resultados revelaron que ni NP, MfNP, R837@NP ni R837@MfNP a diferentes concentraciones exhibieron una toxicidad significativa para las células CT26 sin exposición a la luz. Sin embargo, estas nanopartículas inhibieron significativamente la proliferación de las células CT26 de manera dependiente de la concentración bajo exposición a la luz (Fig. 3B). Estos resultados aclaran que R837@MfNP tiene excelentes propiedades de termoterapia in vitro.

Se realizó un ensayo de doble tinción con calceína-AM/PI para evaluar la apoptosis/necrosis de las células CT26 inducida por la terapia fototérmica mediada por R837@MfNP (PTT). Como se muestra en las Figuras 3C y 3D, las células tratadas con NP, MfNP, R837@NP y R837@MfNP que no fueron irradiadas mostraron fluorescencia verde, lo que confirma la no toxicidad de estas nanopartículas. En contraste, las células CT26 tratadas con estas nanopartículas bajo irradiación de NIR presentaron una evidente fluorescencia roja en el interior de las células. Además, se observó la fluorescencia roja más intensa en el grupo R837@MfNP+NIR, lo que sugiere que la excelente eficacia antitumoral podría deberse a una terapia fototérmica y un tratamiento inmunomodulador sinérgicos. Estos hallazgos fueron consistentes con los resultados del ensayo CCK-8. Estos resultados indican que la terapia fototérmica mediada por R837@MfNP induce eficazmente la apoptosis/necrosis en las células de CRC, demostrando potentes efectos antitumorales.

La terapia fototérmica mediada por R837@MfNP induce la ICD en las células de CRC

La terapia fototérmica no solo erradica directamente las células tumorales mediante la hipertermia, sino que también desencadena la liberación de antígenos asociados al tumor, como los DAMP, que posteriormente activan tanto las respuestas inmunitarias innatas como adaptativas antitumorales ([Yang et al., 2022]). Para explorar si la terapia fototérmica mediada por R837@MfNP puede inducir la ICD, que se caracteriza por la liberación de DAMP, se midieron las señales inmunogénicas, que incluyen HMGB1, ATP y CRT. La exposición de CRT en las superficies de las membranas celulares CT26 sirve como una señal de "cómeme", promoviendo la fagocitosis de las células tumorales por las células dendríticas (DC) y facilitando la maduración de las DC para realizar funciones inmunitarias. Como se ilustra en las Figuras 3E y 3F, en comparación con los otros grupos, el grupo R837@MfNP presentó la mayor expresión de CRT en la superficie celular (fluorescencia verde) después de la exposición a la luz, lo que podría atribuirse al aumento de la captación celular de nanopartículas facilitada por la encapsulación híbrida de la membrana y al efecto potenciador de R837. A continuación, se midió la secreción de HMGB1 y ATP en el sobrenadante de las células CT26 mediante ELISA. HMGB1 puede unirse a sus receptores correspondientes, activando así las vías de señalización relevantes y estimulando la respuesta inmunitaria sistémica. Como se muestra en la Figura 3G, el nivel de secreción de HMGB1 en el grupo de tratamiento R837@MfNP+NIR fue el más alto de todos los grupos. Como se muestra en la Figura 3H, en comparación con el grupo de control, los niveles intracelulares de ATP disminuyeron progresivamente en los grupos NP, MfNP, R837@NP y R837@MfNP bajo irradiación de NIR, lo que indicó que la terapia fototérmica no solo indujo la apoptosis/necrosis de las células de CRC, sino que también promovió la liberación de ATP intracelular, facilitando así la fagocitosis de las células apoptóticas/necróticas por los fagocitos y activando la respuesta inmunitaria específica del tumor. Estos resultados indican que el efecto de la terapia fototérmica mediada por R837@MfNP inicia la respuesta de ICD de las células de CRC para provocar la inmunidad antitumoral.

La terapia fototérmica mediada por R837@MfNP induce la maduración de las DC in vitro

Las DC son las células presentadoras de antígenos más importantes y sufren maduración tras la estimulación, lo que les permite captar y presentar los antígenos tumorales asociados (TAA) y desencadenar una respuesta inmunitaria mediada por células T ([Lien et al., 2025]; [Pittet et al., 2023]). El grado de maduración de las DC se examinó midiendo la expresión de las moléculas costimuladoras CD11c, CD80 y CD86 mediante citometría de flujo. Como se indica en las Figuras 4A-C, en comparación con el grupo de control y el tratamiento con MfNP, tanto el R837 libre como el R837@MfNP promovieron la maduración de las DC, lo que se corresponde con el hallazgo de que el R837 puede inducir la ICD. Además, después del tratamiento con R837@MfNP+NIR, la proporción de DC maduras aumentó hasta el 83,03%, lo que fue mayor que en el grupo tratado con MfNP+NIR (76,63%). Además, en comparación con los del grupo de control, los niveles de secreción de interleucina-12 (IL-12) y factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) de las DC fueron notablemente mayores en los grupos tratados con R837 libre o R837@MfNP, mientras que el grupo tratado con R837@MfNP+NIR ocupó el primer lugar (Figuras 4D y 4E), lo que fue consistente con los hallazgos obtenidos mediante citometría de flujo. Los resultados anteriores sugieren que la terapia fototérmica mediada por R837@MfNP puede inducir eficazmente la maduración de las DC in vitro.

Farmacocinética y distribución tisular de R837@MfNP in vivo

El R837, un adyuvante inmunitario, puede estimular la maduración de las DC ([Karthikeyan et al., 2023]; [Sanlorenzo et al., 2025]). Sin embargo, su rápida eliminación del organismo y su escasa solubilidad en agua limitan su eficacia en la activación inmunitaria. Aquí, se investigó la farmacocinética del R837 libre, R837@NP y R837@MfNP. Como se presenta en la Tabla 2, en comparación con el grupo de R837 libre, el tiempo de semivida de distribución (t1/2α) y el tiempo de semivida de eliminación (t1/2β) del R837 en el grupo R837@MfNP aumentaron en 0,18 h y 7,3 h, respectivamente. La tasa de eliminación (CL) del grupo de R837 libre fue 7,45 veces mayor que la del grupo R837@MfNP, lo que podría deberse al aumento de la permeabilidad y retención (EPR) y a la liberación sostenida de R837 de las nanopartículas. En comparación con los del grupo de R837 libre, el tiempo medio de retención (MRT), el área bajo la curva (AUC0-t) y los valores de AUC0-∞ del grupo R837@MfNP aumentaron notablemente en 14,28, 5,68 y 3,97 veces, respectivamente, lo que verificó el aumento significativo de la circulación sanguínea de R837@MfNP conferido por la NP y la membrana híbrida (Fig. S9).

A continuación, evaluamos más a fondo la capacidad de orientación tumoral y la biodistribución sistémica de la NP, RfNP, CfNP y MfNP in vivo mediante el control de la imagen de fluorescencia de IR775. En comparación con el IR775 libre, IR775@NP, IR775@RfNP, IR775@CfNP e IR775@MfNP en el tejido tumoral aumentaron constantemente con el tiempo, lo que indica que estas nanopartículas se dirigen eficazmente a los tumores. La intensidad de la fluorescencia en el sitio tumoral en el grupo IR775@MfNP fue notablemente mayor que en los grupos IR775@RfNP e IR775@CfNP (Figura 5A y Figura S10). Además, la imagen de fluorescencia ex vivo verificó esta tendencia (Figura 5B), lo que indica que la capacidad de orientación tumoral de IR775@MfNP fue óptima porque se heredaron las membranas de las vesículas CT26 y RAW264.7.

La resonancia magnética (RM) es una herramienta de diagnóstico médico común debido a su no invasividad y sus capacidades de alta resolución ([Hoffmann et al., 2024]; [Li et al., 2020b]). Como se ilustra en la Figura 5C, la intensidad de la señal de RM ponderada en T2 mediada por R837@MfNP disminuyó con el aumento de la concentración de Fe, lo que indica su potencial como un candidato prometedor para agentes de contraste T2 de alta eficiencia en aplicaciones de RM. Además, para evaluar su capacidad de RM in vivo, se obtuvieron imágenes de los ratones con tumores subcutáneos antes (0 h) y después (24 y 48 h) de la inyección de R837@MfNP con un escáner de RM de 3,0 T. En comparación con la imagen de RM previa a la inyección (0 h), se observó una disminución progresiva de la señal de RM ponderada en T2 en la región tumoral a las 24 h después de la inyección de R837@MfNP y se mantuvo durante al menos 48 h. Este resultado confirmó que R837@MfNP puede acumularse eficazmente en la región tumoral debido a la capacidad de orientación activa de la membrana híbrida y al efecto EPR en los tejidos tumorales (Figura 5D). Estos hallazgos destacan el potencial de R837@MfNP como agente de contraste en RM y como una nueva estrategia terapéutica para la combinación de terapia fototérmica e inmunoterapia.

Propiedades fototérmicas in vivo de R837@MfNP

También se evaluaron las propiedades de conversión fototérmica de R837@MfNP in vivo. Como se demuestra en las Figuras 5E y 5F, el grupo NP bajo irradiación de 808 nm a una densidad de potencia de 1 W/cm2 tuvo un rendimiento fototérmico adecuado, y las temperaturas locales en los sitios tumorales de R837@RfNP y R837@CfNP aumentaron bajo la irradiación de NIR. En particular, debido al aumento del enriquecimiento de la modificación de la membrana híbrida, la temperatura del grupo R837@MfNP aumentó a 55 °C después de 5 minutos de irradiación y exhibió una excelente estabilidad fototérmica durante todo el proceso. Estos datos indican que R837@MfNP tiene propiedades de conversión fototérmica sobresalientes in vivo, lo que es crucial para su posible aplicación en terapia fototérmica e inmunoterapia tumoral.

Efectos antitumorales in vivo de la terapia fototérmica mediada por R837@MfNP

Se estableció un modelo de CRC en el que se inyectaron células CT26 por vía subcutánea (s.c.) en ratones BALB/c (Figura 6A). Como se muestra en las Figuras 6B y 6C, no se observó una diferencia significativa en el volumen tumoral entre el grupo de R837 libre y el grupo de solución salina en el día 15 después de la administración. En comparación con el grupo tratado con solución salina, el crecimiento tumoral en los grupos NP+NIR y R837@RfNP+NIR se inhibió hasta cierto punto (p < 0,05, tasas de inhibición del 36,8% y el 43,9%, respectivamente). En comparación con los grupos MfNP+NIR y R837@CfNP+NIR, el grupo R837@MfNP+NIR presentó el mejor efecto terapéutico (tasa de inhibición tumoral = 87,5%) y tuvo una diferencia marcada en el volumen tumoral (p < 0,01, tasas de inhibición del 56,6% y el 60,9%, respectivamente). Las curvas de supervivencia presentadas en la Figura 6D indican que la vida útil de los ratones tratados con R837@MfNP+NIR se prolongó significativamente. Además, no hubo hemólisis de R837@MfNP (Figura S11), no hubo diferencias significativas en el peso corporal entre los grupos (Figura 6E), no hubo alteraciones patológicas discernibles en los órganos principales (Figura S12A) y no hubo alteraciones anormales en los marcadores bioquímicos (Figura S12B), lo que indica la alta biocompatibilidad y bioseguridad de estos sistemas.

Para explorar más a fondo el mecanismo subyacente a la eficacia antitumoral superior mediada por el tratamiento con R837@MfNP+NIR, se examinó posteriormente la maduración de las DC mediante la recolección de los ganglios linfáticos que drenan el tumor para el análisis de citometría de flujo. Como se muestra en las Figuras 6F y 6G, R837@MfNP mejoró la maduración de las DC hasta cierto punto en ausencia de irradiación, lo que se atribuyó al efecto inmunomodulador de R837 y al aumento de la capacidad de orientación tumoral de la membrana híbrida. Además, el tratamiento con NP+NIR aumentó eficazmente la proporción de DC maduras, lo que demostró que la terapia fototérmica puede promover la maduración de las DC. Sin embargo, la tasa de maduración de las DC en el grupo de tratamiento con NP+NIR fue menor que en el grupo de tratamiento con MfNP+NIR, lo que podría deberse a la prolongación de la retención de Fe3O4@PDA y R837 en el tejido tumoral. Además, tanto R837@RfNP como R837@CfNP promovieron significativamente la maduración de las DC. En particular, en comparación con los otros grupos, el grupo R837@MfNP+NIR demostró una mayor estimulación de la maduración de las DC, lo que se atribuyó a la favorable eficacia de ablación fototérmica de Fe3O4@PDA, la capacidad de orientación mejorada de la membrana híbrida y el efecto inmunomodulador de R837.

Más importante aún, las DC maduras desempeñan un papel clave en la presentación de antígenos asociados al tumor a los linfocitos, lo que promueve la infiltración de células T en los tejidos tumorales ([Chiang et al., 2025]; [Huynh et al., 2025b]; [Huynh et al., 2025a]; [Yu et al., 2023]). En consecuencia, se evaluó la infiltración de células T CD8+ en los tumores mediante inmunofluorescencia (IF). Como se muestra en la Figura 6H, en comparación con el grupo de solución salina, el grupo NP+NIR presentó un ligero aumento en el porcentaje de células T CD8+, lo que indica el importante papel de la terapia fototérmica en la activación inmunitaria. Como era de esperar, el grupo R837@MfNP+NIR mostró la mayor proporción de células T CD8+ en los tumores, lo que fue consistente con la tendencia hacia la maduración de las DC.

Además, los resultados de la tinción TUNEL y Ki67 de las secciones tumorales de todos los grupos fueron consistentes con los resultados anteriores. El tratamiento con R837@MfNP+NIR resultó en un área mínima de proliferación tumoral en las secciones teñidas con Ki67, y la fluorescencia roja de las secciones teñidas con TUNEL también fue la más fuerte, lo que demostró un efecto antitumoral superior. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la terapia fototérmica mediada por R837@MfNP puede promover eficazmente la maduración de las DC y potenciar las respuestas inmunitarias antitumorales mediadas por células T in vivo.

Inhibición del crecimiento tumoral distante por la terapia fototérmica mediada por R837@MfNP

Se utilizó un modelo de xenoinjerto de ratón CT26 bilateral para explorar si la terapia fototérmica mediada por R837@MfNP (PTT) podría inhibir el crecimiento de tumores distantes (no irradiados) mediante la activación de la inmunidad antitumoral (Fig. 7A). Además del efecto moderado de supresión tumoral en el grupo MfNP+NIR, el grupo R837@MfNP+NIR logró resultados favorables tanto para los tumores primarios como para los distantes (Fig. 7B-D). Además, la supervivencia de los ratones se prolongó notablemente en el grupo R837@MfNP+NIR (Fig. 7E). Además, no se observó una pérdida significativa de peso corporal durante el tratamiento (Fig. 7F). La infiltración de células T, especialmente células T CD8+, en el microambiente tumoral desempeña un papel vital en la eficacia antitumoral ([Park et al., 2023]). Para explorar aún más el mecanismo inmunitario antitumoral, se midió la infiltración de células T CD3+CD8+ y células T CD3+CD4+ en el tumor y el bazo mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 7G-L, las proporciones de células T CD8+ en el grupo MfNP+NIR (9,17%) y en el grupo R837@MfNP+NIR (33,58%) fueron mayores que en el grupo de solución salina. En contraste, los porcentajes de células T CD3+CD4+ disminuyeron relativamente, posiblemente debido al aumento de los porcentajes de células T CD3+CD8+. El bazo, como uno de los órganos inmunitarios más importantes, también tiene potentes funciones inmunitarias ([Xiong et al., 2021]). La infiltración de células T CD3+CD8+ y células T CD3+CD4+ en el bazo fue similar a la tendencia observada en los tumores. Además, la inhibición de la proliferación tumoral, la inducción de la apoptosis de las células tumorales y la infiltración de células T CD8+ en los tumores distantes se confirmaron mediante Ki67, TUNEL y tinción IF, respectivamente, lo que indica que la PTT mediada por R837@MfNP puede inhibir significativamente el crecimiento tumoral y mejorar la infiltración de células T CD8+ en los tumores (Fig. 7M-P). Además, se midieron los niveles de citocinas inflamatorias en el suero de los ratones mediante ELISA. Como se indica en la Fig. 7Q y R, los tratamientos MfNP+NIR y R837@MfNP+NIR aumentaron eficazmente los niveles de TNF-α e IFN-γ. Estos resultados indicaron que la PTT mediada por R837@MfNP no solo puede erradicar eficazmente los tumores primarios, sino también inhibir el crecimiento de las metástasis distantes, lo que destaca su potencial como estrategia terapéutica para mejorar la inmunidad sistémica contra los tumores.

La PTT mediada por R837@MfNP inhibió la metástasis pulmonar

Para examinar si la PTT mediada por R837@MfNP puede inhibir la metástasis pulmonar en ratones mediante la activación de las respuestas inmunitarias sistémicas antitumorales, se estableció un modelo de ratón CT26 de metástasis pulmonar (Fig. 8A). El grupo R837@MfNP+NIR demostró una eficacia antitumoral superior, con una tasa de inhibición tumoral del 79,7%, y prolongó la supervivencia de los ratones (Fig. 8B-D). Las lesiones metastásicas pulmonares en los ratones también se observaron después del tratamiento. Como se muestra en la Fig. 8E, la metástasis pulmonar se suprimió notablemente en el grupo R837@MfNP+NIR, con muchos menos nódulos pulmonares que en los grupos de solución salina y MfNP+NIR. Los resultados de la tinción con H&E verificaron aún más que el tratamiento con R837@MfNP+NIR disminuyó drásticamente el número y el volumen de los nódulos de metástasis pulmonar. Además, los resultados del ensayo IF indicaron que la infiltración de células T CD8+ en los nódulos pulmonares metastásicos en los tejidos tumorales aumentó en el grupo R837@MfNP+NIR (Fig. 8F-I). Estos hallazgos sugieren que la PTT mediada por R837@MfNP inhibe eficazmente la metástasis del cáncer al desencadenar respuestas inmunitarias antitumorales.

Estos resultados demostraron que la PTT mediada por R837@MfNP puede suprimir la proliferación de CRC e inducir respuestas inmunitarias antitumorales. Este estudio presentó un método para fusionar la membrana de CT26 y la membrana de vesículas extracelulares derivadas de RAW264.7, lo que resultó en un revestimiento biomimético híbrido que se aplicó con éxito a nanopartículas huecas de Fe3O4@PDA cargadas con R837, que colectivamente se denominó R837@MfNP (Esquema 1). La nanoplataforma R837@MfNP, empleada en esta estrategia terapéutica sinérgica, tiene las siguientes ventajas específicas: (1) Fe3O4@PDA sirve no solo como portador de R837, sino también como material fototérmico para la PTT. Además, se puede utilizar eficazmente para la resonancia magnética (RM) para controlar la distribución biológica de los fármacos y el proceso de tratamiento. (2) La capacidad de las membranas de las células CT26 para dirigirse a las células de CRC se debe a la adhesión dirigida homóloga, mientras que la capacidad de las membranas de vesículas extracelulares derivadas de RAW264.7 para mejorar la capacidad de escape inmunitario es notable. Por lo tanto, R837@MfNP demuestra un reconocimiento propio específico del tumor, lo que extiende sustancialmente el tiempo de circulación y aumenta la capacidad de direccionamiento in vivo. (3) Estos métodos se pueden utilizar para controlar con precisión y en tiempo real los cambios de temperatura en los tumores durante el proceso de tratamiento, maximizando el efecto de ablación térmica sobre el tumor y minimizando el daño a los tejidos sanos. (4) El adyuvante inmunitario R837 potencia el efecto antitumoral de la PTT al inducir la maduración de las células dendríticas y aumentar la infiltración de células T, lo que conduce a una mejora sinérgica de la inmunidad, lo que resulta en la inhibición del crecimiento tumoral y la prevención de la metástasis pulmonar. Por lo tanto, R837@MfNP exhibió una capacidad de escape inmunitario y direccionamiento tumoral sobresalientes. Al combinar la alta carga de R837 y las propiedades fototérmicas de Fe3O4@PDA, se puede lograr in vivo una inmunoterapia y una PTT sinérgicas para el CRC. Este sistema de administración de nanomedicamentos multifuncional supera las limitaciones de las monoterapias tradicionales, que incluyen bajas tasas de respuesta y susceptibilidad a la recurrencia y metástasis tumoral. Múltiples estudios han indicado que el sistema de nanomedicamentos logra efectos espacio-temporales sinérgicos entre la PTT y la inmunoterapia. Al regular el microambiente tumoral, este enfoque mejora la infiltración de células T y activa continuamente la respuesta inmunitaria, inhibiendo eficazmente el crecimiento y la metástasis del tumor ([Chiang et al., 2025]; [Huynh et al., 2025b]; [Huynh et al., 2025a]; [Lien et al., 2025]; [Minini et al., 2025]). Esta dirección de investigación interdisciplinaria impulsa los tratamientos hacia una mayor eficacia, una toxicidad reducida y efectos terapéuticos prolongados.

Preparación y caracterización de R837@MfNP

La construcción de R837@MfNP incluyó tres pasos: (1) preparación de nanopartículas de Fe3O4 modificadas con PDA cargadas con R837 (R837@NP), (2) obtención de una membrana de fusión mixta (Mf) de membranas de CT26 (Cm) y membranas de vesículas extracelulares derivadas de RAW264.7 (Rm), y (3) recubrimiento de Mf sobre R837@NP (R837@MfNP) (Fig. S1). Para validar la fusión entre los dos tipos de membranas, se utilizó la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). Como se muestra en la Fig. 1A, un aumento en la proporción de Cm condujo a una disminución en la intensidad de fluorescencia a 590 nm (PE-RhB) y a una recuperación concomitante en la intensidad de fluorescencia a 535 nm (PE-NBD). Esta observación indicó que la incorporación de Cm atenuó la interacción FRET entre PE-NBD y PE-RhB, lo que confirmó que Cm y Rm se fusionaron. Además, para demostrar aún más la fusión exitosa de Cm con Rm para formar membranas híbridas, Cm y Rm se etiquetaron con los colorantes fluorescentes DiO y DiI, respectivamente, antes de mezclarlos. Posteriormente, se monitoreó la captación de MfNP por las células CT26 utilizando CLSM. Como se muestra en la Fig. 1B, se observó fluorescencia verde proveniente de DiO y fluorescencia roja de DiI dentro de las células CT26. Esta importante superposición de fluorescencia indicó claramente que los diferentes tipos de membranas se mezclaron con éxito. El MfNP resultante, con una relación de peso de proteínas de Rm a Cm de 1:3, se utilizó para experimentos posteriores.

La capacidad de escape inmunitario y el direccionamiento homólogo se atribuyen principalmente a los diversos antígenos presentes en estos dos tipos de membranas celulares. El análisis de proteínas SDS-PAGE reveló que MfNP posee las características tanto de las membranas de CT26 como de las membranas de vesículas extracelulares derivadas de RAW264.7. Como se ilustra en la Fig. 1C, MfNP presentó de hecho bandas de proteínas características heredadas tanto de Cm como de Rm, lo que implicó la fusión exitosa de Cm y Rm en la membrana híbrida. El análisis de Western blot verificó aún más que MfNP expresó los marcadores de Cm E-caderina y CD47, los marcadores de VE CD9 y el marcador de macrófagos F4/80 (Fig. S2).

La Tabla 1 resume el tamaño de partícula, el potencial zeta, el índice de polidispersidad (PDI) y la eficiencia de carga de fármacos (LE) de las diversas nanopartículas. R837 es capaz de unirse covalentemente a Fe₃O₄@PDA a través de sus grupos amino inherentes mediante una reacción de Schiff, o puede adsorberse en la superficie de Fe₃O₄@PDA a través de interacciones no covalentes, como el apilamiento π-π y los enlaces de hidrógeno. Tras la carga con R837, el tamaño de R837@NP aumentó ligeramente a 121,5 ± 1,9 nm, y el potencial zeta se desplazó a -22,3 ± 1,5 mV (Fig. 1D y E). La carga negativa en la superficie de R837@NP repele la carga negativa de la membrana compuesta, lo que garantiza que las proteínas de la membrana estén orientadas hacia el exterior y estén bien recubiertas en la superficie de las nanopartículas bajo tratamiento ultrasónico. Se utilizó microscopía electrónica de transmisión (MET) para examinar la morfología de las nanopartículas, como se muestra en la Fig. 1F y la Fig. S3. R837@MfNP mostró una estructura de núcleo-cáscara distinta, una forma esférica y una buena dispersión, con un tamaño de partícula de 136,0 ± 2,0 nm, un potencial zeta de -15,7 ± 0,8 mV y un PDI de 0,18 ± 0,03.

Como se muestra en la Fig. 1G, el perfil de liberación in vitro de fármacos de R837@MfNP se evaluó en diversas condiciones de pH (pH 5,5 y pH 6,8). Cuando se sometió a irradiación con láser NIR, la tasa de liberación de R837 en el tampón de pH 5,5 después de 48 horas fue notablemente mayor, del 68,5%, que en el tampón de pH 6,8, del 16,8%. Esta liberación de fármacos dependiente del pH se puede atribuir a la protonación de los grupos amino en PDA en condiciones ácidas, lo que interrumpe las interacciones de apilamiento π-π entre R837 y PDA. Además, R837, una base débil con un pKa de 7,3, es más soluble en ambientes ácidos que a pH fisiológico (Fig. S4). Además, la irradiación con láser NIR mejoró significativamente la liberación de R837, probablemente debido a la conversión de la energía de la luz en calor por MfNP bajo la irradiación NIR. Este aumento de la temperatura de la solución local interrumpe los enlaces de hidrógeno entre R837 y PDA y promueve el movimiento térmico molecular, lo que conduce a la rápida liberación de R837.

Además, la estabilidad de R837@MfNP se evaluó monitoreando los cambios en el tamaño de partícula utilizando la dispersión de luz dinámica (DLS). Como se muestra en la Fig. 1H y la Fig. S5, no se detectó ninguna fluctuación evidente en el tamaño de partícula de R837@MfNP durante la incubación durante 14 días en PBS y 10% FBS, lo que confirmó la alta estabilidad de R837@MfNP.

Rendimiento de conversión fototérmica y rendimiento de RM de R837@MfNP

Una capacidad de conversión fototérmica superior y una estabilidad fototérmica son cruciales para la aplicación de nanomateriales fototérmicos en la ablación tumoral ([Aboeleneen et al., 2022]). El efecto fototérmico in vitro de R837@MfNP se evaluó utilizando una cámara térmica infrarroja. Como se muestra en la Fig. 2A-C, en comparación con el grupo de control, el efecto fototérmico de R837@MfNP (50, 100, 200 y 400 μg/mL) aumentó gradualmente con el aumento de las concentraciones de R837@NP cargado en la mezcla. En particular, la temperatura de R837@MfNP (400 μg/mL) aumentó a 49 °C en 5 minutos después de la irradiación con láser de 808 nm, lo que indica su capacidad de conversión fototérmica superior. Además, durante los cinco ciclos de irradiación con láser encendido y apagado, la temperatura de R837@MfNP (400 μg/mL) aumentó repetidamente a aproximadamente 49 °C, similar a la del primer ciclo, lo que indica una excelente estabilidad fototérmica (Fig. 2D-E y Fig. S6). La eficiencia de conversión fototérmica de R837@MfNP alcanzó el 35,6%.

La resonancia magnética (RM) es una de las herramientas de diagnóstico médico más utilizadas, debido a su carácter no invasivo y a sus capacidades tomográficas ([Li et al., 2020b]). Los nanosistemas basados en Fe₃O₄ pueden funcionar como agentes de contraste para RM ponderada en T₂ ([Zhao et al., 2024a]). Como se muestra en la Fig. 2F, se midieron los bucles de histéresis de Fe₃O₄ y R837@MfNP a 300 K, y ambos materiales mostraron una remanencia y coercitividad nulas, lo que indica que R837@MfNP presenta un comportamiento superparamagnético. La magnetización de saturación de Fe₃O₄ se registró en 59,66 emu/g, mientras que la de R837@MfNP fue de 50,94 emu/g. Aunque se produjo una disminución de la magnetización de saturación de Fe₃O₄ tras la encapsulación con PDA y la membrana híbrida, el valor siguió siendo suficiente para aplicaciones de RM in vivo. Además, R837@MfNP se pudo atraer fácilmente con un imán y redispersar en 30 s después de una agitación suave (Fig. 2G). Los datos anteriores indicaron que R837@MfNP podría utilizarse como agente de contraste en RM y como fuente de calor en la terapia fototérmica localizada (PTT).

Captación celular de MfNP

Este estudio exploró además la captación celular de MfNP por las células CT26 utilizando microscopía de fluorescencia. MfNP se etiquetó con la cumarina 6 (C6) para el seguimiento visual. Como se muestra en la Fig. S7, en comparación con el grupo de C6 libre, C6@CfNP exhibió una intensidad de fluorescencia más fuerte debido a la capacidad de adhesión homotípica de la membrana CT26. En particular, en comparación con los tratamientos con C6@RfNP y C6@CfNP, la intensidad de fluorescencia del tratamiento con C6@MfNP fue la más alta, lo que demuestra una mayor eficiencia de captación debido a la capacidad de la membrana CT26 y la membrana de vesículas extracelulares derivadas de macrófagos Raw 264.7 para dirigirse entre sí dos veces más (Fig. S7). Estos hallazgos sugieren que MfNP sirve como una plataforma nanoeficaz para dirigirse a las células de CRC.

Toxicidad fototérmica de la PTT mediada por R837@MfNP en células de CRC

Los efectos citotóxicos de la PTT mediada por R837 y R837@MfNP sobre las células de CRC se evaluaron mediante un ensayo CCK-8. En primer lugar, la citotoxicidad de R837 aumentó ligeramente con el aumento de la concentración de R837, y la viabilidad de CT26 fue de aproximadamente el 85,9% cuando la dosis de R837 fue de 40 μg/mL, lo que demuestra que R837 tiene casi ninguna toxicidad evidente para las células tumorales. Además, las células incubadas con MfNP sin exposición a NIR tuvieron una alta tasa de supervivencia (89,7%), incluso a 400 μg/mL, lo que indicó que MfNP tiene una buena biocompatibilidad (Fig. S8). Además, las células CT26 se trataron con NP, MfNP, R837@NP o R837@MfNP a varias concentraciones (0, 50, 100 o 200 μg/mL) con o sin irradiación NIR, seguido de una incubación de 24 h. Como se muestra en la Fig. 3A, los resultados revelaron que ni NP, ni MfNP, ni R837@NP, ni R837@MfNP a diferentes concentraciones exhibieron una toxicidad significativa para las células CT26 sin exposición a la luz. Sin embargo, estas nanopartículas inhibieron significativamente la proliferación de las células CT26 de forma dependiente de la concentración bajo exposición a la luz (Fig. 3B). Estos resultados aclaran que R837@MfNP tiene excelentes propiedades de PTT in vitro.

Se realizó un ensayo de doble tinción con calceína-AM/PI para evaluar la apoptosis/necrosis de las células CT26 inducida por la PTT mediada por R837@MfNP. Como se muestra en la Fig. 3C y D, las células tratadas con NP, MfNP, R837@NP y R837@MfNP que no fueron irradiadas mostraron fluorescencia verde, lo que confirmó la no toxicidad de estas nanopartículas. En contraste, las células CT26 tratadas con estas nanopartículas bajo irradiación NIR presentaron una fluorescencia roja evidente dentro de las células. Además, la fluorescencia roja más brillante se observó en el grupo R837@MfNP+NIR, lo que sugirió que la excelente eficacia antitumoral podría deberse a la PTT y al tratamiento inmunostimulante sinérgicos. Estos hallazgos fueron coherentes con los resultados del ensayo CCK-8. Estos resultados indican que la PTT mediada por R837@MfNP indujo eficazmente la apoptosis/necrosis en las células de CRC, lo que demuestra potentes efectos antitumorales.

La PTT mediada por R837@MfNP induce la ICD en las células de CRC

La PTT no solo erradica directamente las células tumorales mediante la hipertermia, sino que también desencadena la liberación de antígenos asociados al tumor, como los DAMP, que posteriormente activan tanto las respuestas inmunitarias innatas como adaptativas antitumorales ([Yang et al., 2022]). Para explorar si la PTT mediada por R837@MfNP podría inducir la ICD, que se caracteriza por la liberación de DAMP, se midieron las señales inmunogénicas, incluido HMGB1, ATP y CRT. La exposición de CRT en las superficies de las membranas de las células CT26 sirve como una señal de "cómeme", lo que promueve la fagocitosis de las células tumorales por las células dendríticas (CD) y facilita la maduración de las CD para realizar funciones inmunitarias. Como se ilustra en la Fig. 3E y F, en comparación con los otros grupos, el grupo R837@MfNP presentó la mayor expresión de CRT en la superficie celular después de la exposición a la luz, lo que podría atribuirse al aumento de la captación celular de nanopartículas facilitada por la encapsulación de la membrana híbrida y el efecto potenciador de R837. A continuación, se midió la secreción de HMGB1 y ATP en el sobrenadante de las células CT26 mediante ELISA. HMGB1 puede unirse a sus receptores correspondientes, activando así las vías de señalización relevantes y estimulando la respuesta inmunitaria sistémica. Como se muestra en la Fig. 3G, el nivel de secreción de HMGB1 en el grupo de tratamiento con R837@MfNP+NIR fue el más alto entre todos los grupos. Como se muestra en la Fig. 3H, en comparación con el grupo de control, los niveles intracelulares de ATP disminuyeron progresivamente en los grupos NP, MfNP, R837@NP y R837@MfNP bajo irradiación NIR, lo que indicó que la PTT no solo indujo la apoptosis/necrosis de las células de CRC, sino que también promovió la liberación de ATP intracelular, facilitando así la fagocitosis de las células apoptóticas/necróticas por los fagocitos y activando la respuesta inmunitaria específica del tumor. Estos resultados indican que el efecto de la PTT mediada por R837@MfNP inicia la respuesta de ICD de las células de CRC para provocar la inmunidad antitumoral.

La PTT mediada por R837@MfNP induce la maduración de las CD in vitro

Las CD son las células presentadoras de antígenos más importantes y se someten a maduración tras la estimulación, lo que les permite captar y presentar los antígenos tumorales asociados (ATA) y desencadenar una respuesta inmunitaria mediada por células T ([Lien et al., 2025]; [Pittet et al., 2023]). El grado de maduración de las CD se examinó midiendo la expresión de las moléculas costimuladoras CD11c, CD80 y CD86 mediante citometría de flujo. Como se indica en la Fig. 4A-C, en comparación con el grupo de control y el tratamiento con MfNP, tanto R837 libre como R837@MfNP promovieron la maduración de las CD, lo que se corresponde con el hallazgo de que R837 puede inducir la ICD. Además, después del tratamiento con R837@MfNP+NIR, la proporción de CD maduras aumentó hasta el 83,03%, lo que fue mayor que en el grupo tratado con MfNP+NIR (76,63%). Además, en comparación con el grupo de control, los niveles de secreción de interleucina-12 (IL-12) y factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) de las CD fueron notablemente mayores en los grupos tratados con R837 libre o R837@MfNP, mientras que el grupo tratado con R837@MfNP+NIR ocupó el primer lugar (Fig. 4D y E), lo que fue coherente con los hallazgos obtenidos mediante citometría de flujo. Los resultados anteriores implican que la PTT mediada por R837@MfNP puede inducir eficazmente la maduración de las CD in vitro.

Farmacocinética y distribución tisular de R837@MfNP in vivo

R837, un adyuvante inmunitario, puede estimular la maduración de las CD ([Karthikeyan et al., 2023]; [Sanlorenzo et al., 2025]). Sin embargo, su rápida eliminación del organismo y su escasa solubilidad en agua limitan su eficacia en la activación inmunitaria. Aquí, se investigó la farmacocinética de R837 libre, R837@NP y R837@MfNP. Como se presenta en la Tabla 2, en comparación con el grupo de R837 libre, el tiempo de semivida de distribución (t1/2α) y el tiempo de semivida de eliminación (t1/2β) de R837 en el grupo R837@MfNP aumentaron en 0,18 h y 7,3 h, respectivamente. La tasa de eliminación (CL) del grupo de R837 libre fue 7,45 veces mayor que la del grupo R837@MfNP, lo que podría deberse al aumento de la permeabilidad y retención (EPR) y a la liberación sostenida de R837 de las nanopartículas. En comparación con el grupo de R837 libre, el tiempo medio de retención (MRT), el área bajo la curva (AUC0-t) y los valores de AUC0-∞ del grupo R837@MfNP aumentaron notablemente en 14,28, 5,68 y 3,97 veces, respectivamente, lo que verificó el aumento significativo de la circulación sanguínea de R837@MfNP conferido por la NP y la membrana híbrida (Fig. S9).

A continuación, evaluamos aún más la capacidad de orientación tumoral y la biodistribución sistémica de NP, RfNP, CfNP y MfNP in vivo mediante imágenes de fluorescencia con IR775. En comparación con IR775 libre, IR775@NP, IR775@RfNP, IR775@CfNP e IR775@MfNP en el tejido tumoral aumentaron constantemente con el tiempo, lo que indica que estas nanopartículas se dirigen eficazmente a los tumores. La intensidad de fluorescencia en el sitio tumoral en el grupo IR775@MfNP fue notablemente mayor que en los grupos IR775@RfNP e IR775@CfNP (Fig. 5A y Fig. S10). Además, las imágenes de fluorescencia ex vivo verificaron esta tendencia (Fig. 5B), lo que indica que la capacidad de orientación tumoral de IR775@MfNP fue óptima porque las membranas de CT26 y RAW264.7 se heredaron.

La RM es una herramienta de diagnóstico médico común debido a su carácter no invasivo y a sus capacidades de alta resolución ([Hoffmann et al., 2024]; [Li et al., 2020b]). Como se ilustra en la Fig. 5C, la intensidad de la señal de RM ponderada en T2 mediada por R837@MfNP disminuyó con el aumento de la concentración de Fe, lo que indica su potencial como un candidato prometedor para agentes de contraste T2 de alta eficiencia en aplicaciones de RM. Además, para evaluar su capacidad de RM in vivo, se obtuvieron imágenes de ratones con tumores subcutáneos antes (0 h) y después (24 y 48 h) de la inyección de R837@MfNP con un escáner de RM de 3,0 T. En comparación con la imagen de RM previa a la inyección (0 h), se observó una disminución progresiva de la señal de RM ponderada en T₂ en la región tumoral a las 24 h después de la inyección de R837@MfNP y se mantuvo durante al menos 48 h. Este resultado confirmó que R837@MfNP puede acumularse eficazmente en la región tumoral debido a la capacidad de orientación activa de la membrana híbrida y al efecto EPR en los tejidos tumorales (Fig. 5D). Estos hallazgos destacan el potencial de R837@MfNP como agente de contraste en RM y como una nueva estrategia terapéutica para la combinación de PTT e inmunoterapia.

Propiedades fototérmicas in vivo de R837@MfNP

También se evaluaron las propiedades de conversión fototérmica de R837@MfNP in vivo. Como se demuestra en la Fig. 5E y F, el grupo NP bajo irradiación de 808 nm a una densidad de potencia de 1 W/cm2 tuvo un rendimiento fototérmico adecuado, y las temperaturas locales en los sitios tumorales de R837@RfNP y R837@CfNP aumentaron bajo irradiación NIR. En particular, debido al aumento del enriquecimiento de la modificación de la membrana híbrida, la temperatura del grupo R837@MfNP aumentó a 55 °C después de 5 min de irradiación y exhibió una excelente estabilidad fototérmica durante todo el proceso. Estos datos indican que R837@MfNP tiene excelentes propiedades de conversión fototérmica in vivo, lo que es crucial para su potencial aplicación en PTT e inmunoterapia tumoral.

Efectos antitumorales in vivo de la PTT mediada por R837@MfNP

Se estableció un modelo de CRC en el que se inyectaron ratones BALB/c por vía subcutánea (s.c.) con células CT26 (Fig. 6A). Como se muestra en las Figuras 6B y 6C, no se observó una diferencia significativa en el volumen tumoral entre el grupo tratado con R837 libre y el grupo control (salina) en el día 15 después de la administración. En comparación con el grupo tratado con salina, el crecimiento tumoral en los grupos NP + NIR y R837@RfNP + NIR se inhibió hasta cierto punto (p < 0,05, tasas de inhibición del 36,8% y el 43,9%, respectivamente). En comparación con los grupos MfNP + NIR y R837@CfNP + NIR, el grupo R837@MfNP + NIR presentó el mejor efecto terapéutico (tasa de inhibición tumoral = 87,5%) y mostró una diferencia marcada en el volumen tumoral (p < 0,01, tasas de inhibición del 56,6% y el 60,9%, respectivamente). Las curvas de supervivencia presentadas en la Fig. 6D indican que la esperanza de vida de los ratones tratados con R837@MfNP + NIR se prolongó significativamente. Además, no hubo hemólisis de R837@MfNP (Fig. S11), no hubo diferencias significativas en el peso corporal entre los grupos (Fig. 6E), no hubo cambios patológicos discernibles en los órganos principales (Fig. S12A) y no hubo alteraciones anormales en los marcadores bioquímicos (Fig. S12B), lo que indica la alta biocompatibilidad y bioseguridad de estos sistemas.

Para explorar aún más el mecanismo subyacente a la eficacia antitumoral superior mediada por el tratamiento con R837@MfNP + NIR, se examinó posteriormente la maduración de las células dendríticas (DC) mediante la recolección de los ganglios linfáticos que drenan el tumor para el análisis de citometría de flujo. Como se muestra en las Figuras 6F y 6G, R837@MfNP mejoró la maduración de las DC hasta cierto punto en ausencia de irradiación, lo que se atribuyó al efecto inmunomodulador de R837 y a la mayor capacidad de orientación tumoral de la membrana híbrida. Además, el tratamiento con NP + NIR aumentó eficazmente la proporción de DC maduras, lo que demostró que la terapia fototérmica (PTT) puede promover la maduración de las DC. Sin embargo, la tasa de maduración de las DC en el grupo de tratamiento con NP + NIR fue menor que en el grupo de tratamiento con MfNP + NIR, lo que podría deberse a la prolongada retención de Fe3O4@PDA y R837 en el tejido tumoral. Además, tanto R837@RfNP como R837@CfNP promovieron significativamente la maduración de las DC. En particular, en comparación con los otros grupos, el grupo R837@MfNP + NIR demostró una mayor estimulación de la maduración de las DC, lo que se atribuyó a la favorable eficacia de ablación fototérmica de Fe3O4@PDA, la mayor capacidad de orientación de la membrana híbrida y el efecto inmunomodulador de R837.

Más importante aún, las DC maduras desempeñan un papel clave en la presentación de antígenos asociados al tumor a los linfocitos, promoviendo así la infiltración de células T en los tejidos tumorales ([Chiang et al., 2025]; [Huynh et al., 2025b]; [Huynh et al., 2025a]; [Yu et al., 2023]). En consecuencia, se evaluó la infiltración de células T CD8+ en los tumores mediante inmunohistoquímica (IH). Como se muestra en la Fig. 6H, en comparación con el grupo control (salina), el grupo NP + NIR presentó un ligero aumento en el porcentaje de células T CD8+, lo que indica el importante papel de la PTT en la activación inmunitaria. Como era de esperar, el grupo R837@MfNP + NIR mostró la mayor proporción de células T CD8+ en los tumores, lo que fue consistente con la tendencia hacia la maduración de las DC.

Además, los resultados de la tinción TUNEL y Ki67 de las secciones tumorales de todos los grupos fueron consistentes con los resultados anteriores. El tratamiento con R837@MfNP + NIR resultó en un área mínima de proliferación tumoral en las secciones teñidas con Ki67, y la fluorescencia roja de las secciones teñidas con TUNEL también fue la más intensa, lo que demostró un efecto antitumoral superior. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la PTT mediada por R837@MfNP puede promover efectivamente la maduración de las DC y potenciar las respuestas inmunitarias antitumorales mediadas por células T in vivo.

Inhibición del crecimiento tumoral distante mediante la PTT mediada por R837@MfNP

Se utilizó un modelo de xenoinjerto bilateral de CT26 en ratones para explorar si la PTT mediada por R837@MfNP podría inhibir el crecimiento de tumores distantes (no irradiados) mediante la activación de la inmunidad antitumoral (Fig. 7A). Además del efecto moderado de supresión tumoral en el grupo MfNP + NIR, el grupo R837@MfNP + NIR logró resultados favorables tanto para los tumores primarios como para los distantes (Fig. 7B-D). Además, la supervivencia de los ratones se prolongó notablemente en el grupo R837@MfNP + NIR (Fig. 7E). Además, no hubo una pérdida significativa de peso corporal durante el tratamiento (Fig. 7F). La infiltración de células T, especialmente células T CD8+, en el microambiente tumoral desempeña un papel vital en la eficacia antitumoral ([Park et al., 2023]). Para explorar aún más el mecanismo inmunitario antitumoral, se midió la infiltración de células T CD3+CD8+ y células T CD3+CD4+ en el tumor y el bazo mediante citometría de flujo. Como se muestra en las Figuras 7G-L, las proporciones de células T CD8+ en el grupo MfNP + NIR (9,17%) y el grupo R837@MfNP + NIR (33,58%) fueron mayores que en el grupo control (salina). En contraste, los porcentajes de células T CD3+CD4+ disminuyeron relativamente, posiblemente debido al aumento de los porcentajes de células T CD3+CD8+. El bazo, como uno de los órganos inmunitarios más importantes, también tiene potentes funciones inmunitarias ([Xiong et al., 2021]). La infiltración de células T CD3+CD8+ y células T CD3+CD4+ en el bazo fue similar a la tendencia observada en los tumores. Además, la inhibición de la proliferación tumoral, la inducción de la apoptosis de las células tumorales y la infiltración de células T CD8+ en los tumores distantes se confirmaron mediante la tinción con Ki67, TUNEL e IH, respectivamente, lo que indica que la PTT mediada por R837@MfNP puede inhibir significativamente el crecimiento tumoral y mejorar la infiltración de células T CD8+ en los tumores (Fig. 7M-P). Además, se midieron los niveles de citocinas inflamatorias en el suero de los ratones mediante ELISA. Como se indica en las Figuras 7Q y 7R, los tratamientos con MfNP + NIR y R837@MfNP + NIR aumentaron eficazmente los niveles de TNF-α e IFN-γ. Estos resultados indicaron que la PTT mediada por R837@MfNP no solo puede erradicar eficazmente los tumores primarios, sino también inhibir el crecimiento de las metástasis distantes, lo que destaca su potencial como una estrategia terapéutica para mejorar la inmunidad sistémica contra los tumores.

La PTT mediada por R837@MfNP inhibió la metástasis pulmonar

Para examinar si la PTT mediada por R837@MfNP podría inhibir la metástasis pulmonar en ratones mediante la activación de las respuestas inmunitarias antitumorales sistémicas, se estableció un modelo de metástasis pulmonar de CT26 en ratones (Fig. 8A). El grupo R837@MfNP + NIR demostró una eficacia antitumoral superior, con una tasa de inhibición tumoral del 79,7%, y prolongó la supervivencia de los ratones (Fig. 8B-D). Las lesiones metastásicas pulmonares en los ratones también se observaron después del tratamiento. Como se muestra en la Fig. 8E, la metástasis pulmonar se suprimió notablemente en el grupo R837@MfNP + NIR, con muchos menos nódulos pulmonares que en los grupos control (salina) y MfNP + NIR. Los resultados de la tinción con H&E verificaron aún más que el tratamiento con R837@MfNP + NIR disminuyó drásticamente el número y el volumen de los nódulos de metástasis pulmonar. Además, los resultados del ensayo de IH indicaron que la infiltración de células T CD8+ en los nódulos metastásicos pulmonares en los tejidos tumorales aumentó en el grupo R837@MfNP + NIR (Fig. 8F-I). Estos hallazgos sugieren que la PTT mediada por R837@MfNP inhibe eficazmente la metástasis del cáncer al desencadenar las respuestas inmunitarias antitumorales.

Estos resultados demostraron que la PTT mediada por R837@MfNP puede suprimir la proliferación de CRC e inducir las respuestas inmunitarias antitumorales. Este estudio presentó un método para fusionar la membrana de CT26 y la membrana de vesículas extracelulares derivadas de RAW264.7, lo que resultó en un revestimiento biomimético híbrido que se aplicó con éxito a nanopartículas huecas de Fe3O4@PDA cargadas con R837, que se denominaron colectivamente R837@MfNP (Esquema 1). La nanoplataforma R837@MfNP, empleada en esta estrategia terapéutica sinérgica, tiene las siguientes ventajas específicas: (1) Fe3O4@PDA sirve no solo como portador de R837, sino también como material fototérmico para la PTT. Además, se puede utilizar eficazmente para la resonancia magnética (RM) para controlar la distribución biológica de los fármacos y el proceso de tratamiento. (2) La capacidad de las membranas de células CT26 para dirigirse a las células de CRC se debe a la adhesión dirigida homóloga, mientras que la capacidad de las membranas de vesículas extracelulares derivadas de RAW264.7 para mejorar la capacidad de escape inmunitario es notable. Por lo tanto, R837@MfNP demuestra un reconocimiento propio específico del tumor, lo que extiende sustancialmente el tiempo de circulación y aumenta la capacidad de orientación in vivo. (3) Estos métodos se pueden utilizar para controlar con precisión y en tiempo real los cambios de temperatura en los tumores durante el proceso de tratamiento, maximizando el efecto de ablación térmica sobre el tumor y minimizando el daño a los tejidos sanos. (4) El adyuvante inmunitario R837 potencia el efecto antitumoral de la PTT al inducir la maduración de las DC y aumentar la infiltración de células T, logrando así una mejora inmunitaria sinérgica, lo que conduce a la inhibición del crecimiento tumoral y la prevención de la metástasis pulmonar. Por lo tanto, R837@MfNP exhibió una capacidad de escape inmunitario y una capacidad de orientación tumoral sobresalientes. Al combinar la alta carga de R837 y las propiedades fototérmicas de Fe3O4@PDA, se puede lograr in vivo una inmunoterapia y una PTT sinérgicas para el CRC. Este sistema de administración de nanomedicamentos multifuncional supera las limitaciones de las monoterapias tradicionales, que incluyen bajas tasas de respuesta y susceptibilidad a la recurrencia y la metástasis tumoral. Múltiples estudios han indicado que el sistema de nanomedicamentos logra efectos espacio-temporales sinérgicos entre la PTT y la inmunoterapia. Al regular el microambiente tumoral, este enfoque mejora la infiltración de células T y activa continuamente la respuesta inmunitaria, inhibiendo así eficazmente el crecimiento tumoral y la metástasis ([Chiang et al., 2025]; [Huynh et al., 2025b]; [Huynh et al., 2025a]; [Lien et al., 2025]; [Minini et al., 2025]). Esta dirección de investigación interdisciplinaria impulsa los tratamientos hacia una mayor eficacia, una menor toxicidad y efectos terapéuticos más prolongados.

Conclusión

En resumen, se construyó con éxito un sistema de administración de nanopartículas de Fe₃O₄ modificadas con PDA con un revestimiento de membrana híbrida biomimética (R837@MfNP). Este innovador nanosistema fototérmico puede dirigirse activamente a los tejidos tumorales, aprovechando los atributos de orientación homóloga y la prolongación de la circulación de la membrana celular híbrida. Tras la exposición a la luz NIR, R837@MfNP ablata eficazmente los tumores primarios, genera TAAs que inducen la ICD de las células tumorales y libera el adyuvante inmunitario R837. El R837 liberado estimula aún más la maduración de las DC, activando sinérgicamente las respuestas inmunitarias antitumorales mediadas por células T. Este sistema multifuncional no solo se dirige y destruye los tumores primarios, sino que también tiene el potencial de inhibir el crecimiento de tumores distantes y prevenir la metástasis pulmonar, ofreciendo una nueva estrategia para el tratamiento sinérgico del CRC mediante la combinación de inmunoterapia y PTT. Este enfoque representa una vía prometedora para mejorar la eficacia del tratamiento del cáncer y mejorar los resultados de los pacientes.

Declaración de contribución de autoría CRediT

Yuan Zhu: Validación, Software, Metodología, Curación de datos. Yishu Lin: Metodología, Investigación. Tao Wang: Metodología, Curación de datos. Wanyi Liu: Software, Curación de datos. Qi Xia: Validación, Metodología, Curación de datos. Yuanye Jiang: Software, Metodología. Yan Zhao: Software, Metodología. Hongtao Wang: Software, Metodología. Chuanhe Xia: Software, Metodología. Jiafeng Zou: Validación, Metodología. Peihao Yin: Recursos. Feng Gao: Validación, Supervisión, Recursos, Conceptualización. Zeting Yuan: Redacción: revisión y edición, Redacción: borrador original, Validación, Recursos, Adquisición de financiación, Curación de datos.

Declaración de conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses financiero o personal conocido que pueda haber influido en el trabajo presentado en este artículo.