Las mutaciones asociadas a la colibactina en el colon humano parecen reflejar la anatomía y la exposición temprana, y no la oncogénesis.

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común y la segunda causa principal de muerte por cáncer a nivel mundial, y se prevé que su incidencia aumente en un 60 % en los países en desarrollo para 2030.^[1] Aunque la mortalidad por CCR ha disminuido en las últimas décadas en personas mayores de 50 años, la incidencia y la mortalidad han aumentado en pacientes más jóvenes, que a menudo presentan peores pronósticos, en parte debido a la detección tardía.^[2],^[3] Entre 2004 y 2014, la mortalidad por CCR de inicio temprano (es decir, antes de los 50 años) aumentó anualmente entre un 0,9 y un 1,9 %, según la década de vida.^[4] Se ha insistido repetidamente en la necesidad de reducir la edad inicial recomendada para la detección mediante colonoscopia,^[5] pero persisten limitaciones en la aplicación clínica debido a las incertidumbres sobre la progresión de la enfermedad.^[6],^[7] Sin herramientas para determinar los pronósticos específicos de cada paciente a partir de los hallazgos colonoscópicos premalignos, no podemos ajustar los regímenes de detección para abordar las necesidades clínicas. En cambio, corremos el riesgo de generar cargas clínicas insostenibles tanto para los profesionales de la salud como para los pacientes, desperdicio de recursos^[8] y, en casos raros, daño al paciente.

Por lo tanto, es crucial comprender los procesos patogénicos que subyacen al CCR de inicio temprano para mejorar la información que se proporciona a los esfuerzos clínicos preventivos y pronósticos.^[9] La investigación clínica reciente ha demostrado que los casos esporádicos de inicio temprano en los Estados Unidos son más comunes en el colon distal o "izquierdo".^[10] De manera similar, una visión general mundial del cáncer colorrectal reveló que el CCR de inicio temprano está enriquecido 1,88 veces en el colon/recto distal.^[11] Se especula que el aumento de la incidencia de CCR del lado izquierdo en los casos de inicio temprano refleja la evolución de los factores ambientales asociados con la industrialización, aunque la etiología de la enfermedad regional sigue sin estar clara.^[12] Esta laguna de conocimiento es particularmente significativa, dado el regionalización bien establecida del CCR: la ubicación del tumor se ha utilizado como un sustituto de varios atributos patológicos, como la morfología neoplásica y el pronóstico clínico.^[13]–^[15] Los subtipos de CCR también difieren según los factores genéticos, como las mutaciones impulsoras y la inestabilidad de microsatélites,^[16] que a su vez están fuertemente asociados con el sitio anatómico.^[17]–^[19] Por lo tanto, comprender la mutagénesis regional en el contexto de la presentación regional de la enfermedad podría aclarar la etiología del CCR, particularmente para la enfermedad de inicio temprano, donde el enriquecimiento en el colon distal sigue siendo inexplicado a nivel mecanístico.

Se propone estudiar el mosaicismo somático en tejidos sanos o pre-enfermedades para mejorar la comprensión del desarrollo de la enfermedad.^[20],^[21] Evaluar el colon premaligno es especialmente prometedor, dada la tumorigénesis gradual observada en el CCR: aunque los umbrales de mutación exactos y las transiciones biológicas aún se están caracterizando,^[22],^[23], se sabe que el CCR progresa de manera gradual. Los criptas del colon, estructuras de aproximadamente 2000 células que comprenden el epitelio absortivo del colon, se desregulan y forman pólipos adenomatosos,^[24] que confieren riesgo de enfermedad y pueden progresar a cáncer con el tiempo si no se tratan.^[25] Si bien las colonoscopias facilitan el descubrimiento y la eliminación de pólipos adenomatosos, y los exámenes futuros se basan en el tamaño y la morfología de los pólipos^[26], existe evidencia creciente de que incluso los tejidos "normales" albergan mutaciones asociadas con la enfermedad eventual.^[27],^[28] Si podemos comprender qué mutaciones predisponen a un tejido a la carcinogénesis y cuáles se toleran a largo plazo, podemos diseñar estrategias clínicas que sean más sensibles al riesgo de enfermedad y capaces de proporcionar pronósticos personalizados, reduciendo así la carga clínica y económica de la incertidumbre actual en el cribado. Sin embargo, los trabajos anteriores que evalúan el panorama mutacional del colon premaligno se han realizado a nivel de órgano,^[6],^[7],^[29], a pesar de la importancia clínica de las regiones anatómicas en el CCR. Determinar los patrones regionales de mutagénesis en el colon premaligno puede revelar las etiologías de la mutación que subyacen al CCR regional, lo que a su vez podría dilucidar los factores involucrados en los casos de CCR de inicio temprano enriquecidos en el lado distal.

En particular, se ha propuesto que el producto bacteriano colibactina es causante y potencialmente pronóstico en el CCR, especialmente en el de inicio temprano.^[30]–^[32] Las firmas de mutación son patrones inferidos de mutaciones secuenciales específicas asociadas con diversos eventos o fuentes mutagénicas,^[33], y la firma de mutación de colibactina, ID18, está enriquecida en el CCR del lado izquierdo/rectal.^[17] Dado que los patrones de mutagénesis de la colibactina comparten un enriquecimiento regional con el CCR de inicio temprano, la evaluación de los paisajes mutacionales en el colon premaligno puede aclarar las hipótesis sobre el papel causal y el potencial predictivo de la colibactina. Además, establecer una línea de base biológica es esencial para definir el umbral entre un colon sano y un cáncer incipiente, ya que la iniciación de la tumorigénesis aún no se ha caracterizado en gran medida.^[34]

En colaboración con el Consorcio de Microbiota e Inmunología Gastrointestinal (MAGIC) de la Universidad de Utah, evaluamos los paisajes mutacionales del colon premaligno en seis sitios anatómicos en 21 pacientes. La cohorte comprende 11 pacientes sin pólipos identificados en la colonoscopia y 10 con al menos un pólipo adenomatoso. Utilizando la microdisección láser para la captura, aislamos criptas individuales del colon, que son monoclonales y, por lo tanto, genéticamente homogéneas debido a su microestructura contenida y su nicho de células madre confinado.^[35] Cuantificamos la mutagénesis de referencia en los distintos sitios anatómicos del colon para evaluar si los cambios de mutación difieren por región o estado de los pólipos en el colon premaligno. Incorporamos dos fuentes de datos publicados previamente en nuestros análisis: 1) criptas del colon de individuos con CCR (n = 15)^[29] y 2) tendencias de mutación de un estudio regionalmente anotado de tumores de CCR^[17]. El último estudio evaluó seis firmas de mutación que se superponen con las que extraemos (tendencias resumidas y asociaciones conocidas en la Tabla Suplementaria 1). Al comparar la mutagénesis del colon premaligno con las tendencias de mutación derivadas de tumores, identificamos patrones de mutación compartidos entre el tejido premaligno y los tumores establecidos, incluido los patrones de carga de la firma ID18 estrechamente comparables en los grupos clínicos indicativos de una mutagénesis común de la colibactina, e identificamos divergencias que pueden reflejar procesos específicos de la enfermedad.

Resultados

Descripción general del estudio y panorama mutacional general

Realizamos secuenciación de todo el genoma de 125 criptas individuales aisladas mediante microdisección láser para la captura del colon premaligno de 21 individuos: 11 sin hallazgos en la colonoscopia y 10 con pólipos (Fig. 1A). Se tomaron biopsias de seis regiones estandarizadas durante la colonoscopia, en el siguiente orden: ciego, colon ascendente, colon transverso, colon descendente, colon sigmoide y recto (ver Métodos). Estas regiones también se pueden agrupar como colon derecho (ciego, ascendente, transverso) e izquierdo (descendente, sigmoide y recto). Un promedio de cinco regiones por donante estuvieron representadas en nuestros datos, y el número de criptas individuales por donante varió de 2 a 15 (media y mediana: 6; Tabla 1). Pudimos lograr una alta calidad de secuenciación del ADN (calidad base promedio de la muestra a o por encima de Q30: 93,91 %) y una cobertura promedio de secuenciación del ADN en todo el genoma de aproximadamente 26X (Fig. S1). Dado que las criptas del colon son estructuras clonales que surgen de unas pocas células madre, esta cobertura de secuenciación facilitó la detección precisa de mutaciones tanto clonales como subclonales, definidas por una frecuencia alélica de mutación (MAF) ≥ y < 0,2, respectivamente (Fig. 1B).

Como se esperaba y se documentó en estudios anteriores, el número de mutaciones somáticas observadas por cripta se acumuló significativamente con la edad (Fig. 1C).^[36],^[37] Encontramos una acumulación anual general de aproximadamente 23,7 SNV por año (rango de ~20–40; Fig. S2). Esta estimación es comparable a una estimación de un estudio anterior de ~36/año, con un intervalo de confianza del 95 % de ~26,9 a 50,6.^[38] La acumulación general de ~24 SNV/año fue consistente en el colon derecho e izquierdo, y la tasa de acumulación de inserciones y deleciones (indels) también fue consistente por lado (~1/año). Además, comparamos los rangos de carga con los informados previamente en 50 criptas de siete individuos con un rango de edad similar (este estudio: 34–76 años; Moore^[39]: 38–78). Los rangos de carga de SNV (este estudio: 545–5066; Moore: 883–5160) y los rangos de carga de indels (este estudio: 15–227; Moore: 20–147) fueron comparables. Es posible que observemos una mayor carga máxima debido a la mayor sensibilidad de nuestra tecnología de secuenciación hacia los indels^[40] o a la biología específica de cada individuo. El tipo de mutación más abundante fue C>T, que representó más del 30 % de las mutaciones, y los espectros de mutación generales (es decir, la distribución de frecuencia de los diferentes tipos de mutación, como C>T, C>A, etc.) fueron consistentes con los espectros de mutación observados en estudios anteriores de mutagénesis de criptas (Fig. 1D),^[29],^[41], lo que indica una biología tisular compartida. Al comparar los espectros de mutación con los de hombres sanos del estudio de Lee-Six et al. (un contexto biológico similar), la similitud del coseno es de 0,981, lo que indica una mutagénesis comparable de estas criptas "normales" (Fig. S1).

Dinámica de mutación específica de la región

A continuación, examinamos la variación en el tipo y la carga de mutación en las seis regiones biopsiadas para identificar las diferencias regionales en la mutagénesis del colon premaligno. Observamos una estabilidad de microsatélites consistente en todas las regiones en las muestras premalignas, según lo determinado por un panel de cinco loci de diagnóstico (Fig. 2A, ver Métodos). Utilizamos el método estadístico "distancia del espectro de mutación agregada"^[42],^[43] para comparar los espectros de mutación de las criptas del colon izquierdo y derecho. Al evaluar la distancia del espectro con 10 000 simulaciones permutadas a partir de matrices de contexto de trinucleótidos de SNV, encontramos que el colon derecho e izquierdo diferían significativamente en la proporción de mutación (valor p = 0,008) pero no en el recuento de mutación (valor p = 0,119) (Fig. 2B), lo que indica que, si bien los recuentos generales de SNV son comparables entre los lados, la composición de los subtipos de mutación difiere.

Cuando modelamos la carga de mutación ajustada por la edad y el grupo clínico (Métodos), la carga de SNV no diferió significativamente por lado (derecho medio: 1517, rango intercuartílico: 546; izquierdo medio: 1563, IQR: 546). Sin embargo, al evaluar la composición de SNV en todo el colon, encontramos que el subtipo C>T estaba significativamente enriquecido en el lado derecho (valor p ajustado = 0,026, pruebas de Wilcoxon pareadas). Además, las sustituciones C>A, C>G, T>A, T>C y T>G fueron significativamente diferentes al compararlas entre las regiones, con la señal más fuerte en los subtipos T>A y T>C (valores p ajustados < 0,05, pruebas de Kruskal-Wallis) (Tabla S2). Al comparar con el promedio global de mutaciones agrupadas en C>[A,G,T] y T>[A,C,G], solo el recto fue completamente distinto del promedio global (Fig. 2C), y fue significativamente diferente de cada región con respecto a ambos grupos de mutación. Las mutaciones T>[A,C,G] se elevaron significativamente en el recto en comparación con el promedio de mutación global y con otras regiones, mientras que C>[A,G,T] se redujeron en comparación. De manera similar, la carga de mutación de indels aumentó significativamente en el colon izquierdo (media: 124, IQR: 54) frente al derecho (media: 103, IQR: 47) (valor p ajustado < 0,001), con un aumento aproximado del ~26 % en el modelo (Métodos).

Firmas de mutación en los grupos clínicos

SPANISH TRANSLATION:

A la luz de la hipótesis en desarrollo de que la genotoxina colibactina es la causa del CCR, tomamos nota de la asociación previamente observada entre la mutagenicidad de la colibactina y las inserciones/deleciones ^[44] y las mutaciones T>[A,C,G].^[45],^[46] Dado que observamos un impacto de la anatomía del colon en la abundancia de inserciones/deleciones y mutaciones T>[A,C,G], hipotetizamos que estas variaciones pueden reflejar procesos mutagénicos regionales, que a su vez deberían ser observables como firmas mutacionales. Extraímos las firmas de las muestras premalignas y encontramos que las dos firmas asociadas con la colibactina genotóxica estaban significativamente enriquecidas en el recto: la firma de sustitución de una sola base SBS88 y la firma de inserciones/deleciones ID18^[30] (Fig. 3A, Fig. S3). Para distinguir la mutagenicidad específica de la región de la específica del estado de la enfermedad, comparamos estos hallazgos con las tendencias tumorales regionales de Cornish et al. (Tabla S3), que identificó que ID18 aumentaba de derecha a izquierda en pacientes con tumores colorrectales (Tabla S1). Separamos el conjunto de datos premalignos en pacientes con hallazgos colonoscópicos normales ("saludables", n=11) y aquellos con pólipos adenomatosos ("en riesgo", n=10), y comparamos ambos grupos con las tendencias tumorales, escalando los resultados para superponer las líneas de tendencia (Fig. 3B).

Estratificamos las mutaciones por estado clonal (≥0,2 MAF) y subclonal ( 0,05). La estratificación por regiones génicas y codificantes no cambió la consistencia general entre los grupos clínicos, aunque la potencia para este análisis fue limitada (el número medio de SNV de colibactina dentro de un exón fue de 0 por muestra genotipada) (Fig. S7). Las SNV asociadas con la colibactina mostraron una alta similitud del coseno con SBS88 (0,96 en "saludable", 0,93 en "en riesgo"), lo que indica una detección basada en motivos precisa, consistente con la extracción de firmas (Fig. S8). Cuando modelamos la carga y la proporción de SNV e inserciones/deleciones asociadas con la colibactina utilizando modelos lineales mixtos generalizados que incluyen la edad, las únicas diferencias significativas fueron regionales (es decir, enriquecimiento en el colon distal), no entre los grupos clínicos. La edad no fue un factor de modelo significativo para las cargas de mutación de la colibactina, lo que sugiere que se trata de mutaciones adquiridas tempranamente en lugar de acumuladas a lo largo de la vida. Además, las firmas de colibactina siguen la trayectoria de edad de SBS89, una firma que se sabe que se adquiere temprano en la vida,^[11],^[17] en lugar de una firma similar a un reloj, como SBS5 (Fig. 4B). En conjunto, estos resultados indican una exposición temprana comparable a la colibactina en los grupos clínicos, sin evidencia de una carga inicial diferencial o una acumulación continua que se esperaría si la mutagenicidad de la colibactina fuera un factor iniciador en el CCR (Fig. 4C). Si la mutagenicidad de la colibactina fuera un factor determinante de la enfermedad, esperaríamos ver una mayor carga inicial en los individuos con exposición temprana en la vida o una mayor acumulación con el tiempo; en cambio, vemos datos consistentes con una exposición temprana en la vida que es comparable entre los grupos clínicos, independientemente del estado de la enfermedad o la edad.

Resumen del estudio y panorama mutacional general

Realizamos un secuenciamiento del genoma completo de 125 criptas individuales aisladas mediante microdisección láser de captura del colon premaligno de 21 individuos: 11 sin hallazgos colonoscópicos y 10 con pólipos (Fig. 1A). Se tomaron biopsias de seis regiones estandarizadas durante la colonoscopia, en el siguiente orden: ciego, colon ascendente, colon transverso, colon descendente, colon sigmoide y recto (ver Métodos). Estas regiones también se pueden agrupar como colon derecho (ciego, ascendente, transverso) e izquierdo (descendente, sigmoide y recto). Un número medio de cinco regiones por donante se representó en nuestros datos, y el número de criptas individuales por donante osciló entre 2 y 15 (media y mediana: 6; Tabla 1). Pudimos lograr una alta calidad de secuenciación del ADN (calidad base promedio de la muestra a o por encima de Q30: 93,91%) y una cobertura de secuenciación del genoma de mediana de ~26X (Fig. S1). Dado que las criptas del colon son estructuras clonales que surgen de unas pocas células madre, esta cobertura de secuenciación facilitó la detección precisa de mutaciones clonales y sublonales, definidas por una frecuencia alélica de mutación (MAF) ≥ y < 0,2, respectivamente (Fig. 1B).

Como se esperaba y se documentó en estudios anteriores, el número de mutaciones somáticas observadas por cripta se acumuló significativamente con la edad (Fig. 1C).^[36],^[37] Encontramos una acumulación anual general de ~23,7 SNV por año (rango ~20–40; Fig. S2). Esta estimación es comparable a una estimación de un estudio previo de ~36/año, con un intervalo de confianza del 95% de ~26,9 a 50,6.^[38] La acumulación general de ~24 SNV/año fue consistente en el colon derecho e izquierdo, y la tasa de acumulación de inserciones/deleciones también fue consistente por lado (~1/año). Además, comparamos los rangos de carga con los informados previamente en 50 criptas de siete individuos con un rango de edad similar (este estudio: 34–76 años; Moore^[39]: 38–78). Los rangos de carga de SNV (este estudio: 545–5066; Moore: 883–5160) y los rangos de carga de inserciones/deleciones (este estudio: 15–227; Moore: 20–147) fueron comparables. Es posible que observemos una mayor carga máxima debido a la mayor sensibilidad de nuestra tecnología de secuenciación hacia las inserciones/deleciones^[40] o a la biología específica del individuo. El tipo de mutación más abundante fue C>T, que representó >30% de las mutaciones, y los espectros de mutación generales (es decir, la distribución de frecuencia de los diferentes tipos de mutación, como C>T, C>A, etc.) fueron consistentes con los espectros de mutación observados en estudios previos de la mutagenicidad de las criptas (Fig. 1D),^[29],^[41], lo que indica una biología tisular específica compartida. Al comparar los espectros de mutación con los de hombres "saludables" del estudio de Lee-Six et al. (un contexto biológico similar), la similitud del coseno es de 0,981, lo que indica una mutagenicidad comparable de estas criptas "normales" (Fig. S1).

Dinámica mutacional específica de la región

A continuación, examinamos la variación en el tipo y la carga de las mutaciones en las seis regiones biopsiadas para identificar las diferencias regionales en la mutagenicidad del colon premaligno. Observamos una estabilidad de microsatélites consistente en todas las regiones en las muestras premalignas, según lo determinado por un panel de cinco loci de diagnóstico (Fig. 2A, ver Métodos). Utilizamos el método estadístico "distancia del espectro de mutación agregado"^[42],^[43] para comparar los espectros de mutación de las criptas del colon izquierdo y derecho. Al evaluar la distancia del espectro con 10 000 simulaciones permutadas a partir de matrices de contexto de trinucleótidos de SNV, encontramos que el colon derecho e izquierdo diferían significativamente en la proporción de mutaciones (valor p = 0,008) pero no en el recuento de mutaciones (valor p = 0,119) (Fig. 2B), lo que indica que, si bien los recuentos generales de SNV son comparables entre los lados, la composición de los subtipos de mutación difiere.

Cuando se modela la carga de mutaciones ajustada por la edad y el grupo clínico (Métodos), la carga de SNV no difería significativamente según el lado (media derecha: 1517, rango intercuartílico: 546; media izquierda: 1563, IQR: 546). Sin embargo, al evaluar la composición de las SNV en todo el colon, encontramos que el subtipo C>T estaba significativamente enriquecido en el lado derecho (p ajustada = 0,026, pruebas de Wilcoxon pareadas). Además, las sustituciones C>A, C>G, T>A, T>C y T>G fueron significativamente diferentes al comparar entre regiones, con la señal más fuerte en los subtipos T>A y T>C (p ajustadas < 0,05, pruebas de Kruskal-Wallis) (Tabla suplementaria 2). Al comparar con el promedio global de mutaciones agrupadas en C>[A,G,T] y T>[A,C,G], solo el recto fue completamente distinto del promedio global (Fig. 2C) y fue significativamente diferente de cada región con respecto a ambos grupos de mutaciones. Las mutaciones T>[A,C,G] estaban significativamente elevadas en el recto en comparación con el promedio global de mutaciones y con otras regiones, mientras que las C>[A,G,T] estaban relativamente disminuidas. De manera similar, la carga de mutaciones de inserciones y deleciones (indel) aumentó significativamente en el colon izquierdo (media: 124, IQR: 54) en comparación con el derecho (media: 103, IQR: 47) (p ajustada < 0,001), con un aumento aproximado de ~26% en el modelo (Métodos).

Firmas mutacionales en los diferentes grupos clínicos

A la luz de la hipótesis en desarrollo de que la genotoxina colibactina es la causa del CRC, tomamos nota de la asociación previamente observada de la mutagénesis por colibactina con las inserciones y deleciones (indel) ^[44] y las mutaciones T>[A,C,G] ^[45], ^[46]. Dado que observamos un impacto de la anatomía del colon en la abundancia de mutaciones de inserciones y deleciones y T>[A,C,G], hipotetizamos que estas variaciones pueden reflejar procesos mutagénicos regionales, que a su vez deberían ser observables como firmas mutacionales. Extrajimos las firmas de las muestras premalignas y encontramos que las dos firmas asociadas con la genotoxina colibactina estaban significativamente enriquecidas en el recto: la firma de sustitución de una sola base SBS88 y la firma de inserciones y deleciones ID18 ^[30] (Fig. 3A, Fig. suplementaria 3). Para distinguir la mutagénesis específica de la región de la mutagénesis específica del estado de la enfermedad, comparamos estos hallazgos con las tendencias tumorales regionales de Cornish et al. (Tabla suplementaria 3), que identificó ID18 como un aumento de derecha a izquierda en pacientes con tumores colorrectales (Tabla suplementaria 1). Separamos el conjunto de datos premalignos en pacientes con hallazgos colonoscópicos normales ('saludables', n=11) y aquellos con pólipos adenomatosos ('en riesgo', n=10), y comparamos ambos grupos con las tendencias tumorales, escalando los resultados para superponer las líneas de tendencia (Fig. 3B).

Estratificamos las mutaciones por estado clonal (≥0,2 MAF) y subclonal ( 0,05). La estratificación por regiones génicas y codificantes no cambió la consistencia general entre los grupos clínicos, aunque la potencia para este análisis fue limitada (el número medio de SNV de colibactina dentro de un exón fue de 0 por muestra genotipada) (Fig. suplementaria 7). Las SNV asociadas con la colibactina mostraron una alta similitud del coseno con SBS88 (0,96 en sanos, 0,93 en riesgo), lo que indica una detección precisa basada en motivos, consistente con la extracción de firmas (Fig. suplementaria 8). Cuando modelamos la carga y la proporción de SNV y inserciones y deleciones asociadas con la colibactina utilizando modelos lineales mixtos generalizados que incluyen la edad, las únicas diferencias significativas fueron regionales (es decir, enriquecimiento en el colon distal), no entre los grupos clínicos. La edad no fue un factor de modelo significativo para las cargas de mutación de colibactina, lo que sugiere que estas son mutaciones adquiridas temprano en la vida en lugar de acumuladas a lo largo de la vida. Además, las firmas de colibactina siguen la trayectoria de edad de SBS89, una firma que se sabe que se adquiere temprano en la vida ^[11], ^[17], en lugar de una firma similar a un reloj, como SBS5 (Fig. 4B). En conjunto, estos resultados indican una exposición temprana a la colibactina comparable en los grupos clínicos, sin evidencia de una carga inicial diferencial o una acumulación continua que se esperaría si la mutagénesis por colibactina fuera un factor iniciador en el CRC (Fig. 4C). Si la mutagénesis por colibactina fuera un factor determinante de la enfermedad, esperaríamos ver una mayor carga inicial en las personas con exposición temprana en la vida o una mayor acumulación con el tiempo; en cambio, vemos datos consistentes con una exposición temprana en la vida que es comparable entre los grupos clínicos, independientemente del estado de la enfermedad o la edad.

Discusión

La mutagénesis asociada con la colibactina en el colon es específica del sitio e independiente del estado de la enfermedad. Estas mutaciones parecen ser el resultado de una exposición temprana en la vida y persisten sin una patogenicidad inherente, lo que contradice las teorías actuales de que la mutagénesis impulsada por la colibactina predispone a las personas al CRC. Un estudio previo que identificó las firmas de colibactina en los casos de CRC de inicio temprano propuso que el examen de las criptas normales en grupos de diferentes estados clínicos debería revelar niveles elevados de SBS88 y ID18 si la mutagénesis por colibactina impulsa causalmente el CRC de inicio temprano ^[11]. Sin embargo, nuestros datos contradicen esta hipótesis, ya que encontramos que los niveles de SBS88 y ID18 son comparables entre la edad del paciente y el estado clínico y parecen reflejar una exposición regional específica temprana en la vida en lugar de una mutagénesis continua. Es interesante que la carga de ID18 informada por este estudio previo en los tumores colorrectales estables de microsatélites (que son 76% distales/rectales) se encuentre dentro de los intervalos de confianza que observamos para las criptas del colon izquierdo en los grupos de datos (media 110, mediana 111). Sin embargo, los autores de Díaz-Gay et al., como es la práctica habitual, informan los datos de la firma en su manuscrito como porcentajes de la carga de la firma individual, lo que puede reflejar un enfoque más amplio que oscurece la realidad clínica de la mutagénesis por colibactina. Debido a que las mutaciones de colibactina se acumulan temprano en la vida, los pacientes más jóvenes naturalmente tienen una mayor proporción de estas mutaciones en relación con su menor carga de mutación general, lo que hace que las mutaciones de colibactina parezcan enriquecidas en los individuos más jóvenes (Fig. suplementaria 9) sin ninguna diferencia en la exposición absoluta (Fig. suplementaria 6). En los análisis de los motivos asociados con la colibactina, la edad no fue un factor significativo al modelar las mutaciones de colibactina por recuento, mientras que se convirtió en un factor significativo al modelar por proporción. Esto sugiere que, si bien el numerador de las mutaciones de colibactina permanece constante entre los grupos, el denominador del recuento total de mutaciones aumenta con el tiempo. Además, la firma ID18 solo se detecta en las expansiones clonales y no se acumula con la edad, lo que es consistente con un evento temprano y limitado en la vida en lugar de una actividad continua y acumulativa de la colibactina.

SPANISH TRANSLATION:

La elevación de la señal de colibactina en el recto, donde los cánceres esporádicos de inicio temprano son especialmente comunes, probablemente exacerba la confusión entre la incidencia biológica y la relevancia clínica. Aunque el número total de mutaciones fue consistente en los diferentes sitios anatómicos, los espectros mutacionales regionales difieren, particularmente en los subtipos T>[A,C,G] asociados con la mutagénesis por colibactina.^[45],^[46] Los datos mostraron que la carga de SNV e indels asociados con la colibactina no difería entre los grupos clínicos (valores p > 0,05), con diferencias significativas solo por región, mostrando un enriquecimiento distal. De hecho, la mutagénesis por colibactina parece ser un evento fisiológico común que se distribuye regionalmente, en lugar de clínicamente. Estos hallazgos coinciden con un informe reciente que indica que más de la mitad de los bebés incluidos en el estudio estaban colonizados por una cepa de E. coli productora de colibactina durante los primeros dos años de vida, lo que llevó a los autores a concluir que la exposición a la colibactina forma parte del desarrollo normal del microbioma intestinal y es poco probable que aumente de forma independiente el riesgo de cáncer, dado que su prevalencia supera con creces la del CRC en la población general.^[56] Los datos respaldan esta interpretación, lo cual es una consideración importante dado el gran número de casos en los que se ha propuesto la colibactina como un factor causal en el CRC^[48],^[49],^[57] y como un posible factor pronóstico para el CRC de inicio temprano^[32],^[48].

En cambio, una explicación más parsimoniosa es que los aductos de colibactina específicos de la secuencia pueden formarse dentro de genes clínicamente relevantes como parte de la mutagénesis estocástica,^[58], lo que, a su vez, conduce a mutaciones recurrentes aparentemente causantes que coinciden con la firma de la colibactina, como se informó anteriormente^[11],^[31],^[59]. Esto sigue a un estudio reciente que plantea la hipótesis de que los "motivos lineales cortos" mutados por la mutagénesis asociada a diferentes firmas son un componente mecanicista de los genomas del cáncer, mediando la transformación oncogénica a través de la especificidad de secuencia indirecta.^[60] Como tal, la investigación de las mutaciones causantes en la mucosa del paciente, independientemente de la asociación con la colibactina, puede ser más informativa que inferir la importancia clínica a partir de la carga agregada de colibactina. También es necesario distinguir la presencia de E. coli pks+, que coloniza oportunísticamente en condiciones inflamadas y parece ser más abundante en el CRC en etapa temprana que en la mucosa intestinal sana o en el cáncer en etapa más avanzada,^[61], de las mutaciones incurridas por la exposición genotóxica décadas antes. De hecho, múltiples estudios no han encontrado una relación directa entre los genes de colibactina indicativos de la colonización intestinal actual y la mutagénesis asociada con la colibactina, lo que refuerza esta distinción.^[47],^[62].

En términos más generales, nuestro estudio aprovechó los avances técnicos, incluido el diseño de bibliotecas optimizado para una baja cantidad de ADN y una secuenciación de alta fidelidad^[40], para mejorar la precisión de la secuenciación y la cobertura general. Esto, a su vez, permitió la captura de mutaciones subclonales de alta confianza, lo cual estaba limitado en estudios anteriores.^[29],^[39]. Dado que múltiples descendientes de una célula madre ancestral mantienen la población de criptas, las mutaciones de baja frecuencia pueden ocurrir a través de este mecanismo o a través de daños no reparados en las células diferenciadas.^[24]. Cuando la mutagénesis subclonal difiere de las tendencias clonales y generales, como en las cargas de SNV/indel y SBS1 por región, puede reflejar una biología no observada en estudios anteriores de criptas del colon. Estos aspectos únicos de la mutagénesis, que solo son aparentes en las mutaciones subclonales de las criptas normales, pueden desempeñar un papel en la tumorigénesis a medida que la reparación de mutaciones se vuelve cada vez más desregulada. Por el contrario, las firmas que fueron consistentes en los conjuntos de biopsias y los estados de clonalidad pueden reflejar la biología innata del órgano. Por ejemplo, la firma oxidativa SBS18 disminuyó globalmente en carga desde el colon proximal hasta el distal, lo que puede reflejar un mayor estrés oxidativo en el colon proximal debido a factores como el aumento del transporte de electrolitos y la exposición a ácidos biliares.^[1],^[15]. Este enriquecimiento proximal es consistente con la asociación del daño oxidativo con la inestabilidad de microsatélites y la deficiencia de reparación de errores de emparejamiento,^[63],^[64], ambos de los cuales se sabe que están enriquecidos en el colon proximal.^[14],^[65]. Sin embargo, dado que también se encontró que SBS18 estaba enriquecido proximalmente en el CRC con microsatélites estables y en este conjunto de datos, se necesita una mayor aclaración para distinguir los fenómenos específicos de la región de la mutagénesis específica de la patología.

Este estudio tiene limitaciones. En primer lugar, el tamaño de la muestra de cada población de pacientes fue pequeño, lo que limitó nuestra capacidad para generalizar ampliamente los hallazgos. Realizamos muestreos de regiones estandarizadas y no realizamos biopsias inmediatamente adyacentes a un pólipo, ni secuenciamos pólipos. En segundo lugar, tuvimos enfoques metodológicos distintos de los conjuntos de datos que agregamos en los análisis.^[17],^[29]. Además, nuestros datos parecen estar potencialmente enriquecidos con artefactos C>A subclonales, probablemente debido a daños durante la generación de la biblioteca (Fig. S10). Aún así, dado que estos no son relevantes para las firmas de colibactina o los motivos de secuencia (que persisten cuando se eliminan las mutaciones subclonales) y se identificaron como artefactos durante la extracción de la firma, es poco probable que afecten las interpretaciones centrales.

Concluimos que distinguir la presencia de microorganismos productores de colibactina de las mutaciones asociadas con la colibactina es clínicamente esencial. Si bien la colibactina ha sido un candidato prometedor en la carcinogénesis colorrectal, los datos sugieren que su huella mutacional está determinada regionalmente, se adquiere temprano y es independiente del estado de la enfermedad, lo que socava su función propuesta como factor causal o pronóstico en el CRC. Es esencial realizar más investigaciones para distinguir las mutaciones de colibactina aparentemente comunes, la presencia de E. coli productora de colibactina y los factores que inician y progresan definitivamente la formación de tumores. El análisis cuidadoso de las mutaciones específicas de la cripta puede aprovecharse en el futuro para determinar el riesgo del paciente y los regímenes de detección personalizados. Estos análisis y estrategias clínicas centrados en la precisión, a su vez, pueden reducir la morbilidad clínica del CRC de alto riesgo, incluidos los casos de inicio temprano. En última instancia, el valor clínico de la mutagénesis de la cripta puede residir no en la carga agregada de la firma, sino en la identificación de mutaciones causantes específicas, ya sean o no asociadas con la colibactina, que confieren un riesgo individual y proporcionan información para la detección personalizada.

Materiales y métodos

Informe de datos.

No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Los experimentos no fueron aleatorizados y los investigadores no fueron cegados durante los experimentos o la evaluación de los resultados.### Población de estudio y muestras biológicas.

Los pacientes varones (de aproximadamente 35 a 75 años) programados en nuestra institución para una colonoscopia de detección o seguimiento eran elegibles para el reclutamiento en el Biobanco MAGIC (https://www.magic.path.utah.edu/biobank) bajo el IRB #00113193 a través de la Universidad de Utah. Las características basales de la cohorte de estudio están disponibles en la Tabla 1; restringimos el estudio a los hombres debido a las diferencias de sexo postuladas en el CRC. También se recolectaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de 19 de 21 pacientes para la secuenciación de sangre. Los gastroenterólogos colaboradores recolectaron biopsias de colon utilizando fórceps grandes de regiones estandarizadas, que incluyen: ciego, colon ascendente, colon transverso, colon descendente, colon sigmoide y recto, según lo discernible por la morfología durante el procedimiento. Se tomaron dos biopsias endoscópicas de cada región identificada por el gastroenterólogo asistente. Las muestras de colon se colocaron inmediatamente en un 10% de suero fetal bovino en PBS estéril para su transporte al laboratorio. Dentro de los 30 minutos posteriores a la adquisición, los tejidos se colocaron en OCT en un bloque de moldeo y se solidificaron utilizando hielo seco. Las muestras se almacenaron a -80 °C hasta la criosección.

Los criomoldes se cortaron en secciones de aproximadamente 15 μm utilizando un criostato y se montaron en portaobjetos de PEN para maximizar el tamaño de la cripta a lo largo del eje longitudinal. Se realizó una criosección piloto para garantizar la orientación adecuada de las criptas del colon (orientación de "tubo de ensayo" transversal). Se mezcló una mezcla de deshidratación de 0,1 vol de acetato de sodio: 2 vol de 100% de etanol y se dejó reposar durante la noche para fijar las diapositivas durante 2 minutos antes de la tinción. La tinción con H&E se realizó en el tinte automático Tissue-Tek® Prisma (62667-SS) de la siguiente manera: Estación de lavado 1:00 (1 minuto); Agua destilada 0:10 (10 segundos); Hematoxilina 3:00; Estación de lavado 1:00; Agua de amoníaco 1:00; Estación de lavado 0:30; Eosina 1:30; Estación de lavado 1:00. Procedimos con la microdisección láser de captura dentro de las 24 horas posteriores a la tinción, según las recomendaciones del protocolo.^[66]### Microdisección láser de captura de criptas del colon.

La captura láser para aislar criptas individuales del colon se realizó utilizando el MMI CellCut (102001), con captura de contacto en las tapas de aislamiento proporcionadas por MMI (número de producto 50204). El láser se calibró rutinariamente y la configuración se mantuvo consistentemente en aproximadamente 78 μm de enfoque de corte y 50-60% de potencia de corte, con captura en el objetivo de 20x.### Extracción de ADN y preparación de bibliotecas.

Las criptas del colon se transfirieron de las tapas de aislamiento con 20 μl de solución de proteinasa K reconstituida (Arcturus: KIT0103) en tubos de tira de ocho compatibles con termocicladores. La confirmación visual de la transferencia de criptas fue posible en la mayoría de los casos. La lisis celular se realizó a 60 °C (6 horas), la desnaturalización a 75 °C (30 min) y las muestras se almacenaron a 4 °C. Se realizó una purificación con cuentas AMPURE (Beckman Coulter: A63880) con dos rondas de lavados con 75% de etanol; las cuentas se mantuvieron en solución y no se realizó la cuantificación del ADN, según lo recomendado para maximizar el rendimiento del ADN.^[66]

Las muestras de PBMC para la filtración de la línea germinal de tejidos coincidentes se sometieron a extracción de ADN mediante el kit Qiagen QIAamp Mini DNA. El ADN de alto peso molecular se fragmentó mediante cizallamiento mecánico a aproximadamente 350 pb (Covaris, Cat# 500295).

Se realizó la preparación de bibliotecas de baja entrada para las muestras de criptas y sangre (Kit de preparación de bibliotecas Watchmaker DNA, número de pieza 7K0101-096). Utilizamos IDT X-Gen UDI-UMI (número de pieza 10005903) en la ligación del adaptador. Las muestras de criptas se sometieron a 8 ciclos de amplificación por PCR. Después de la construcción de la biblioteca, las bibliotecas se verificaron para determinar el tamaño utilizando el analizador de fragmentos AATI con el kit NGS de alta sensibilidad y se verificó la concentración utilizando el kit de ensayo Qubit 1X dsDNA HS (número de pieza Q33231). Luego, todas las muestras se convirtieron utilizando el protocolo Element Biosciences Adept Rapid PCR-Plus (kit 830-00018) con cinco ciclos de PCR.### Secuenciación del genoma completo.

Los datos de secuenciación (Element Biosciences AVITI y AVITI24) se generaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante con el kit de preparación de bibliotecas Element Elevate (Element Biosciences, Cat# 830-00008).^[40] Las bibliotecas lineales se cuantificaron mediante PCR cuantitativa y se secuenciaron con los kits de secuenciación Cloudbreak Freestyle (n = 20, Element Biosciences, Cat# 810-00003) o Cloudbreak UltraQ (n = 28, Element Biosciences, Cat# 810-00008). El software Bases2Fastq (versiones v2.1.0, v2.2.0, v2.2.1 y v2.3.0; Element Biosciences) se utilizó para generar archivos FASTQ desmultiplexados.### Procesamiento y filtrado de datos.

Los archivos FASTQ (R1 y R2) se alinearon con la referencia GRCh38 utilizando BWA (0.7.19) con la configuración predeterminada y 16 hilos.

Los archivos BAM se sometieron a la llamada de variantes mediante dos herramientas: el método basado en haplotipos FreeBayes^[67] (1.3.4) y el método de aprendizaje profundo DeepSomatic^[68] (1.9.0). La llamada de variantes de FreeBayes se realizó para cada donante en regiones de 5 Mb de cada cromosoma, requiriendo 2 alelos alternativos con una puntuación q mínima de 40. Los donantes PD34200 y PD34201 de Lee-Six et al. se omitieron de la genotipificación por tener 49 y 56 muestras de criptas, respectivamente, lo cual fue computacionalmente prohibitivo para la llamada conjunta a nivel de donante de freebayes. Dado que ambos donantes de Lee-Six eran hombres sanos dentro del rango de edad del estudio, no esperábamos que estos donantes proporcionaran un contexto biológico adicional.

Se realizó la identificación de variantes mediante DeepSomatic utilizando contenedores descargados de https://github.com/google/deepsomatic/blob/r1.9/docs/deepsomatic-quick-start.md, ejecutados en Singularity^[69] (4.1.1) por cromosoma a nivel de muestra. Las muestras con sangre correspondiente se analizaron con el tipo de modelo “WGS”, mientras que las muestras sin sangre correspondiente utilizaron el tipo de modelo “WGSTUMORONLY”. Los archivos VCF resultantes, específicos de cada muestra y cromosoma, se fusionaron con GLNexus^[70] (v1.2.7) para producir resultados por donante, que luego se concatenaron para abarcar todo el genoma.

Los resultados de los identificadores de variantes se cruzaron para maximizar la especificidad y garantizar una señal biológica verdadera en la extracción de firmas.^[71] Se eliminó cualquier variante encontrada en gnomAD^[72] v3, según lo anotado por Slivar^[73], así como las regiones de baja complejidad^[74] utilizadas para el filtrado en un estudio de laboratorio previo y los loci del navegador del genoma UCSC^[75], Simple Repeats track, identificados por Tandem Repeats Finder^[76]. Se conservaron las mutaciones no de referencia con cero lecturas en otras muestras de donantes (incluida la sangre), con una profundidad del sitio de 8 y al menos 4 lecturas alternativas. Se requirió una profundidad promedio de 10 para garantizar una cobertura consistente en todo el genoma. Se eliminaron las variantes encontradas en diferentes donantes, ya que podrían ser variantes de la población que se pasaron por alto. Finalmente, se eliminaron las muestras con menos de 500 variantes de un solo nucleótido (SNV), basándose en trabajos previos sobre criptas de colon, asumiendo una captura de muestra inadecuada^[11],^[53], ajustado para la distribución de la carga de SNV de este estudio (Fig. Supl. 1).

Análisis de firmas.

La extracción de firmas se realizó con SigProfilerExtractor^[77] (1.2.5), que es robusto en comparación con otras herramientas de extracción.^[78] Se utilizó el esquema SBS288, que comprende contextos de trinucleótidos de cadena única, para la extracción de firmas SBS, y el esquema ID83 se utilizó para la extracción de firmas de inserción-deleción (indel). Utilizamos el genoma de referencia GRCh38 y la versión 3.4 de COSMIC para la coincidencia de firmas. Se permitió un mínimo de 1 y un máximo de 15 firmas en la extracción de firmas, con la configuración predeterminada en el resto de los parámetros (replicaciones de factorización de matrices no negativas: 100, estrategia de normalización de matrices: modelo de mezcla gaussiana; estabilidad de la estimación de la solución: 0,8, estabilidad mínima: 0,2, estabilidad combinada: 1,0). La extracción de firmas SBS utilizando todas las mutaciones tuvo una estabilidad promedio de 0,96 y una estabilidad mínima de 0,9 (clonal: 0,94 y 0,86, subclonal: 0,99 y 0,99), y la extracción de firmas de indel de todas las mutaciones tuvo una estabilidad promedio y mínima de 0,99 y 0,98 (clonal: 0,86 y 0,61, subclonal: 0,97 y 0,94). La correlación media entre las mutaciones de la muestra original y las firmas reconstruidas fue ≥ 0,9 para todos los análisis no sub clonales, mientras que las extracciones de firmas sub clonales tuvieron una correlación media de 0,464 para las mutaciones SBS y 0,581 para los indels.

La información de firmas a nivel de estudio y anotada por región de Cornish et al. (2024) se tomó de la Tabla Suplementaria 37. La información de firmas a nivel de paciente y no regional de Diaz-Gay (2025) se tomó de la Tabla Suplementaria 12; los recuentos de las regiones de las muestras con microsatélites estables se derivaron de la Figura Suplementaria 9. No podemos dividir estos datos en mutaciones clonales y sub clonales debido a la falta de información sobre la frecuencia alélica de las mutaciones. Dado que los tumores de CRC contienen una mezcla de mutaciones clonales y sub clonales,^[79], optamos por comparar estos datos específicos del tumor tal como están con cada extracción de firmas.

Análisis de microsatélites.

Utilizamos la herramienta inSTRbility (GitHub: https://github.com/dashnowlab/inSTRbility) en todos los archivos BAM para evaluar la inestabilidad de los microsatélites en las muestras.^[80] Utilizamos un catálogo de cinco marcadores de inestabilidad de microsatélites bien establecidos (BAT25, BAT26, NR21, NR27, NR24)^[81] y requerimos dos índices de inestabilidad de salida que reflejen el tamaño medio y mediano del alelo para que sean concordantes (mayor que 1 desviación estándar por encima del promedio) para considerar que un locus es inestable. Si 1-2 loci eran inestables, la muestra se designó como MSI-L. Ninguna de las muestras presentaba 3 o más loci inestables (MSI-H).

Análisis de motivos de colibactina.

Huber et al. probaron el enriquecimiento de motivos en organoides expuestos a colibactina en comparación con los organoides de control, registrando todas las bases en un contexto extendido de 10 pb alrededor de las mutaciones T>N, que están asociadas con la mutagénesis de colibactina y en las firmas de mutación asociadas con colibactina SBS88 e ID18.^[53] Los autores encontraron que las SNV con adenina en la 3.ª y 4.ª posición de la ventana de secuencia se enriquecieron después de la exposición a colibactina, y se enriquecieron más en 17 contextos de trinucleótidos que mostraron una similitud coseno significativa con SBS88. Huber et al. validaron aún más sus motivos específicos de colibactina utilizando un modelo de bosque aleatorio entrenado en los organoides, y aplicaron esta canalización a múltiples conjuntos de datos de secuenciación de cáncer para identificar las SNV y los indels específicos de colibactina. Utilizamos esta canalización para identificar mutaciones en los motivos de colibactina en este estudio. Todos los scripts utilizados en los análisis se adaptaron directamente del repositorio de GitHub asociado con Huber et al. (https://github.com/ProjectsVanBox/colibactin_detection).

Métodos estadísticos.

Modelamos los datos en el lenguaje estadístico R (v4.5.2) con el paquete lme4 (v1.1.38). Generalmente, utilizamos modelos lineales mixtos generalizados en el espacio binomial negativo, ya que los modelos de Poisson presentaban sobredispersión. Incluimos un factor aleatorio para la identidad del donante y factores fijos para la edad (centrada y escalada para la estabilidad del modelo) y el grupo clínico, etiquetado como cohorte. El término apropiado para el nivel de detalle anatómico (lado [derecho e izquierdo], región [todas las seis] o región_trinaria [derecho, colon transverso, izquierdo]) se incluyó como un término fijo en los diversos análisis. Al incorporar los datos de Lee-Six en estos modelos, como cuando se evalúan las mutaciones de colibactina en las tres cohortes, incluimos el factor fijo de estudio, que nunca fue significativo. Cuando se incluyó el contenido de GC de las bases detectables en estos modelos, el término no fue significativo y condujo a un peor ajuste del modelo (AIC más alto y problemas de convergencia), por lo que se excluyó. También modelamos una prueba de lado*edad para evaluar las diferencias en la pendiente con la edad a lo largo del colon, pero no hubo una interacción significativa.

Nuestro modelado basado en datos de recuento (SNV y indels específicos de la cripta y del motivo de colibactina) utilizó el logaritmo del genoma detectable (número de bases en el genoma de referencia con una profundidad de lectura ≥ 8) como un desplazamiento. Por ejemplo, al modelar la acumulación de SNV específicas de la cripta:

Cuando se modela en función de la proporción, utilizamos el logaritmo del recuento total de mutaciones como un desplazamiento. Por ejemplo, al modelar la significancia de la proporción C>[A,C,G] en las regiones:

El término “región - 1”, que suprime la intersección y, en cambio, utiliza una media de nivel en lugar de un nivel de referencia, se utilizó en la evaluación de todas las regiones para la visualización en la Figura 2, mientras que “región” se utilizó con el aparente valor atípico del recto como referencia para determinar la significancia estadística.

La excepción al uso del binomial negativo es el modelo de enriquecimiento y agotamiento de firmas en las regiones. Utilizamos un modelo logarítmico para tener en cuenta la ausencia o presencia binaria (región_bin) de una firma en una muestra.

En cuanto a la estabilidad del modelo, hubo ajustes singulares (indicativos de un posible sobreajuste) en el caso del modelado de subtipos de mutación y el enriquecimiento/agotamiento de firmas, pero optamos por mantener la variable de efectos aleatorios (1 | donante) basándonos en su probable significancia biológica. Hubo una instancia de fallo de convergencia al modelar el recuento de indels del motivo de colibactina, probablemente debido al menor recuento en este escenario (ocasionalmente menos de 10, varias veces menor que las SNV del motivo de colibactina), por lo que evaluamos el mismo modelo en un espacio de Poisson con resultados equivalentes (no significancia entre los grupos clínicos).

Todos los modelos se corrigieron para la no independencia ajustando los valores p con la corrección de Benjamini-Hochberg.

Presentación de datos.

No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Los experimentos no se aleatorizaron y los investigadores no estuvieron cegados durante los experimentos o la evaluación de los resultados.

Población de estudio y muestras biológicas.

Los pacientes masculinos (aproximadamente de 35 a 75 años) programados en nuestra institución para una colonoscopia de detección o seguimiento eran elegibles para el reclutamiento en el Biobanco MAGIC (https://www.magic.path.utah.edu/biobank) bajo el IRB #00113193 a través de la Universidad de Utah. Las características basales de la cohorte de estudio están disponibles en la Tabla 1; restringimos el estudio a los hombres debido a las diferencias de sexo postuladas en el CRC. También se recolectaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de 19 de los 21 pacientes para el secuenciamiento de sangre. Los gastroenterólogos colaboradores recolectaron biopsias de colon utilizando fórceps grandes de las regiones estandarizadas, que incluyen: ciego, colon ascendente, colon transverso, colon descendente, colon sigmoide y recto, según lo discernible por la morfología durante el procedimiento. Se tomaron dos biopsias endoscópicas de cada región identificada por el gastroenterólogo asistente. Las muestras de colon se colocaron inmediatamente en un 10% de suero fetal bovino en PBS estéril para el transporte al laboratorio. Dentro de los 30 minutos posteriores a la adquisición, los tejidos se colocaron en OCT en un bloque de moldeo y se solidificaron utilizando hielo seco. Las muestras se almacenaron a -80 °C hasta la criosección.

Los criomoldes se cortaron en secciones de aproximadamente 15 μm utilizando un criostato y se montaron en portaobjetos de PEN para maximizar el tamaño de la cripta a lo largo del eje longitudinal. Se realizó una criosección piloto para garantizar la orientación adecuada de las criptas del colon (orientación de "tubo de ensayo" transversal). Se mezcló una mezcla de deshidratación de 0,1 volúmenes de acetato de sodio: 2 volúmenes de 100% de etanol y se dejó reposar durante la noche para fijar los portaobjetos durante 2 minutos antes de la tinción. La tinción con H&E se realizó en el tinte automático Tissue-Tek® Prisma (62667-SS) de la siguiente manera: Estación de lavado 1:00 (1 minuto); Agua destilada 0:10 (10 segundos); Hematoxilina 3:00; Estación de lavado 1:00; Agua de amoníaco 1:00; Estación de lavado 0:30; Eosina 1:30; Estación de lavado 1:00. Procedimos con la microdisección láser de captura dentro de las 24 horas posteriores a la tinción, según las recomendaciones del protocolo.^[66]

Microdisección láser de captura de criptas cólicas.

La captura láser para aislar las criptas cólicas individuales se realizó utilizando el MMI CellCut (102001), con captura de contacto en las tapas de aislamiento proporcionadas por MMI (número de producto 50204). El láser se calibró de forma rutinaria y la configuración fue consistentemente de aproximadamente 78 μm de enfoque de corte y 50-60% de potencia de corte, con captura en el objetivo de 20x.

Extracción de ADN y preparación de la biblioteca.

Las criptas cólicas se transfirieron de las tapas de aislamiento con 20 μl de solución de proteinasa K reconstituida (Arcturus: KIT0103) en tubos de tira de ocho compatibles con los termocicladores. La confirmación visual de la transferencia de criptas fue posible en la mayoría de los casos. La lisis celular se realizó a 60 °C (6 horas), la desnaturalización a 75 °C (30 min) y las muestras se almacenaron a 4 °C. Se realizó una purificación con cuentas AMPURE (Beckman Coulter: A63880) con dos rondas de lavados con 75% de etanol; las cuentas se mantuvieron en solución y no se realizó la cuantificación del ADN, según lo recomendado para maximizar el rendimiento del ADN.^[66]

Las muestras de PBMC para el filtrado de la línea germinal de los tejidos correspondientes se sometieron a extracción de ADN mediante el kit Qiagen QIAamp Mini DNA. El ADN de alto peso molecular se fragmentó mediante cizallamiento mecánico a aproximadamente 350 pb (Covaris, Cat# 500295).

Se realizó la preparación de bibliotecas de bajo rendimiento para las muestras de criptas y sangre (kit de preparación de bibliotecas Watchmaker DNA, número de pieza 7K0101-096). Utilizamos IDT X-Gen UDI-UMI (número de pieza 10005903) en la ligación del adaptador. Las muestras de criptas se sometieron a 8 ciclos de amplificación por PCR. Después de la construcción de la biblioteca, se verificó el tamaño de las bibliotecas utilizando el AATI Fragment Analyzer con el kit de alta sensibilidad NGS, y se verificó la concentración utilizando el kit de ensayo Qubit 1X dsDNA HS (número de pieza Q33231). Luego, todas las muestras se convirtieron utilizando el protocolo Element Biosciences Adept Rapid PCR-Plus (kit 830-00018) con cinco ciclos de PCR.

Secuenciación del genoma completo.

Los datos de secuenciación (Element Biosciences AVITI y AVITI24) se generaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, utilizando el kit de preparación de bibliotecas Element Elevate (Element Biosciences, Cat# 830–00008).^[40] Las bibliotecas lineales se cuantificaron mediante PCR cuantitativa y se secuenciaron utilizando los kits de secuenciación Cloudbreak Freestyle (n = 20, Element Biosciences, Cat# 810–00003) o Cloudbreak UltraQ (n = 28, Element Biosciences, Cat# 810–00008). El software Bases2Fastq (versiones v2.1.0, v2.2.0, v2.2.1 y v2.3.0; Element Biosciences) se utilizó para generar archivos FASTQ desmultiplexados.

Procesamiento y filtrado de datos.

Los archivos FASTQ (R1 y R2) se alinearon con la referencia GRCh38 utilizando BWA (0.7.19) con los parámetros predeterminados y 16 hilos.

Los archivos BAM se sometieron a la identificación de variantes mediante dos herramientas: FreeBayes^[67] (1.3.4), basada en haplotipos, y el método de aprendizaje profundo DeepSomatic^[68] (1.9.0). La identificación de variantes con FreeBayes se realizó para cada donante en regiones de 5 Mb de cada cromosoma, requiriendo 2 alelos alternativos con un qsum mínimo de 40. Los donantes PD34200 y PD34201 del estudio de Lee-Six et al. se omitieron del genotipado debido a que tenían 49 y 56 muestras de criptas, respectivamente, lo que representaba una carga computacional prohibitiva para la identificación conjunta a nivel de donante con FreeBayes. Dado que ambos donantes de Lee-Six eran hombres sanos y se encontraban dentro del rango de edad del estudio, no esperábamos que estos donantes proporcionaran un contexto biológico adicional.

La identificación de variantes con DeepSomatic se realizó utilizando contenedores descargados de https://github.com/google/deepsomatic/blob/r1.9/docs/deepsomatic-quick-start.md, ejecutados en singularity^[69] (4.1.1) por cromosoma a nivel de muestra. Las muestras con sangre coincidente se analizaron con el tipo de modelo "WGS", mientras que las muestras sin sangre coincidente utilizaron el tipo de modelo "WGSTUMORONLY". Los archivos VCF resultantes, específicos de cada muestra y cromosoma, se fusionaron con GLNexus^[70] (v1.2.7) para producir resultados por donante, que se concatenaron para abarcar todo el genoma.

Los resultados de los identificadores de variantes se cruzaron para maximizar la especificidad y garantizar una señal biológica verdadera en la extracción de firmas.^[71] Se eliminó cualquier variante encontrada en gnomAD^[72] v3, según lo anotado por Slivar^[73], así como las regiones de baja complejidad^[74] utilizadas para el filtrado en un estudio de laboratorio anterior y los loci del navegador del genoma UCSC^[75] Simple Repeats track, identificados por Tandem Repeats Finder^[76]. Se conservaron las mutaciones no de referencia con cero lecturas en otras muestras de donantes (incluida la sangre), con una profundidad del sitio de 8 y al menos 4 lecturas alternativas. Se requirió una profundidad promedio de 10 para garantizar una cobertura consistente en todo el genoma. Se eliminaron las variantes encontradas en diferentes donantes, ya que podrían ser variantes de la población que no se detectaron. Finalmente, se eliminaron las muestras con menos de 500 variantes de un solo nucleótido (SNV), basándose en trabajos previos sobre criptas de colon, asumiendo una captura de muestra inadecuada^[11],^[53], ajustado para la distribución de la carga de SNV de este estudio (Fig. S1).

Análisis de firmas.

La extracción de firmas se realizó con SigProfilerExtractor^[77] (1.2.5), que es robusto en comparación con otras herramientas de extracción.^[78] Se utilizó el esquema SBS288, que comprende contextos de trinucleótidos de cadena única, para la extracción de firmas SBS, y el esquema ID83 se utilizó para la extracción de firmas de inserción-deleción (indel). Utilizamos el genoma de referencia GRCh38 y la versión 3.4 de COSMIC para la coincidencia de firmas. Se permitió un mínimo de 1 y un máximo de 15 firmas en la extracción de firmas, con la configuración predeterminada para el resto (replicaciones de factorización de matrices no negativas: 100, estrategia de normalización de matrices: modelo de mezcla gaussiana; estabilidad de la solución: 0.8, estabilidad mínima: 0.2, estabilidad combinada: 1.0). La extracción de firmas SBS utilizando todas las mutaciones tuvo una estabilidad promedio de 0.96 y una estabilidad mínima de 0.9 (clonal: 0.94 y 0.86, subclonal: 0.99 y 0.99), y la extracción de firmas de indel de todas las mutaciones tuvo una estabilidad promedio y mínima de 0.99 y 0.98 (clonal: 0.86 y 0.61, subclonal: 0.97 y 0.94). La correlación media entre las mutaciones de la muestra original y las firmas reconstruidas fue ≥ 0.9 para todos los análisis no sub clonales, mientras que las extracciones de firmas sub clonales tuvieron una correlación media de 0.464 para las mutaciones SBS y 0.581 para los indels.

La información de firmas a nivel de estudio y anotada por región del estudio de Cornish et al. (2024) se obtuvo de la Tabla Suplementaria 37. La información de firmas a nivel de paciente y no regional del estudio de Diaz-Gay (2025) se obtuvo de la Tabla Suplementaria 12; los recuentos de las regiones de las muestras con estabilidad de microsatélites se derivaron de la Figura Suplementaria 9. No podemos dividir estos datos en mutaciones clonales y sub clonales debido a la falta de información sobre la frecuencia alélica de las mutaciones. Dado que los tumores de CRC contienen una mezcla de mutaciones clonales y sub clonales,^[79], optamos por comparar estos datos específicos del tumor tal como están con cada extracción de firmas.

Análisis de microsatélites.

Utilizamos la herramienta inSTRbility (GitHub: https://github.com/dashnowlab/inSTRbility) en todos los archivos BAM para evaluar la inestabilidad de los microsatélites en todas las muestras.^[80] Utilizamos un catálogo de cinco marcadores de inestabilidad de microsatélites bien establecidos (BAT25, BAT26, NR21, NR27, NR24)^[81] y requerimos dos índices de inestabilidad de salida que reflejen el tamaño medio y mediano del alelo para que sean concordantes (mayor que 1 desviación estándar por encima de la media) para considerar que un locus es inestable. Si 1-2 loci eran inestables, la muestra se designó como MSI-L. Ninguna de las muestras presentaba 3 o más loci inestables (MSI-H).

Análisis de motivos de colibactina.

Huber et al. probaron el enriquecimiento de motivos en organoides expuestos a colibactina en comparación con organoides de control, registrando todas las bases en un contexto extendido de 10 pb alrededor de las mutaciones T>N, que están asociadas con la mutagénesis de la colibactina y en las firmas de mutación asociadas a la colibactina SBS88 y ID18.^[53] Los autores encontraron que las SNV con adenina en la 3.ª y 4.ª posición de la ventana de secuencia se enriquecieron después de la exposición a la colibactina, y se enriquecieron más en 17 contextos de trinucleótidos que mostraban una similitud coseno significativa con SBS88. Huber et al. validaron además sus motivos específicos de colibactina utilizando un modelo de bosque aleatorio entrenado en los organoides, y aplicaron esta canalización a múltiples conjuntos de datos de secuenciación de cáncer para identificar SNV e indels específicos de colibactina. Utilizamos esta canalización para identificar mutaciones en los motivos de colibactina en este estudio. Todos los scripts utilizados en los análisis se adaptaron directamente del repositorio de GitHub asociado con Huber et al. (https://github.com/ProjectsVanBox/colibactin_detection).

Métodos estadísticos.

Modelamos los datos en el lenguaje estadístico R (v4.5.2) con el paquete lme4 (v1.1.38). Generalmente, utilizamos modelos lineales mixtos generalizados en el espacio binomial negativo, ya que los modelos de Poisson presentaban sobredispersión. Incluimos un factor aleatorio para la identidad del donante y factores fijos para la edad (centrada y escalada para la estabilidad del modelo) y el grupo clínico, etiquetado como cohorte. El término apropiado para el nivel de detalle anatómico (lado [derecho e izquierdo], región [todas las seis] o región_trinaria [derecho, colon transverso, izquierdo]) se incluyó como un término fijo en los diversos análisis. Al incorporar los datos de Lee-Six en estos modelos, como cuando se evalúan las mutaciones de colibactina en las tres cohortes, incluimos el factor fijo de estudio, que nunca fue significativo. Cuando se incluyó el contenido de GC de las bases detectables en estos modelos, el término no fue significativo y condujo a un peor ajuste del modelo (mayor AIC y problemas de convergencia), por lo que se excluyó. También modelamos una prueba de interacción lado*edad para evaluar las diferencias en la pendiente con la edad en todo el colon, pero no hubo una interacción significativa.

Nuestro modelado basado en datos de recuento (SNV y indels específicos de la cripta y motivos de colibactina) utilizó el logaritmo del genoma detectable (número de bases en el genoma de referencia con una profundidad de lectura ≥ 8) como un desplazamiento. Por ejemplo, al modelar la acumulación de SNV específicas de la cripta:

Cuando se modela en función de la proporción, utilizamos el logaritmo del recuento total de mutaciones como un desplazamiento. Por ejemplo, al modelar la proporción de C>[A,C,G] significativa en las regiones:

El término "región - 1", que suprime la intersección y, en su lugar, utiliza una media de nivel en lugar de un nivel de referencia, se utilizó al evaluar todas las regiones para la visualización en la Figura 2, mientras que "región" se utilizó con el aparente valor atípico del recto como referencia para determinar la significación estadística.

La excepción al uso del binomial negativo es el modelo de enriquecimiento y agotamiento de firmas en las regiones. Utilizamos un modelo logarítmico para tener en cuenta la ausencia o presencia binaria (región_bin) de una firma en una muestra.

En cuanto a la estabilidad del modelo, hubo ajustes singulares (indicativos de un posible sobreajuste) en el caso de modelar los subtipos de mutación y el enriquecimiento/agotamiento de firmas, pero optamos por mantener la variable de efectos aleatorios (1 | donante) basándonos en su probable significación biológica. Hubo una instancia de fallo de convergencia al modelar el recuento de indels del motivo de colibactina, probablemente debido a los recuentos más bajos en este escenario (ocasionalmente menos de 10, varias veces menor que las SNV del motivo de colibactina), por lo que evaluamos el mismo modelo en un espacio de Poisson con resultados equivalentes (no significación entre los grupos clínicos).

Todos los modelos se corrigieron para la no independencia ajustando los valores p con la corrección de Benjamini-Hochberg.