La administración de c-di-AMP mediante Salmonella modificada genéticamente activa la vía STING y remodela el microambiente tumoral.

La inmunoterapia tumoral es una estrategia terapéutica transformadora que aumenta la capacidad del sistema inmunitario para reconocer y responder a los antígenos asociados al tumor, lo que permite desencadenar una respuesta inmunitaria robusta y específica del tumor.^[1] En el centro de este proceso se encuentra el microambiente tumoral (MET), un ecosistema complejo que no solo impulsa la progresión del tumor, sino que también modula críticamente la eficacia de las intervenciones inmunoterapéuticas. Un objetivo clave es mejorar la infiltración de células inmunitarias y superar las barreras inmunosupresoras para crear condiciones favorables para la erradicación del tumor.^[2] Dentro de este intrincado microambiente, las células dendríticas (CD) y los macrófagos desempeñan un papel fundamental como células presentadoras de antígenos (CPA), orquestando la respuesta inmunitaria adaptativa contra las neoplasias. Estas células especializadas median la captura y el procesamiento de antígenos, y su posterior presentación a través de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase I y II a los linfocitos T CD8+ y CD4+, respectivamente.^[3] Tras la captación de los restos celulares tumorales, las CD activan las células T CD8+ antitumorales mediante la presentación cruzada, mientras que los macrófagos activan principalmente las células T CD4+ a través de la vía del CMH de clase II.^[4] La expresión de moléculas coestimuladoras y citocinas inmunomoduladoras facilita la activación y expansión de las poblaciones de células T efectoras, incluidas las células T CD8+ citotóxicas y las células T CD4+ colaboradoras, lo que culmina en una potente respuesta inmunitaria antitumoral.^[5] Sin embargo, la activación eficaz de las CPA dentro del MET se enfrenta a importantes desafíos. Una limitación importante proviene de la inmunogenicidad inherentemente pobre de las células tumorales, que con frecuencia exhiben una expresión disminuida o ausente de las moléculas del CMH, lo que compromete la presentación de antígenos.^[6],^[7] Además de estos problemas, incluso cuando se reconocen los antígenos tumorales, estos pueden sufrir un procesamiento subóptimo por parte de las CPA, lo que dificulta significativamente la generación de respuestas inmunitarias eficaces.^[8],^[9] Para superar estas barreras, se han dirigido importantes esfuerzos de investigación hacia el desarrollo de agonistas de la inmunidad innata. En particular, los agonistas de los receptores tipo Toll (TLR) y los agonistas del estimulador de los genes de interferón (STING) han surgido como candidatos prometedores capaces de mejorar la activación de las CPA intratumorales y la presentación de antígenos, lo que podría contrarrestar la inmunosupresión del MET.^[10],^[11],^[12],^[13]

La vía de señalización STING ha ganado protagonismo como un objetivo clave en la inmunidad antitumoral. Sin embargo, la evidencia clínica emergente indica que la monoterapia con agonistas STING muestra una eficacia limitada en la regresión tumoral y puede facilitar paradójicamente los mecanismos de evasión inmunitaria. Un estudio fundamental dirigido por el grupo de investigación de Jenny P.Y. Ting en la Universidad de Carolina del Norte reveló que la activación de STING desencadena una acumulación sustancial de células B reguladoras dentro del MET.^[14] Esta respuesta celular, mediada a través del eje STING-IL-35 en los linfocitos B, suprime posteriormente la proliferación de las células asesinas naturales (NK) y altera la inmunidad antitumoral mediada por las células NK.^[14] Estos hallazgos resaltan las limitaciones de la monoterapia con agonistas STING. Además, la activación de STING fuera del objetivo en las CPA no, como las células T efectoras, puede inducir la apoptosis y alterar la memoria inmunitaria.^[15] Estas ideas sobre la naturaleza de doble filo de la activación de la vía STING han impulsado la exploración de estrategias de administración dirigidas, incluidos los sistemas mediados por bacterias.

Las especies de Salmonella, como patógenos intracelulares anaerobios facultativos, demuestran un notable tropismo tumoral, colonizando los tejidos neoplásicos a niveles 100 a 1000 veces mayores que en los órganos normales.^[16] La cepa atenuada Salmonella typhimurium ΔppGpp utilizada en este estudio alberga mutaciones dobles en los genes relA y spoT, que interrumpen la síntesis de guanosina-3′,5′-bis(difosfato) (ppGpp). Esta modificación genética da como resultado una reducción de 105 a 106 veces en la virulencia en comparación con la cepa de tipo salvaje, al tiempo que se mantienen las capacidades de orientación tumoral. En particular, la cepa ΔppGpp exhibe una menor patogenicidad que las cepas VNP20009 y SalpIL2.^[17] Tras la colonización tumoral, S. typhimurium ΔppGpp induce una respuesta inmunitaria robusta caracterizada por una mayor infiltración de macrófagos y neutrófilos. Estas células inmunitarias, a través de la secreción de citocinas proinflamatorias como el TNF-α y la IL-1β, contribuyen a la supresión del crecimiento tumoral.^[18],^[19],^[20] Para aumentar su potencial terapéutico, la cepa ΔppGpp se ha modificado genéticamente para expresar varios agentes anticancerígenos, incluidos Noxa,^[21] FlaB,^[22] y ClyA,^[18] dentro del MET.

El cáncer colorrectal (CCR) se encuentra entre las neoplasias más prevalentes, con un estimado de 1.926.136 casos notificados en 2022 y una alta mortalidad asociada.^[23] En la última década, las terapias neoadyuvantes que utilizan inhibidores de los puntos de control inmunitario (ICPI) han demostrado una eficacia prometedora en el tratamiento.^[24] El MET funciona como un ecosistema complejo que abarca células inmunitarias, células estromales y componentes extracelulares que influyen colectivamente en la progresión tumoral y la respuesta al tratamiento.^[25] Se ha demostrado que las células T citotóxicas dentro del MET se agotan de forma irreversible, mientras que las células T periféricas se dirigen a los lugares del tumor como resultado de las inmunoterapias. En consecuencia, una respuesta inmunitaria antitumoral es crucial para la eficacia de estos enfoques inmunoterapéuticos.^[26] En este estudio, diseñamos una cepa atenuada de S. typhimurium (SLdisA) para producir di-AMP cíclico (c-di-AMP), dirigida a la activación de STING en las CPA dentro del MET. Este enfoque aprovecha el tropismo tumoral intrínseco de la bacteria para la administración dirigida de c-di-AMP y aprovecha las vías de la inmunidad innata complementarias activadas por el vector bacteriano, con el objetivo de lograr una eficacia antitumoral sinérgica a través de un mecanismo inmunoterapéutico multimodal.

Resultados

Construcción de una cepa capaz de producir c-di-AMP

La vía STING sirve como un vínculo crítico entre la inmunidad innata y adaptativa al activar las CPA, inducir la producción de interferón de tipo I (IFN-I) y promover el reconocimiento de neoantígenos.^[27] Para aprovechar este mecanismo para la inmunoterapia tumoral, diseñamos una cepa atenuada de S. typhimurium ΔppGpp (SL) para expresar la sintetasa de di-AMP cíclico (c-di-AMP, CDA) (SLdisA; Figura 1A). El análisis de inmunoblotaje confirmó la expresión inducible de L-arabinosa de la proteína recombinante (Figura 1B), y la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) verificó la producción exitosa de c-di-AMP por SLdisA, como lo demuestra su coelución con un estándar sintético (Figura 1C). Si bien SLdisA exhibió un ligero retraso en el crecimiento durante la fase logarítmica temprana en comparación con la cepa SL parental, ambas culturas alcanzaron densidades ópticas comparables en la fase estacionaria (Figura 1D), lo que sugiere un mantenimiento estable de la modificación genética sin costos de aptitud física graves. En conjunto, estos resultados establecen SLdisA como un vector bacteriano eficaz para la administración de c-di-AMP, lo que proporciona una base para evaluar su eficacia antitumoral in vivo.

SLdisA activa las CD a través de mecanismos dependientes de STING

Para caracterizar la activación de las CD inducida por SLdisA, realizamos experimentos de cocultivo in vitro con CD derivadas de la médula ósea (CDMO) (Figura 2). La estimulación con SLdisA aumentó significativamente la secreción de IFN-1 de las CDMO, y este efecto se abolió mediante el inhibidor de STING H-151 (Figura 2A), lo que confirmó la activación inmunitaria dependiente de la vía STING.

El análisis citométrico de flujo reveló una marcada regulación al alza de los principales marcadores de maduración (CMH II) en las CDMO tratadas con SLdisA (Figuras 2B y 2C), lo que indica una mayor capacidad de presentación de antígenos. Para evaluar las consecuencias funcionales, evaluamos las respuestas de las células T utilizando un sistema de cocultivo de CDMO y esplenocitos. Las CDMO preparadas con SLdisA promovieron significativamente la proliferación de esplenocitos (Figura S1). En conjunto, estos hallazgos demuestran que SLdisA mejora la maduración de las CD y la posterior proliferación de esplenocitos a través de un mecanismo mediado por STING.

SLdisA exhibe una mayor eficacia antitumoral in vivo

Para evaluar el potencial terapéutico de SLdisA, establecimos ratones portadores de tumores CT26 y administramos SL o SLdisA por inyección intravenosa, seguida de la inducción de L-arabinosa para activar la producción de c-di-AMP (Figura 3A). El tratamiento con SLdisA condujo a una reducción significativamente mayor de los volúmenes tumorales en el punto final del experimento en comparación con los grupos tratados con SL y los grupos de control (Figuras 3B–3D y S2) y se asoció con una mejor supervivencia (Figura 3E).

Aunque ambos grupos de tratamiento bacteriano exhibieron una pérdida de peso transitoria después de la inoculación, el peso corporal volvió posteriormente a niveles comparables al del grupo de control (Figura 3F), lo que indica una buena tolerabilidad de la terapia. En conjunto, estos resultados demuestran que la producción de c-di-AMP a través de la expresión de disA mejora significativamente la eficacia antitumoral de la plataforma basada en Salmonella sin comprometer la seguridad del huésped.

Biodistribución in vivo y perfil de seguridad de SLdisA

Para caracterizar la dinámica espacio-temporal de la colonización bacteriana, realizamos imágenes de bioluminiscencia de ratones portadores de tumores después de la administración intravenosa de cepas SL o SLdisA que expresan Lux (Figura 4A). Ambas cepas permanecieron detectables mediante bioluminiscencia hasta 12 días después de la inoculación, lo que demuestra una viabilidad sostenida in vivo. El análisis bacteriológico cuantitativo confirmó la colonización tumoral preferencial por ambas cepas, con SLdisA que exhibió una carga bacteriana tumoral significativamente mayor que SL en el día 5 (Figura 4B), lo que implica que la producción de c-di-AMP puede mejorar el tropismo tumoral.

Para evaluar la posible toxicidad, realizamos una evaluación histopatológica exhaustiva de los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmones y riñones) y un análisis bioquímico del suero. La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) no reveló diferencias obvias en los atributos patológicos entre los diferentes grupos de tratamiento (Figura 4C). Los marcadores séricos de la función hepática (alanina aminotransferasa [ALT], aspartato aminotransferasa [AST]) se mantuvieron dentro de los rangos normales en todos los grupos (Figura 4D), lo que confirmó la ausencia de hepatotoxicidad relacionada con el tratamiento. En conjunto, estos resultados demuestran que SLdisA conserva una capacidad de orientación tumoral favorable al tiempo que exhibe un excelente perfil de seguridad.

El perfilado transcriptómico revela la activación inmunitaria inducida por SLdisA

Para dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a los efectos terapéuticos de SLdisA, realizamos un secuenciamiento de ARN de los tejidos tumorales de los ratones tratados. El análisis comparativo reveló una mayor regulación de los genes en el grupo tratado con SLdisA en relación con los grupos tratados con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y SL (Figura 5A). La anotación funcional identificó un enriquecimiento significativo de las vías de activación inmunitaria en los tumores tratados con SLdisA (Figura 5B), lo que fue consistente con los niveles elevados de las principales citocinas (IFN-β, granzima B, IL-2, TNF-α, IL-6 y TGF-β) (Figura S3). Además, el tratamiento con SLdisA también aumentó la expresión de CD8a y PD-L1 en comparación con los controles.

Los análisis de la ontología génica (GO) y la enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) confirmaron la activación de las vías inmunitarias mediada por SLdisA (Figura S4). El análisis CIBERSORT (v1.03) demostró una expansión significativa de las poblaciones de CD activadas y menos inmaduras en los tumores tratados con SLdisA (Figura 5C). Al mismo tiempo, observamos una reducción de las células T CD8+ de memoria y las células Th2 en el grupo SLdisA. Dado que las células Th2 pueden formar un microambiente inmunosupresor y promover la evasión inmunitaria tumoral, su disminución es indicativa de un cambio favorable.^[28] En conjunto, estos hallazgos sugieren que SLdisA ejerce sus efectos antitumorales principalmente mediante la activación de las CD, lo que promueve las respuestas de las células T y reprograma el MET de un estado inmunosupresor a un estado inmunostimulante.

SLdisA remodela el microambiente inmunitario tumoral

Para caracterizar la inmunomodulación mediada por SLdisA, analizamos los leucocitos infiltrantes tumorales 24 horas después de la inducción con L-arabinosa. La cuantificación por citometría de flujo reveló un aumento significativo de la infiltración de células T CD8+ y CD4+ en los tumores tratados con SLdisA en comparación con los grupos tratados con SL y el grupo control (Figuras 6A–6D).

El análisis de la polarización de macrófagos demostró un aumento selectivo de macrófagos tipo M1 (proinflamatorios) en los tumores tratados con SLdisA (Figuras 6E y 6F). En conjunto, estos hallazgos establecen que SLdisA recluta linfocitos T citotóxicos y promueve la polarización de macrófagos proinflamatorios dentro del microambiente tumoral (TME).

SLdisA actúa de forma sinérgica con el bloqueo de PD-1 para mejorar la eficacia antitumoral

Basándonos en nuestros hallazgos de que SLdisA aumenta la expresión de PD-L1 (Figura S3) y mejora la infiltración de células T (Figura 6), hipotetizamos que la combinación de SLdisA con el bloqueo de PD-1 produciría efectos terapéuticos sinérgicos (Figura 7A). En consonancia con esta hipótesis, la terapia combinada produjo una mejora significativa en el control tumoral y una prolongación de la supervivencia en comparación con los grupos de monoterapia (Figuras 7B y 7C). Estos resultados demuestran que la activación inmune mediada por SLdisA potencia la actividad antitumoral de la inhibición del punto de control PD-1, lo que proporciona una base para una prometedora estrategia de inmunoterapia combinada.

Construcción de una cepa capaz de producir c-di-AMP

La vía STING sirve como un vínculo crítico entre la inmunidad innata y la adaptativa al activar las APC, inducir la producción de interferón de tipo I (IFN-I) y promover el reconocimiento de neoantígenos.^[27] Para aprovechar este mecanismo para la inmunoterapia tumoral, diseñamos una cepa atenuada de S. typhimurium ΔppGpp (SL) para que exprese la sintetasa de di-AMP cíclico (c-di-AMP, CDA) (SLdisA; Figura 1A). El análisis de inmunoblotaje confirmó la expresión inducible de la proteína recombinante por L-arabinosa (Figura 1B), y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) verificó la producción exitosa de c-di-AMP por SLdisA, como lo demuestra su coelución con un estándar sintético (Figura 1C). Si bien SLdisA exhibió un ligero retraso en el crecimiento durante la fase logarítmica temprana en comparación con la cepa SL parental, ambas culturas alcanzaron densidades ópticas comparables en la fase estacionaria (Figura 1D), lo que sugiere un mantenimiento estable de la modificación genética sin costos de aptitud graves. En conjunto, estos resultados establecen que SLdisA es un vector bacteriano eficaz para la administración de c-di-AMP, lo que proporciona una base para evaluar su eficacia antitumoral in vivo.

SLdisA activa las DC a través de mecanismos dependientes de STING

Para caracterizar la activación de DC inducida por SLdisA, realizamos experimentos de cocultivo in vitro con DC derivadas de médula ósea (BMDC) (Figura 2). La estimulación con SLdisA aumentó significativamente la secreción de IFN-1 de las BMDC, y este efecto se abolió con el inhibidor de STING H-151 (Figura 2A), lo que confirmó la activación inmune dependiente de la vía STING.

El análisis por citometría de flujo reveló una marcada regulación al alza de los principales marcadores de maduración (MHC II) en las BMDC tratadas con SLdisA (Figuras 2B y 2C), lo que indica una mayor capacidad de presentación de antígenos. Para evaluar las consecuencias funcionales, evaluamos las respuestas de las células T utilizando un sistema de cocultivo de BMDC y esplenocitos. Las BMDC activadas con SLdisA promovieron significativamente la proliferación de esplenocitos (Figura S1). En conjunto, estos hallazgos demuestran que SLdisA mejora la maduración de las DC y la posterior proliferación de esplenocitos a través de un mecanismo mediado por STING.

SLdisA exhibe una mayor eficacia antitumoral in vivo

Para evaluar el potencial terapéutico de SLdisA, establecimos ratones portadores de tumores CT26 y administramos SL o SLdisA por inyección intravenosa, seguido de la inducción con L-arabinosa para activar la producción de c-di-AMP (Figura 3A). El tratamiento con SLdisA condujo a una reducción significativa de los volúmenes tumorales en el punto final del experimento en comparación con los grupos tratados con SL y el grupo control (Figuras 3B–3D y S2) y se asoció con una mejor supervivencia (Figura 3E).

Aunque ambos grupos de tratamiento bacteriano exhibieron una pérdida de peso transitoria después de la inoculación, el peso corporal volvió posteriormente a niveles comparables al del grupo control (Figura 3F), lo que indica una buena tolerabilidad de la terapia. En conjunto, estos resultados demuestran que la producción de c-di-AMP a través de la expresión de disA mejora significativamente la eficacia antitumoral de la plataforma basada en Salmonella sin comprometer la seguridad del huésped.

Biodistribución in vivo y perfil de seguridad de SLdisA

Para caracterizar la dinámica espacio-temporal de la colonización bacteriana, realizamos imágenes de bioluminiscencia de ratones portadores de tumores después de la administración intravenosa de SL o SLdisA que expresan Lux (Figura 4A). Ambas cepas permanecieron detectables mediante luminiscencia hasta 12 días después de la inoculación, lo que demuestra una viabilidad sostenida in vivo. El análisis bacteriológico cuantitativo confirmó la colonización tumoral preferencial por ambas cepas, con SLdisA exhibiendo una carga bacteriana tumoral significativamente mayor que SL en el día 5 (Figura 4B), lo que implica que la producción de c-di-AMP puede mejorar el tropismo tumoral.

Para evaluar la posible toxicidad, realizamos una evaluación histopatológica exhaustiva de los principales órganos (corazón, hígado, bazo, pulmones y riñones) y un análisis bioquímico del suero. La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) no reveló diferencias obvias en los atributos patológicos entre los diferentes grupos de tratamiento (Figura 4C). Los marcadores séricos de la función hepática (alanina aminotransferasa [ALT], aspartato aminotransferasa [AST]) se mantuvieron dentro de los rangos normales en todos los grupos (Figura 4D), lo que confirmó la ausencia de hepatotoxicidad relacionada con el tratamiento. En conjunto, estos resultados demuestran que SLdisA conserva una capacidad de orientación tumoral favorable al tiempo que exhibe un excelente perfil de seguridad.

El perfilado transcriptómico revela la activación inmune inducida por SLdisA

Para dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a los efectos terapéuticos de SLdisA, realizamos un secuenciamiento de ARN de los tejidos tumorales de los ratones tratados. El análisis comparativo reveló una mayor regulación de genes en el grupo tratado con SLdisA en relación con los grupos tratados con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y SL (Figura 5A). La anotación funcional identificó un enriquecimiento significativo de las vías de activación inmune en los tumores tratados con SLdisA (Figura 5B), lo que fue consistente con los niveles elevados de las principales citocinas (IFN-β, granzima B, IL-2, TNF-α, IL-6 y TGF-β) (Figura S3). Además, el tratamiento con SLdisA también aumentó la expresión de CD8a y PD-L1 en comparación con los controles.

Los análisis de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) confirmaron la activación de las vías inmunes mediada por SLdisA (Figura S4). El análisis CIBERSORT (v1.03) demostró una expansión significativa de las poblaciones de DC activadas y menos inmaduras en los tumores tratados con SLdisA (Figura 5C). Concurrentemente, observamos una reducción de las células T de memoria CD8+ y las células Th2 en el grupo SLdisA. Dado que las células Th2 pueden formar un microambiente inmunosupresor y promover la evasión inmune tumoral, su disminución es indicativa de un cambio favorable.^[28] En conjunto, estos hallazgos sugieren que SLdisA ejerce sus efectos antitumorales principalmente mediante la activación de las DC, lo que promueve las respuestas de las células T y reprograma el TME de un estado inmunosupresor a un estado inmunostimulador.

SLdisA remodela el microambiente inmune tumoral

Para caracterizar la inmunomodulación mediada por SLdisA, analizamos los leucocitos infiltrantes tumorales 24 horas después de la inducción con L-arabinosa. La cuantificación por citometría de flujo reveló un aumento significativo de la infiltración de células T CD8+ y CD4+ en los tumores tratados con SLdisA en comparación con los grupos tratados con SL y el grupo control (Figuras 6A–6D).

El análisis de la polarización de macrófagos demostró un aumento selectivo de macrófagos tipo M1 (proinflamatorios) en los tumores tratados con SLdisA (Figuras 6E y 6F). En conjunto, estos hallazgos establecen que SLdisA recluta linfocitos T citotóxicos y promueve la polarización de macrófagos proinflamatorios dentro del TME.

SLdisA actúa de forma sinérgica con el bloqueo de PD-1 para mejorar la eficacia antitumoral

Basándonos en nuestros hallazgos de que SLdisA aumenta la expresión de PD-L1 (Figura S3) y mejora la infiltración de células T (Figura 6), hipotetizamos que la combinación de SLdisA con el bloqueo de PD-1 produciría efectos terapéuticos sinérgicos (Figura 7A). En consonancia con esta hipótesis, la terapia combinada produjo una mejora significativa en el control tumoral y una prolongación de la supervivencia en comparación con los grupos de monoterapia (Figuras 7B y 7C). Estos resultados demuestran que la activación inmune mediada por SLdisA potencia la actividad antitumoral de la inhibición del punto de control PD-1, lo que proporciona una base para una prometedora estrategia de inmunoterapia combinada.

Discusión

En este estudio, desarrollamos SLdisA, una cepa atenuada de S. typhimurium diseñada para administrar el agonista STING c-di-AMP, que activa potentes DC y mejora las respuestas de las células T específicas del tumor. Nuestros estudios preclínicos demuestran que tanto SL como SLdisA exhiben un tropismo tumoral sostenido, manteniendo colonias viables durante 12 días, una propiedad consistente con informes anteriores del tropismo de Salmonella hacia diversos tipos de tumores.^[29] Uno de los mecanismos de orientación tumoral implica la red caótica de vasos sanguíneos dentro de ellos, lo que conduce a la formación de regiones deficientes en oxígeno y necróticas, estableciendo así condiciones ideales para microorganismos anaeróbicos vitales.^[30] Además, los nutrientes liberados de las células tumorales necróticas, junto con la motilidad bacteriana y las quimiocinas, fomentan el crecimiento y la expansión de las bacterias. Salmonella se ve obligada a infiltrarse en el tumor para su propia protección después de la respuesta inmune del huésped, ya que el TME exhibe una naturaleza inmunosupresora pronunciada, lo que impide que el sistema inmune del huésped elimine las bacterias.^[31]

Este sistema de administración dirigido al tumor logra un efecto terapéutico dual: (1) la activación de STING mediada por bacterias aumenta la inmunogenicidad tumoral y (2) los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) intrínsecos de las bacterias proporcionan una estimulación inmune adicional, reprogramando colectivamente los microambientes tumorales inmunológicamente "fríos" en microambientes "calientes".^[32] En particular, la localización tumoral específica de SLdisA garantiza la seguridad sistémica, como lo confirma el análisis histopatológico exhaustivo, que no reveló daños orgánicos relacionados con el tratamiento. Nuestros hallazgos establecen la administración de agonistas STING mediada por vectores microbianos como un paradigma terapéutico prometedor que combina una orientación tumoral precisa con una potente activación inmune. Este enfoque aborda las limitaciones clave de la inmunoterapia convencional al superar simultáneamente la evasión inmune tumoral y al minimizar la toxicidad fuera del objetivo.

DisA funciona como una sintetasa canónica de c-di-AMP que activa potentes la vía de señalización STING a través de c-di-AMP.^[33] La activación de STING en las APC orquesta las tres señales críticas necesarias para la activación de los linfocitos T: (1) presentación de antígenos a través de complejos péptido-MHC, (2) coestimulación a través de interacciones CD28-CD80/CD86, CD40/CD40L, 4-1BBL/4-1BB y SLAM-SLAM, y (3) señalización parácrina mediada por citocinas que en última instancia determina la diferenciación y la función de las células T.^[27] Nuestros datos experimentales demuestran que SLdisA mejora la maduración de las BMDC, aumentando la expresión de MHC II involucrado en la presentación de antígenos y la coestimulación. Esta activación de DC se tradujo funcionalmente en una mayor proliferación de esplenocitos, lo que proporciona información mecanicista sobre los efectos antitumorales de SLdisA. La infección por Salmonella se detecta inicialmente mediante TLR en macrófagos y DC.^[34] Estos receptores reconocen varios PAMP y estimulan la respuesta inmune del huésped, lo que promueve los efectos antitumorales.^[34] El c-di-AMP producido por disA aumenta la capacidad de presentación de antígenos de las APC, activando las células T para eliminar los tumores. Esta activación coordinada de las DC dentro del TME estimula fuertemente las respuestas de los linfocitos, lo que subyace a la mayor eficacia terapéutica de SLdisA.

Mediante un perfil inmunológico exhaustivo, demostramos que SLdisA (1) activa múltiples vías relacionadas con la inmunidad, (2) promueve la maduración de las células dendríticas (DC) dentro del microambiente tumoral (TME) y (3) mejora la infiltración de macrófagos M1, células T CD4+ y células T CD8+. Cabe destacar que el tratamiento con SLdisA aumentó la expresión de marcadores de activación de las células T (CD8a, granzima B) y estimuló respuestas robustas de IFN-I, lo que indica el establecimiento de un microambiente tumoral proinflamatorio propicio para una inmunidad antitumoral eficaz. Estos hallazgos establecen que la reprogramación inmunitaria mediada por SLdisA inicia potentes respuestas de las células T a través de mecanismos dependientes de las DC. Nuestros resultados coinciden con trabajos previos que muestran que SLdacA, otra cepa de S. typhimurium productora de c-di-AMP, también mejora el reclutamiento y la activación de las células T,^[29], lo que demuestra en conjunto que la administración de c-di-AMP mediada por bacterias representa una estrategia robusta y aplicable para superar la evasión inmune tumoral.

Cabe destacar que observamos una regulación al alza significativa de PD-L1 tras el tratamiento con SLdisA. El aumento de la expresión de PD-L1 en los tumores del grupo SLdisA se atribuye a la activación de la señalización STING^[35] y al consiguiente TME inflamatorio.^[36] Reconociendo esto como un mecanismo de resistencia inmunitaria adaptativa, hipotetizamos que la combinación de SLdisA con el bloqueo de PD-1 mejoraría la eficacia terapéutica. Esta combinación demostró, de hecho, una actividad antitumoral superior en comparación con la monoterapia. El eje PD-1/PD-L1 desempeña un papel fundamental en la regulación de la activación, la proliferación y las funciones efectoras de las células T, y su inhibición representa una piedra angular de la inmunoterapia moderna contra el cáncer.^[37],^[38],^[39] Si bien el bloqueo de PD-1/PD-L1 ha demostrado un notable éxito clínico en múltiples neoplasias,^[40] su eficacia sigue siendo limitada en tumores no inflamados (“fríos”).^[41] Las terapias bacterianas como SLdisA abordan esta limitación al convertir tumores inmunológicamente quiescentes en microambientes inflamados. Este paradigma está respaldado por estudios recientes que muestran efectos terapéuticos mejorados al combinar terapias bacterianas con la inhibición de puntos de control. Por ejemplo, E. coli Nissle1917 actuó de forma sinérgica con el bloqueo de PD-L1 al expandir los linfocitos infiltrantes tumorales^[42] y Salmonella que expresa FlaB potenció la terapia combinada de IL-15/PD-L1 en modelos murinos 4T1 y B16F10.^[43] Nuestros hallazgos revelan que SLdisA aumenta aún más la eficacia del bloqueo de PD-1 a través de la activación de la vía STING, creando un microambiente tumoral proinflamatorio con una mayor infiltración de células T. Este trabajo establece la activación mediada por bacterias de STING como una estrategia poderosa para superar la resistencia a la inmunoterapia de puntos de control.

Se han explorado previamente diversas terapias basadas en bacterias para el tratamiento del cáncer.^[44] En ensayos clínicos, estas cepas oncolíticas no han logrado demostrar una eficacia robusta o se han visto obstaculizadas por toxicidades limitantes de la dosis.^[44] Aunque se requieren más estudios preclínicos para demostrar la seguridad a largo plazo de SLdisA, las indicaciones positivas de eficacia facilitarían el desarrollo de cepas modificadas adicionales con funcionalidades adaptadas a los requisitos específicos de diferentes cánceres y pacientes. Si bien la inmunoterapia tumoral mediada por bacterias se encuentra todavía en las primeras etapas de aplicación en terapias humanas, nuestra investigación destaca su potencial y proporciona orientación para el desarrollo de futuras estrategias de evaluación clínica.

Es importante señalar que el presente estudio se llevó a cabo en un único modelo murino de CRC. Los trabajos futuros deberían validar la eficacia terapéutica de SLdisA en un panel más amplio de líneas celulares humanas de CRC y en organoides derivados de pacientes para establecer plenamente su potencial traslacional.

En resumen, en este estudio, diseñamos una cepa atenuada de S. typhimurium ΔppGpp para expresar la sintasa de c-di-AMP DisA, creando una potente plataforma inmunoterapéutica basada en microorganismos. SLdisA ejerce sus efectos antitumorales a través de un mecanismo multifacético: (1) la activación de la vía STING mejora la capacidad de presentación de antígenos de las DC, (2) la posterior activación y reclutamiento de las células T se amplifican y (3) se logra una mejora sinérgica de la eficacia del bloqueo del punto de control PD-1. Estos hallazgos avanzan en el potencial de traslación clínica de la inmunoterapia contra el cáncer mediada por bacterias al demostrar cómo los microorganismos modificados pueden remodelar el TME para superar las limitaciones clave de las inmunoterapias actuales.

Materiales y métodos

Línea celular, plásmido y cepa bacteriana

Las líneas celulares CT26 se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC; VA, EE. UU.) y se cultivaron en condiciones estándar (37 °C, 5 % de CO2) en medio Dulbecco modificado de Eagle (DMEM; Gibco, Nueva York, EE. UU.) suplementado con un 10 % de suero bovino fetal (FBS; Newzerum, Christchurch, Nueva Zelanda) y un 1 % de penicilina-estreptomicina. La cepa S. typhimurium ΔppGpp (relA:cat, spoT:kan, SL),^[45], modificada genéticamente para expresar el gen de la luciferasa (lux) y un marcador de resistencia a la kanamicina, fue amablemente proporcionada por J. J. Min (Instituto de Imagenología y Terapia Molecular, Hospital Universitario Nacional de Chonnam Hwasun, Jeonnam, República de Corea). El gen disA, que codifica la sintasa de c-di-AMP, se derivó de Bacillus thuringiensis BMB171 (número de acceso GenBank: CP001903.1).^[46] Se incorporó una etiqueta epítopo FLAG en el extremo C-terminal de disA, y la secuencia del gen modificado se sintetizó por General Biol (Anhui, China). El constructo disA-FLAG se clonó posteriormente en el vector plasmídico pBAD, que contiene un gen de resistencia a la ampicilina, utilizando los sitios de restricción NcoI y PmeI. El plásmido recombinante (pBAD-disA) se introdujo posteriormente en S. typhimurium ΔppGpp mediante electroporación (1,8 kV; Bio-Rad). Las cepas transformadas se mantuvieron en medio Luria-Bertani (LB) suplementado con kanamicina (50 μg/mL) y ampicilina (100 μg/mL) y se conservaron a −80 °C en un 25 % de glicerol para su almacenamiento a largo plazo.

Prueba de CDA mediante HPLC

Para evaluar la producción de di-AMP cíclico (CDA) in vitro, se recogieron cultivos bacterianos por centrifugación, se lavaron dos veces con PBS de Dulbecco (DPBS) y se resuspendieron a una concentración de 1010 células/mL antes de almacenarlos a −80 °C. Tras la extracción de los gránulos bacterianos, el CDA se cuantificó mediante HPLC (Waters e2695). La separación cromatográfica se realizó utilizando un sistema de elución en gradiente que comprende dos fases móviles: fase móvil A (0,1 % de ácido fórmico) y fase móvil B (0,1 % de ácido fórmico en acetonitrilo). La temperatura de la columna se mantuvo a 30 °C y el caudal se fijó en 0,8 mL/min.

Cultivo de células dendríticas

Las BMDC se generaron extrayendo asépticamente células de la médula ósea de tibias y fémures de ratón. Tras la extracción, los eritrocitos se lisaron utilizando un tampón de lisis de eritrocitos estéril (Wuhan Servicebio Technology, Co., Ltd.). Las células de la médula ósea aisladas se resuspendieron posteriormente en medio RPMI 1640-GlutaMax suplementado con un 10 % de FBS, 50 μM de β-mercaptoetanol, penicilina-estreptomicina (100 UI/mL y 100 μg/mL) y 20 ng/mL de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF; Yeasen, Shanghái, China). A partir del día 3, se añadió medio de cultivo fresco cada dos días. Después de 8 días, las BMDC estaban listas para los experimentos posteriores.

Experimentos con ratones

Se adquirieron ratones BALB/c machos libres de patógenos (de 5 a 6 semanas de edad) del Centro de Animales de Laboratorio de Guangdong (Guangzhou, China). El Comité de Investigación de Animales de la Universidad de Hainan aprobó los protocolos animales utilizados en este estudio. Para establecer modelos tumorales, se inyectaron subcutáneamente 1 × 106 células CT26 en el flanco derecho de cada ratón. El crecimiento tumoral se controló cada dos días y el volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula: (longitud × ancho2)/2. Una vez que los tumores alcanzaron un volumen de 90-200 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento y se les administró PBS, S. typhimurium ΔppGpp (SL) o SLdisA a una dosis de 3,75 × 107 unidades formadoras de colonias (UFC) en 125 μL mediante inyección intravenosa. Para inducir la expresión génica, se administró L-arabinosa (V900920, Sigma, EE. UU.) por vía intraperitoneal a 0,15 g por ratón al día, comenzando 24 horas después de la inyección bacteriana y continuando durante 15 días.

Para los experimentos de terapia combinada que involucran el bloqueo de PD-1, los ratones se asignaron aleatoriamente a los siguientes grupos: (1) control, (2) anti-PD-1, (3) SL, (4) SL + anti-PD-1, (5) SLdisA y (6) SLdisA + anti-PD-1. El anticuerpo anti-PD-1 (Sintilimab Injection) se administró por vía intravenosa a 10 mg/kg en los días 3 y 10 después de la inoculación del tumor. Se observaron estrictamente los puntos finales humanitarios y los ratones con tumores que superaban los 1500 mm3 fueron sacrificados.

Análisis de Western blotting

Para validar la expresión in vitro de la proteína disA, se cultivaron cultivos bacterianos a una densidad óptica (OD600) de 0,5-0,7 y se indujeron con un 4 % de L-arabinosa. Después de un período de inducción de 4,5 horas, las células bacterianas se recogieron por centrifugación. La expresión de proteínas se confirmó posteriormente mediante inmunoblotting utilizando un anticuerpo anti-FLAG (Biosynthesis Biotechnology, Beijing, China).

Análisis de qPCR

Para evaluar la expresión de citocinas dentro del TME, se recogieron tejidos tumorales 24 horas después de la administración de L-arabinosa. El ARN total se aisló utilizando el reactivo TRIzol (Wuhan Servicebio Technology, Co., Ltd.) y se transcribió posteriormente en ADN complementario (ADNc) utilizando un kit de síntesis de ADNc SuperScript II (Takara Biomedical Technology, Beijing, China). Se realizó un análisis de PCR cuantitativa (qPCR) utilizando el Master Mix ChamQ SYBR Color qPCR (Vazyme, Nanjing, China) para cuantificar los niveles de expresión de los genes diana. Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla 1, y el gen HPRT se utilizó como gen de referencia.

Ensayo de activación inmunitaria in vitro

Para caracterizar la activación de las DC dependiente de STING, las BMDC se cocultivaron con cepas bacterianas durante 90 minutos antes de reemplazar el medio con RPMI 1640 que contiene antibióticos. Para investigar la dependencia de STING de la activación inmunitaria inducida por SLdisA, se realizaron experimentos de cotratamiento con el inhibidor de STING H-151 (2 μM de concentración final; MedChemExpress, EE. UU.). Los sobrenadantes se recogieron 4 horas después del tratamiento para su posterior análisis. La concentración de IFN-β en los sobrenadantes de BMDC se cuantificó utilizando kits ELISA disponibles comercialmente (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd.), con mediciones de absorbancia normalizadas a una curva estándar de IFN-β recombinante.

Ensayo de proliferación de esplenocitos

Para evaluar la capacidad de proliferación de las células T, se aislaron asépticamente esplenocitos de bazo de ratón y se etiquetaron con éster de succinimidilo de carboxyfluoresceína (CFSE, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Después de la estimulación de las BMDC como se describió anteriormente, los esplenocitos etiquetados con CFSE se cocultivaron con las BMDC en una proporción de 10:1. Después de 72 horas de cocultivo, se recogieron las células y se analizaron mediante citometría de flujo para evaluar la proliferación de los esplenocitos.

Prueba de índices bioquímicos

Los niveles séricos de ALT y AST se cuantificaron utilizando un analizador bioquímico BS-240vet. Todos los kits de ensayo se adquirieron de Shenzhen Mindray Animal Medical Technology Co., Ltd., y los análisis se realizaron de acuerdo con los protocolos del fabricante.

Biodistribución in vivo

Para evaluar la biodistribución in vivo de SLdisA, los ratones portadores de tumores recibieron inyecciones intravenosas de SL o SLdisA a través de la vena de la cola. Se administró L-arabinosa por vía intraperitoneal 24 horas después de la inoculación bacteriana. Se realizó una imagen de bioluminiscencia en los días 2, 4, 6, 8, 10 y 12 utilizando un sistema de imagen IVIS 100 (Caliper Life Sciences) para controlar las señales derivadas de Lux de S. typhimurium ΔppGpp, lo que permite el seguimiento longitudinal de la localización y la persistencia bacterianas.

Recuento de bacterias

Para cuantificar la colonización bacteriana en varios órganos, se recolectaron asépticamente el corazón, el hígado, el bazo, los pulmones, los riñones y el tumor de ratones portadores de tumor, a los 3 y 5 días posteriores a la inoculación. Los tejidos se homogeneizaron y se diluyeron seriadamente en PBS estéril. Se tomaron alícuotas de las suspensiones de tejido y se sembraron en agar LB suplementado con kanamicina (50 μg/mL) y se incubaron durante la noche a 37 °C. Las cargas bacterianas se determinaron mediante el recuento de colonias y se normalizaron al peso del tejido utilizando el siguiente cálculo: Y × 10Z × (1 + X) × 10/X (UFC/g; donde X = peso del tejido, Y = colonias en la placa de Petri y Z = factor de dilución).

Tinción con hematoxilina y eosina

Para el análisis histológico, los ratones se sacrificaron 3 días después del tratamiento y se recolectaron inmediatamente los principales órganos (corazón, pulmones, hígado, bazo y riñones) y se fijaron en formaldehído al 4% durante 48 h. Posteriormente, los tejidos se procesaron utilizando protocolos estándar de inclusión en parafina y se cortaron en secciones de 4 μm de espesor. Para la desparafinación de las secciones de parafina, se aplicaron secuencialmente las siguientes soluciones: solución de desparafinación ecológica I durante 20 min, solución de desparafinación ecológica II durante 20 min, etanol anhidro I durante 5 min, etanol anhidro II durante 5 min y alcohol al 75% durante 5 min, seguido de un lavado con agua limpia. Para la tinción con hematoxilina y eosina, las secciones de parafina se sumergieron en solución de tinción con hematoxilina durante 3 a 5 min y luego se lavaron con agua. Posteriormente, las secciones se trataron con solución de diferenciación, se lavaron nuevamente con agua, se sumergieron en solución azul y se enjuagaron con agua corriente. Luego, las secciones de parafina se sumergieron secuencialmente en soluciones de alcohol al 85% y 95% durante 5 min cada una, seguido de la tinción en solución de eosina durante 5 min. Para deshidratar y aclarar las secciones, se sumergieron secuencialmente en etanol al 95% I durante 5 min, etanol al 95% II durante 5 min, etanol anhidro I durante 5 min, etanol anhidro II durante 5 min, xileno I durante 5 min y xileno II durante 5 min. Después del secado, las secciones se sellaron con goma neutra. Se adquirieron imágenes digitales de las secciones teñidas utilizando un escáner de portaobjetos de alta resolución para una evaluación patológica exhaustiva.

Análisis de citometría de flujo

Inmunofenotipado in vitro: las BMDC se estimularon con cepas bacterianas y los esplenocitos se cocultivaron con BMDC activadas. Posteriormente, las células se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromos dirigidos a marcadores de superficie, incluido el anti-CD11c (clon N418, Elabscience Biotechnology Co., Ltd.) FITC y el anti-MHC II (clon M5/114, Elabscience Biotechnology Co., Ltd.) PE-Cy7, y se analizaron utilizando un citómetro CytoFLEX (Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.).

Perfilado inmunitario in vivo: los tumores se extirparon 48 h después de la administración bacteriana y se procesaron en suspensiones de células individuales mediante la digestión enzimática con 1 mg/mL de colagenasa tipo I (Wuhan Servicebio Technology) durante 45 min a 37 °C. Después de la disociación mecánica y la filtración a través de un tamiz de 70 μm, las células se tiñeron con anticuerpos fluorescentes durante 30 min. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-F4/80 (clon CI: A3-1) FITC, anti-CD86 (clon GL-1) APC, anti-CD3 (clon 17A2) FITC, anti-CD4 (clon GK1.5) APC y anti-CD8 (clon YTS-169) APC, todos adquiridos de Elabscience Biotechnology Co., Ltd. Las poblaciones de células inmunitarias se cuantificaron utilizando un citómetro CytoFLEX (Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.), adquiriendo un mínimo de 10 000 eventos por muestra.

Secuenciación de ARN y análisis transcriptómico

Se extrajo el ARN total de las muestras de tumor (n = 3 por grupo PBS/SLdisA; n = 2 por grupo SL) utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen), siguiendo el protocolo del fabricante. Se evaluó la integridad y la concentración del ARN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific). Antes de la secuenciación, los datos brutos se sometieron a filtración para producir datos limpios de alta calidad. Todos los análisis posteriores utilizaron estos datos limpios. Las bibliotecas de cDNA se prepararon con el kit Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2 (Illumina) como se describió previamente.^[50] Los datos de secuenciación se alinearon y se cuantificaron utilizando Cufflinks (v2.2.1),^[51], y los niveles de expresión génica se informaron como transcritos por millón (TPM). El análisis de genes diferencialmente expresados (DEG) se realizó utilizando los criterios |log2(FoldChange)| > 1 y padj < 0,05.

Se generaron tres conjuntos comparativos de DEG: PBS vs. SL, SL vs. SLdisA y PBS vs. SLdisA. El software de análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) (versión 4.0.3) se utilizó para realizar el análisis de enriquecimiento de DEG entre los grupos SL y SLdisA en las vías GO y KEGG. Para el análisis inmunocitométrico, los perfiles transcriptómicos se analizaron utilizando CIBERSORT (v1.03) con una matriz de referencia de inmunocitos murinos para inferir la composición del TME.^[52]

Análisis estadístico

Todos los datos se analizaron utilizando GraphPad Prism 10.0 (GraphPad Software). Se utilizaron la prueba t de Student de dos colas y el análisis de varianza (ANOVA) de una vía para analizar la significación estadística. Las curvas de supervivencia se analizaron utilizando la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox). La significación estadística se definió como p < 0,05. Los datos se presentan como media ± SEM, a menos que se indique lo contrario.

Línea celular, plásmido y cepa bacteriana

Las líneas celulares CT26 se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC; VA, EE. UU.) y se cultivaron en condiciones estándar (37 °C, 5% de CO2) en medio Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM; Gibco, NY, EE. UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS; Newzerum, Christchurch, Nueva Zelanda) y 1% de penicilina-estreptomicina. La cepa S. typhimurium ΔppGpp (relA:cat, spoT:kan, SL),^[45], modificada genéticamente para expresar el gen de la luciferasa (lux) y un marcador de resistencia a la kanamicina, fue amablemente proporcionada por J. J. Min (Institute for Molecular Imaging and Theranostics, Chonnam National University Hwasun Hospital, Jeonnam, República de Corea). El gen disA, que codifica la c-di-AMP sintasa, se derivó de Bacillus thuringiensis BMB171 (número de acceso GenBank: CP001903.1).^[46] Se incorporó una etiqueta de epítopo FLAG en el extremo C-terminal de disA, y la secuencia del gen modificado se sintetizó por General Biol (Anhui, China). El constructo disA-FLAG se clonó posteriormente en el vector plasmídico pBAD, que contiene un gen de resistencia a la ampicilina, utilizando los sitios de restricción NcoI y PmeI. El plásmido recombinante (pBAD-disA) se introdujo posteriormente en S. typhimurium ΔppGpp mediante electroporación (1,8 kV; Bio-Rad). Las cepas transformadas se mantuvieron en medio Luria-Bertani (LB) suplementado con kanamicina (50 μg/mL) y ampicilina (100 μg/mL) y se conservaron a -80 °C en 25% de glicerol para su almacenamiento a largo plazo.

Prueba de CDA mediante HPLC

Para evaluar la producción de di-AMP cíclico (CDA) in vitro, se recolectaron cultivos bacterianos por centrifugación, se lavaron dos veces con PBS (DPBS) y se resuspendieron a una concentración de 1010 células/mL antes de almacenarlos a -80 °C. Después de la extracción de los gránulos bacterianos, el CDA se cuantificó utilizando HPLC (Waters e2695). La separación cromatográfica se realizó utilizando un sistema de elución en gradiente que comprende dos fases móviles: fase móvil A (0,1% de ácido fórmico) y fase móvil B (0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo). La temperatura de la columna se mantuvo a 30 °C y el caudal se fijó en 0,8 mL/min.

Cultivo de células dendríticas

Las BMDC se generaron recolectando asépticamente células de la médula ósea de los huesos tibiales y femorales de ratones. Después de la extracción, los eritrocitos se lisaron utilizando un tampón de lisis de eritrocitos estéril (Wuhan Servicebio Technology, Co., Ltd.). Las células de la médula ósea aisladas se resuspendieron posteriormente en medio RPMI 1640-GlutaMax suplementado con 10% de FBS, 50 μM de β-mercaptoetanol, penicilina-estreptomicina (100 UI/mL y 100 μg/mL) y 20 ng/mL de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF; Yeasen, Shanghái, China). A partir del día 3, se añadió medio de cultivo fresco cada dos días. Después de 8 días, las BMDC estuvieron listas para los experimentos posteriores.

Experimentos con ratones

Se adquirieron ratones BALB/c machos libres de patógenos específicos (de 5 a 6 semanas de edad) del Guangdong Medical Laboratory Animal Center (Guangzhou, China). El Comité de Investigación de Animales de la Universidad de Hainan aprobó los protocolos de animales utilizados en este estudio. Para establecer modelos portadores de tumor, se inyectaron subcutáneamente 1 × 106 células CT26 en el flanco derecho de cada ratón. El crecimiento tumoral se controló cada dos días y el volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula: (longitud × ancho2)/2. Una vez que los tumores alcanzaron un volumen de 90 a 200 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento y se les administró PBS, S. typhimurium ΔppGpp (SL) o SLdisA a una dosis de 3,75 × 107 unidades formadoras de colonias (UFC) en 125 μL mediante inyección intravenosa. Para inducir la expresión génica, se administró L-arabinosa (V900920, Sigma, EE. UU.) por vía intraperitoneal a 0,15 g por ratón diariamente, comenzando 24 h después de la inyección bacteriana y continuando durante 15 días.

Para los experimentos de terapia combinada que involucran el bloqueo de PD-1, los ratones se asignaron aleatoriamente a los siguientes grupos: (1) control, (2) anti-PD-1, (3) SL, (4) SL + anti-PD-1, (5) SLdisA y (6) SLdisA + anti-PD-1. El anticuerpo anti-PD-1 (Sintilimab Injection) se administró por vía intravenosa a 10 mg/kg los días 3 y 10 después de la inoculación del tumor. Se observaron estrictamente los puntos finales humanitarios y los ratones con tumores que superaban los 1500 mm3 fueron sacrificados.

Análisis de Western blotting

Para validar la expresión in vitro de la proteína disA, los cultivos bacterianos a una densidad óptica (OD600) de 0,5 a 0,7 se indujeron con 4% de L-arabinosa. Después de un período de inducción de 4,5 h, las células bacterianas se centrifugaron. Posteriormente, la expresión de proteínas se confirmó mediante inmunoblotting utilizando un anticuerpo anti-FLAG (Biosynthesis Biotechnology, Beijing, China).

Análisis de qPCR

Para evaluar la expresión de citocinas dentro del TME, los tejidos tumorales se recolectaron 24 h después de la administración de L-arabinosa. Se extrajo el ARN total utilizando el reactivo TRIzol (Wuhan Servicebio Technology, Co., Ltd.) y luego se transcribió inversamente a cDNA utilizando un kit de síntesis de cDNA SuperScript II (Takara Biomedical Technology, Beijing, China). Se realizó un análisis de PCR cuantitativa (qPCR) utilizando el maestro de PCR cuantitativa ChamQ SYBR Color (Vazyme, Nanjing, China) para cuantificar los niveles de expresión de los genes diana. Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla 1, y el gen HPRT se utilizó como gen de referencia.

Ensayo de activación inmunitaria in vitro

Para caracterizar la activación de DC dependiente de STING, las BMDC se cocultivaron con cepas bacterianas durante 90 min antes de reemplazar el medio con RPMI 1640 que contiene antibióticos. Para investigar la dependencia de STING de la activación inmunitaria inducida por SLdisA, se realizaron experimentos de cotratamiento con el inhibidor de STING H-151 (2 μM de concentración final; MedChemExpress, EE. UU.). Los sobrenadantes se recolectaron 4 h después del tratamiento para su posterior análisis. La concentración de IFN-β en los sobrenadantes de BMDC se cuantificó utilizando kits ELISA disponibles comercialmente (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd.), y las mediciones de absorbancia se normalizaron a una curva estándar de IFN-β recombinante.

Ensayo de proliferación de esplenocitos

Para evaluar la capacidad de proliferación de las células T, los esplenocitos se aislaron asépticamente de los bazo de ratones y se etiquetaron con éster de succinimidilo de carboxyfluoresceína (CFSE, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Después de la estimulación de las BMDC como se describió anteriormente, los esplenocitos etiquetados con CFSE se cocultivaron con las BMDC en una proporción de 10:1. Después de 72 h de cocultivo, las células se recolectaron y se analizaron mediante citometría de flujo para evaluar la proliferación de los esplenocitos.

Prueba de índice bioquímico

Los niveles séricos de ALT y AST se cuantificaron utilizando un analizador bioquímico BS-240vet. Todos los kits de ensayo se adquirieron de Shenzhen Mindray Animal Medical Technology Co., Ltd., y los análisis se realizaron de acuerdo con los protocolos del fabricante.

Biodistribución in vivo

Para evaluar la biodistribución in vivo de SLdisA, se administraron inyecciones intravenosas de SL o SLdisA a ratones portadores de tumores a través de la vena caudal. Se administró L-arabinosa por vía intraperitoneal 24 horas después de la inoculación bacteriana. Se realizó una imagen de bioluminiscencia en los días 2, 4, 6, 8, 10 y 12 utilizando un sistema de imagen IVIS 100 (Caliper Life Sciences) para controlar las señales derivadas de Lux de S. typhimurium ΔppGpp, lo que permitió el seguimiento longitudinal de la localización y persistencia bacteriana.

Recuento de bacterias

Para cuantificar la colonización bacteriana en varios órganos, se recolectaron asépticamente el corazón, el hígado, el bazo, los pulmones, los riñones y el tumor de ratones portadores de tumores a los 3 y 5 días posteriores a la inoculación. Los tejidos se homogeneizaron y se diluyeron seriadamente en PBS estéril. Se tomaron alícuotas de las suspensiones de tejido y se sembraron en agar LB suplementado con kanamicina (50 μg/mL) y se incubaron durante la noche a 37 °C. Se determinaron las cargas bacterianas mediante el recuento de colonias y se normalizaron al peso del tejido utilizando el siguiente cálculo: Y × 10Z × (1 + X) × 10/X (UFC/g; donde X = peso del tejido, Y = colonias en la placa de Petri y Z = factor de dilución).

Tinción con H&E

Para el análisis histológico, se sacrificaron los ratones 3 días después del tratamiento y se recolectaron inmediatamente los principales órganos (corazón, pulmones, hígado, bazo y riñones) y se fijaron en un 4% de paraformaldehído durante 48 horas. Posteriormente, los tejidos se procesaron utilizando protocolos estándar de inclusión en parafina y se seccionaron con un grosor de 4 μm. Para la desparafinación de las secciones de parafina, se aplicaron secuencialmente las siguientes soluciones: solución de desparafinación ecológica I durante 20 minutos, solución de desparafinación ecológica II durante 20 minutos, etanol anhidro I durante 5 minutos, etanol anhidro II durante 5 minutos y alcohol al 75% durante 5 minutos, seguido de un lavado con agua limpia. Para la tinción con H&E, las secciones de parafina se sumergieron en solución de tinción con hematoxilina durante 3 a 5 minutos y luego se lavaron con agua. Posteriormente, las secciones se trataron con solución de diferenciación, se lavaron nuevamente con agua, se sumergieron en solución azul y se enjuagaron con agua corriente. Luego, las secciones de parafina se sumergieron secuencialmente en soluciones de alcohol al 85% y 95% durante 5 minutos cada una, seguido de la tinción en solución de eosina durante 5 minutos. Para deshidratar y aclarar las secciones, se sumergieron secuencialmente en etanol al 95% I durante 5 minutos, etanol al 95% II durante 5 minutos, etanol anhidro I durante 5 minutos, etanol anhidro II durante 5 minutos, xileno I durante 5 minutos y xileno II durante 5 minutos. Después del secado, las secciones se sellaron con goma neutra. Se adquirieron imágenes digitales de las secciones teñidas utilizando un escáner de portaobjetos de alta resolución para una evaluación patológica exhaustiva.

Análisis de citometría de flujo

Inmunofenotipado in vitro: las BMDC se estimularon con cepas bacterianas y los esplenocitos se cocultivaron con BMDC activadas. Posteriormente, las células se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromos dirigidos a marcadores de superficie, incluido el FITC anti-ratón CD11c (clon N418, Elabscience Biotechnology Co., Ltd.) y el PE-Cy7 anti-ratón MHC II (clon M5/114, Elabscience Biotechnology Co., Ltd.), y se analizaron utilizando un citómetro CytoFLEX (Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.).

Perfilado inmunitario in vivo: se extirparon los tumores 48 horas después de la administración bacteriana y se procesaron en suspensiones de células individuales mediante la digestión enzimática con 1 mg/mL de colagenasa tipo I (Wuhan Servicebio Technology) durante 45 minutos a 37 °C. Después de la disociación mecánica y la filtración a través de un tamiz de 70 μm, las células se tiñeron con anticuerpos fluorescentes durante 30 minutos. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: FITC anti-ratón F4/80 (clon CI: A3-1), APC anti-ratón CD86 (clon GL-1), FITC anti-ratón CD3 (clon 17A2), APC anti-ratón CD4 (clon GK1.5) y APC anti-ratón CD8 (clon YTS-169), todos adquiridos de Elabscience Biotechnology Co., Ltd. Se cuantificaron las poblaciones de células inmunitarias utilizando un citómetro CytoFLEX (Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.), adquiriendo un mínimo de 10 000 eventos por muestra.

Secuenciación de ARN y análisis transcriptómico

Se extrajo el ARN total de las muestras de tumor (n = 3 por grupo PBS/SLdisA; n = 2 por grupo SL) utilizando el kit RNeasy Mini Kit (Qiagen), siguiendo el protocolo del fabricante. Se evaluó la integridad y la concentración del ARN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific). Antes de la secuenciación, los datos brutos se sometieron a filtración para producir datos limpios de alta calidad. Todos los análisis posteriores utilizaron estos datos limpios. Se prepararon las bibliotecas de cDNA con el kit Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2 (Illumina) como se describió previamente.^[50] Los datos de secuenciación se alinearon y se cuantificaron utilizando Cufflinks (v2.2.1),^[51], y los niveles de expresión génica se informaron como transcripciones por millón (TPM). Se realizó un análisis de genes de expresión diferencial (DEG) utilizando los criterios |log2(FoldChange)| > 1 y padj < 0,05.

Se generaron tres conjuntos comparativos de DEG: PBS vs. SL, SL vs. SLdisA y PBS vs. SLdisA. Se utilizó el software de análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) (versión 4.0.3) para realizar el análisis de enriquecimiento de los DEG entre los grupos SL y SLdisA en las vías GO y KEGG. Para el análisis inmunocitométrico, los perfiles transcriptómicos se analizaron utilizando CIBERSORT (v1.03) con una matriz de referencia de inmunocitos murinos para inferir la composición del TME.^[52]

Análisis estadístico

Todos los datos se analizaron utilizando GraphPad Prism 10.0 (GraphPad Software). Se utilizaron la prueba t de Student de dos colas y el análisis de varianza (ANOVA) de una vía para analizar la significación estadística. Las curvas de supervivencia se analizaron utilizando la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox). La significación estadística se definió como p < 0,05. Los datos se presentan como media ± SEM, a menos que se indique lo contrario.

Disponibilidad de datos y código

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles a través de los autores correspondientes a solicitud.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (núm. 32260854).

Contribuciones de los autores

Conceptualización, X.L. y H.Z.; metodología, X.L.; software, Y.H.; validación, Y.H. y L.P.; análisis formal, L.P.; investigación, Y.H.; recursos, Y.H.; curación de datos, Y.H.; redacción: preparación del borrador original, Y.H.; redacción: revisión y edición, L.P., X.L. y H.Z.; visualización, H.Z.; supervisión, X.L. y H.Z.; administración del proyecto, X.L. y H.Z.; adquisición de financiación, X.L. y H.Z. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Declaración de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.