La transcriptómica espacio-temporal caracteriza el microambiente inmunitario durante el envejecimiento del hígado en ratones.

El hígado, como el órgano más grande del cuerpo humano, desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis metabólica (Ishibashi et al. ^[2009]). Su arquitectura espacial única da como resultado distintas propiedades funcionales entre los hepatocitos en diferentes zonas (Ben-Moshe e Itzkovitz ^[2019]). Más allá de sus funciones metabólicas, el hígado es cada vez más reconocido por sus funciones inmunológicas, albergando diversas células inmunitarias, como las células de Kupffer, las células dendríticas (DC) y las células T (Robinson et al. ^[2016]). Estas células inmunitarias son fundamentales en la presentación de antígenos, la modulación de las respuestas inflamatorias y la eliminación de patógenos del intestino y las células dañadas, lo que subraya el doble papel del hígado como centro metabólico y centinela inmunológico (Robinson et al. ^[2016]).

A pesar de las funciones críticas del hígado, el envejecimiento conduce a una disminución de su rendimiento, lo que aumenta el riesgo de enfermedades relacionadas con el hígado, como la hepatitis, la fibrosis, la cirrosis y el carcinoma hepatocelular (CHC). La investigación actual sobre el envejecimiento del hígado se ha centrado predominantemente en las células no inmunitarias, como los hepatocitos, las células endoteliales y las células estrelladas hepáticas, revelando sus alteraciones funcionales y sus contribuciones a las patologías relacionadas con la edad (Sanfeliu-Redondo et al. ^[2024]). Sin embargo, los cambios dinámicos y los papeles funcionales de las células inmunitarias dentro del hígado envejecido siguen siendo poco conocidos. Esta laguna en el conocimiento dificulta una comprensión integral de los mecanismos subyacentes a las enfermedades hepáticas asociadas con la edad y el desarrollo de terapias dirigidas.

Recientemente, se han comenzado a descubrir los papeles de las células inmunitarias en el envejecimiento del hígado. Por ejemplo, Mogilenko et al. identificaron la acumulación de células T CD8+ GZMK+ en hígados envejecidos y sugirieron su posible papel en la promoción de la senescencia celular (Mogilenko et al. ^[2021]). De manera similar, Liu et al. informaron sobre un aumento de las proporciones de macrófagos Cxcl2+ en hígados envejecidos, lo que recluta neutrófilos y contribuye a las lesiones hepáticas relacionadas con la edad (Liu et al. ^[2024]). Sin embargo, ambos estudios carecen de resolución espacial, lo que impide captar las interacciones microambientales de las células inmunitarias dentro de la arquitectura zonal única del hígado. Para abordar estas limitaciones, nuestro estudio empleó transcriptómica unicelular/nuclear y espacial para mapear de manera integral los cambios dinámicos y la heterogeneidad espacial de las células inmunitarias en hígados de ratones jóvenes y envejecidos. Se identificaron las células T como el tipo de célula inmunitaria más dinámico a nivel transcripcional, caracterizado por marcadores de agotamiento y asociado con la progresión de la enfermedad. Además, exploramos los factores intra y extracelulares que contribuyen al agotamiento y descubrimos que los hepatocitos PP pueden promover el agotamiento de las células T vecinas a través de la regulación al alza de LPIN1. Los hallazgos ofrecen nuevas perspectivas para comprender las patologías hepáticas relacionadas con la edad y desarrollar estrategias terapéuticas.

Resultado

El análisis transcripcional unicelular reveló el panorama de las células inmunitarias durante el envejecimiento del hígado y las células T exhiben los cambios más pronunciados

Para caracterizar el panorama de las células inmunitarias durante el envejecimiento del hígado, se empleó la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq). Dado que las células inmunitarias son de baja abundancia en el hígado, se capturaron las células clasificadas CD45+ para la secuenciación de ARN unicelular (Figura 1A). Para investigar la interacción entre las células no inmunitarias y las células inmunitarias, y considerando que los hepatocitos tienden a morir durante los experimentos, se utilizó la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq) (Figura 1A). Se obtuvieron células y núcleos únicos de alta calidad después de un estricto control de calidad, y las muestras de baja calidad (Y2, O2 e Yn1) se excluyeron del procesamiento posterior (Figura S1A, B). Para identificar los principales tipos de células, se utilizó la agrupación no supervisada para obtener 8 tipos de células a partir de los datos de scRNA-seq y 5 tipos de células a partir de los datos de snRNA-seq (Figura 1B, C, Figura S1C-G). En conjunto, construimos un atlas completo de los tipos de células del hígado de ratones jóvenes y viejos.

Luego, exploramos la composición y los cambios en el transcriptoma durante el envejecimiento del hígado. El análisis de enriquecimiento celular (Chu et al. ^[2024]) revela que todos los tipos de células presentan cambios significativos en la composición. El grupo de edad avanzada exhibe reducciones significativas en las proporciones de células NK, neutrófilos, DC, macrófagos, hepatocitos PP, células endoteliales y células estrelladas hepáticas, al tiempo que muestra un aumento en las proporciones de células T, células NKT, células B, hepatocitos pericentrales (hepatocitos PC) y células inmunitarias totales (Figura 1D). Este patrón de redistribución celular se alinea con la dinámica de la proporción de células inmunitarias previamente informada en la investigación sobre el envejecimiento del hígado (Liu et al. ^[2024]; Lin et al. ^[2024]; Yang et al. ^[2023]). Los efectos de lote se mezclan con las diferencias de grupo en los datos de snRNA-seq; por lo tanto, analizamos solo los cambios transcriptómicos de las células inmunitarias. En particular, las células T muestran los cambios más pronunciados entre las células inmunitarias, con la mayor distancia de Bhattacharyya y el mayor número de genes expresados diferencialmente (DEG) (Figura 1E, F). En conjunto, estos datos revelan que las células T aumentan en población y cambian significativamente en su transcriptoma durante el envejecimiento del hígado.

A continuación, investigamos los cambios funcionales de las células T. El análisis de enriquecimiento de DEG revela que tanto la regulación positiva como la negativa de la activación de las células T, así como la vía citotóxica, están significativamente reguladas al alza en los hígados envejecidos (Figura 1G). Cd5 y Cd83 son marcadores de activación de las células T (Cramer et al. ^[2000]; Biancone et al. ^[1996]); Cd6 mejora la amplificación de la señal del receptor de células T (TCR) (Hassan et al. ^[2006]); Card11 media la transducción de la vía del TCR (Hwang et al. ^[2020]); Eomes y Tbx21 se asocian con las funciones citotóxicas y de memoria en las células T activadas (Intlekofer et al. ^[2005]). Tox, Pdcd1 y Tigit sirven como marcadores de agotamiento en las células T (Khan et al. ^[2019]; Wherry y Kurachi ^[2015]); Lilrb4a/b suprimen la funcionalidad de las células T (Deng et al. ^[2018]); Lyn media la señalización inmunosupresora (Mkaddem et al. ^[2017]). Gzmm codifica la granzima M, y Stx11 media la liberación de granzima (Chiang et al. ^[2013]). Además, en los hígados envejecidos, la vía de regulación de la apoptosis está regulada al alza, con Bcl2 y Gimap8 que inhiben la apoptosis (Jourdan et al. ^[2009]; Ho y Tsai ^[2017]) y Fcgr2b y Nr4a3 que la promueven (Morris et al. ^[2020]; Fedorova et al. ^[2019]) (Figura 1G). La regulación negativa de la vía metabólica del fósforo está regulada al alza en los hígados envejecidos; el factor de iniciación de la traducción citoplasmática (Eif2s3y) y las proteínas ribosómicas (Rps26, Rpl35a) están reguladas a la baja (Figura 1G). Este cambio metabólico, junto con la disminución de la capacidad de traducción, sugiere la senescencia de las células T. Para delinear aún más los estados globales de las células T, el análisis de puntuación de la vía demuestra que, durante el envejecimiento del hígado, las células T salen de la quiescencia con una mayor proliferación/citotoxicidad, pero exhiben una diferenciación de agotamiento/senescencia terminal junto con una inhibición de la apoptosis, lo que es consistente con la progresión de la senescencia (Figura 1H). Estos resultados indican que las células T exhiben cambios funcionales, mostrando características de agotamiento y senescencia en los hígados envejecidos.

Para diseccionar la heterogeneidad de las células T, así como otras células inmunitarias, realizamos una sub-agrupación de los principales tipos de células (Figura 1I, Figuras S2 y S3). El análisis del cambio en la proporción revela que el tipo de célula B similar a la célula B tipo 1 (ABC like B1), la célula T CD4+ positiva para Pdcd1 (CD4+ Pdcd1+ T), el neutrófilo positivo para Npg (Npg+ Neu) y la célula T CD8+ agotada (CD8+ Tex) son los cuatro tipos de células que exhiben los cambios proporcionales más importantes (Figura 1J, Figura S4B-D). Además, el análisis de enriquecimiento celular (Chu et al. ^[2024]) confirmó la significancia (Figura S4A). Entre los cuatro tipos de células, CD8+ Tex exhibe la proporción más alta en el grupo de edad avanzada, lo que sugiere su importante papel (Figura 1K). Para validar aún más la acumulación de CD8+ Tex, recopilamos conjuntos de datos de scRNA-seq públicos (Mogilenko et al. ^[2021]; Almanzar ^[2020]; Cai et al. ^[2023]; Nikopoulou et al. ^[2023]) y obtuvimos la misma conclusión (Figura S4E-H). En conjunto, CD8+ Tex se acumula en los hígados envejecidos, lo que es consistente con los cambios funcionales de las células T.

Para dilucidar la relación entre la acumulación de CD8+ Tex y la progresión de la enfermedad hepática, analizamos el estado de agotamiento de las células T CD8+ en múltiples condiciones de enfermedad. En los modelos de ratón de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) (Xiong et al. ^[2019]), las células T CD8+ en los hígados con EHNA exhiben una mayor puntuación de agotamiento (Figura 1L). Los ratones con una dieta alta en grasas/alta en fructosa (Su, Kim, et al. ^[2021]) muestran una agravación de la EHNA dependiente de la duración de la dieta con una puntuación de firma de CD8+ Tex elevada, lo que implica un papel patógeno de CD8+ Tex (Figura 1L). Los hígados cirróticos humanos (Ramachandran et al. ^[2019]) exhiben células T CD8+ que se asemejan a CD8+ Tex en los hígados envejecidos, con una elevación concurrente de la puntuación de la firma de CD8+ Tex en la sangre periférica en comparación con el control, lo que indica una disfunción sistémica de las células T CD8+ (Figura 1L). En los pacientes con CHC (Li et al. ^[2024]), las células T CD8+ en los ganglios linfáticos y los tejidos tumorales muestran puntuaciones de firma de CD8+ Tex más altas en comparación con los tejidos no tumorales (Figura 1L). Dudek et al. informaron sobre la acumulación de CD8+ Tex CXCR6+ autoagresiva en los hígados murinos/humanos con EHNA (Dudek et al. ^[2021]), mientras que CD8+ Tex carece de firmas genéticas comparables (Figura S4I, J). En conjunto, las células T CD8+ en las patologías hepáticas muestran una mayor similitud transcripcional con CD8+ Tex envejecido, a nivel de correlación, lo que implica su papel patógeno.

Las células T en los hígados envejecidos exhiben una vía de agotamiento única con un nivel de agotamiento más alto

Para investigar los factores intrínsecos que promueven el agotamiento de las células T CD8+, realizamos una trayectoria de diferenciación de las células T CD8+. La trayectoria describe la transición de las células T CD8+ desde el estado de ingenuo al estado de memoria y, finalmente, al estado de agotamiento (Figura 2A). En particular, existen dos vías de agotamiento, una que involucra el estado 7 y la otra que involucra el estado 1 (Figura 2A). El análisis muestra que CD8+ Tex en el estado 7 proviene principalmente del grupo joven, mientras que CD8+ Tex en el estado 1 proviene principalmente del grupo de edad avanzada (Figura 2B). Un análisis adicional de la composición de CD8+ Tex en cada muestra muestra que CD8+ Tex del grupo joven proviene parcialmente del estado 7, mientras que CD8+ Tex del grupo de edad avanzada proviene casi por completo del estado 1 (Figura 2C). Esto sugiere que la vía de diferenciación que conduce al estado 1 está preferentemente activa en el grupo de edad avanzada.

Por lo tanto, para dilucidar la acumulación de CD8+ Tex en hígados envejecidos, analizamos los genes diferencialmente expresados (DEGs) de la vía que conduce al estado 1. El análisis de enriquecimiento revela que el estado 1 regula al alza los genes de supresión de células T (Figura 2D): Tox induce el agotamiento (Khan et al. ^[2019]); Ptpn22 inhibe la fosforilación de ZAP70/LCK (Tizaoui et al. ^[2021]); Tnfrsf1b suprime la IFNγ en las células T agotadas (Gao et al. ^[2023]); Lax1 perjudica la señalización del TCR (Zhu et al. ^[2005]); la deleción de Itpkb mejora la activación de las células T y los fenotipos de memoria, así como la citotoxicidad (Pouillon et al. ^[2013]). Además, el estado 1 regula a la baja los genes que mantienen la capacidad de autorrenovación y la memoria (Figura 2D): Ccr7 media la migración a los ganglios linfáticos (Förster et al. ^[2008]); Il7r mantiene las células T de memoria (Barata et al. ^[2019]); Lef1 mantiene las células T citotóxicas similares a células madre y es esencial para una respuesta mejorada al bloqueo de los puntos de control inmunitario (Zhao et al. ^[2022]); Myc impulsa el metabolismo asociado a la proliferación en las células T activadas (Rathmell ^[2011]); Satb1 suprime la regulación al alza de PD1 durante la activación (Stephen et al. ^[2017]). Además, los genes regulados al alza en el estado 1 están enriquecidos en vías metabólicas, incluyendo la regulación negativa del proceso metabólico del fósforo y el metabolismo del condroitín sulfato, lo que sugiere una reprogramación metabólica. La vía citotóxica basada en la perforina y los ligandos de muerte también está enriquecida por los genes regulados al alza. Los genes regulados a la baja están enriquecidos en las vías de cotradicción y el ensamblaje de ribosomas, lo que sugiere una capacidad de traducción y actividad celular reducidas durante el envejecimiento del hígado (Figura 2D). El estado 7 induce el agotamiento a través de la regulación al alza de Ctla4, Lgals1 y Thbs1 (Walker y Sansom ^[2011]; Rubinstein et al. ^[2004]; Omatsu et al. ^[2023]), al tiempo que adquiere una mayor producción de citocinas y citotoxicidad mediada por granzimas (Figura 2D). Aunque los DEGs del estado 1 están enriquecidos en la vía de respuesta de TGFβ, y tanto los DEGs del estado 1 como los del estado 7 están enriquecidos en la vía de la apoptosis, no se observan diferencias significativas en las puntuaciones generales de la vía (Figura S4K). En conjunto, estos análisis revelan que, en el proceso de envejecimiento del hígado, las células T sufren un agotamiento específico de la edad mediante la regulación al alza de genes específicos relacionados con el agotamiento y la regulación a la baja de los genes relacionados con la memoria y la capacidad de autorrenovación.

A continuación, exploramos el nivel de agotamiento de las CD8+ Tex. La puntuación con los genes de agotamiento (Pdcd1, Lag3, Tigit, Tox, Havcr2, Cxcl13) revela puntuaciones significativamente más altas en el estado 1 en comparación con el estado 7 (Figura 2E), lo que sugiere un mayor nivel de agotamiento en el estado 1, que está enriquecido en el grupo de edad avanzada. Para validar aún más este fenómeno, empleamos un sub-agrupamiento en las CD8+ Tex según investigaciones previas (Zhou et al. ^[2023]; Beltra et al. ^[2020]) (Figura 2F, G, Figura S4L). Se identificaron cuatro estados de agotamiento distintos: tipo precursor agotado 1 (CD8+ Tpex1), tipo precursor agotado 2 (CD8+ Tpex2), tipo terminalmente agotado 1 (CD8+ Tex1) y tipo terminalmente agotado 2 (CD8+ Tex2), con niveles de agotamiento progresivamente crecientes. El análisis de enriquecimiento celular revela un aumento de las poblaciones de CD8+ Tpex1 y CD8+ Tex2 en el grupo de edad avanzada, mientras que CD8+ Tex1 está enriquecido en el grupo joven, lo que indica que el grupo de edad avanzada exhibe no solo fuentes de células T agotadas expandidas, sino también un mayor nivel de agotamiento. Un análisis adicional de las proporciones de subconjuntos en los estados demostró que el estado 1 (enriquecido en el grupo de edad avanzada) contiene más CD8+ Tex2, lo que concuerda con su mayor puntuación de genes de agotamiento (Figura 2H, I).

Para diseccionar el microambiente de las CD8+ Tex, realizamos Stereo-seq y análisis espacial (Figuras 1A y 3A). Se eligió Bin200 como un punto espacial y se sometió a control de calidad (Figura 3A, Figura S5A). El hígado exhibe una heterogeneidad espacial única (Ben-Moshe y Itzkovitz ^[2019]), por lo tanto, siguiendo un estudio previo (Wu et al. ^[2024]), los puntos se dividieron en 9 capas para investigar la distribución espacial de las CD8+ Tex (Figura 3B, Figura S5B). Dado que cada punto contiene múltiples células, utilizamos los datos de scRNA-seq y snRNA-seq generados en este estudio para anotar los datos de Stereo-seq. La distribución de la densidad de hepatocitos anotada por cell2location (Kleshchevnikov et al. ^[2022]) se alinea con la teoría, lo que demuestra la fiabilidad de los resultados de la anotación (Figura S6A). Se observó la distribución de la densidad de los subconjuntos de células T CD8+, lo que reveló que las CD8+ Tex están específicamente enriquecidas en la capa 6-9 (zona PV) del grupo de edad avanzada (Figura 3C, Figura S6E). La anotación de Stereoscope (Andersson et al. ^[2020]) corroboró la misma conclusión (Figura S6B, C, E). Para validar aún más la distribución espacial de las CD8+ Tex, se empleó el método de puntuación de genes de firma para el análisis. La distribución de las puntuaciones de las células endoteliales se alinea con las expectativas, lo que indica la fiabilidad de este método (Figura S6D). Las CD8+ Tex muestran un aumento progresivo de las puntuaciones desde la zona CV hasta la zona PV en el grupo de edad avanzada, mientras que otros subconjuntos carecen de esta tendencia espacial (Figura 3D, Figura S7). Además, las puntuaciones de las CD8+ Tex son significativamente más altas en el grupo de edad avanzada en comparación con el grupo joven, lo que corrobora los hallazgos del análisis de datos de scRNA-seq (Figura 3E). En conjunto, las CD8+ Tex se acumulan predominantemente en la zona PV del hígado envejecido.

Además de delinear la distribución espacial de las CD8+ Tex, investigamos más a fondo sus socios celulares colocalizados mediante la realización de un análisis de colocalización celular. El análisis de las correlaciones de densidad y proporción celular revela que las CD8+ Tex exhiben colocalización con diversos tipos de células en el grupo de edad avanzada, incluyendo Ngp+ Neu, Spp1+ Mac, CD4+ Treg, hepatocitos PP, Apod+ pDC, células B naïvas y NK (Figura 4A). El análisis de correlación basado en la puntuación de genes de firma delineó aún más los socios celulares colocalizados (Figura S8). Se observa una correlación positiva significativa entre los hepatocitos y las puntuaciones de los genes de las células endoteliales en la misma zona anatómica, lo que valida la capacidad del método para detectar tipos de células colocalizadas espacialmente (Figura 4C). En última instancia, entre todos los posibles tipos de células colocalizadas con las CD8+ Tex, solo los hepatocitos PP exhibieron una correlación positiva significativa en sus perfiles de puntuación (Figura 4C). Además, validamos la colocalización de las CD8+ Tex con los hepatocitos PP envejecidos utilizando una puntuación de colocalización, un método no basado en la correlación (Figura S9B). En resumen, la superposición espacial de las CD8+ Tex y los hepatocitos PP en el grupo de edad avanzada indica que la acumulación de Tex específica de la zona PV puede estar impulsada por los hepatocitos PP (Figura 4B, Figura S9A).

Para explorar la relación entre los hepatocitos PP y el agotamiento de las células T, analizamos las características de la transcripción de los hepatocitos PP en el grupo de edad avanzada. Dado que la acumulación específica de la edad de las CD8+ Tex, es fundamental investigar si las vías relacionadas con la edad están vinculadas mecánicamente al agotamiento de las células T. Coherente con las expectativas, tres vías relacionadas con la senescencia (senescencia replicativa, senescencia celular y fenotipo secretor asociado a la senescencia [SASP]) exhiben puntuaciones significativamente más altas en el grupo de edad avanzada en comparación con el grupo joven (Figura 5A). Las vías de senescencia celular y SASP muestran puntuaciones significativamente más altas en la zona PV en comparación con la zona CV, un patrón que se observa de manera consistente en ambos grupos (Figura 5A, Figura S10A). Si bien las zonas CV y PV muestran diferentes niveles de senescencia, la senescencia celular y la actividad de SASP no se correlacionan con la puntuación de la firma de las CD8+ Tex, lo que indica que la senescencia local tiene poco efecto sobre la disfunción de las células T (Figura 5B).

A continuación, analizamos los DEGs de los hepatocitos PP del grupo de edad avanzada. Se realizó un análisis de enriquecimiento de genes en la intersección de tres conjuntos de genes: hepatocitos PP del grupo de edad avanzada frente a hepatocitos PC del grupo de edad avanzada en los datos de snRNA-seq; zona PV del grupo de edad avanzada frente a zona CV del grupo de edad avanzada en los datos de Stereo-seq; zona PV del grupo de edad avanzada frente a zona PV del grupo joven en los datos de Stereo-seq (Figura 5C). Los DEGs están significativamente enriquecidos en múltiples vías relacionadas con el metabolismo, y los genes regulados al alza muestran específicamente un enriquecimiento en la biosíntesis de aminoácidos, la regulación de la biosíntesis de triglicéridos, el metabolismo del oxaloacetato y las vías de señalización de la insulina (Figura 5C). Las puntuaciones de actividad de estas cuatro vías son consistentemente más altas en la zona PV o en los hepatocitos PP en los tres grupos (Figura S10B). En particular, las puntuaciones de actividad de estas cuatro vías exhiben una fuerte correlación espacial positiva con la puntuación de la firma de las CD8+ Tex, lo que sugiere que estas vías pueden impulsar el agotamiento de las células T en el microambiente del hígado envejecido (Figura 5D).

Para investigar si los hígados envejecidos contienen un mayor número de CD8+ Tex, examinamos la abundancia y el fenotipo de las células T CD8+ en los hígados de ratones jóvenes y envejecidos. El análisis citométrico de flujo y la PCR cuantitativa en tiempo real revelaron un aumento de la infiltración de células T CD8+ y un fenotipo de agotamiento más pronunciado en el grupo de edad avanzada (Figura 6A-C). Para determinar aún más la localización espacial de las células CD8+ Tex, realizamos inmunohistoquímica (IHC) y observamos un mayor número de células PD1-positivas en los hígados envejecidos, con un enriquecimiento marcado en la región PV en comparación con la región CV (Figura 6D). Para probar si los hepatocitos PP de la zona PV en el hígado envejecido contribuyen al agotamiento de las células T CD8+, realizamos experimentos de cocultivo. Las células T CD8+ cocultivadas con hepatocitos PP envejecidos exhibieron niveles de agotamiento más altos en comparación con las cultivadas con hepatocitos PP jóvenes (Figura 6E, F). Nuestro análisis transcriptómico previo identificó una regulación al alza de la vía de síntesis de triglicéridos en los hepatocitos PP que se correlacionó positivamente con el agotamiento de las células T; por lo tanto, nos centramos en LPIN1, el gen más significativamente regulado al alza en esta vía, para una validación adicional. Se confirmó que la expresión de LPIN1 estaba elevada en los hepatocitos PP envejecidos (Figura 6G). Funcionalmente, la sobreexpresión de LPIN1 en los hepatocitos jóvenes promovió el agotamiento de las células T CD8+, mientras que la inhibición de LPIN1 en los hepatocitos envejecidos atenuó este efecto (Figura 6H-J).

Para mejorar aún más la generalizabilidad y la relevancia clínica de estos hallazgos, realizamos estudios de validación utilizando muestras humanas sanas. Examinamos la abundancia y el fenotipo de las células T CD8+ en el tejido hepático de individuos jóvenes y de edad avanzada. Coherente con nuestros datos de ratón, los hígados humanos envejecidos exhibieron un aumento de la infiltración de células T CD8+ y un fenotipo de agotamiento más pronunciado (Figura 7A-C). Además, se confirmó que la expresión de LPIN1 estaba elevada en los hepatocitos PP envejecidos (Figura 7D). En conjunto, estos resultados sugieren que los hepatocitos PP envejecidos pueden promover el agotamiento de las células T CD8+ a través de la regulación al alza de la expresión de LPIN1.

El análisis transcripcional de células individuales reveló el panorama de las células inmunitarias durante el envejecimiento del hígado y las células T exhiben los cambios más pronunciados

Para caracterizar el panorama de las células inmunitarias durante el envejecimiento del hígado, se empleó la secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq). Dado que las células inmunitarias son de baja abundancia en los hígados, las células clasificadas por CD45+ se capturaron para la secuenciación de ARN de células individuales (Figura 1A). Para investigar la interacción entre las células no inmunitarias y las células inmunitarias, y considerando que los hepatocitos tienden a morir durante los experimentos, se utilizó la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq) (Figura 1A). Se obtuvieron células individuales y núcleos individuales de alta calidad después de un estricto control de calidad y las muestras de baja calidad (Y2, O2 y Yn1) se excluyeron del procesamiento posterior (Figura S1A, B). Para identificar los principales tipos de células, se utilizó un agrupamiento no supervisado para obtener 8 tipos de células a partir de los datos de scRNA-seq y 5 tipos de células a partir de los datos de snRNA-seq (Figura 1B, C, Figura S1C-G). En conjunto, construimos un atlas de todos los tipos de células del hígado de ratón joven y envejecido.

A continuación, exploramos la composición y los cambios en el transcriptoma durante el envejecimiento hepático. El análisis de enriquecimiento celular (Chu et al. ^[2024]) revela que todos los tipos de células presentan cambios significativos en su composición. El grupo de edad avanzada exhibe reducciones significativas en las proporciones de células NK, neutrófilos, células dendríticas, macrófagos, hepatocitos PP, células endoteliales y células estrelladas hepáticas, al tiempo que muestra proporciones aumentadas en células T, células NKT, células B, hepatocitos pericentrales (hepatocitos PC) y células inmunitarias totales (Figura 1D). Este patrón de redistribución celular se alinea con la dinámica de las proporciones de células inmunitarias previamente informada en la investigación sobre el envejecimiento hepático (Liu et al. ^[2024]; Lin et al. ^[2024]; Yang et al. ^[2023]). Los efectos de lote se mezclan con las diferencias entre los grupos en los datos de snRNA-seq; por lo tanto, analizamos únicamente los cambios transcriptómicos de las células inmunitarias. Cabe destacar que las células T muestran los cambios más pronunciados entre las células inmunitarias, con la mayor distancia de Bhattacharyya y el mayor número de genes diferencialmente expresados (DEG) (Figura 1E, F). En conjunto, estos datos revelan que las células T aumentan en población y experimentan cambios importantes en su transcriptoma durante el envejecimiento hepático.

A continuación, investigamos los cambios funcionales de las células T. El análisis de enriquecimiento de los DEG revela que tanto la regulación positiva como la negativa de la activación de las células T, así como la vía citotóxica, están significativamente aumentadas en los hígados envejecidos (Figura 1G). Cd5 y Cd83 son marcadores de activación de las células T (Cramer et al. ^[2000]; Biancone et al. ^[1996]); Cd6 mejora la amplificación de la señalización del receptor de células T (TCR) (Hassan et al. ^[2006]); Card11 media la transducción de la vía del TCR (Hwang et al. ^[2020]); Eomes y Tbx21 se asocian con funciones citotóxicas y de memoria en las células T activadas (Intlekofer et al. ^[2005]). Tox, Pdcd1 y Tigit sirven como marcadores de agotamiento en las células T (Khan et al. ^[2019]; Wherry y Kurachi ^[2015]); Lilrb4a/b suprimen la funcionalidad de las células T (Deng et al. ^[2018]); Lyn media la señalización inmunosupresora (Mkaddem et al. ^[2017]). Gzmm codifica la granzima M, y Stx11 media la liberación de granzimas (Chiang et al. ^[2013]). Además, en los hígados envejecidos, la vía de regulación de la apoptosis está aumentada, con Bcl2 y Gimap8 inhibiendo la apoptosis (Jourdan et al. ^[2009]; Ho y Tsai ^[2017]) y Fcgr2b y Nr4a3 promoviéndola (Morris et al. ^[2020]; Fedorova et al. ^[2019]) (Figura 1G). La regulación negativa de la vía metabólica del fósforo está aumentada en los hígados envejecidos; el factor de iniciación de la traducción citoplasmática (Eif2s3y) y las proteínas ribosómicas (Rps26, Rpl35a) están disminuidas (Figura 1G). Este cambio metabólico, junto con la disminución de la capacidad de traducción, sugiere la senescencia de las células T. Para delinear aún más los estados globales de las células T, el análisis de puntuación de vías demuestra que, durante el envejecimiento hepático, las células T abandonan la quiescencia con una proliferación/citotoxicidad mejorada, pero muestran una diferenciación terminal de agotamiento/senescencia junto con una inhibición de la apoptosis, lo que es consistente con la progresión de la senescencia (Figura 1H). Estos resultados indican que las células T exhiben cambios funcionales, mostrando características de agotamiento y senescencia en los hígados envejecidos.

Para analizar la heterogeneidad de las células T, así como de otras células inmunitarias, realizamos un sub-agrupamiento de los principales tipos de células (Figura 1I, Figuras S2 y S3). El análisis del cambio de proporción muestra que el tipo de célula B similar a las células B asociadas a la edad (ABC-like B1), la célula T CD4+ positiva para Pdcd1 (CD4+ Pdcd1+ T), el neutrófilo positivo para Npg (Npg+ Neu) y la célula T CD8+ agotada (CD8+ Tex) son los cuatro tipos de células que exhiben los cambios proporcionales más significativos (Figura 1J, Figura S4B-D). Además, el análisis de enriquecimiento celular (Chu et al. ^[2024]) confirmó la significancia (Figura S4A). Entre los cuatro tipos de células, la CD8+ Tex exhibe la proporción más alta en el grupo de edad avanzada, lo que sugiere su importante papel (Figura 1K). Para validar aún más la acumulación de CD8+ Tex, recopilamos conjuntos de datos de scRNA-seq públicos (Mogilenko et al. ^[2021]; Almanzar ^[2020]; Cai et al. ^[2023]; Nikopoulou et al. ^[2023]) y obtuvimos la misma conclusión (Figura S4E-H). En general, la CD8+ Tex se acumula en los hígados envejecidos, lo que es consistente con los cambios funcionales de las células T.

Para dilucidar la relación entre la acumulación de CD8+ Tex y la progresión de la enfermedad hepática, analizamos el estado de agotamiento de las células T CD8+ en múltiples condiciones de enfermedad. En los modelos de ratón de esteatohepatitis no alcohólica (NASH) (Xiong et al. ^[2019]), las células T CD8+ en los hígados con NASH exhiben una mayor puntuación de agotamiento (Figura 1L). Los ratones con una dieta alta en grasas/alta en fructosa (Su, Kim, et al. ^[2021]) muestran una exacerbación de la NASH dependiente de la duración de la dieta con una puntuación de firma de CD8+ Tex elevada, lo que implica un papel patógeno de la CD8+ Tex (Figura 1L). Los hígados cirróticos humanos (Ramachandran et al. ^[2019]) exhiben células T CD8+ que se asemejan a la CD8+ Tex en los hígados envejecidos, con una elevación concurrente de la puntuación de la firma de CD8+ Tex en la sangre periférica en comparación con el control, lo que indica una disregulación sistémica de las células T CD8+ (Figura 1L). En los pacientes con CHC (Li et al. ^[2024]), las células T CD8+ en los ganglios linfáticos y los tejidos tumorales muestran puntuaciones de firma de CD8+ Tex más altas en comparación con los tejidos no tumorales (Figura 1L). Dudek et al. informaron sobre la acumulación de CD8+ Tex CXCR6+ autoagresiva en los hígados murinos/humanos con NASH (Dudek et al. ^[2021]), mientras que la CD8+ Tex carece de firmas genéticas comparables (Figura S4I, J). En conjunto, las células T CD8+ en todas las patologías hepáticas muestran una mayor similitud transcripcional con la CD8+ Tex envejecida, a nivel de correlación, lo que implica su papel patógeno.

Las células T en los hígados envejecidos exhiben una vía de agotamiento única con un nivel de agotamiento aumentado

Para investigar los factores intrínsecos que promueven el agotamiento de las células T CD8+, realizamos una trayectoria de diferenciación de las células T CD8+. La trayectoria describe la transición de las células T CD8+ desde el estado de ingenuidad hasta el estado de memoria y, finalmente, el estado de agotamiento (Figura 2A). Cabe destacar que existen dos vías de agotamiento, una que involucra el estado 7 y la otra que involucra el estado 1 (Figura 2A). El análisis muestra que la CD8+ Tex en el estado 7 proviene principalmente del grupo joven, mientras que la CD8+ Tex en el estado 1 proviene principalmente del grupo de edad avanzada (Figura 2B). Un análisis adicional de la composición de la CD8+ Tex en cada muestra muestra que la CD8+ Tex del grupo joven proviene parcialmente del estado 7, mientras que la CD8+ Tex del grupo de edad avanzada proviene casi por completo del estado 1 (Figura 2C). Esto sugiere que la vía de diferenciación que conduce al estado 1 está preferentemente activa en el grupo de edad avanzada.

Por lo tanto, para dilucidar la acumulación de CD8+ Tex en los hígados envejecidos, analizamos los DEG de la vía que conduce al estado 1. El análisis de enriquecimiento revela que el estado 1 aumenta los genes de supresión de las células T (Figura 2D): Tox impulsa el agotamiento (Khan et al. ^[2019]); Ptpn22 inhibe la fosforilación de ZAP70/LCK (Tizaoui et al. ^[2021]); Tnfrsf1b suprime la IFNγ en las células T agotadas (Gao et al. ^[2023]); Lax1 altera la señalización del TCR (Zhu et al. ^[2005]); Itpkb la deleción mejora los fenotipos de activación/memoria de las células T y la citotoxicidad (Pouillon et al. ^[2013]). Además, el estado 1 disminuye los genes que mantienen la capacidad de tronco y la memoria (Figura 2D): Ccr7 media la llegada a los ganglios linfáticos (Förster et al. ^[2008]); Il7r mantiene las células T de memoria (Barata et al. ^[2019]); Lef1 mantiene las células T citotóxicas similares a las de tronco y es esencial para una respuesta mejorada al bloqueo de los puntos de control inmunitario (Zhao et al. ^[2022]); Myc impulsa el metabolismo asociado a la proliferación en las células T activadas (Rathmell ^[2011]); Satb1 suprime la regulación ascendente de PD1 durante la activación (Stephen et al. ^[2017]). Además, los genes aumentados en el estado 1 están enriquecidos en las vías metabólicas, incluido la regulación negativa del proceso metabólico del fósforo y el metabolismo del condroitín sulfato, lo que sugiere una reprogramación metabólica. La vía citotóxica basada en la perforina y los ligandos de la muerte también se enriquece con los genes aumentados. Los genes disminuidos están enriquecidos en las vías de cotradicción y el ensamblaje de ribosomas, lo que sugiere una capacidad de traducción y actividad celular reducidas durante el envejecimiento hepático (Figura 2D). El estado 7 impulsa el agotamiento a través de la regulación ascendente de Ctla4, Lgals1 y Thbs1 (Walker y Sansom ^[2011]; Rubinstein et al. ^[2004]; Omatsu et al. ^[2023]), al tiempo que adquiere una mayor producción de citocinas y citotoxicidad mediada por granzimas (Figura 2D). Aunque los DEG del estado 1 están enriquecidos en la vía de respuesta de TGFβ, y tanto los DEG del estado 1 como los del estado 7 están enriquecidos en la vía de la apoptosis, no se observan diferencias significativas en las puntuaciones generales de la vía (Figura S4K). En conjunto, estos análisis revelan que, en el proceso de envejecimiento hepático, las células T experimentan un agotamiento específico de la edad al aumentar los genes relacionados con el agotamiento y disminuir los genes relacionados con la memoria/capacidad de tronco.

A continuación, exploramos el nivel de agotamiento de la CD8+ Tex. La puntuación con los genes de agotamiento (Pdcd1, Lag3, Tigit, Tox, Havcr2, Cxcl13) revela puntuaciones significativamente más altas en el estado 1 en comparación con el estado 7 (Figura 2E), lo que sugiere un mayor nivel de agotamiento en el estado 1, que está enriquecido en el grupo de edad avanzada. Para validar aún más el fenómeno, empleamos un sub-agrupamiento de la CD8+ Tex según investigaciones previas (Zhou et al. ^[2023]; Beltra et al. ^[2020]) (Figura 2F, G, Figura S4L). Se identificaron cuatro estados de agotamiento distintos: tipo de agotamiento precursor 1 (CD8+ Tpex1), tipo de agotamiento precursor 2 (CD8+ Tpex2), tipo de agotamiento terminal 1 (CD8+ Tex1) y tipo de agotamiento terminal 2 (CD8+ Tex2), con niveles de agotamiento progresivamente crecientes. El análisis de enriquecimiento celular revela poblaciones aumentadas de CD8+ Tpex1 y CD8+ Tex2 en el grupo de edad avanzada, mientras que la CD8+ Tex1 se enriquece en el grupo joven, lo que indica que el grupo de edad avanzada exhibe no solo fuentes de células T agotadas expandidas, sino también un nivel de agotamiento aumentado (Figura 2H, I).

La CD8+ Tex está específicamente enriquecida en la zona PV del hígado envejecido

Para analizar el microambiente de la CD8+ Tex, realizamos análisis de Stereo-seq y espacial (Figuras 1A y 3A). Se eligió Bin200 como un punto espacial y se realizó un control de calidad (Figura 3A, Figura S5A). El hígado exhibe una heterogeneidad espacial única (Ben-Moshe y Itzkovitz ^[2019]); por lo tanto, siguiendo un estudio previo (Wu et al. ^[2024]), los puntos se dividieron en 9 capas para investigar la distribución espacial de la CD8+ Tex (Figura 3B, Figura S5B). Dado que cada punto contiene múltiples células, utilizamos los datos de scRNA-seq y snRNA-seq generados en este estudio para anotar los datos de Stereo-seq. La distribución de la densidad de hepatocitos anotada por cell2location (Kleshchevnikov et al. ^[2022]) se alinea con la teoría, lo que demuestra la fiabilidad de los resultados de la anotación (Figura S6A). Se observó la distribución de la densidad de los subgrupos de células T CD8+, lo que reveló que la CD8+ Tex está específicamente enriquecida en las capas 6-9 (zona PV) del grupo de edad avanzada (Figura 3C, Figura S6E). La anotación de Stereoscope (Andersson et al. ^[2020]) corroboró la misma conclusión (Figura S6B, C, E). Para validar aún más la distribución espacial de la CD8+ Tex, se empleó el método de puntuación de la firma génica para el análisis. La distribución de las puntuaciones de las células endoteliales se alinea con las expectativas, lo que indica la fiabilidad de este método (Figura S6D). La CD8+ Tex muestra un aumento progresivo de las puntuaciones desde la zona CV hasta la zona PV en el grupo de edad avanzada, mientras que otros subgrupos carecen de esta tendencia espacial (Figura 3D, Figura S7). Además, las puntuaciones de la CD8+ Tex son significativamente más altas en el grupo de edad avanzada en comparación con el grupo joven, lo que corrobora los hallazgos del análisis de los datos de scRNA-seq (Figura 3E). En conjunto, la CD8+ Tex se acumula predominantemente en la zona PV del hígado envejecido.

La CD8+ Tex se colocaliza con los hepatocitos PP en el hígado envejecido

Además de delimitar la distribución espacial de los linfocitos CD8+ Tex, investigamos más a fondo sus socios celulares colocalizados mediante la realización de un análisis de colocalización celular. El análisis de la densidad celular y las correlaciones proporcionales revela que los linfocitos CD8+ Tex exhiben colocalización con diversos tipos de células en el grupo de edad avanzada, incluyendo Ngp+ Neu, Spp1+ Mac, linfocitos CD4+ Treg, hepatocitos PP, Apod+ pDC, linfocitos B naive y células NK (Figura 4A). El análisis de correlación basado en la puntuación del gen característico delimitó aún más los socios celulares colocalizados (Figura S8). Se observa una correlación positiva significativa entre las puntuaciones de los genes característicos de los hepatocitos y las células endoteliales en la misma zona anatómica, lo que valida la capacidad del método para detectar tipos de células colocalizados espacialmente (Figura 4C). En última instancia, entre todos los posibles tipos de células colocalizadas con los linfocitos CD8+ Tex, solo los hepatocitos PP exhibieron una correlación positiva significativa en sus perfiles de puntuación (Figura 4C). Además, validamos la colocalización de los linfocitos CD8+ Tex con los hepatocitos PP envejecidos utilizando una puntuación de colocalización, un método no basado en la correlación (Figura S9B). En resumen, la superposición espacial de los linfocitos CD8+ Tex y los hepatocitos PP en el grupo de edad avanzada indica que la acumulación de linfocitos Tex específicos de PV puede estar impulsada por los hepatocitos PP (Figura 4B, Figura S9A).

Los hepatocitos PP del hígado envejecido pueden inducir el agotamiento de las células T a través de vías metabólicas

Para explorar la relación entre los hepatocitos PP y el agotamiento de las células T, analizamos las características de la transcripción de los hepatocitos PP en el grupo de edad avanzada. Dado que la acumulación de linfocitos CD8+ Tex es específica de la edad, es fundamental investigar si las vías relacionadas con el envejecimiento están vinculadas mecánicamente al agotamiento de las células T. Coherente con lo esperado, tres vías relacionadas con la senescencia (senescencia replicativa, senescencia celular y fenotipo secretor asociado a la senescencia [SASP]) exhiben puntuaciones significativamente más altas en el grupo de edad avanzada en comparación con el grupo joven (Figura 5A). Las vías de senescencia celular y SASP muestran puntuaciones significativamente más altas en la zona PV en comparación con la zona CV, un patrón que se observa de manera consistente en ambos grupos (Figura 5A, Figura S10A). Si bien las zonas CV y PV muestran diferentes niveles de senescencia, la senescencia celular y la actividad de SASP no se correlacionan con la puntuación del gen característico de los linfocitos CD8+ Tex, lo que indica que la senescencia local tiene poco efecto sobre la disfunción de las células T (Figura 5B).

A continuación, analizamos los genes diferencialmente expresados (DEG) de los hepatocitos PP del grupo de edad avanzada. Se realizó un análisis de enriquecimiento de genes sobre la intersección de tres conjuntos de genes: hepatocitos PP del grupo de edad avanzada frente a hepatocitos PC del grupo de edad avanzada en datos de secuenciación de ARN de una sola célula (snRNA-seq); zona PV del grupo de edad avanzada frente a zona CV del grupo de edad avanzada en datos de secuenciación espacial (Stereo-seq); zona PV del grupo de edad avanzada frente a zona PV del grupo joven en datos de secuenciación espacial (Stereo-seq) (Figura 5C). Los DEG están significativamente enriquecidos en múltiples vías relacionadas con el metabolismo, y los genes regulados al alza muestran específicamente un enriquecimiento en la biosíntesis de aminoácidos, la regulación de la biosíntesis de triglicéridos, el metabolismo del oxaloacetato y las vías de señalización de la insulina (Figura 5C). Las puntuaciones de actividad de estas cuatro vías son consistentemente más altas en la zona PV o en los hepatocitos PP en los tres grupos (Figura S10B). En particular, las puntuaciones de actividad de estas cuatro vías exhiben fuertes correlaciones espaciales positivas con la puntuación del gen característico de los linfocitos CD8+ Tex, lo que sugiere que estas vías pueden impulsar el agotamiento de las células T en el microambiente hepático envejecido (Figura 5D).

Los hepatocitos PP en el hígado envejecido promueven el agotamiento de las células T a través de la expresión elevada de LPIN1

Para investigar si los hígados envejecidos contienen un mayor número de linfocitos CD8+ Tex, examinamos la abundancia y el fenotipo de los linfocitos CD8+ T en los hígados de ratones jóvenes y envejecidos. El análisis citométrico de flujo y la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) revelaron un aumento de la infiltración de linfocitos CD8+ T y un fenotipo de agotamiento más pronunciado en el grupo de edad avanzada (Figura 6A-C). Para determinar aún más la localización espacial de las células CD8+ Tex, realizamos inmunohistoquímica (IHC) y observamos un mayor número de células PD1-positivas en los hígados envejecidos, con un enriquecimiento marcado en la región PV en comparación con la región CV (Figura 6D). Para probar si los hepatocitos PP de la zona PV en el hígado envejecido contribuyen al agotamiento de las células CD8+ T, realizamos experimentos de cocultivo. Los linfocitos CD8+ T cocultivados con hepatocitos PP envejecidos exhibieron niveles de agotamiento más altos en comparación con los cultivados con hepatocitos PP jóvenes (Figura 6E, F). Nuestro análisis transcriptómico anterior identificó una regulación al alza de la vía de síntesis de triglicéridos en los hepatocitos PP que se correlacionó positivamente con el agotamiento de las células T; por lo tanto, nos centramos en LPIN1, el gen más significativamente regulado al alza en esta vía (Tabla S2), para una validación adicional. Se confirmó que la expresión de LPIN1 estaba elevada en los hepatocitos PP envejecidos (Figura 6G). Funcionalmente, la sobreexpresión de LPIN1 en los hepatocitos jóvenes promovió el agotamiento de las células CD8+ T, mientras que la inhibición de LPIN1 en los hepatocitos envejecidos atenuó este efecto (Figura 6H-J).

Para mejorar aún más la generalizabilidad y la relevancia clínica de estos hallazgos, realizamos estudios de validación utilizando muestras de humanos sanos. Examinamos la abundancia y el fenotipo de los linfocitos CD8+ T en el tejido hepático de individuos jóvenes y envejecidos. Coherente con nuestros datos de ratón, los hígados humanos envejecidos exhibieron un aumento de la infiltración de linfocitos CD8+ T y un fenotipo de agotamiento más pronunciado (Figura 7A-C). Además, se confirmó que la expresión de LPIN1 estaba regulada al alza en los hepatocitos PP envejecidos (Figura 7D). En conjunto, estos resultados sugieren que los hepatocitos PP envejecidos pueden promover el agotamiento de las células CD8+ T a través de la regulación al alza de la expresión de LPIN1.

Discusión

Las células inmunitarias en el hígado desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis inflamatoria hepática y en la eliminación de patógenos extraños y células dañadas. Sin embargo, los cambios dinámicos y las alteraciones funcionales de estas células inmunitarias durante el envejecimiento siguen siendo poco conocidos. Nuestro estudio delineó el panorama del envejecimiento de las células inmunitarias hepáticas utilizando la transcriptómica de una sola célula/un solo núcleo y la transcriptómica espacial. En particular, identificamos los cambios relacionados con la edad más pronunciados en las células T, caracterizados por la acumulación de células T agotadas. Combinando el análisis espacial y de una sola célula, investigamos sistemáticamente tanto los mecanismos intrínsecos de las células T como los ambientales que subyacen al agotamiento de las células T. Desde una perspectiva intrínseca, el envejecimiento impulsa un programa de agotamiento único marcado por la regulación al alza de la expresión de genes asociados al agotamiento (por ejemplo, Tox, Ptpn22, Lax1) y la regulación a la baja de genes relacionados con la memoria/células madre (por ejemplo, Il7r, Lef1). Desde una perspectiva microambiental, las células T agotadas están específicamente enriquecidas en la zona PV, donde los hepatocitos PP pueden promover el agotamiento de las células T a través de la regulación al alza de LPIN1.

Las células T exhiben las alteraciones más pronunciadas entre las poblaciones de células inmunitarias hepáticas durante el envejecimiento del hígado, manifestadas por la acumulación de células T agotadas. Como efectores críticos responsables de eliminar las células dañadas, las células infectadas por virus y las células neoplásicas en el hígado, el agotamiento de las células T puede elevar el riesgo de patologías hepáticas. Nuestra investigación multi-modelo en cohortes de enfermedades murinas y humanas revela una correlación positiva entre el agotamiento de las células T y la progresión de las enfermedades hepáticas, lo que sugiere que la focalización de las células T agotadas podría representar una nueva estrategia terapéutica para los trastornos hepáticos. Sin embargo, un estudio reciente en modelos murinos de NASH demuestra que los anticuerpos anti-PD-1 (diseñados para revertir el agotamiento de las células T) comprometieron paradójicamente la vigilancia inmunitaria antitumoral, lo que resultó en tasas elevadas de hepatocarcinogénesis (Pfister et al. ^[2021]). Estos hallazgos subrayan la necesidad de estudios mecanicistas adicionales para aclarar la relación causal entre el agotamiento de las células T y la patogénesis de las enfermedades hepáticas, particularmente en el contexto de equilibrar la eficacia terapéutica frente a los posibles riesgos oncogénicos.

Nuestra investigación mecanicista del agotamiento de las células T en los hígados envejecidos revela que, más allá de los cambios transcripcionales intrínsecos de las células T, las alteraciones metabólicas en los hepatocitos contribuyen de manera crítica al proceso de agotamiento. Demostramos a través de experimentos de ganancia y pérdida de función que la regulación al alza de LPIN1, un regulador clave de la síntesis de triglicéridos en los hepatocitos PP, promueve el agotamiento de las células T. Sin embargo, una limitación de nuestro estudio es que solo se utilizaron ratones machos y el mecanismo preciso por el cual LPIN1 ejerce este efecto pro-agotamiento, y si la focalización de LPIN1 podría mitigar el impacto del agotamiento de las células T en el hígado envejecido, aún deben dilucidarse y justifican una mayor investigación.

Método

Declaración ética

Los ratones jóvenes y envejecidos de la cepa C57BL/6J se alojaron en el Departamento de Ciencia Experimental de Animales, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pekín. Todos los ratones se alojaron en condiciones estándar libres de patógenos específicos. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Pekín. La adquisición y el uso de especímenes clínicos recibieron una autorización explícita del Comité de Ética del Hospital Shougang de la Universidad de Pekín (Número de aprobación: SGYYZ202103), y se obtuvo la documentación del consentimiento informado por escrito de todos los donantes antes de su participación.

Animales

Los ratones C57BL/6 se compraron a Vital River Laboratory Animal Technology. Los ratones jóvenes (2 meses) o envejecidos (18 meses) C57BL/6 se definieron por la edad. Todos los ratones se mantuvieron en instalaciones libres de patógenos y se utilizaron estrictamente de acuerdo con los protocolos aprobados por el IACUC de la Universidad de Tsinghua. El estudio cumple con todas las regulaciones éticas pertinentes con respecto a la investigación con animales. El sexo no se consideró en el diseño y el análisis del estudio, ya que este estudio no fue diseñado para detectar diferencias de sexo. Solo se utilizaron ratones machos para este estudio y todos los datos de los ratones se recopilaron de ratones machos.

Aislamiento y cultivo de hepatocitos primarios

Los ratones jóvenes o envejecidos se anestesiaron según los métodos anteriores (Bai et al. ^[2021]). Para obtener hepatocitos primarios, se recolectaron tejidos hepáticos de ratones machos. Se llevó a cabo un procedimiento de perfusión a través de la vena porta utilizando 50 ml de HBSS precalentado (37 °C, Corning) que contenía 1 mM de EGTA y 5,5 mM de glucosa, administrado a una velocidad de flujo de 11 ml/min. Esto fue seguido por la digestión enzimática con 40 ml de solución de colagenasa IV basada en HBSS (Sigma, 0,25 mg/ml) suplementada con 5 mM de CaCl2 y 5,5 mM de glucosa. Después de la dispersión, la suspensión de hepatocitos se centrifugó a 500 rpm durante 2-5 minutos para sedimentar las células. Después de dos pasos de lavado con medio M199 (MacGene, Beijing), el pellet celular se resuspendió en medio de adherencia que consistía en M199 suplementado con 0,2% de BSA, 2% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Luego, las células se colocaron en placas de cultivo pre-recubiertas con 0,1% de gelatina y se mantuvieron a 37 °C en una incubadora de 5% de CO2. Después de 4 horas de incubación para permitir la adherencia, el medio se reemplazó con medio de cultivo fresco y las células se mantuvieron en cultivo para análisis experimentales posteriores.

Líneas celulares

Las células 293T se compraron a la American Type Culture Collection y se cultivaron en medio DMEM (macgene, CM10013). Las células 293T se autenticaron y se probaron para detectar contaminación por micoplasma. Además, hemos autenticado la línea celular utilizando un método de perfilado de repeticiones cortas en tándem de acuerdo con el protocolo informado.

Construcciones de ADN y producción de lentivirus

Los fragmentos para la sobreexpresión de Lpin1 del ratón se construyeron en el vector pCHN1. Los fragmentos de shRNA se clonaron en el vector pLKO.1-TRC. Las secuencias de shRNA se diseñaron (F: CCGGGCCGTGTCATATCAGCAATTTCTCGAGAAATTGCTGATATGACACGGCTTTTTG, R: AATTCAAAAAGCCGTGTCATATCAGCAATTTCTCGAGAAATTGCTGATATGACACGGC) y se clonaron aguas abajo del promotor U6 dentro del vector lentiviral pLKO-GFP, utilizando una secuencia de shRNA no diana como control. El lentivirus se produjo en células HEK293T mediante la transfección conjunta de los plásmidos anteriores junto con pMD2.G y psPAX2. Los sobrenadantes de cultivo se recolectaron y se concentraron mediante ultracentrifugación a 20 000 rpm durante 2,5 horas.

Aislamiento y estimulación de linfocitos CD8+ primarios

Se aislaron células T CD8+ de ratón a partir de los bazo de ratón utilizando un kit de selección con biotina. Las células T CD8+ y las células T CD8+ P14 de ratón se estimularon con 3,5 μg/mL de anticuerpo anti-CD3 y 1 μg/mL de anticuerpo anti-CD28. Las células T CD8+ se cultivaron en medio RPMI-1640 (macgene, CM10041) con 100 U/mL de IL-2. Para el agotamiento in vitro, las células T CD8+ se estimularon cuatro veces con un intervalo de 2 días.

Citometría de flujo

Para la tinción de superficie, se recolectaron las células y se tiñeron con anticuerpos a la dilución recomendada antes del análisis por citometría de flujo. Para la proteína intracelular LPIN1, se recolectaron y lavaron las células, se fijaron con el tampón de fijación IC de eBioscience (00-8222-49), se permeabilizaron con el tampón de permeabilización de eBioscience (00-8333-56) y se tiñeron según el protocolo del fabricante. Las células teñidas se lavaron antes del análisis por FACS. Se utilizó el software de citometría de flujo BD FACSuite para la recolección de señales de FACS. Los eventos positivos se determinaron mediante el control de isotipo para cada anticuerpo. Primero, las células se clasificaron utilizando las características FSC/SSC para excluir los restos celulares, seguido de la clasificación de FSC-A y FSC-H, y luego SSC-A y SSC-H para eliminar los no singletes. A continuación, las células diana se clasificaron en la población de interés mediante una tinción específica. El análisis de datos se realizó utilizando FlowJo.

Inmunohistoquímica multiplex

Se empleó un enfoque de tinción de inmunofluorescencia multiplex para detectar secuencialmente tres marcadores proteicos: PD1 (CST84651), glutamina sintetasa (ab176562) y arginasa-1 (16001-1-AP). Los anticuerpos primarios se aplicaron en rondas sucesivas: PD1 a una dilución de 1:100 con incubación nocturna a 4 °C, seguido de glutamina sintetasa (1:1000, 30 minutos a temperatura ambiente) y arginasa-1 (1:1000, 30 minutos a temperatura ambiente). Cada ciclo incluyó la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP y la amplificación de la señal con tiramida (TSA) para la visualización por fluorescencia. Para evitar la reactividad cruzada entre las rondas de tinción, se realizó la recuperación del antígeno asistida por microondas después de cada paso de TSA utilizando EDTA para PD1 y tampón de citrato de sodio para la glutamina sintetasa y la arginasa-1. Después de completar la tinción de todas las proteínas diana, los núcleos celulares se contrateñeron con DAPI (Sigma-Aldrich).

Preparación y secuenciación de la biblioteca scRNA-Seq

Las bibliotecas scRNA-seq se prepararon utilizando la plataforma 10× Genomics Chromium con el kit Single Cell 3′ Library & Gel Bead Kit v3.1 (1000121) y el kit Single Cell G Chip Kit (1000120). Las suspensiones celulares que contenían de 300 a 600 células viables/μL (cuantificadas mediante el análisis de viabilidad Count Star) se procesaron utilizando el controlador Chromium para crear particiones de gel-en-emulsión (GEM) siguiendo el flujo de trabajo recomendado. Brevemente, las células individuales se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con 0,04% de albúmina sérica bovina (BSA), con aproximadamente 12 000 células cargadas por canal microfluídico, lo que da como resultado una tasa de recuperación anticipada de ~10 000 células por muestra. La lisis celular y el posterior etiquetado de ARN se lograron mediante la transcripción inversa basada en GEM. La síntesis de ADNc se llevó a cabo en un termociclador S1000TM Touch (Bio-Rad) utilizando el siguiente perfil térmico: 45 minutos a 53 °C, 5 minutos a 85 °C, seguido de un mantenimiento a 4 °C. Los productos de ADNc amplificados se sometieron a una verificación del control de calidad utilizando el Agilent 4200 (servicio proporcionado por CapitalBio Technology, Beijing). Las bibliotecas construidas se secuenciaron posteriormente en una plataforma Illumina NovaSeq 6000, empleando una estrategia de lectura pareada de 150 pb (PE150), con una profundidad de secuenciación de al menos 100 000 lecturas por célula. Este proceso de secuenciación fue realizado por CapitalBio Technology en Beijing.

Preparación y secuenciación de la biblioteca snRNA-Seq

El hígado de ratón se colocó en 1 mL de tampón de lisis (LB) y se homogeneizó utilizando un homogeneizador de tejidos. El homogeneizado se lisó luego sobre hielo durante 1-10 minutos. Se utilizó un filtro de malla de 40 μm para eliminar los restos celulares, y el filtrado se centrifugó a 4 °C y 500 g durante 5 minutos. Después de eliminar el sobrenadante, se agregaron 300 μL de solución LB al sedimento, y el núcleo se resuspendió por pipeteo. La suspensión se transfirió a un nuevo tubo de centrífuga, y se agregaron 300 μL de tampón de resuspensión (RB), seguido de una mezcla completa. A continuación, se agregaron lentamente 600 μL de solución PB1 al fondo del tubo para formar una capa. De manera similar, se agregaron lentamente 600 μL de solución PB2 al fondo del tubo para formar otra capa. La mezcla se centrifugó luego a 4 °C y 4000 g durante 20 minutos, con el núcleo ubicado en la interfaz entre PB1 y PB2. Se transfirió un volumen de 150-300 μL de la capa del núcleo a 1 mL de solución RB, se mezcló a fondo y se filtró a través de un filtro de malla de 40 μm. El filtrado se centrifugó a 4 °C y 500 g durante 5 minutos. Después de eliminar el sobrenadante, el sedimento del núcleo se resuspendió en 100 μL de solución EB. Los pasos posteriores se llevaron a cabo siguiendo el flujo de trabajo estándar de scRNA-seq. La preparación de la biblioteca y la secuenciación de la snRNA-seq fueron realizadas por CapitalBio Technology en Beijing. Los grupos jóvenes y viejos se procesaron en lotes separados, lo que hizo imposible separar los efectos de lote de las diferencias causadas por el envejecimiento entre los dos grupos.

Preparación y secuenciación de la biblioteca Stereo-Seq

Las muestras frescas de tejido hepático de ratón se adhirieron a las virutas de transcriptómica espacial Stereo-seq fabricadas por BGI mediante un breve acondicionamiento térmico a 37 °C durante 3 minutos. La fijación posterior implicó la inmersión en metanol absoluto enfriado (-20 °C) durante 40 minutos antes de iniciar los flujos de trabajo de construcción de la biblioteca. Para la validación morfológica, se sometieron a tinción nuclear con tinte de ácido nucleico (Thermo Fisher Scientific, Q10212) secciones seleccionadas, y se capturaron micrografías fluorescentes utilizando un sistema de microscopio Motic Custom PA53 FS6. Estas muestras controladas por calidad se procesaron posteriormente a través de flujos de trabajo de codificación espacial de canal FITC para la captura del transcriptoma.

Las secciones de tejido se trataron inicialmente con una solución tampón que contenía 0,1× SSC (Thermo, AM9770) y 0,05 U/mL de inhibidor de RNasa (NEB, M0314L) para prepararlas para los pasos posteriores. La permeabilización se logró sumergiendo las secciones en una solución que contenía 0,1% de pepsina (Sigma, P7000) en 0,01 M de HCl, seguida de una incubación a 37 °C durante 5 minutos. Después de este paso, las secciones se lavaron nuevamente con la misma solución tampón que contenía el inhibidor de RNasa. El ARN liberado del tejido permeabilizado se capturó mediante nanoesferas de ADN (DNB) y se sometió a transcripción inversa. Este proceso utilizó la transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen, 18064-014) en una mezcla de reacción que contenía 10 U/mL de transcriptasa inversa, 1 mM de dNTP, 1 M de betaína, 7,5 mM de MgCl2, 5 mM de DTT, 2 U/mL de inhibidor de RNasa, 2,5 mM de Stereo-seq TSO y 1× tampón de primera cadena. La transcripción inversa se llevó a cabo durante la noche a 42 °C. Después de esto, las secciones de tejido se lavaron dos veces con tampón 0,1× SSC y luego se trataron con tampón de eliminación de tejido (que comprende 10 mM de Tris-HCl, 25 mM de EDTA, 100 mM de NaCl y 0,5% de SDS) a 55 °C durante 10 minutos para facilitar la digestión del tejido. Las virutas que contienen ADNc se trataron posteriormente con una mezcla de liberación de ADNc (que comprende enzima de liberación de ADNc y tampón) durante la noche a 55 °C. Finalmente, el ADNc se purificó utilizando cuentas de limpieza de ADN VAHTSTM en una proporción de 0,8× para garantizar una recuperación de ADNc de alta calidad.

La amplificación del ADNc se realizó utilizando la mezcla maestra de polimerasa de ADN KAPA HiFi HotStart (Roche, KK2602) suplementada con 0,8 μM de cebadores de amplificación específicos de ADNc. Los parámetros del ciclo térmico se configuraron con el siguiente perfil: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 minutos; 15 ciclos de amplificación que consisten en desnaturalización a 98 °C durante 20 segundos, hibridación de cebador a 58 °C durante 20 segundos y extensión de cadena a 72 °C durante 3 minutos por ciclo; concluyendo con una fase de extensión terminal a 72 °C durante 5 minutos para garantizar la elongación completa del producto.

La cuantificación del ADN de los productos de PCR se realizó utilizando el kit de ensayo de ADN de doble cadena Qubit (Thermo, Q32854). Para la preparación de la biblioteca, se fragmentaron 20 ng de ADN purificado mediante incubación con la transposasa Tn5 formulada a medida a 55 °C durante 10 minutos, y la actividad enzimática se detuvo mediante la adición de una solución de SDS al 0,02% seguida de una suave mezcla a 37 °C durante 5 minutos. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en volúmenes de 100 μL que contenían 25 μL de ADN fragmentado, 1× concentración de KAPA HiFi HotStart Ready Mix, 0,3 μM de cebador Stereo-seq-Library-F, 0,3 μM de cebador Stereo-seq-Library-R y agua libre de nucleasas para alcanzar el volumen final. Las condiciones del ciclo térmico comprendieron una desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 13 ciclos de 98 °C durante 20 segundos, 58 °C durante 20 segundos y 72 °C durante 30 segundos, concluyendo con una extensión final a 72 °C durante 5 minutos. Las bibliotecas amplificadas se purificaron secuencialmente utilizando cuentas magnéticas AMPure XP con relaciones de selección de tamaño de 0,63 y 0,153, seguidas de la generación de DNB mediante protocolos estándar. La secuenciación final se realizó en la plataforma MGI DNBSEQ-Tx utilizando una configuración de lectura pareada de 150 pb.

Procesamiento de datos brutos de scRNA-Seq y snRNA-Seq

Los archivos FASTQ originales se alinearon al genoma de referencia mm10 utilizando la función cellranger count en cellranger 7.0.1 (10× Genomics Cell Ranger v7.0.1). Para las muestras O2 e Y2, el parámetro -force-cells se estableció explícitamente en 11 600 y 26 200, respectivamente, mientras que se aplicaron los valores predeterminados para otras muestras. Los tres archivos de salida generados por esta canalización se importaron posteriormente a Seurat 5.2.1 (Hao et al. ^[2024]) para el análisis posterior.

Procesamiento de datos brutos de Stereo-Seq

La adquisición de datos de secuenciación se realizó en la plataforma MGI DNBSEQ-Tx, generando lecturas pareadas con identificadores espaciales integrados. La lectura 1 contenía códigos de barras de oligonucleótidos duales (CID: posiciones 1-25; MID: posiciones 26-35), mientras que la lectura 2 contenía secuencias de ADNc. El procesamiento primario implicó la referencia cruzada de las secuencias CID con las coordenadas espaciales predefinidas derivadas de las rondas de secuenciación iniciales, lo que permitió desajustes de un solo nucleótido para compensar los artefactos técnicos. El filtrado de calidad excluyó las lecturas que contenían bases ambiguas (N) en las regiones MID o aquellas que excedían dos posiciones con puntuaciones Phred inferiores a 10. Las combinaciones CID-MID validadas se integraron en los encabezados FASTQ como etiquetas de metadatos. La alineación de secuencias se ejecutó mediante el alineador STAR (Dobin et al. ^[2013]) con el genoma de referencia mm10, reteniendo solo las lecturas mapeadas de forma única con puntuaciones de calidad de mapeo (MAPQ) superiores a 10 para la anotación de genes. La deduplicación molecular consolidó los UMI que comparten las mismas coordenadas espaciales CID y loci de genes, incorporando una tolerancia de un solo nucleótido para mitigar los sesgos de amplificación. La salida final generó una matriz de expresión resuelta espacialmente que codifica los perfiles transcripcionales anclados a CID. Se eligió Bin200 como punto.

Control de calidad de scRNA-Seq, snRNA-Seq y Stereo-Seq

Control de calidad de datos de scRNA-Seq

Para cada muestra, se calcularon dos métricas para filtrar las células de baja calidad y los dobletes: (1) porcentaje de UMI de genes mitocondriales y (2) número total de genes detectados. Las células con UMI mitocondriales > 10% o < 500 genes totales detectados se clasificaron como de baja calidad, mientras que aquellas con > 6000 genes detectados se marcaron como dobletes y se excluyeron. Las muestras Y2 y O2, que mostraron un recuento de genes significativamente menor en comparación con otros miembros del grupo, también se excluyeron para minimizar la heterogeneidad intra-grupo que afecta las comparaciones inter-grupo.

Control de calidad de datos de snRNA-Seq

Se aplicó un flujo de trabajo similar, pero con umbrales ajustados: se excluyeron las células con UMI mitocondriales > 5%, < 500 genes totales o > 5000 genes (dobletes). La muestra Yn1 se eliminó debido a su proporción anormalmente alta de células de baja calidad en comparación con otras muestras de su grupo.

Control de calidad de datos de Stereo-Seq (punto bin200)

Se evaluaron los puntos utilizando el porcentaje de UMI mitocondriales (> 5%) y el número total de genes detectados (< 200) para identificar los puntos de baja calidad. No se impuso un límite superior al recuento de genes, ya que cada punto (resolución bin200) puede abarcar varias células. Todos los puntos de baja calidad se excluyeron de los análisis posteriores.

Agrupamiento y anotación de scRNA-Seq y snRNA-Seq

La matriz de expresión se procesó mediante el flujo de trabajo estándar en Seurat v5.2.1 (Hao et al. ^[2024]). La normalización inicial, utilizando la función NormalizeData, eliminó las variaciones técnicas en el número total de UMI por célula. Se identificaron dos mil genes altamente variables mediante la función FindVariableFeatures, seguida de la escalada de características mediante ScaleData para mitigar los efectos de dominancia de los genes altamente expresados. La reducción de la dimensionalidad se realizó mediante el análisis de componentes principales (PCA) para capturar las principales variaciones biológicas. Para los conjuntos de datos de scRNA-seq, los recuentos brutos se fusionaron directamente utilizando la función merge, y los análisis posteriores se llevaron a cabo en el espacio reducido por PCA. Los conjuntos de datos de snRNA-seq requirieron integración mediante el análisis de correlación canónica (CCA), con análisis posteriores realizados en el espacio dimensional alineado por CCA. El sub-agrupamiento de los datos de scRNA-seq empleó la integración de Harmony, con análisis posteriores realizados en el espacio reducido por Harmony. El agrupamiento de células utilizó los primeros 50 componentes principales mediante el particionamiento basado en el gráfico de vecinos más cercanos (SNN). La visualización bidimensional se logró mediante RunUMAP para la representación de los grupos. La anotación final del tipo de célula se basó en los genes marcadores informados en la literatura o en los DEG identificados mediante el análisis basado en modelos de la transcriptómica de una sola célula (MAST).

Genes Marcadores Utilizados en la Anotación

Anotación Principal del Tipo de Célula de los Datos de scRNA-Seq

Célula T (Cd3e +, Cd3d +, Cd3g +) (Liu et al. ^[2024]; Su, Kim, et al. ^[2021]); NK (Klrb1c +) (Liu et al. ^[2024]); NKT (Cd3e +, Cd3d +, Cd3g +, Klrb1c +) (Shen et al. ^[2020]); célula B (Cd19 +, Cd79a +, Ms4a1 +) (Liu et al. ^[2024]; Su, Kim, et al. ^[2021]); neutrófilo (Retnlg +) (Su, Kim, et al. ^[2021]); DC (Flt3 +) (Su, Kim, et al. ^[2021]); macrófago (Clec4f +, Adgre1 +) (Wen et al. ^[2021]; Krenkel y Tacke ^[2017]; Liang et al. ^[2022]); célula endotelial (Clec4g +, Ptprb +) (Su, Kim, et al. ^[2021]; Drexler et al. ^[2019]).

Anotación Principal del Tipo de Célula de los Datos de snRNA-Seq

Hepatocito PP (Sds +, Cyp2f2 +) (Nikopoulou et al. ^[2023]; Bravo González-Blas et al. ^[2024]); hepatocito PC (Glul +, Cyp2e1 +) (Bravo González-Blas et al. ^[2024]); célula endotelial (Dpp4 +) (Nikopoulou et al. ^[2023]); célula estrellada hepática (Reln +) (Su, Kim, et al. ^[2021]); célula inmune (Ptprc +) (Liu et al. ^[2024]).

Anotación de Subgrupos de Células T

Células T CD8+: estado naive (CD8+ Tn, Lef1 +, Sell +, Il7r +) (Liu et al. ^[2024]; Technology, C. S, [n.d.]); estado de memoria central (CD8+ Tcm, Sell +, CD44 +, Il7r +) (Technology, C. S, [n.d.]); estado de memoria efector (CD8+ Tem, CD44 +, Il7r +) (Technology, C. S, [n.d.]); estado de agotamiento (CD8+ Tex, Pdcd1 +, Tigit +, Lag3 +, Tox +) (Mogilenko et al. ^[2021]).

Células T CD4+: estado naive (CD4+ Tn, Lef1 +, Sell +, Il7r +) (Liu et al. ^[2024]; Technology, C. S, [n.d.]); estado de memoria efector (CD4+ Tem, CD44 +, Il7r +) (Technology, C. S, [n.d.]); estado regulador (CD4+ Treg, Foxp3 +, Il2ra +, Ctla4 +) (Ohkura y Sakaguchi ^[2020]); estado de agotamiento (CD4+ Pdcd1+ T, Pdcd1 +, Tigit +, Lag3 +, Tox +) (Mogilenko et al. ^[2021]).

Otras células T: célula T reguladora tipo DN (CD4/CD8 negativa) (Il2ra +).

Anotación de Subgrupos de NK

NK de estrés (Hspa1a +, Hspa1b +, Hsph1 +).

Anotación de Subgrupos de NKT

NKT en tránsito (Klf2 +, S1pr1 +, Sell +) (Shen et al. ^[2020]); NKT activo (Icos +) (Shen et al. ^[2020]); NKT Cd200r1 + (Cd200r1 +).

Anotación de Subgrupos de Células B

Célula B naive (Ighd +) (Biocompare, [n.d.]); célula B de estrés (Hspa1a +, Hspa1b +); célula B tipo 1 asociada a la edad (ABC tipo B1, Zbtb32 +, Fcrl5 +, Tbx21 +, Cr2 -, Fcer2a -) (Mogilenko et al. ^[2021]; Hao et al. ^[2011]); célula B tipo 2 asociada a la edad (ABC tipo B2, Fcrl5 +, Cr2 -, Fcer2a -, Cd93 -, Fcer1g -, Spn -) (Mogilenko et al. ^[2021]; Hao et al. ^[2011]).

Anotación de Subgrupos de Neutrófilos

Neu Fnip2 + (Fnip2 +, Ccrl +); Neu Cxcl3 + (Cxcl3 +); Neu Ngp + (Fgd4 +, Ngp +, Camp +).

Anotación de Subgrupos de DC

pDC Grm8 + (Bst2 +, Siglech +, Grm8 +) (Segure ^[2016]); pDC Apod + (Bst2 +, Siglech +, Apod +) (Segure ^[2016]); cDC1 Batf3 + (Batf3 +) (Segure ^[2016]); cDC1 Xcr1 + (Batf3 +, Xcr1 +) (Segure ^[2016]); cDC2 (Cd209a +) (Liu et al. ^[2024]).

Anotación de Subgrupos de Macrófagos

Macrófagos derivados de monocitos (Cx3cr1 +) (Krenkel y Tacke ^[2017]): Mo-Mac Vcan + (Vcan +); Mo-Mac Dusp16 + (Dusp16 +); Mo-Mac Stxbp6 + (Stxbp6 +); Mo-Mac Cxcl2 + (Cxcl2 +); Mo-Mac Cxcl9 + (Cxcl9 +).

Otros macrófagos: célula de Kupffer (Clec4f +, Vsig4 +) (Nikopoulou et al. ^[2023]; Su, Kim, et al. ^[2021]); Mac Cxcl9 + (Cxcl9 +); Mac Spp1 + (Spp1 +).

Enriquecimiento Celular (Chu et al. 2024)

Para determinar si tipos celulares específicos presentan un enriquecimiento en el grupo de edad avanzada, se realizó un análisis de enriquecimiento celular utilizando la prueba de chi-cuadrado. Para el tipo celular X, todas las células inmunes se clasificaron en cuatro grupos comparativos: células X en el grupo de edad avanzada, células X en el grupo de edad joven, células no X en el grupo de edad avanzada y células no X en el grupo de edad joven. Los recuentos cuantitativos de células de estas cuatro categorías se analizaron estadísticamente mediante la prueba de chi-cuadrado. La relación de valores observados a esperados (Ro/e) se calculó como el número de células X observadas en el grupo de edad avanzada dividido por el número teórico de células X predichas para el grupo de edad avanzada bajo la hipótesis nula, proporcionando una métrica para cuantificar el nivel de enriquecimiento.

Análisis de DEG

El análisis de expresión génica diferencial se realizó utilizando la función FindMarkers en Seurat v5.2.1 (Hao et al. ^[2024]) con el algoritmo MAST. Para identificar los genes asociados a la senescencia en las principales poblaciones de células inmunes, se realizaron análisis comparativos entre los grupos de edad avanzada y joven dentro de cada categoría de células inmunes, aplicando umbrales de |avglog2FC| > 1 y pvaladj < 0,05 para definir los DEG significativos. En el análisis de los hepatocitos PP en el grupo de edad avanzada, se establecieron tres comparaciones distintas: hepatocitos PP de edad avanzada frente a hepatocitos PC de edad avanzada en los datos de snRNA-seq, puntos espaciales de la zona PV frente a puntos espaciales de la zona CV dentro del grupo de edad avanzada de los datos de Stereo-seq, y puntos espaciales de la zona PV de edad avanzada frente a puntos espaciales de la zona PV de edad joven en los datos de Stereo-seq. Para estas comparaciones de hepatocitos PP, la identificación de DEG empleó criterios más laxos de |avglog2FC| > 0,25 con pvaladj < 0,05.

Cálculo de la Distancia de Bhattacharyya

La distancia de Bhattacharyya, una medida de similitud entre dos distribuciones, es eficaz para cuantificar las diferencias entre dos grupos en un espacio de alta dimensionalidad. Para calcular esta métrica, se utilizó el software distdimscr (versión 0.0.0.9000), que está disponible en https://github.com/arc85/distdimscr. Para mejorar la eficiencia computacional, se implementó un enfoque de muestreo aleatorio: para cada población principal de células inmunes, se seleccionaron aleatoriamente 250 células para el análisis, y este proceso de muestreo se repitió 100 veces.

Análisis de Enriquecimiento de DEG

Los DEG se clasificaron en grupos de genes regulados al alza y regulados a la baja para análisis de enriquecimiento separados, que se realizaron utilizando Metascape (Zhou et al. ^[2019]) (https://metascape.org/gp/). Las vías sujetas al análisis de enriquecimiento se obtuvieron de cinco bases de datos: GO Molecular Functions, GO Biological Processes, GO Cellular Components, Reactome Gene Sets y KEGG Pathway.

Puntuación de Vías y Genes de Firma

La puntuación de vías se realizó utilizando la función AddModuleScore en Seurat v5.2.1 (Hao et al. ^[2024]). Las vías relacionadas con el estado de las células T (quiescencia, proliferación, citotoxicidad, agotamiento progenitor, agotamiento terminal, senescencia) se obtuvieron de TCellSI v0.1.0 (Yang et al. ^[2024]). La vía de activación de la apoptosis se derivó de la literatura (Jourdan et al. ^[2009]), mientras que la vía de respuesta de TGFβ (HALLMARKTGFBETASIGNALING) se obtuvo de la base de datos MSigDB. Los genes marcadores para los tipos de células se identificaron mediante el análisis de expresión diferencial interno de la línea: Ngp + Neu frente a los subtipos restantes de neutrófilos, Spp1 + Mac frente a otros subtipos de macrófagos, Apod_ + pDC frente a otros subtipos de DC, células B naive frente a otros subtipos de células B, y subtipos de células T/NK/NKT frente a sus respectivas poblaciones restantes. Los genes marcadores comprendieron los 30 genes más expresados por tipo de célula y los genes seleccionados manualmente de la literatura (Bravo González-Blas et al. ^[2024]; Su, Yang, et al. ^[2021]) para las células endoteliales y los hepatocitos. Todos los conjuntos de genes marcadores no presentaron superposición entre las clases de células o los conjuntos de genes de puntuación de capa. La senescencia replicativa (GO:0090399), la senescencia celular (GO:009038) y las vías SASP se obtuvieron de MSigDB y la literatura (Suryadevara et al. ^[2024]). Las vías metabólicas (síntesis de aminoácidos (mmu00290, mmu00220, mmu00400), señalización de la insulina (mmu04910), síntesis de hormonas esteroideas (mmu00140), metabolismo de la tirosina (mmu00350), gluconeogénesis (R-MMU-70263), metabolismo del oxaloacetato (GO:0006107), síntesis de triglicéridos (GO:0019432), respuesta a la glucagón (GO:0033762), respuesta al alcohol (GO:0097305), síntesis de ácidos grasos (GO:0006633) y degradación de ácidos grasos (GO:0009062)) se obtuvieron de KEGG y MSigDB.

Recopilación y Análisis de Conjuntos de Datos de scRNA-Seq Públicos

Los conjuntos de datos de células individuales del hígado de ratones jóvenes y viejos sanos se seleccionaron de los estudios (Mogilenko et al. ^[2021]; Almanzar ^[2020]; Cai et al. ^[2023]; Nikopoulou et al. ^[2023]) para el análisis. Los procedimientos de control de calidad siguieron los protocolos originales del estudio con ajustes adicionales: el estudio (Cai et al. ^[2023]) implementó un umbral de recuento de < 10 000; el estudio (Mogilenko et al. ^[2021]) aplicó un límite máximo de recuento de 20 000; el estudio (Nikopoulou et al. ^[2023]) excluyó las células que excedían el 20 % de contenido de genes mitocondriales; el estudio (Almanzar ^[2020]) complementó los datos basados en gotas con un límite de recuento de 50 000 y los datos ordenados por FACS con un límite de recuento de 1 × 107. Los conjuntos de datos de scRNA-seq del hígado asociados a enfermedades de los estudios (Xiong et al. ^[2019]; Su, Kim, et al. ^[2021]; Ramachandran et al. ^[2019]; Li et al. ^[2024]) se sometieron a control de calidad de acuerdo con sus respectivas publicaciones originales.

Trayectoria de Diferenciación Celular

El análisis de la trayectoria de diferenciación de las células T CD8+ se realizó utilizando Monocle v2.26.0 (Qiu et al. ^[2017]). Las matrices de recuento brutos se convirtieron en un objeto CellDataSet, seguido de la normalización del tamaño de la biblioteca y la estimación de la dispersión mediante la función estimateSizeFactors. Los DEG entre los subtipos de células T CD8+ se identificaron utilizando el método differentialGeneTest, seleccionando los 200 DEG principales como características de entrada. La reconstrucción de la trayectoria se ejecutó mediante el algoritmo DDRTree, estableciendo las células T CD8+ Tn como el estado raíz. Los patrones de expresión específicos de la rama en dos trayectorias de agotamiento se analizaron utilizando la función BEAM, con DEG definidos por un valor q < 0,05 y detección en ≥ 5 % de las células.

Anotación de Stereo-Seq

Los datos de scRNA-seq y snRNA-seq generados en este estudio se utilizaron como referencia después de excluir las células B en estado de estrés, las células similares a Treg DN y las poblaciones de células NK en estado de estrés. Los datos de transcriptómica espacial de muestras antiguas se deconvolucionaron utilizando referencias del grupo antiguo, mientras que los datos espaciales de muestras jóvenes emplearon las referencias correspondientes del grupo joven. El primer enfoque de anotación utilizó cell2location v0.1.3 (Kleshchevnikov et al. ^[2022]) siguiendo su flujo de trabajo estándar. Se eliminaron los genes mitocondriales, seguido de un filtrado de genes con parámetros predeterminados (cellcountcutoff = 5, cellpercentagecutoff2 = 0.03, nonzmeancutoff = 1.12). Se construyeron matrices de firmas de referencia con corrección de lote a nivel de muestra y se entrenaron durante 1000 épocas. El modelado de resolución espacial se realizó utilizando hiperparámetros Ncellsperlocation = 32 (determinado en base a datos de densidad nuclear hepática murina de la literatura (Hildebrandt et al. ^[2021])) y detectionalpha = 20, seguido de un entrenamiento de 10.000 épocas. La abundancia celular se cuantificó utilizando el percentil 5 de las distribuciones posteriores, según lo recomendado. El segundo enfoque empleó stereoscope v0.3.1 (Andersson et al. ^[2020]), donde los datos de entrada se prepararon mediante subsample-data.py (máximo 500 células por clase) y la deconvolución se ejecutó utilizando stereoscope run con los parámetros -sce 50000, -n 5000, -ste 50000, -stb 100 y -scb 100.

Asignación de capas

Los puntos de transcriptómica espacial se puntuaron para la zonificación de PV y CV utilizando genes marcadores informados previamente (Xu et al. ^[2024]), implementados a través de la función AddModuleScore en Seurat v5.2.1 (Hao et al. ^[2024]). La puntuación de zonificación final se calculó como la puntuación de la firma de CV menos la puntuación de la firma de PV. Dentro de cada muestra, todos los puntos se estratificaron en nueve cuantiles iguales (capa1-capa9) en función de las puntuaciones de zonificación descendentes, con las regiones de CV definidas como las capas 1-3, las zonas intermedias como las capas 4-6 y las regiones de PV como las capas 7-9.

Declaración ética

Los ratones jóvenes y envejecidos de la cepa C57BL/6J se alojaron en el Departamento de Ciencia Experimental de Animales, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pekín. Todos los ratones se alojaron en condiciones estándar libres de patógenos específicos. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Pekín. La adquisición y el uso de especímenes clínicos recibieron una autorización explícita del Comité de Ética del Hospital Shougang de la Universidad de Pekín (Número de aprobación: SGYYZ202103), y se obtuvo la documentación del consentimiento informado de todos los donantes antes de su participación.

Animales

Los ratones C57BL/6 se compraron a Vital River Laboratory Animal Technology. Los ratones jóvenes (2 meses) o envejecidos (18 meses) C57BL/6 se definieron por su edad. Todos los ratones se mantuvieron en instalaciones libres de patógenos y se utilizaron estrictamente de acuerdo con los protocolos aprobados por el IACUC de la Universidad de Tsinghua. El estudio cumple con todas las regulaciones éticas pertinentes con respecto a la investigación con animales. El sexo no se consideró en el diseño y el análisis del estudio, ya que este estudio no fue diseñado para detectar diferencias de sexo. Solo se utilizaron ratones machos para este estudio y se recopilaron todos los datos de los ratones de ratones machos.

Aislamiento y cultivo de hepatocitos primarios

Los ratones jóvenes o envejecidos se anestesiaron según los métodos anteriores (Bai et al. ^[2021]). Para obtener hepatocitos primarios, se recolectaron tejidos hepáticos de ratones machos. Se realizó un procedimiento de perfusión a través de la vena porta utilizando 50 mL de HBSS precalentado (37 °C, Corning) que contenía 1 mM de EGTA y 5,5 mM de glucosa, administrado a un caudal de 11 mL/min. Esto fue seguido por una digestión enzimática con 40 mL de solución de colagenasa IV a base de HBSS (Sigma, 0,25 mg/mL) suplementada con 5 mM de CaCl2 y 5,5 mM de glucosa. Después de la dispersión, la suspensión de hepatocitos se centrifugó a 500 rpm durante 2-5 minutos para sedimentar las células. Después de dos pasos de lavado con medio M199 (MacGene, Beijing), el sedimento celular se resuspendió en un medio de adherencia que consistía en M199 suplementado con 0,2% de BSA, 2% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Luego, las células se colocaron en placas de cultivo pre-recubiertas con 0,1% de gelatina y se mantuvieron a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2. Después de 4 horas de incubación para permitir la adherencia, el medio se reemplazó con medio de cultivo fresco y las células se mantuvieron en cultivo para análisis experimentales posteriores.

Líneas celulares

Las células 293T se compraron a la American Type Culture Collection y se cultivaron en medio DMEM (macgene, CM10013). Las células 293T se han autenticado y se han probado para detectar contaminación por micoplasma. Además, hemos autenticado la línea celular utilizando un método de perfilado de repeticiones cortas en tándem de acuerdo con el protocolo informado.

Construcción de ADN y producción de lentivirus

Los fragmentos para la sobreexpresión de Lpin1 de ratón se construyeron en el vector pCHN1. Los fragmentos de shRNA se clonaron en pLKO.1-TRC. Las secuencias de shRNA se diseñaron (F: CCGGGCCGTGTCATATCAGCAATTTCTCGAGAAATTGCTGATATGACACGGCTTTTTG, R: AATTCAAAAAGCCGTGTCATATCAGCAATTTCTCGAGAAATTGCTGATATGACACGGC) y se clonaron aguas abajo del promotor U6 dentro del vector lentiviral pLKO-GFP, utilizando una secuencia de shRNA no dirigida como control. El lentivirus se produjo en células HEK293T mediante la co-transfección de los plásmidos anteriores junto con pMD2.G y psPAX2. Los sobrenadantes de cultivo se recolectaron y se concentraron mediante ultracentrifugación a 20000 rpm durante 2,5 horas.

Aislamiento y estimulación de CD8+ T primarios

Las células CD8+ T de ratón se aislaron de los bazo de ratón utilizando un kit de selección de biotina. Las células CD8+ T y las células CD8+ T de ratón P14 se estimularon con 3,5 μg/mL de anticuerpo anti-CD3 y 1 μg/mL de anticuerpo anti-CD28. Las células CD8+ T se cultivaron en medio RPMI-1640 (macgene, CM10041) con 100 U/mL de IL-2. Para el agotamiento in vitro, las células CD8+ T se estimularon cuatro veces con un intervalo de 2 días.

Citometría de flujo

Para la tinción de superficie, las células se recolectaron y se tiñeron con anticuerpos a la dilución recomendada antes del análisis de citometría de flujo. Para la proteína intracelular LPIN1, las células se recolectaron y se lavaron, se fijaron con el tampón de fijación IC de eBioscience (00-8222-49) y se permeabilizaron con el tampón de permeabilización de eBioscience (00-8333-56), y se tiñeron según el protocolo del fabricante. Las células teñidas se lavaron antes del análisis por FACS. El software de citometría de flujo BD FACSuite se utilizó para la recolección de señales de FACS. Los eventos positivos se determinaron mediante la fijación de control de isotipo para cada anticuerpo. Primero, las células se clasificaron utilizando las características FSC/SSC para excluir los desechos, seguido de la clasificación de FSC-A y FSC-H, luego SSC-A y SSC-H para eliminar los no singletes. Luego, las células objetivo se clasificaron en la población de interés mediante la tinción específica. El análisis de datos se realizó utilizando FlowJo.

Inmunohistoquímica multiplexada

Se empleó un enfoque de tinción de inmunofluorescencia multiplexada para detectar secuencialmente tres marcadores de proteínas: PD1 (CST84651), sintetasa de glutamina (ab176562) y arginasa-1 (16001-1-AP). Los anticuerpos primarios se aplicaron en rondas sucesivas: PD1 a una dilución de 1:100 con incubación nocturna a 4 °C, seguido de sintetasa de glutamina (1:1000, 30 min a temperatura ambiente) y arginasa-1 (1:1000, 30 min a temperatura ambiente). Cada ciclo incluyó la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP y la amplificación de la señal de tiol (TSA) para la visualización por fluorescencia. Para evitar la reactividad cruzada entre las rondas de tinción, se realizó una recuperación de antígeno asistida por microondas después de cada paso de TSA utilizando EDTA para PD1 y tampón de citrato de sodio para la sintetasa de glutamina y la arginasa-1. Después de completar el etiquetado de todas las proteínas objetivo, los núcleos de las células se contrateñeron con DAPI (Sigma-Aldrich).

Preparación y secuenciación de la biblioteca de scRNA-Seq

Las bibliotecas de scRNA-seq se prepararon utilizando la plataforma 10× Genomics Chromium con el kit de biblioteca y cuentas de gel de célula única 3′ v3.1 (1000121) y el kit de chip de célula única G (1000120). Las suspensiones celulares que contenían de 300 a 600 células viables/μL (cuantificadas mediante el análisis de viabilidad Count Star) se procesaron utilizando el controlador de cromo para crear particiones de cuentas de gel en emulsión (GEM) siguiendo el flujo de trabajo recomendado. Brevemente, las células individuales se resuspendieron en tampón fosfato salino (PBS) suplementado con 0,04% de albúmina sérica bovina (BSA), con aproximadamente 12 000 células cargadas por canal microfluídico, lo que da como resultado una tasa de recuperación anticipada de ~10 000 células por muestra. La lisis celular y el posterior etiquetado de barras de ARN se lograron mediante la transcripción inversa basada en GEM. La síntesis de cDNA se llevó a cabo en un termociclador S1000TM Touch (Bio-Rad) utilizando el siguiente perfil térmico: 45 min a 53 °C, 5 min a 85 °C, seguido de una pausa a 4 °C. Los productos de cDNA amplificados se sometieron a una verificación de control de calidad utilizando el Agilent 4200 (servicio proporcionado por CapitalBio Technology, Beijing). Las bibliotecas construidas se secuenciaron posteriormente en una plataforma Illumina NovaSeq 6000, empleando una estrategia de lectura emparejada de 150 pb (PE150), con una profundidad de secuenciación de al menos 100 000 lecturas por célula. Este proceso de secuenciación fue realizado por CapitalBio Technology en Beijing.

Preparación y secuenciación de la biblioteca de snRNA-Seq

El hígado de ratón se colocó en 1 mL de tampón de lisis (LB) y se homogeneizó utilizando un homogeneizador de tejidos. El homogeneizado se lisó luego sobre hielo durante 1-10 minutos. Se utilizó un filtro de celdas de 40 μm para filtrar los desechos, y el filtrado se centrifugó a 4 °C y 500 g durante 5 minutos. Después de eliminar el sobrenadante, se añadió 300 μL de solución LB al sedimento y la suspensión de núcleo se resuspendió mediante pipeteo. La suspensión se transfirió a un nuevo tubo de centrífuga y se añadieron 300 μL de solución RB, seguida de una mezcla completa. A continuación, se añadieron lentamente 600 μL de solución PB1 en la parte inferior del tubo para formar una capa. De manera similar, se añadieron lentamente 600 μL de solución PB2 en la parte inferior del tubo para formar otra capa. La mezcla se centrifugó luego a 4 °C y 4000 g durante 20 minutos, con el núcleo ubicado en la interfaz entre PB1 y PB2. Se transfirió un volumen de 150-300 μL de la capa de núcleo a 1 mL de solución RB, se mezcló a fondo y se filtró a través de un filtro de celdas de 40 μm. El filtrado se centrifugó a 4 °C y 500 g durante 5 minutos. Después de eliminar el sobrenadante, el sedimento del núcleo se resuspendió en 100 μL de solución EB. Los pasos posteriores se llevaron a cabo siguiendo el flujo de trabajo estándar de scRNA-seq. La preparación de la biblioteca y la secuenciación de snRNA-seq fueron realizadas por CapitalBio Technology en Beijing. Los grupos jóvenes y envejecidos se procesaron en lotes separados, lo que hizo imposible separar los efectos de lote de las diferencias causadas por el envejecimiento entre los dos grupos.

Preparación y secuenciación de la biblioteca de Stereo-Seq

Los especímenes frescos de tejido hepático de ratón se adhirieron a chips de transcriptómica espacial Stereo-seq fabricados por BGI mediante un breve acondicionamiento térmico a 37 °C durante 3 minutos. La fijación implicó la inmersión en metanol absoluto enfriado (-20 °C) durante 40 minutos antes de iniciar los flujos de trabajo de construcción de la biblioteca. Para la validación morfológica, se sometieron a tinción nuclear con tinte nuclear (Thermo Fisher Scientific, Q10212) secciones seleccionadas, con imágenes fluorescentes capturadas utilizando un sistema de microscopio Motic Custom PA53 FS6. Estos especímenes controlados por calidad se procesaron posteriormente a través de flujos de trabajo de codificación espacial del canal FITC para la captura del transcriptoma.

Las secciones de tejido se trataron inicialmente con una solución tampón que contenía 0,1× SSC (Thermo, AM9770) y 0,05 U/mL de inhibidor de la RNasa (NEB, M0314L) para prepararlas para los pasos posteriores. La permeabilización se logró sumergiendo las secciones en una solución que contenía 0,1% de pepsina (Sigma, P7000) en 0,01 M de HCl, seguida de una incubación a 37 °C durante 5 minutos. Después de este paso, las secciones se lavaron nuevamente con la misma solución tampón que contenía el inhibidor de la RNasa. El ARN liberado del tejido permeabilizado se capturó mediante nanoesferas de ADN (DNB) y se sometió a transcripción inversa. Este proceso utilizó la transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen, 18064-014) en una mezcla de reacción que contenía 10 U/mL de transcriptasa inversa, 1 mM de dNTP, 1 M de betaína, 7,5 mM de MgCl2, 5 mM de DTT, 2 U/mL de inhibidor de la RNasa, 2,5 mM de Stereo-seq TSO y 1× de tampón de primera cadena. La transcripción inversa se llevó a cabo durante la noche a 42 °C. Posteriormente, las secciones de tejido se sometieron a dos lavados con tampón 0,1× SSC y luego se trataron con tampón de eliminación de tejido (que comprende 10 mM de Tris-HCl, 25 mM de EDTA, 100 mM de NaCl y 0,5% de SDS) a 55 °C durante 10 minutos para facilitar la digestión del tejido. Los chips que contenían el ADNc se trataron posteriormente con una mezcla de liberación de ADNc (que comprende enzima de liberación de ADNc y tampón) durante la noche a 55 °C. Finalmente, el ADNc se purificó utilizando cuentas de limpieza de ADN VAHTSTM en una proporción de 0,8× para garantizar una recuperación de ADNc de alta calidad.

La amplificación del ADNc se realizó utilizando la mezcla maestra de polimerasa de ADN KAPA HiFi HotStart (Roche, KK2602) complementada con 0,8 μM de cebadores de amplificación específicos del ADNc. Los parámetros del ciclo térmico se configuraron con el siguiente perfil: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 minutos; 15 ciclos de amplificación que consisten en desnaturalización a 98 °C durante 20 segundos, hibridación de cebadores a 58 °C durante 20 segundos y extensión de la cadena a 72 °C durante 3 minutos por ciclo; finalizando con una fase de extensión terminal a 72 °C durante 5 minutos para garantizar la elongación completa del producto.

La cuantificación del ADN de los productos de PCR se realizó utilizando el kit de ensayo de ADN de doble cadena Qubit (Thermo, Q32854). Para la preparación de la biblioteca, 20 ng de ADN purificado se sometieron a fragmentación mediante incubación con transposasa Tn5 formulada a medida a 55 °C durante 10 minutos, y la actividad enzimática se detuvo mediante la adición de una solución de SDS al 0,02%, seguida de una mezcla suave a 37 °C durante 5 minutos. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en volúmenes de 100 μL que contenían 25 μL de ADN fragmentado, una concentración de 1× de KAPA HiFi HotStart Ready Mix, 0,3 μM de cebador Stereo-seq-Library-F, 0,3 μM de cebador Stereo-seq-Library-R y agua libre de nucleasas para alcanzar el volumen final. Las condiciones del ciclo térmico comprendieron una desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 13 ciclos de 98 °C durante 20 segundos, 58 °C durante 20 segundos y 72 °C durante 30 segundos, finalizando con una extensión final a 72 °C durante 5 minutos. Las bibliotecas amplificadas se sometieron a una purificación secuencial utilizando cuentas magnéticas AMPure XP con relaciones de selección de tamaño de 0,63 y 0,153, seguida de la generación de DNB mediante protocolos estándar. La secuenciación final se realizó en la plataforma MGI DNBSEQ-Tx utilizando una configuración de lectura emparejada de 150 pb.

Procesamiento de datos brutos de scRNA-Seq y snRNA-Seq

Los archivos FASTQ originales se alinearon al genoma de referencia mm10 utilizando la función cellranger count en cellranger 7.0.1 (10× Genomics Cell Ranger v7.0.1). Para las muestras O2 e Y2, el parámetro -force-cells se estableció explícitamente en 11 600 y 26 200, respectivamente, mientras que se aplicaron los valores predeterminados para las demás muestras. Los tres archivos de salida generados por esta canalización se importaron posteriormente a Seurat 5.2.1 (Hao et al. ^[2024]) para el análisis posterior.

Procesamiento de datos brutos de Stereo-Seq

La adquisición de datos de secuenciación se realizó en la plataforma MGI DNBSEQ-Tx, generando lecturas emparejadas con identificadores espaciales integrados. La lectura 1 contenía códigos de barras de oligonucleótidos duales (CID: posiciones 1-25; MID: posiciones 26-35), mientras que la lectura 2 contenía secuencias de ADNc. El procesamiento primario implicó la referencia cruzada de las secuencias de CID con las coordenadas espaciales predefinidas derivadas de las rondas de secuenciación iniciales, lo que permitió desajustes de un solo nucleótido para compensar los artefactos técnicos. El filtrado de calidad excluyó las lecturas que contenían bases ambiguas (N) en las regiones MID o aquellas que excedían dos posiciones con puntuaciones de Phred inferiores a 10. Las combinaciones validadas de CID-MID se integraron en los encabezados FASTQ como etiquetas de metadatos. La alineación de secuencias se realizó mediante el alineador STAR (Dobin et al. ^[2013]) con el genoma de referencia mm10, reteniendo solo las lecturas mapeadas de forma única con puntuaciones de calidad de mapeo (MAPQ) superiores a 10 para la anotación de genes. La desduplicación molecular consolidó los UMI que compartían las mismas coordenadas espaciales de CID y los loci de genes, incorporando una tolerancia de un solo nucleótido para mitigar los sesgos de amplificación. La salida final generó una matriz de expresión resuelta espacialmente que codificaba perfiles de transcripción anclados a CID. Se eligió Bin200 como punto.

Control de calidad de scRNA-Seq, snRNA-Seq y Stereo-Seq

Control de calidad de los datos de scRNA-Seq

Para cada muestra, se calcularon dos métricas para filtrar las células y los dobletes de baja calidad: (1) porcentaje de UMI del gen mitocondrial y (2) número total de genes detectados. Las células con UMI mitocondrial > 10% o < 500 genes totales detectados se clasificaron como de baja calidad, mientras que aquellas con > 6000 genes detectados se marcaron como dobletes y se excluyeron. Las muestras Y2 y O2, que mostraron un recuento de genes significativamente menor en comparación con otros miembros del grupo, también se excluyeron para minimizar la heterogeneidad intragrupal que afecta a las comparaciones intergrupales.

Control de calidad de los datos de snRNA-Seq

Se aplicó un flujo de trabajo similar, pero con umbrales ajustados: se excluyeron las células con UMI mitocondrial > 5%, < 500 genes totales o > 5000 genes (dobletes). La muestra Yn1 se eliminó debido a su proporción anormalmente alta de células de baja calidad en comparación con otras muestras de su grupo.

Control de calidad de los datos de Stereo-Seq (punto bin200)

Se evaluaron los puntos utilizando el porcentaje de UMI mitocondrial (> 5%) y el número total de genes detectados (< 200) para identificar los puntos de baja calidad. No se impuso un límite superior al recuento de genes, ya que cada punto (resolución bin200) puede abarcar varias células. Todos los puntos de baja calidad se excluyeron de los análisis posteriores.

Control de calidad de los datos de scRNA-Seq

Para cada muestra, se calcularon dos métricas para filtrar las células y los dobletes de baja calidad: (1) porcentaje de UMI del gen mitocondrial y (2) número total de genes detectados. Las células con UMI mitocondrial > 10% o < 500 genes totales detectados se clasificaron como de baja calidad, mientras que aquellas con > 6000 genes detectados se marcaron como dobletes y se excluyeron. Las muestras Y2 y O2, que mostraron un recuento de genes significativamente menor en comparación con otros miembros del grupo, también se excluyeron para minimizar la heterogeneidad intragrupal que afecta a las comparaciones intergrupales.

Control de calidad de los datos de snRNA-Seq

Se aplicó un flujo de trabajo similar, pero con umbrales ajustados: se excluyeron las células con UMI mitocondrial > 5%, < 500 genes totales o > 5000 genes (dobletes). La muestra Yn1 se eliminó debido a su proporción anormalmente alta de células de baja calidad en comparación con otras muestras de su grupo.

Control de calidad de los datos de Stereo-Seq (punto bin200)

Se evaluaron los puntos utilizando el porcentaje de UMI mitocondrial (> 5%) y el número total de genes detectados (< 200) para identificar los puntos de baja calidad. No se impuso un límite superior al recuento de genes, ya que cada punto (resolución bin200) puede abarcar varias células. Todos los puntos de baja calidad se excluyeron de los análisis posteriores.

Agrupamiento y anotación de scRNA-Seq y snRNA-Seq

La matriz de expresión se procesó mediante el flujo de trabajo estándar en Seurat v5.2.1 (Hao et al. ^[2024]). La normalización inicial utilizando la función NormalizeData eliminó las variaciones técnicas en el recuento total de UMI por célula. Se identificaron dos mil genes altamente variables mediante la función FindVariableFeatures, seguida de la escala de características mediante ScaleData para mitigar los efectos de dominio de los genes altamente expresados. La reducción de la dimensionalidad se realizó mediante el análisis de componentes principales (PCA) para capturar las principales variaciones biológicas. Para los conjuntos de datos de scRNA-seq, los recuentos brutos se fusionaron directamente utilizando la función merge, y los análisis posteriores se realizaron en el espacio reducido por PCA. Los conjuntos de datos de snRNA-seq requirieron la integración mediante el análisis de correlación canónica (CCA), y los análisis posteriores se realizaron en el espacio dimensional alineado por CCA. El subagrupamiento de los datos de scRNA-seq empleó la integración de Harmony, y los análisis posteriores se realizaron en el espacio reducido por Harmony. El agrupamiento de células utilizó los primeros 50 componentes principales mediante el particionamiento basado en gráficos de vecinos compartidos (SNN). La visualización bidimensional se logró mediante RunUMAP para la representación de los grupos. La anotación final del tipo de célula aprovechó los genes marcadores informados en la literatura o los DEG identificados mediante el análisis basado en modelos de la transcriptómica de una sola célula (MAST).

Genes marcadores utilizados en la anotación

Anotación del tipo de célula principal de los datos de scRNA-Seq

Célula T (Cd3e +, Cd3d +, Cd3g +) (Liu et al. ^[2024]; Su, Kim, et al. ^[2021]); NK (Klrb1c +) (Liu et al. ^[2024]); NKT (Cd3e +, Cd3d +, Cd3g +, Klrb1c +) (Shen et al. ^[2020]); célula B (Cd19 +, Cd79a +, Ms4a1 +) (Liu et al. ^[2024]; Su, Kim, et al. ^[2021]); neutrófilo (Retnlg +) (Su, Kim, et al. ^[2021]); DC (Flt3 +) (Su, Kim, et al. ^[2021]); macrófago (Clec4f +, Adgre1 +) (Wen et al. ^[2021]; Krenkel y Tacke ^[2017]; Liang et al. ^[2022]); célula endotelial (Clec4g +, Ptprb +) (Su, Kim, et al. ^[2021]; Drexler et al. ^[2019]).

Anotación del tipo de célula principal de los datos de snRNA-Seq

Hepatocito PP (Sds +, Cyp2f2 +) (Nikopoulou et al. ^[2023]; Bravo González-Blas et al. ^[2024]); hepatocito PC (Glul +, Cyp2e1 +) (Bravo González-Blas et al. ^[2024]); célula endotelial (Dpp4 +) (Nikopoulou et al. ^[2023]); célula estrellada hepática (Reln +) (Su, Kim, et al. ^[2021]); célula inmunitaria (Ptprc +) (Liu et al. ^[2024]).

Anotación del subgrupo de células T

Células T CD8+: estado naive (CD8+ Tn, Lef1 +, Sell +, Il7r +) (Liu et al. ^[2024]; Technology, C. S, [n.d.]); estado de memoria central (CD8+ Tcm, Sell +, CD44 +, Il7r +) (Technology, C. S, [n.d.]); estado de memoria efector (CD8+ Tem, CD44 +, Il7r +) (Technology, C. S, [n.d.]); estado de agotamiento (CD8+ Tex, Pdcd1 +, Tigit +, Lag3 +, Tox +) (Mogilenko et al. ^[2021]).

Células T CD4+: estado naive (CD4+ Tn, Lef1 +, Sell +, Il7r +) (Liu et al. ^[2024]; Technology, C. S, [n.d.]); estado de memoria efector (CD4+ Tem, CD44 +, Il7r +) (Technology, C. S, [n.d.]); estado regulador (CD4+ Treg, Foxp3 +, Il2ra +, Ctla4 +) (Ohkura y Sakaguchi ^[2020]); estado de agotamiento (CD4+ Pdcd1+ T, Pdcd1 +, Tigit +, Lag3 +, Tox +) (Mogilenko et al. ^[2021]).

Otras células T: célula T reguladora similar a CD4/CD8 negativa (DN Treg, Il2ra +).

Anotación del subgrupo de NK

NK de estrés (Hspa1a +, Hspa1b +, Hsph1 +).

Anotación del subgrupo de NKT

NKT de tráfico (Klf2 +, S1pr1 +, Sell +) (Shen et al. ^[2020]); NKT activo (Icos +) (Shen et al. ^[2020]); NKT Cd200r1 + (Cd200r1 +).

Anotación del subgrupo de células B

Célula B naive (Ighd +) (Biocompare, [n.d.]); célula B de estrés (Hspa1a +, Hspa1b +); célula B similar a la célula B de tipo 1 asociada a la edad (ABC like B1, Zbtb32 +, Fcrl5 +, Tbx21 +, Cr2 -, Fcer2a -) (Mogilenko et al. ^[2021]; Hao et al. ^[2011]); célula B similar a la célula B de tipo 2 asociada a la edad (ABC like B2, Fcrl5 +, Cr2 -, Fcer2a -, Cd93 -, Fcer1g -, Spn -) (Mogilenko et al. ^[2021]; Hao et al. ^[2011]).

Anotación del subgrupo de neutrófilos

Neu Fnip2 + (Fnip2 +, Ccrl +); Neu Cxcl3 + (Cxcl3 +); Neu Ngp + (Fgd4 +, Ngp +, Camp +).

Anotación del subgrupo de DC

pDC Grm8 + (Bst2 +, Dusp16 +, Stxbp6 +, Cxcl2 +, Cxcl9 +).

Otros macrófagos: célula de Kupffer (Clec4f
+, Vsig4
+) (Nikopoulou et al. ^[2023]; Su, Kim, et al. ^[2021]); Macrófago Cxcl9
+ (Cxcl9
+); Macrófago Spp1
+ (Spp1
+).

Anotación de los principales tipos de células a partir de los datos de secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-Seq)

Célula T (Cd3e
+, Cd3d
+, Cd3g
+) (Liu et al. ^[2024]; Su, Kim, et al. ^[2021]); NK (Klrb1c
+) (Liu et al. ^[2024]); NKT (Cd3e
+, Cd3d
+, Cd3g
+, Klrb1c
+) (Shen et al. ^[2020]); Célula B (Cd19
+, Cd79a
+, Ms4a1
+) (Liu et al. ^[2024]; Su, Kim, et al. ^[2021]); Neutrófilo (Retnlg
+) (Su, Kim, et al. ^[2021]); DC (Flt3
+) (Su, Kim, et al. ^[2021]); Macrófago (Clec4f
+, Adgre1
+) (Wen et al. ^[2021]; Krenkel y Tacke ^[2017]; Liang et al. ^[2022]); Célula endotelial (Clec4g
+, Ptprb
+) (Su, Kim, et al. ^[2021]; Drexler et al. ^[2019]).

Anotación de los principales tipos de células a partir de los datos de secuenciación de ARN de núcleos de células individuales (snRNA-Seq)

Hepatocito PP (Sds
+, Cyp2f2
+) (Nikopoulou et al. ^[2023]; Bravo González‐Blas et al. ^[2024]); Hepatocito PC (Glul
+, Cyp2e1
+) (Bravo González‐Blas et al. ^[2024]); Célula endotelial (Dpp4
+) (Nikopoulou et al. ^[2023]); Célula estrellada hepática (Reln
+) (Su, Kim, et al. ^[2021]); Célula inmune (Ptprc
+) (Liu et al. ^[2024]).

Anotación de subgrupos de células T

Células T CD8+: estado naive (CD8+ Tn, Lef1
+, Sell
+, Il7r
+) (Liu et al. ^[2024]; Technology, C. S, [n.d.]); estado de memoria central (CD8+ Tcm, Sell
+, CD44
+, Il7r
+) (Technology, C. S, [n.d.]); estado de memoria efectora (CD8+ Tem, CD44
+, Il7r
+) (Technology, C. S, [n.d.]); estado de agotamiento (CD8+ Tex, Pdcd1
+, Tigit
+, Lag3
+, Tox
+) (Mogilenko et al. ^[2021]).

Células T CD4+: estado naive (CD4+ Tn, Lef1
+, Sell
+, Il7r
+) (Liu et al. ^[2024]; Technology, C. S, [n.d.]); estado de memoria efectora (CD4+
Tem, CD44
+, Il7r
+) (Technology, C. S, [n.d.]); estado regulador (CD4+ Treg, Foxp3
+, Il2ra
+, Ctla4
+) (Ohkura y Sakaguchi ^[2020]); estado de agotamiento (CD4+
Pdcd1
+ T, Pdcd1
+, Tigit
+, Lag3
+, Tox
+) (Mogilenko et al. ^[2021]).

Otras células T: célula T reguladora tipo DN (CD4/CD8 negativo) (Il2ra
+).

Anotación de subgrupos de NK

NK de estrés (Hspa1a
+, Hspa1b
+, Hsph1
+).

Anotación de subgrupos de NKT

NKT en tráfico (Klf2
+, S1pr1
+, Sell
+) (Shen et al. ^[2020]); NKT activo (Icos
+) (Shen et al. ^[2020]); NKT Cd200r1
+ (Cd200r1
+).

Anotación de subgrupos de células B

Célula B naive (Ighd
+) (Biocompare, [n.d.]); Célula B de estrés (Hspa1a
+, Hspa1b
+); célula B asociada a la edad, tipo 1 (B1 tipo ABC, Zbtb32
+, Fcrl5
+, Tbx21
+, Cr2
−, Fcer2a
−) (Mogilenko et al. ^[2021]; Hao et al. ^[2011]); célula B asociada a la edad, tipo 2 (B2 tipo ABC, Fcrl5
+, Cr2
−, Fcer2a
−, Cd93
−, Fcer1g
−, Spn
−) (Mogilenko et al. ^[2021]; Hao et al. ^[2011]).

Anotación de subgrupos de neutrófilos

Neu Fnip2
+ (Fnip2
+, Ccrl
+); Neu Cxcl3
+ (Cxcl3
+); Neu Ngp
+ (Fgd4
+, Ngp
+, Camp
+).

Anotación de subgrupos de DC

pDC Grm8
+ (Bst2
+, Siglech
+, Grm8
+) (Segure ^[2016]); pDC Apod
+ (Bst2
+, Siglech
+, Apod
+) (Segure ^[2016]); cDC1 Batf3
+ (Batf3
+) (Segure ^[2016]); cDC1 Xcr1
+ (Batf3
+, Xcr1
+) (Segure ^[2016]); cDC2 (Cd209a
+) (Liu et al. ^[2024]).

Anotación de subgrupos de macrófagos

Macrófagos derivados de monocitos (Cx3cr1
+) (Krenkel y Tacke ^[2017]): Mo-Mac Vcan
+ (Vcan
+); Mo-Mac Dusp16
+ (Dusp16
+); Mo-Mac Stxbp6
+ (Stxbp6
+); Mo-Mac Cxcl2
+ (Cxcl2
+); Mo-Mac Cxcl9
+ (Cxcl9
+).

Otros macrófagos: célula de Kupffer (Clec4f
+, Vsig4
+) (Nikopoulou et al. ^[2023]; Su, Kim, et al. ^[2021]); Macrófago Cxcl9
+ (Cxcl9
+); Macrófago Spp1
+ (Spp1
+).

Enriquecimiento celular (Chu et al. 2024)

Para determinar si tipos celulares específicos presentan un enriquecimiento en el grupo de edad avanzada, se realizó un análisis de enriquecimiento celular utilizando la prueba de chi-cuadrado. Para el tipo celular X, todas las células inmunes se clasificaron en cuatro grupos comparativos: células X en el grupo de edad avanzada, células X en el grupo de edad joven, células no X en el grupo de edad avanzada y células no X en el grupo de edad joven. Los recuentos cuantitativos de células de estas cuatro categorías se analizaron estadísticamente mediante la prueba de chi-cuadrado. La relación de valores observados a valores esperados (Ro/e) se calculó como el número de células X observadas en el grupo de edad avanzada dividido por el número teórico de células X predichas para el grupo de edad avanzada bajo la hipótesis nula, proporcionando una métrica para cuantificar el nivel de enriquecimiento.

Análisis de DEG

Se realizó un análisis de expresión génica diferencial utilizando la función FindMarkers en Seurat v5.2.1 (Hao et al. ^[2024]) con el algoritmo MAST. Para identificar genes asociados a la senescencia en las principales poblaciones de células inmunes, se realizaron análisis comparativos entre los grupos de edad avanzada y joven dentro de cada categoría de células inmunes, aplicando umbrales de |avglog2FC| > 1 y p_valadj  0.25 con pvaladj