TWIST1 media la activación transcripcional de SPON2, lo que favorece la metástasis peritoneal del cáncer colorrectal a través de una red de señalización de las células del estroma.

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer diagnóstico de cáncer más común y la segunda causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos [^[1]]. Entre sus patrones metastásicos, la metástasis peritoneal (MP) representa una forma de diseminación de la enfermedad particularmente agresiva y desafiante, que afecta aproximadamente al 20-30% de los pacientes con CCR y comprende el 25-35% de los casos en estadio IV [^[2]–^[4]]. La MP se asocia con el peor pronóstico entre los sitios metastásicos del CCR, con una supervivencia media de solo 6 meses sin terapia sistémica y de 16 meses con terapia sistémica [^[2], ^[5]]. Los estudios post-mortem muestran MP en casi el 50% de los pacientes con CCR, lo que sugiere que es un factor importante en la mortalidad de los pacientes [^[6]]. Las estrategias curativas actuales para pacientes seleccionados implican la cirugía citorreductora (CCR) combinada con la quimioterapia intraperitoneal hiperérmica (QIPH). Si bien este enfoque multimodal ha mejorado la supervivencia en subgrupos específicos, se asocia con una morbilidad perioperatoria significativa. Además, su eficacia a menudo se ve limitada por la integridad de la citorreducción, y la mayoría de los pacientes finalmente experimentan recurrencia (50-90%) debido a enfermedad residual microscópica y resistencia a los quimioterapéuticos estándar, lo que contribuye a una sombría tasa de supervivencia global a los 5 años que se aproxima al 0% [^[7], ^[8]]. Con el aumento de la incidencia de CCR avanzado, particularmente en casos de inicio temprano ( 0,58 (|FC lineal| > 1,5) y un p ajustado < 0,05 (corrección de Benjamini-Hochberg) se consideraron diferencialmente expresados. Todos los análisis se realizaron en R (v. 4.2.2) utilizando el marco RStudio (v. 2022.12.0).

ChIP-Seq

Generación y secuenciación de bibliotecas

Las células LoVo y MDST8 se cultivaron, se fijaron con formaldehído, se lisaron y se sonicaron. Se utilizó el anticuerpo TWIST1 (Abcam ab50887) para la inmunoprecipitación con un control positivo bacteriano (Abcam). Los complejos se capturaron con cuentas magnéticas de proteína G, se lavaron y se purificó el ADN para la construcción de bibliotecas y la secuenciación. Se generaron bibliotecas de extremo pareado utilizando los protocolos de Illumina. Las bibliotecas se cuantificaron (Qubit3.0), se diluyeron a 1 ng/µL, se verificó el tamaño del fragmento (Agilent 2100) y se determinó la concentración efectiva (>10 nM) (Bio-Rad CFX 96 qPCR) para garantizar la calidad. Las bibliotecas calificadas se secuenciaron en la plataforma Illumina NextSeq 500, y se generaron lecturas de extremo pareado de 150 pb.

Análisis de datos

Los datos de secuenciación sin procesar en formato FASTQ se recortaron para mejorar la calidad y se eliminaron los adaptadores utilizando Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trimgalore/). Los datos recortados en formato FASTQ se alinearon al genoma humano utilizando Bowtie 2 (v.2.4.5) y, a continuación, se convirtieron al formato BAM, se ordenaron por coordenadas y se indexaron utilizando samtools (v.1.6) [^[20]]. Los archivos BAM ordenados se utilizaron finalmente como entrada para MACS2 (v.2.2.7.1) para realizar la llamada de picos. Solo se utilizaron los picos con un p_ < 0,05 para análisis posteriores. Los picos significativos se anotaron en función de su ubicación en relación con el TSS de los genes codificantes de proteínas mediante CHIPpeakAnno (v.3.30.1) utilizando las coordenadas genómicas obtenidas de ENSEMBL (internas para CHIPpeakAnno)[^[21]]. La visualización de los picos alrededor del TSS y otras características genómicas se realizó utilizando el paquete R ChIPseeker (v.1.32.1) [^[22]].

Modelo animal

Todos los experimentos que involucran animales se realizaron de acuerdo con el protocolo aprobado por el Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas. Se estableció un modelo sinérgico de MP de cáncer colorrectal mediante inyección intraperitoneal utilizando células MC38 [^[23]]. Se obtuvieron ratones C57BL/6 y ratones con deleción de SPP1 (B6.129S6(Cg)-Spp1tm1Blh/J) del Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Se alojaron ratones C57BL/6 y ratones con deleción de SPP1 de seis semanas de edad en grupos de cinco por jaula. Cada ratón recibió una inyección intraperitoneal de 50 000 células de las líneas celulares MC38 con deleción de TWIST1 o SPON2 o de control. Se monitorearon los ratones hasta que mostraron signos de enfermedad grave o murieron por causas naturales. A los 28 días después de la inyección del tumor, los ratones del grupo de control mostraron signos que justificaron la eutanasia. Se sacrificaron los ratones y se realizaron autopsias. El índice de carcinomatosis peritoneal (ICP) se evaluó de forma independiente con un sistema de puntuación equivalente al ICP utilizado en humanos por tres investigadores (ACK, MHP y ZZ) para garantizar una evaluación precisa e imparcial [^[24], ^[25]].

Análisis estadístico

Se realizaron análisis estadísticos utilizando GraphPad Prism 10. Para comparar las medias de dos grupos, se utilizaron pruebas t de Student no pareadas. Para las comparaciones entre múltiples grupos, se aplicó una ANOVA de un factor (para una variable independiente) o una ANOVA de dos factores (para dos variables independientes) con la prueba de comparación múltiple de Tukey a todas las combinaciones por pares. Todas las pruebas estadísticas fueron bilaterales, y se consideró significativo un valor de P 1,5) y un p ajustado < 0,05 (corrección de Benjamini-Hochberg) como genes con expresión diferencial. Todos los análisis se realizaron en R (v. 4.2.2) utilizando el marco RStudio (v. 2022.12.0).

ChIP-Seq

Generación y secuenciación de bibliotecas

Las células LoVo y MDST8 se cultivaron, se fijaron con formaldehído, se lisaron y se sonicaron. Se utilizó el anticuerpo TWIST1 (Abcam ab50887) para la inmunoprecipitación con un control positivo bacteriano (Abcam). Los complejos se capturaron con cuentas magnéticas de proteína G, se lavaron y se purificó el ADN para la construcción de bibliotecas y la secuenciación. Se generaron bibliotecas de doble extremo utilizando los protocolos de Illumina. Se cuantificaron las bibliotecas (Qubit3.0), se diluyeron a 1 ng/µL, se verificó el tamaño del fragmento (Agilent 2100) y se determinó la concentración efectiva (>10 nM) (Bio-Rad CFX 96 qPCR) para garantizar la calidad. Las bibliotecas calificadas se secuenciaron en la plataforma Illumina NextSeq 500, y se generaron lecturas de doble extremo de 150 pb.

Generación y secuenciación de bibliotecas

Las células LoVo y MDST8 se cultivaron, se fijaron con formaldehído, se lisaron y se sonicaron. Se utilizó el anticuerpo TWIST1 (Abcam ab50887) para la inmunoprecipitación con un control positivo bacteriano (Abcam). Los complejos se capturaron con cuentas magnéticas de proteína G, se lavaron y se purificó el ADN para la construcción de bibliotecas y la secuenciación. Se generaron bibliotecas de doble extremo utilizando los protocolos de Illumina. Se cuantificaron las bibliotecas (Qubit3.0), se diluyeron a 1 ng/µL, se verificó el tamaño del fragmento (Agilent 2100) y se determinó la concentración efectiva (>10 nM) (Bio-Rad CFX 96 qPCR) para garantizar la calidad. Las bibliotecas calificadas se secuenciaron en la plataforma Illumina NextSeq 500, y se generaron lecturas de doble extremo de 150 pb.

Análisis de datos

Los datos de secuenciación sin procesar en formato FASTQ se recortaron para mejorar la calidad y se eliminaron los adaptadores utilizando Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trimgalore/). Los datos recortados en formato FASTQ se alinearon al genoma humano utilizando Bowtie 2 (v.2.4.5) y, a continuación, se convirtieron al formato BAM, se ordenaron por coordenadas y se indexaron utilizando samtools (v.1.6) [^[20]]. Finalmente, los archivos BAM ordenados se utilizaron como entrada para MACS2 (v.2.2.7.1) para realizar la llamada de picos. Solo se utilizaron para análisis posteriores los picos con un p_ < 0,05. Se anotaron los picos significativos en función de su ubicación en relación con el TSS de los genes codificantes de proteínas mediante CHIPpeakAnno (v.3.30.1) utilizando las coordenadas genómicas obtenidas de ENSEMBL (interna para CHIPpeakAnno)[^[21]]. La visualización de los picos alrededor del TSS y otras características genómicas se realizó utilizando el paquete R ChIPseeker (v.1.32.1) [^[22]].

Modelo animal

Todos los experimentos que involucraron animales se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo aprobado por la Universidad de Texas Southwestern Medical Center. Se estableció un modelo PM colateral sinérgico mediante inyección intraperitoneal utilizando células MC38 [^[23]]. Se obtuvieron ratones C57BL/6 y ratones con deleción de SPP1 (B6.129S6(Cg)-Spp1tm1Blh/J) del Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Se alojaron ratones C57BL/6 y ratones con deleción de SPP1 de seis semanas de edad en grupos de cinco por jaula. Cada ratón recibió una inyección intraperitoneal de 50 000 células de las líneas celulares MC38 con deleción de TWIST1 o SPON2 o de control. Se monitorearon los ratones hasta que mostraron signos de enfermedad grave o murieron por causas naturales. A los 28 días después de la inyección del tumor, los ratones del grupo de control mostraron signos que justificaron la eutanasia. Se sacrificaron los ratones y se realizaron autopsias. El índice de carcinomatosis peritoneal (PCI) se evaluó de forma independiente con un sistema de puntuación equivalente al PCI utilizado en humanos por tres investigadores (ACK, MHP y ZZ) para garantizar una evaluación precisa e imparcial [^[24], ^[25]].

Análisis estadístico

Se realizaron análisis estadísticos utilizando GraphPad Prism 10. Para comparar las medias de dos grupos, se utilizaron pruebas t de Student no pareadas. Para las comparaciones entre múltiples grupos, se aplicó una ANOVA de un factor (para una variable independiente) o una ANOVA de dos factores (para dos variables independientes) con la prueba de comparación múltiple de Tukey a todas las combinaciones por pares. Todas las pruebas estadísticas fueron bilaterales, y se consideró significativo un valor de P < 0,05. Las tasas de mortalidad entre los grupos se compararon utilizando pruebas de log-rank, y la significación también se estableció en un valor de P < 0,05.

Declaración ética

Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. El manejo de los ratones y los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Universidad de Texas Southwestern Medical Center, de acuerdo con las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y la Ley de Bienestar Animal. Para el uso de muestras de pacientes humanos, los protocolos del estudio fueron aprobados por las Juntas de Revisión Institucional (IRB) en el Centro Médico Wexner de la Universidad Estatal de Ohio y la Universidad de Texas Southwestern Medical Center, y se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes.

Resultados

TWIST1 se sobreexpresa específicamente en las metástasis peritoneales del cáncer colorrectal

Analizamos un conjunto de datos de CRC PM publicado previamente, GSE183202, para investigar los patrones de expresión de los factores de transcripción EMT canónicos (TWIST1, SNAI1, SNAI2, ZEB1) en CRC PM [^[13]]. El perfil de expresión génica diferencial que compara las muestras de CRC PM con los tumores primarios no pareados reveló una sobreexpresión significativa de TWIST1 (p = 0,031) y SNAI2 (p = 0,025), mientras que SNAI1 y ZEB1 no mostraron cambios significativos en la expresión (Fig. 1A, S1A–F). El análisis de inmunotransferencia (Western blot) de muestras derivadas de pacientes validó aún más que TWIST1 fue el principal factor de transcripción EMT sobreexpresado en CRC PM en comparación con los tumores primarios (Fig. 1B, S1G).

Para evaluar la especificidad de TWIST1 en las metástasis peritoneales, examinamos datos transcriptómicos de GSE50760, que incluye CRLM y tumores primarios [^[26]], y los validamos comparando la expresión de proteínas entre los tejidos CRLM y PM. Los resultados mostraron que la expresión de TWIST1 se incrementaba significativamente solo en PM (Fig. 1C, D). En conjunto, estos hallazgos identifican a TWIST1 como el factor canónico de la EMT que se sobreexpresa específicamente en las metástasis de CRC en el peritoneo (CRC PM), lo que sugiere que puede contribuir a la formación de PM.### TWIST1 promueve la migración, la invasión y la autorrenovación en las células de CRC

A continuación, realizamos la desactivación mediada por CRISPR-Cas9 de TWIST1 (TWIST1KO) en la línea celular de CRC metastásico humano CMS4, MDST8, y en las líneas celulares de CRC murino CT26 y MC38, para dilucidar la función de TWIST1 en la tumorigénesis de la PM de CRC (Figs. 1E, S2A) [^[13], ^[27]]. Además, utilizamos la inhibición mediada por shRNA en la línea celular de CRC metastásico humano no CMS4, LoVo, para delimitar los objetivos posteriores específicos de TWIST1, distintos de CMS4 (Figs. 1E, S2B) [^[27]]. El análisis de las colonias derivadas de células individuales TWIST1KO demostró una disminución significativa en la migración, la invasión y el cierre de heridas (Figs. 1F–M, S2C–F), lo que es consistente con el papel establecido de TWIST1 en la promoción de la motilidad celular y el potencial invasivo, esenciales para la cascada metastásica. Además, TWIST1 regula el estado indiferenciado en las células primarias de CRC CD44+, lo que se demuestra mediante una mayor formación de esferoides [^[17]]. Expusimos las células TWIST1KO en una cultura en suspensión tridimensional (3D) para evaluar la capacidad de autorrenovación mediante la formación de esferoides. En particular, las células TWIST1KO MDST8 y MC38 exhibieron una capacidad reducida de formación de esferoides y un diámetro de esferoide menor (Fig. 1N–Q). En conjunto, estos hallazgos indican que la pérdida de TWIST1 conduce a deficiencias in vitro sustanciales, que incluyen reducciones en la migración/invasión y la autorrenovación, que son fundamentales para la metástasis en órganos distantes.### SPON2 es un objetivo transcripcional directo de TWIST1

Para identificar los genes diana posteriores desregulados responsables de este fenotipo, realizamos RNA-seq en TWIST1KO y también en las células con inhibición mediada por shRNA (Fig. S3). Simultáneamente, realizamos una secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-Seq) con anti-TWIST1 en células de tipo salvaje para identificar los genes diana posteriores directos (Figs. 2A, S3). A través del análisis bioinformático que integra los resultados de RNA-seq y ChIP-Seq (Figs. 2B, S3), identificamos 27 genes diana directos de TWIST1 desregulados. En particular, los siguientes genes se sobreexpresaron significativamente en las células TWIST1KO y con inhibición mediada por shRNA: KCNAB2, MIR3142HG, PIK3IP1, PODXL2, SLAIN1, PCDHGC3, MGMT, PDCD4, ACTR3C, TNFRSF21, TNFAIP3, SLC12A2 y PPM1N. Por el contrario, los genes que se expresaron significativamente menos en las células TWIST1KO y con inhibición mediada por shRNA incluyeron F3, CDC20, SYNE1, SLC7A5, CENPM, ASF1B, SFXN2, DBF4B, SLC7A1, RFX2, LPAR1, FOXL1, TNS1 y SPON2 (Figs. 2B, S3).

Evaluamos aún más estos 27 genes diana en las metástasis de CRC en el peritoneo (CRC PM) en comparación con los tumores primarios para identificar los genes diana posteriores directos de TWIST1 desregulados clínicamente relevantes. SPON2 se sobreexpresó significativamente en las metástasis de CRC en el peritoneo (CRC PM) (P = 0,0084) (Fig. 2C). SPON2 es una proteína secretada con una comprensión muy limitada de su función biológica en el desarrollo y la tumorigénesis [^[28]]. Aunque la expresión de SPON2 se ha correlacionado con el CRC, su contribución a la metástasis sigue sin estar clara. El examen de la expresión de SPON2 en las metástasis de CRC en el peritoneo (CRLM) en comparación con los tumores primarios no reveló una expresión preferencial (Fig. 2D). El análisis de TCGA mediante GEPIA 2.0 (https://gepia2.cancer-pku.cn/) indicó una tendencia hacia una peor supervivencia general asociada con un SPON2 alto, con una supervivencia libre de enfermedad significativamente reducida (Fig. 2E, F). Para investigar la relación clínica entre TWIST1 y SPON2, analizamos conjuntos de datos transcriptómicos y observamos una correlación positiva significativa entre la expresión de TWIST1 y SPON2 en las muestras de pacientes con CRC PM (Spearman R = 0,57) y en la gran cohorte de cáncer colorrectal de TCGA (Spearman R = 0,77) (Fig. S4A, B). Además, los niveles de SPON2 se correlacionaron significativamente con la progresión de la enfermedad, lo que exhibió una razón de riesgo dramáticamente aumentada en las etapas avanzadas del CRC (Etapa 4 HR = 10,69) en el análisis utilizando TIMER 2.0 (http://timer.cistrome.org/) (Fig. S4C). Es importante destacar que los análisis de las líneas celulares de CRC humano y murino con TWIST1KO demostraron una reducción significativa en la expresión de ARNm y proteínas de SPON2 (tanto en las formas de lisado como secretadas), lo que implica aún más que SPON2 es un gen diana directo crucial de TWIST1 (Fig. 2G–J).

Para confirmar definitivamente que SPON2 es un objetivo transcripcional directo, analizamos la secuencia del promotor de SPON2 e identificamos un motivo E-box conservado (CATCTG) aproximadamente 1 kb aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción (Fig. 2K). El análisis de ChIP-qPCR validó que TWIST1 se une específicamente a esta región que contiene E-box (Región b) en comparación con las regiones de control adyacentes (Fig. 2K). Además, utilizando un sistema de reportero GFP impulsado por el promotor de Spon2, observamos que la sobreexpresión de TWIST1 inducible por doxiciclina activó significativamente el promotor de Spon2, lo que resultó en una expresión robusta de GFP (Fig. 2L, M). Dada la especificidad de la expresión de SPON2 en las metástasis de CRC en el peritoneo (CRC PM) y su regulación directa por TWIST1, estos datos sugieren que SPON2 puede ser una molécula importante del programa impulsado por TWIST1.### SPON2 media los fenotipos metastásicos impulsados por TWIST1

Con el objetivo de comprender mejor la implicación biológica de SPON2, realizamos la desactivación mediada por CRISPR-Cas9 de SPON2 en las líneas celulares de CRC metastásico MDST8 y MC38 (Fig. 3A). Coherente con el fenotipo TWIST1KO, las células con desactivación de SPON2 (SPON2KO) exhibieron deficiencias significativas en la migración, la invasión, la cicatrización de heridas y la formación de esferoides (Figs. 1F–Q, 3B–L). También realizamos la neutralización de la proteína SPON2 con un anticuerpo monoclonal, lo que resultó en reducciones significativas y análogas en la migración, la invasión, la cicatrización de heridas y la formación de esferoides, lo que destaca a SPON2 como un posible objetivo terapéutico (Figs. 3M–P, S5A–F). Por el contrario, el tratamiento de las células MDST8 o MC38 con SPON2 humano recombinante o SPON2 murino, respectivamente, aceleró la cicatrización de heridas, la invasión y la formación de esferoides en las células de tipo salvaje y también rescató los fenotipos TWIST1KO y SPON2KO (Fig. 3M–P, S5A–H). Además, la sobreexpresión de SPON2 marcada con GFP en las células TWIST1KO rescató el fenotipo TWIST1KO, lo que consolidó aún más que SPON2 es fundamental para mediar los procesos celulares pro-metastásicos posteriores a TWIST1 (Fig. 3Q–S, S5I–L).### SPP1 estromal activa el eje TWIST1-SPON2 a través de la señalización PI3K/AKT

La expresión de TWIST1, específicamente en el CRC, es un regulador importante de la tumorigénesis y la metástasis a través de la regulación transcripcional de la desdiferenciación de la población de CRC CD44+ [^[17]]. Uno de los ligandos establecidos para CD44 es la fosfoproteína secretada 1 (SPP1). SPP1 es un factor paracrino secretado por las células dentro del estroma tumoral en varios cánceres, incluido el CRC PM [^[19], ^[29]]. Por lo tanto, examinamos si la estimulación de SPP1 en las células tumorales podría inducir la expresión de TWIST1 y la posterior transcripción de SPON2. La estimulación de las células MDST8 y MC38 con SPP1 condujo a un aumento significativo dependiente de la dosis en los niveles de transcripción de TWIST1 y SPON2, la expresión de proteínas con una cuantificación que mostró una clara correlación lineal y la posterior secreción de SPON2 (Fig. 4A, B). Además, el análisis de qPCR confirmó que el tratamiento con SPP1 en las células de tipo salvaje aumentó significativamente tanto el ARNm de Twist1 como de Spon2, un efecto que se abolió por completo en las células TWIST1KO (Fig. 4B). Establecimos además células MC38 estables transfectadas con pEZX-mSPON2-GFP, un vector con GFP bajo el control del promotor murino de Spon2 (Fig. 2L). La estimulación de estas células con proteína Spp1 recombinante resultó en una mayor expresión de GFP, lo que confirmó la regulación de la transcripción del gen Spon2 por Spp1 en las células cancerosas (Fig. 4C, D).

Estudios previos han informado que SPP1 regula la función de TWIST1 al mediar la señalización a través de las vías AKT y ERK en el cáncer de mama [^[30]]. En las células de CRC, la estimulación de SPP1 resultó en un aumento de la fosforilación de AKT sin afectar la fosforilación de ERK (Fig. 4E). Esta activación específica de la señal fue consistente en múltiples líneas celulares (MC38, MDST8, CT26), donde el tratamiento con SPP1 aumentó de forma dependiente de la dosis los niveles de p-AKT junto con la regulación al alza de TWIST1 y SPON2 (Fig. 4E, paneles de la derecha y Fig. S6A). Además, la inhibición de la vía PI3K/AKT utilizando inhibidores de moléculas pequeñas, MK2206 y LY294002, redujo los niveles de proteína TWIST1 después de la estimulación con SPP1, junto con la disminución concurrente del ARNm y la proteína SPON2 (Figs. 4F, S6B). El ensayo del promotor de SPON2 confirmó que la inhibición de AKT con MK2206 bloqueó la transcripción de SPON2 mediada por SPP1 (Figs. 4G, S6C). Además, la neutralización de la proteína SPP1 secretada con un anticuerpo específico suprimió la expresión inducida por SPP1 de las proteínas TWIST1 y SPON2 (Fig. 4H). Para explorar aún más las consecuencias funcionales de este eje de señalización, examinamos el impacto de SPP1 en la EMT. Nuestro estudio reciente ha demostrado que las células mesoteliales son una fuente importante de SPP1 estromal en el CRC PM. Por lo tanto, establecimos una línea celular mesotelial inmortalizada del mesotelio del omento del ratón (OmenMeso). La cocultivo con nuestras células OmenMeso patentadas o el tratamiento con SPP1 recombinante indujo un cambio morfológico distinto en las células MC38, caracterizado por un fenotipo mesenquimal de forma de huso (Fig. S6D). El análisis de Western blot confirmó este cambio de EMT, lo que mostró la regulación al alza de los marcadores mesenquimales (NCAD, VIM, TWIST1) en las células tratadas con SPP1 y en las células cocultivadas con OmenMeso (Fig. S6E). En conjunto, estos resultados demuestran que la cascada reguladora de TWIST1-SPON2 se induce a través de SPP1 de una manera dependiente de PI3K/AKT y promueve un programa de EMT propicio para la metástasis.### SPON2 induce la transición de mesotelio a CAF y la secreción paracrina de SPP1

Hemos demostrado previamente en el CRC PM que SPP1 puede derivarse de las células estromales y de las células cancerosas [^[19]]. Primero, investigamos si TWIST1-SPON2 regula la señalización autocrina de SPP1 dentro de las células cancerosas. En particular, la comparación de las células de tipo salvaje con las células TWIST1KO reveló una disminución significativa en los niveles de proteína SPP1 secretada, a pesar de que no hubo alteración en los niveles citoplasmáticos (Fig. S7A). El tratamiento de las células MC38 con proteína SPON2 recombinante resultó en un aumento significativo de la secreción de SPP1 (Fig. 5A). Por el contrario, las células TWIST1KO exhibieron una secreción suprimida, incluso en el entorno de la estimulación de SPON2 (Fig. 5A), lo que sugiere que el mecanismo de secreción de SPP1 intrínseco a las células tumorales puede estar mediado posteriormente a TWIST1.

A continuación, examinamos si las proteínas secretadas derivadas del tumor, SPON2, influyen en las células del estroma, en particular en la regulación de la secreción de SPP1. Nuestro estudio reciente identificó las células mesoteliales, que recubren la superficie peritoneal, como un tipo celular importante implicado en la metástasis peritoneal (MP). Es importante destacar que también descubrimos que las células mesoteliales son una fuente importante de SPP1 estromal en la MP del CCRC [^[31]]. Dada la importancia de las interacciones tumor-mesoteliales en la progresión de la MP del CCRC, investigamos el efecto de SPON2 sobre las células mesoteliales [^[19]]. Tratamos dos líneas celulares mesoteliales, PanMeso y OmenMeso, derivadas, respectivamente, del mesotelio pancreático y omental, con SPON2 recombinante o medio acondicionado de células cancerosas (CM). El tratamiento con SPON2 o CM de células MC38 de tipo salvaje aumentó significativamente los niveles de SPP1 en las células mesoteliales en comparación con el tratamiento con CM de células TWIST1KO (Fig. 5B, C). Además, el CM de células SPON2KO produjo una reducción en la expresión de SPP1, lo que sugiere que SPON2 es un regulador ascendente de SPP1 en las células del estroma (Fig. 5D). A continuación, transfectamos las células OmenMeso con un gen reportero mCherry impulsado por el promotor de Spp1 (pEZX-mSpp1-mCherry). Tras la estimulación con la proteína Spon2, las células mesoteliales mostraron una mayor expresión de mCherry, lo que confirmó que Spon2 regula directamente la transcripción de Spp1 en las células del estroma (Fig. S7B-D). Las distintas respuestas de las células cancerosas y del estroma a SPON2, donde SPON2 aumenta la secreción de SPP1 en las células cancerosas, al tiempo que aumenta la expresión intracelular y secretada de SPP1 en las células del estroma, pueden reflejar vías de señalización o perfiles de expresión de receptores específicos del tipo celular.

Para investigar más a fondo si SPON2 secretada por el tumor media la plasticidad de las células mesoteliales, realizamos análisis de PCR cuantitativa y Western blot en un panel de marcadores de diferenciación de fibroblastos en las células PanMeso y OmenMeso tras el tratamiento con mSPON2 recombinante. Los resultados demostraron que SPON2 promovió significativamente la regulación al alza de genes, incluidos Col1a1, Tgfb1, Pdgfrb y Spp1, así como la expresión de proteínas de los marcadores de fibroblastos asociados al cáncer (CAF) Col1a1 (Fig. S7E), lo que sugiere que SPON2 puede promover la diferenciación de PanMeso y OmenMeso en fibroblastos asociados al cáncer (Fig. 5E, F). Esta transición se vio respaldada por los cambios morfológicos observados en el cocultivo (Fig. S7F). Este nuevo hallazgo destaca que SPON2 derivada del tumor induce la secreción de SPP1 en las células mesoteliales dentro del microambiente tumoral y también es fundamental para la estimulación de las células mesoteliales durante la MP.### La señalización de SPON2 en las células mesoteliales depende de Src/FAK y es independiente de las integrinas.

La importancia de SPON2 en el CCRC metastásico se ha establecido previamente, y se ha propuesto que varios receptores, incluido α5β1, median los efectos posteriores de SPON2 [^[28]]. Si bien el mecanismo preciso por el cual SPON2 induce la secreción de SPP1 no está claro, planteamos la hipótesis de que podría implicar la señalización mediada por integrinas, como se ha descrito para otras proteínas matricelulares [^[32]]. Para dilucidar el mecanismo preciso por el cual SPON2 induce la secreción de SPP1, analizamos las vías de señalización posteriores de las integrinas. El tratamiento con SPON2 indujo una fosforilación dependiente de la dosis de Egfr (Y1068) en las células cancerosas MC38, mientras que indujo la fosforilación de Fak (Y397) y Src (Y416) en las células mesoteliales OmenMeso (Fig. 5G), lo que sugiere vías de señalización de SPON2 distintas en las células tumorales y mesoteliales. Sin embargo, es fundamental destacar que la regulación al alza inducida por SPON2 de la secreción de SPP1 y la activación de la señalización posterior (p-Fak, p-Src) no se vieron afectadas por los anticuerpos neutralizantes contra la integrina β1 o β3, pero se vieron abolidas por el inhibidor de Src, dasatinib, y el inhibidor de FAK, defactinib (Fig. 5H). Estos resultados identifican definitivamente que SPON2 promueve la secreción de SPP1 y la activación de la señalización a través de una vía dependiente de Src/Fak, pero independiente de la integrina β1 o β3, lo que implica que el receptor específico de SPON2 en las células mesoteliales aún debe identificarse.

Para evaluar las consecuencias funcionales de la expresión de SPP1 inducida por SPON2, tratamos las células MC38 y MDST8 de tipo salvaje con la proteína SPP1 recombinante y observamos un aumento significativo en el cierre de la herida, la migración, la invasión y la formación de esferoides (Fig. 5I-L y S7G-J). En particular, la neutralización de SPP1 redujo notablemente estas propiedades protumorales, lo que demuestra que SPP1 es un mediador clave de la agresividad de las células tumorales (Fig. 5I-L y S7G-J). Para confirmar el papel del mesotelio en este proceso, utilizamos un sistema de cocultivo transwell (Fig. 5M, S7E). El cocultivo con células OmenMeso mejoró significativamente la migración y la invasión de las células MC38 de tipo salvaje; sin embargo, esta mejora se abolió en las células Twist1KO y Spon2KO (Fig. 5M, S7K). Además, el tratamiento con un anticuerpo neutralizante de Spon2 bloqueó eficazmente la migración y la invasión inducidas por el cocultivo (Fig. 5N, S7L). Estos hallazgos respaldan aún más que el eje TWIST1-SPON2 impulsa la expresión y la secreción de SPP1 en las células del estroma, estableciendo así un microambiente protumoral que facilita la metástasis del CCRC. En conjunto, nuestros resultados destacan a SPON2 como un regulador fundamental del remodelamiento del estroma y la progresión tumoral, con posibles implicaciones para el direccionamiento terapéutico del eje de señalización TWIST1-SPON2-SPP1 en el CCRC metastásico.

Además, se descubrió que la regulación al alza de SPON2 inducida por SPP1 dependía de TWIST1, lo que indica la presencia de un bucle de retroalimentación positiva que refuerza la señalización TWIST1-SPON2 y mantiene un microambiente tumoral prométastásico en el CCRC (Fig. 4A, B). Esto sugiere que el eje TWIST1-SPON2 impulsa activamente la expresión y la secreción de SPP1 en las células del estroma, lo que lleva a una acumulación de SPP1 dentro del microambiente tumoral. Este aumento de la reserva de SPP1 mejora la señalización PI3K/AKT-TWIST1-SPON2 en las células cancerosas, lo que en última instancia promueve la invasión de las células cancerosas, el enriquecimiento de las propiedades similares a las de las células madre y la metástasis (Fig. 5O).### El eje SPP1-TWIST1-SPON2 impulsa la carcinomatosis peritoneal y la exclusión inmune in vivo

Para evaluar la contribución de un eje SPP1-TWIST1-SPON2 en la MP del CCRC, utilizamos un modelo sinérgico. Establecimos un modelo sinérgico de MP intraperitoneal utilizando ratones de tipo salvaje (WT) y deficientes en Spp1 (Spp1-/-) inyectados intraperitonealmente con 50 000 células MC38-WT o MC38-Twist1KO. Después de 28 días, evaluamos la carga tumoral peritoneal utilizando el PCI y evaluamos la formación de ascitis [^[33], ^[34]]. En los ratones WT inyectados con células MC38-WT, se observó la mayor carga tumoral, como lo reflejan las puntuaciones del PCI significativamente elevadas (Fig. 6A, B y S8A). Además, estos ratones exhibieron una formación de ascitis significativa, que ocurrió en el 62,5 % del grupo de control en comparación con la ausencia completa (0 %) en los grupos de eliminación (Fig. 6C). Es interesante destacar que la depleción de SPP1 del estroma o de TWIST1 intrínseco al tumor condujo a una reducción significativa en la expresión de Spp1, Spon2 y Col1a1 dentro del tumor, al tiempo que aumentaba las células que expresan Cd45 (Fig. 6D y S8B-E). La inmunofenotipificación detallada reveló que este aumento en la infiltración inmune fue impulsado específicamente por las células T citotóxicas CD8+, que se enriquecieron significativamente en los tumores de los grupos de intervención, mientras que las poblaciones de células T CD4+ y células mieloides CD11b+ permanecieron en gran medida sin cambios (Fig. 6D, E). Estos hallazgos sugieren que la cascada de señalización SPP1-TWIST1-SPON2 probablemente contribuye al desarrollo de un microambiente que promueve la MP del CCRC. Además, evaluamos la carga tumoral utilizando las puntuaciones del PCI y la incidencia de ascitis en ratones inyectados con 50 000 células MC38-WT o MC38-Spon2KO para investigar más a fondo el impacto de SPON2 en la progresión tumoral. La pérdida de Spon2 en las células MC38 resultó en una reducción significativa en las puntuaciones del PCI, la formación de ascitis y el estroma tumoral (Fig. 6F-H y S8F-G). Por el contrario, la depleción de Spon2 condujo a un aumento en la infiltración de células inmunes positivas para CD45. Coherente con los modelos de depleción de Twist1/Spp1, esta infiltración inmune en los tumores deficientes en Spon2 se caracterizó por una regulación al alza específica y significativa de las células T CD8+, sin diferencias significativas observadas en las poblaciones de CD4+ o CD11b+ (Fig. 6I, J), lo que sugiere que Spon2 contribuye al establecimiento de un microambiente tumoral fibrótico e inmunosuprimido (Fig. 6H). En conjunto, estos hallazgos demuestran que la señalización TWIST1-SPON2 intrínseca al tumor es un impulsor clave de la MP del CCRC al promover la secreción de SPP1 derivada del estroma. Este eje fomenta un microambiente protumoral caracterizado por una mayor fibrosis y supresión de la inmunidad de las células T citotóxicas, lo que destaca su potencial como un objetivo terapéutico en el CCRC metastásico.

Además, se descubrió que la regulación al alza de SPON2 inducida por SPP1 dependía de TWIST1, lo que indica la presencia de un bucle de retroalimentación positiva que refuerza la señalización TWIST1-SPON2 y mantiene un microambiente tumoral prométastásico en el CCRC (Fig. 4A, B). Esto sugiere que el eje TWIST1-SPON2 impulsa activamente la expresión y la secreción de SPP1 en las células del estroma, lo que lleva a una acumulación de SPP1 dentro del microambiente tumoral. Este aumento de la reserva de SPP1 mejora la señalización PI3K/AKT-TWIST1-SPON2 en las células cancerosas, lo que en última instancia promueve la invasión de las células cancerosas, el enriquecimiento de las propiedades similares a las de las células madre y la metástasis (Fig. 5O).### El eje SPP1-TWIST1-SPON2 impulsa la carcinomatosis peritoneal y la exclusión inmune in vivo

Para evaluar la contribución de un eje SPP1-TWIST1-SPON2 en la MP del CCRC, utilizamos un modelo sinérgico. Establecimos un modelo sinérgico de MP intraperitoneal utilizando ratones de tipo salvaje (WT) y deficientes en Spp1 (Spp1-/-) inyectados intraperitonealmente con 50 000 células MC38-WT o MC38-Twist1KO. Después de 28 días, evaluamos la carga tumoral peritoneal utilizando el PCI y evaluamos la formación de ascitis [^[33], ^[34]]. En los ratones WT inyectados con células MC38-WT, se observó la mayor carga tumoral, como lo reflejan las puntuaciones del PCI significativamente elevadas (Fig. 6A, B y S8A). Además, estos ratones exhibieron una formación de ascitis significativa, que ocurrió en el 62,5 % del grupo de control en comparación con la ausencia completa (0 %) en los grupos de eliminación (Fig. 6C). Es interesante destacar que la depleción de SPP1 del estroma o de TWIST1 intrínseco al tumor condujo a una reducción significativa en la expresión de Spp1, Spon2 y Col1a1 dentro del tumor, al tiempo que aumentaba las células que expresan Cd45 (Fig. 6D y S8B-E). La inmunofenotipificación detallada reveló que este aumento en la infiltración inmune fue impulsado específicamente por las células T citotóxicas CD8+, que se enriquecieron significativamente en los tumores de los grupos de intervención, mientras que las poblaciones de células T CD4+ y células mieloides CD11b+ permanecieron en gran medida sin cambios (Fig. 6D, E). Estos hallazgos sugieren que la cascada de señalización SPP1-TWIST1-SPON2 probablemente contribuye al desarrollo de un microambiente que promueve la MP del CCRC. Además, evaluamos la carga tumoral utilizando las puntuaciones del PCI y la incidencia de ascitis en ratones inyectados con 50 000 células MC38-WT o MC38-Spon2KO para investigar más a fondo el impacto de SPON2 en la progresión tumoral. La pérdida de Spon2 en las células MC38 resultó en una reducción significativa en las puntuaciones del PCI, la formación de ascitis y el estroma tumoral (Fig. 6F-H y S8F-G). Por el contrario, la depleción de Spon2 condujo a un aumento en la infiltración de células inmunes positivas para CD45. Coherente con los modelos de depleción de Twist1/Spp1, esta infiltración inmune en los tumores deficientes en Spon2 se caracterizó por una regulación al alza específica y significativa de las células T CD8+, sin diferencias significativas observadas en las poblaciones de CD4+ o CD11b+ (Fig. 6I, J), lo que sugiere que Spon2 contribuye al establecimiento de un microambiente tumoral fibrótico e inmunosuprimido (Fig. 6H). En conjunto, estos hallazgos demuestran que la señalización TWIST1-SPON2 intrínseca al tumor es un impulsor clave de la MP del CCRC al promover la secreción de SPP1 derivada del estroma. Este eje fomenta un microambiente protumoral caracterizado por una mayor fibrosis y supresión de la inmunidad de las células T citotóxicas, lo que destaca su potencial como un objetivo terapéutico en el CCRC metastásico.

TWIST1 se regula al alza específicamente en las metástasis peritoneales del cáncer colorrectal

Analizamos un conjunto de datos de MP del CCRC publicado anteriormente, GSE183202, para investigar los patrones de expresión de los factores de transcripción EMT canónicos (TWIST1, SNAI1, SNAI2, ZEB1) en la MP del CCRC [^[13]]. El perfil de expresión génica diferencial que compara las muestras de MP del CCRC con los tumores primarios no emparejados reveló una regulación al alza significativa de TWIST1 (p = 0,031) y SNAI2 (p = 0,025), mientras que SNAI1 y ZEB1 no mostraron cambios significativos en la expresión (Fig. 1A, S1A-F). El análisis de Western blot de especímenes derivados de pacientes validó aún más que TWIST1 fue el principal factor de transcripción EMT que se reguló al alza en la MP del CCRC en comparación con los tumores primarios (Fig. 1B, S1G).

Para evaluar la especificidad de TWIST1 para las metástasis peritoneales, examinamos los datos de la transcripción de GSE50760, que incluye CRLM y tumores primarios [^[26]], y lo validamos comparando la expresión de proteínas entre los tejidos CRLM y PM. Los resultados mostraron que la expresión de TWIST1 se reguló al alza significativamente solo en PM (Fig. 1C, D). En conjunto, estos hallazgos identifican a TWIST1 como el factor EMT canónico que se regula específicamente al alza en la MP del CCRC, lo que sugiere que puede contribuir a la MP.

TWIST1 promueve la migración, la invasión y la autorrenovación en las células del CCRC

A continuación, realizamos la eliminación mediada por CRISPR-Cas9 de TWIST1 (TWIST1KO) en la línea celular de CCRC metastásico humano CMS4, MDST8, y en las líneas celulares de CCRC murino CT26 y MC38 para dilucidar la función de TWIST1 en la tumorigénesis de la MP del CCRC (Fig. 1E, S2A) [^[13], ^[27]]. Además, utilizamos la supresión mediada por shRNA en la línea celular de CCRC metastásico humano no CMS4, LoVo, para delinear los objetivos posteriores específicos de TWIST1 no CMS4 (Fig. 1E, S2B) [^[27]]. El análisis de las colonias derivadas de células individuales TWIST1KO demostró una disminución significativa en la migración, la invasión y el cierre de la herida (Fig. 1F-M, S2C-F), lo que es consistente con el papel establecido de TWIST1 en la promoción de la motilidad celular y el potencial invasor esenciales para la cascada metastásica. Además, TWIST1 regula el estado indiferenciado en las células primarias CD44+ del CCRC, como lo demuestra la formación de esferoides mejorada [^[17]]. Desafiamos a las células TWIST1KO en un cultivo de suspensión tridimensional (3D) para evaluar la capacidad de autorrenovación a través de la formación de esferoides. En particular, las células TWIST1KO MDST8 y MC38 exhibieron una capacidad reducida de formación de esferoides y un diámetro de esferoide reducido (Fig. 1N-Q). En conjunto, estos hallazgos indican que la pérdida de TWIST1 conduce a deficiencias in vitro sustanciales, que incluyen reducciones en la migración/invasión y la autorrenovación, que son fundamentales para la metástasis en órganos distantes.

SPON2 es un objetivo transcripcional directo de TWIST1

Para identificar los genes diana regulados a la baja responsables de este fenotipo, realizamos secuenciación de ARN (RNA-seq) en células TWIST1KO, así como en células con la expresión de TWIST1 silenciada mediante shRNA (Fig. S3). Concurrentemente, llevamos a cabo una secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-Seq) con anticuerpos anti-TWIST1 en células de tipo salvaje para identificar los genes diana directos regulados a la baja (Figs. 2A, S3). A través de un análisis bioinformático que integró los resultados de la secuenciación de ARN y la ChIP-Seq (Figs. 2B, S3), identificamos 27 genes diana directos de TWIST1 cuya expresión estaba alterada. Cabe destacar que los siguientes genes se encontraron significativamente sobreexpresados en las células TWIST1KO y en las células con la expresión de TWIST1 silenciada mediante shRNA: KCNAB2, MIR3142HG, PIK3IP1, PODXL2, SLAIN1, PCDHGC3, MGMT, PDCD4, ACTR3C, TNFRSF21, TNFAIP3, SLC12A2 y PPM1N. Por el contrario, los genes que mostraron una regulación a la baja significativa en las células TWIST1KO y en las células con la expresión de TWIST1 silenciada mediante shRNA incluyeron F3, CDC20, SYNE1, SLC7A5, CENPM, ASF1B, SFXN2, DBF4B, SLC7A1, RFX2, LPAR1, FOXL1, TNS1 y SPON2 (Figs. 2B, S3).

Evaluamos además estos 27 genes diana en el CMP de CRC frente a los tumores primarios para identificar los genes diana directos de TWIST1 cuya expresión estaba alterada y que eran clínicamente relevantes. SPON2 se encontró significativamente sobreexpresado en el CMP de CRC (P = 0,0084) (Fig. 2C). SPON2 es una proteína secretada, y se conoce muy poco sobre su función biológica en el desarrollo y la tumorigénesis [^[28]]. Aunque la expresión de SPON2 se ha correlacionado con el CRC, su contribución a la metástasis aún no está clara. El examen de la expresión de SPON2 en CRLM en comparación con los tumores primarios no reveló una expresión preferencial (Fig. 2D). El análisis de TCGA mediante GEPIA 2.0 (https://gepia2.cancer-pku.cn/) indicó una tendencia hacia una peor supervivencia general asociada con niveles altos de SPON2, con una reducción significativa de la supervivencia libre de enfermedad (Fig. 2E, F). Para investigar la relación clínica entre TWIST1 y SPON2, analizamos conjuntos de datos transcriptómicos y observamos una correlación positiva significativa entre la expresión de TWIST1 y SPON2 tanto en las muestras de pacientes con CMP de CRC (Spearman R = 0,57) como en la gran cohorte de cáncer colorrectal de TCGA (Spearman R = 0,77) (Fig. S4A, B). Además, los niveles de SPON2 se correlacionaron significativamente con la progresión de la enfermedad, mostrando una razón de riesgo dramáticamente aumentada en las etapas avanzadas del CRC (Etapa 4 HR = 10,69) en el análisis utilizando TIMER 2.0 (http://timer.cistrome.org/) (Fig. S4C). Es importante destacar que los análisis de líneas celulares de CRC humanas y murinas con TWIST1KO demostraron una reducción significativa en la expresión de ARNm y proteína de SPON2 (tanto en las formas lisado como secretadas), lo que implica aún más que SPON2 es un gen diana directo crucial de TWIST1 (Fig. 2G–J).

Para confirmar definitivamente que SPON2 es un gen diana transcripcional directo, analizamos la secuencia del promotor de SPON2 e identificamos un motivo E-box conservado (CATCTG) aproximadamente 1 kb aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción (Fig. 2K). El análisis de ChIP-qPCR validó que TWIST1 se une específicamente a esta región que contiene el motivo E-box (Región b) en comparación con las regiones de control adyacentes (Fig. 2K). Además, utilizando un sistema de reportero GFP impulsado por el promotor de Spon2, observamos que la sobreexpresión de TWIST1 inducible por doxiciclina activó significativamente el promotor de Spon2, lo que resultó en una expresión robusta de GFP (Fig. 2L, M). Dado que la expresión de SPON2 es específica en el CMP de CRC y está regulada directamente por TWIST1, estos datos sugieren que SPON2 puede ser una molécula importante del programa impulsado por TWIST1.

SPON2 media los fenotipos metastásicos impulsados por TWIST1

Con el objetivo de comprender mejor la implicación biológica de SPON2, realizamos un knockout de SPON2 mediante CRISPR-Cas9 en las líneas celulares de CRC metastásicas MDST8 y MC38 (Fig. 3A). Coherente con el fenotipo TWIST1KO, las células con el knockout de SPON2 (SPON2KO) exhibieron deficiencias significativas en la migración, la invasión, la cicatrización de heridas y la formación de esferoides (Figs. 1F–Q, 3B–L). También realizamos la neutralización de la proteína SPON2 con un anticuerpo monoclonal, lo que resultó en reducciones significativas y análogas en la migración, la invasión, la cicatrización de heridas y la formación de esferoides, lo que destaca a SPON2 como un posible objetivo terapéutico (Figs. 3M–P, S5A–F). Por el contrario, el tratamiento de las células MDST8 o MC38 con SPON2 humano recombinante o SPON2 murino, respectivamente, aceleró el cierre de heridas, la invasión y la formación de esferoides en las células de tipo salvaje y también revirtió los fenotipos TWIST1KO y SPON2KO (Fig. 3M–P, S5A–H). Además, la sobreexpresión de SPON2 marcada con GFP en las células TWIST1KO revirtió el fenotipo TWIST1KO, lo que refuerza aún más que SPON2 es fundamental para mediar los procesos celulares pro-metastásicos aguas abajo de TWIST1 (Fig. 3Q–S, S5I–L).

SPP1 estromal activa el eje TWIST1-SPON2 a través de la señalización PI3K/AKT

La expresión de TWIST1, específicamente en el CRC, es un regulador importante de la tumorigénesis y la metástasis a través de la regulación transcripcional de la desdiferenciación de la población de CRC CD44+ [^[17]]. Uno de los ligandos establecidos para CD44 es la proteína fosfoproteica secretada 1 (SPP1). SPP1 es un factor paracrino secretado por las células dentro del estroma tumoral en varios cánceres, incluido el CMP de CRC [^[19], ^[29]]. Por lo tanto, examinamos si la estimulación con SPP1 en las células tumorales podría inducir la expresión de TWIST1 y la posterior transcripción de SPON2. La estimulación de las células MDST8 y MC38 con SPP1 condujo a una inducción significativa dependiente de la dosis en los niveles de transcripción de TWIST1 y SPON2, la expresión de proteínas con una cuantificación que mostró una clara correlación lineal y la posterior secreción de SPON2 (Fig. 4A, B). Además, el análisis de qPCR confirmó que el tratamiento con SPP1 en las células WT aumentó significativamente tanto los niveles de ARNm de Twist1 como de Spon2, un efecto que se abolió por completo en las células TWIST1KO (Fig. 4B). Establecimos además células MC38 estables transfectadas con pEZX-mSPON2-GFP, un vector con GFP bajo el control del promotor murino de Spon2 (Fig. 2L). La estimulación de estas células con proteína Spp1 recombinante resultó en una mayor expresión de GFP, lo que confirmó la regulación de la transcripción del gen Spon2 por Spp1 en las células cancerosas (Fig. 4C, D).

Estudios previos han informado que SPP1 regula la función de TWIST1 al mediar la señalización a través de las vías AKT y ERK en el cáncer de mama [^[30]]. En las células de CRC, la estimulación con SPP1 resultó en un aumento de la fosforilación de AKT sin afectar la fosforilación de ERK (Fig. 4E). Esta activación específica de la señal fue consistente en múltiples líneas celulares (MC38, MDST8, CT26), donde el tratamiento con SPP1 aumentó de forma dependiente de la dosis los niveles de p-AKT junto con la regulación al alza de TWIST1 y SPON2 (Fig. 4E, paneles de la derecha y Fig. S6A). Además, la inhibición de la vía PI3K/AKT utilizando inhibidores de moléculas pequeñas, MK2206 y LY294002, redujo los niveles de proteína TWIST1 después de la estimulación con SPP1, junto con la disminución concurrente de los niveles de ARNm y proteína de SPON2 (Figs. 4F, S6B). El ensayo del promotor de SPON2 confirmó que la inhibición de AKT con MK2206 bloqueó la transcripción de SPON2 mediada por SPP1 (Figs. 4G, S6C). Además, la neutralización de la proteína SPP1 secretada con un anticuerpo específico suprimió la expresión de las proteínas TWIST1 y SPON2 inducida por SPP1 (Fig. 4H). Para explorar aún más las consecuencias funcionales de este eje de señalización, examinamos el impacto de SPP1 en la EMT. Nuestro estudio reciente ha demostrado que las células mesoteliales son una fuente importante de SPP1 estromal en el CMP de CRC. Por lo tanto, establecimos una línea celular mesotelial inmortalizada del mesotelio del omento del ratón (OmenMeso). La cocultivo con nuestras células OmenMeso patentadas o el tratamiento con SPP1 recombinante indujo un cambio morfológico distinto en las células MC38, caracterizado por un fenotipo mesenquimal de forma de huso (Fig. S6D). El análisis de Western blot confirmó este cambio de EMT, mostrando la regulación al alza de los marcadores mesenquimales (NCAD, VIM, TWIST1) en las células tratadas con SPP1 y en las células cocultivadas con OmenMeso (Fig. S6E). En conjunto, estos resultados demuestran que la cascada reguladora TWIST1-SPON2 es inducida por SPP1 de forma dependiente de PI3K/AKT y promueve un programa de EMT propicio para la metástasis.

SPON2 media la transición mesotelial a CAF y la secreción paracrina de SPP1

Hemos demostrado previamente en el CMP de CRC que SPP1 puede derivarse de las células estromales y de las células cancerosas [^[19]]. Primero, investigamos si TWIST1-SPON2 regula la señalización autocrina de SPP1 dentro de las células cancerosas. En particular, la comparación de las células de tipo salvaje con las células TWIST1KO reveló una disminución significativa en los niveles de proteína SPP1 secretada, a pesar de no haber alteración en los niveles citoplasmáticos (Fig. S7A). El tratamiento de las células MC38 con proteína SPON2 recombinante resultó en un aumento significativo de la SPP1 secretada (Fig. 5A). Por el contrario, las células TWIST1KO exhibieron una secreción suprimida, incluso en presencia de estimulación con SPON2 (Fig. 5A), lo que sugiere que el mecanismo de secreción de SPP1 intrínseco a las células tumorales puede estar mediado aguas abajo de TWIST1.

A continuación, examinamos si la SPON2 secretada derivada del tumor influye en las células estromales, en particular en la regulación de la secreción de SPP1. Nuestro estudio reciente identificó las células mesoteliales, que recubren la superficie peritoneal, como un tipo de célula importante involucrado en el CMP. Es importante destacar que también encontramos que las células mesoteliales son una fuente importante de SPP1 estromal en el CMP de CRC [^[31]]. Dada la importancia de las interacciones tumor-mesoteliales en la progresión del CMP de CRC, investigamos el efecto de SPON2 en las células mesoteliales [^[19]]. Tratamos dos líneas celulares mesoteliales, PanMeso y OmenMeso, derivadas del mesotelio pancreático y omental, respectivamente, con proteína SPON2 recombinante o medio de cultivo celular (CM). El tratamiento con SPON2 o CM de células MC38 de tipo salvaje aumentó significativamente los niveles de SPP1 en las células mesoteliales en comparación con el tratamiento con CM de células TWIST1KO (Fig. 5B, C). Además, el CM de las células SPON2KO resultó en una reducción de la expresión de SPP1, lo que sugiere que SPON2 es un regulador aguas arriba de SPP1 en las células estromales (Fig. 5D). Luego, transfectamos las células OmenMeso con un reportero mCherry impulsado por el promotor de Spp1 (pEZX-mSpp1-mCherry). Tras la estimulación con proteína Spon2, las células mesoteliales mostraron una mayor expresión de mCherry, lo que confirmó que Spon2 regula directamente la transcripción de Spp1 en las células estromales (Fig. S7B–D). Las distintas respuestas de las células cancerosas y estromales a SPON2, donde SPON2 mejora la secreción de SPP1 en las células cancerosas, mientras que aumenta tanto la SPP1 intracelular como la secretada en las células estromales, pueden reflejar vías de señalización o perfiles de expresión de receptores específicos de cada tipo de célula.

Para investigar aún más si la SPON2 secretada por el tumor media la plasticidad de las células mesoteliales, realizamos una PCR cuantitativa y un análisis de Western blot en un panel de marcadores de diferenciación de fibroblastos en las células PanMeso y OmenMeso después del tratamiento con mSPON2 recombinante. Los resultados demostraron que SPON2 promovió significativamente la regulación al alza de los genes, incluidos Col1a1, Tgfb1, Pdgfrb y Spp1, así como la expresión de proteínas de los marcadores CAF Col1a1 (Fig. S7E), lo que sugiere que SPON2 puede promover la diferenciación de PanMeso y OmenMeso en fibroblastos asociados al cáncer (Fig. 5E, F). Esta transición se vio respaldada además por los cambios morfológicos observados en el cocultivo (Fig. S7F). Este nuevo hallazgo destaca que la SPON2 derivada del tumor induce la secreción de SPP1 en las células mesoteliales dentro del microambiente tumoral y también es fundamental para la estimulación de las células mesoteliales durante el CMP.

La señalización de SPON2 en las células mesoteliales es dependiente de Src/FAK e independiente de la integrina

La importancia de SPON2 en el CRC metastásico se ha establecido previamente, y se ha propuesto que varios receptores, incluido α5β1, median los efectos posteriores de SPON2 [^[28]]. Si bien el mecanismo preciso por el cual SPON2 induce la secreción de SPP1 aún no está claro, planteamos la hipótesis de que podría implicar la señalización mediada por integrinas, como se ha descrito para otras proteínas matricelulares [^[32]]. Para dilucidar el mecanismo preciso por el cual SPON2 induce la secreción de SPP1, analizamos las vías de señalización posteriores de las integrinas. El tratamiento con SPON2 indujo una fosforilación dependiente de la dosis de Egfr (Y1068) en las células cancerosas MC38, mientras que indujo la fosforilación de Fak (Y397) y Src (Y416) en las células mesoteliales OmenMeso (Fig. 5G), lo que sugiere distintas vías de señalización de SPON2 en las células tumorales frente a las células mesoteliales. Sin embargo, es importante destacar que la regulación al alza de la secreción de SPP1 inducida por SPON2 y la activación de la señalización posterior (p-Fak, p-Src) no se vieron afectadas por los anticuerpos neutralizantes contra la integrina β1 o β3, pero se abolieron mediante el inhibidor de Src, dasatinib, y el inhibidor de FAK, defactinib (Fig. 5H). Estos resultados identifican de manera definitiva que SPON2 promueve la secreción de SPP1 y la activación de la señalización a través de una vía dependiente de Src/Fak, pero independiente de la integrina β1 o β3, lo que implica que el receptor específico de SPON2 en las células mesoteliales aún debe identificarse.

Para evaluar las consecuencias funcionales de la expresión de SPP1 inducida por SPON2, tratamos las células MC38 y MDST8 de tipo salvaje con la proteína SPP1 recombinante y observamos un aumento significativo en el cierre de la herida, la migración, la invasión y la formación de esferoides (Figs. 5I-L y S7G-J). En particular, la neutralización de SPP1 redujo notablemente estas propiedades pro-tumorales, lo que demuestra que SPP1 es un mediador clave de la agresividad de las células tumorales (Figs. 5I-L y S7G-J). Para confirmar el papel del mesotelio en este proceso, utilizamos un sistema de cocultivo en transwell (Figs. 5M, S7E). El cocultivo con células OmenMeso mejoró significativamente la migración y la invasión de las células MC38 de tipo salvaje; sin embargo, esta mejora se abolió en las células Twist1KO y Spon2KO (Figs. 5M, S7K). Además, el tratamiento con un anticuerpo neutralizante de Spon2 bloqueó eficazmente la migración y la invasión inducidas por el cocultivo (Figs. 5N, S7L). Estos hallazgos respaldan aún más que el eje TWIST1-SPON2 impulsa la expresión y la secreción de SPP1 en las células del estroma, estableciendo así un microambiente pro-tumoral que facilita la metástasis del CRC. En conjunto, nuestros resultados destacan a SPON2 como un regulador fundamental del remodelado del estroma y la progresión tumoral, con posibles implicaciones para el direccionamiento terapéutico del eje de señalización TWIST1-SPON2-SPP1 en el CRC metastásico.

Además, se descubrió que la regulación al alza de SPON2 inducida por SPP1 dependía de TWIST1, lo que indica la presencia de un bucle de retroalimentación positiva que refuerza la señalización TWIST1-SPON2 y mantiene un microambiente tumoral pro-metastásico en el CRC (Fig. 4A, B). Esto sugiere que el eje TWIST1-SPON2 impulsa activamente la expresión y la secreción de SPP1 en las células del estroma, lo que conduce a una acumulación de SPP1 dentro del microambiente tumoral. Este aumento de la reserva de SPP1 mejora la señalización PI3K/AKT-TWIST1-SPON2 en las células cancerosas, lo que en última instancia promueve la invasión de las células cancerosas, el enriquecimiento de las propiedades similares a las de las células madre y la metástasis (Fig. 5O).

El eje SPP1-TWIST1-SPON2 impulsa la carcinomatosis peritoneal y la exclusión inmune in vivo

Para evaluar la contribución de un eje SPP1-TWIST1-SPON2 en la metástasis peritoneal del CRC (PM), utilizamos un modelo sinérgico. Establecimos un modelo sinérgico de PM intraperitoneal utilizando ratones de tipo salvaje (WT) y deficientes en Spp1 (Spp1-/-) inyectados intraperitonealmente con 50.000 células MC38-WT o MC38-Twist1KO. Después de 28 días, evaluamos la carga tumoral peritoneal utilizando el PCI y evaluamos la formación de ascitis [^[33], ^[34]]. En los ratones WT inyectados con células MC38-WT, se observó la mayor carga tumoral, como lo reflejan las puntuaciones del PCI significativamente elevadas (Figs. 6A, B y S8A). Además, estos ratones exhibieron una formación de ascitis significativa, que ocurrió en el 62,5% del grupo de control en comparación con la ausencia completa (0%) en los grupos de eliminación (Fig. 6C). Curiosamente, la depleción de SPP1 del estroma o de TWIST1 intrínseco al tumor condujo a una reducción significativa en la expresión de Spp1, Spon2 y Col1a1 dentro del tumor, al tiempo que aumentaba las células que expresan Cd45 (Figs. 6D y S8B-E). El análisis inmunofenotípico detallado reveló que este aumento de la infiltración inmune fue impulsado específicamente por las células T citotóxicas CD8+, que se enriquecieron significativamente en los tumores de los grupos de intervención, mientras que las poblaciones de células T CD4+ y células mieloides CD11b+ permanecieron en gran medida sin cambios (Fig. 6D, E). Estos hallazgos sugieren que la cascada de señalización SPP1-TWIST1-SPON2 probablemente contribuye al desarrollo de un microambiente que promueve la PM del CRC. Además, evaluamos la carga tumoral utilizando las puntuaciones del PCI y la incidencia de ascitis en ratones inyectados con 50.000 células MC38-WT o MC38-Spon2_KO para investigar más a fondo el impacto de SPON2 en la progresión tumoral. La pérdida de Spon2 en las células MC38 resultó en una reducción significativa en las puntuaciones del PCI, la formación de ascitis y el estroma tumoral (Figs. 6F-H y S8F-G). Por el contrario, la depleción de Spon2 condujo a un aumento en la infiltración de células inmunes positivas para CD45. Coherente con los modelos de depleción de Twist1/Spp1, esta infiltración inmune en los tumores deficientes en Spon2 se caracterizó por una regulación al alza específica y significativa de las células T CD8+, sin diferencias significativas observadas en las poblaciones de CD4+ o CD11b+ (Fig. 6I, J), lo que sugiere que Spon2 contribuye al establecimiento de un microambiente tumoral fibrótico e inmunosuprimido (Fig. 6H). En conjunto, estos hallazgos demuestran que la señalización TWIST1-SPON2 intrínseca al tumor es un impulsor clave de la PM del CRC al promover la secreción de SPP1 derivada del estroma. Este eje fomenta un microambiente pro-tumoral caracterizado por una mayor fibrosis y supresión de la inmunidad de las células T citotóxicas, lo que destaca su potencial como un objetivo terapéutico en el CRC metastásico.

Discusión

A pesar de la alta incidencia mundial de PM del CRC, sigue existiendo una importante laguna en el conocimiento de los fundamentos moleculares. Esta falta de comprensión contribuye a la rápida progresión de la enfermedad, la frecuente resistencia a las terapias sistémicas estándar y el mal pronóstico del paciente debido a las opciones terapéuticas limitadas. El perfilado molecular previo de la PM del CRC demostró un enriquecimiento de la firma CMS4/mesenquimal, que se asocia con un comportamiento tumoral agresivo y malos resultados [^[12], ^[35]]. El presente estudio amplía esta observación a través de la caracterización genética y molecular, que identificó TWIST1 y su objetivo directo posterior, SPON2, como específicamente regulados al alza en la PM del CRC. Además, la activación de la cascada SPP1-TWIST1-SPON2 y la disección del eje permitieron la elucidación del intercambio molecular dentro del microambiente tumoral entre el epitelio tumoral y el estroma, in vitro e in vivo. Además, el estudio identificó los componentes de este eje de señalización como posibles biomarcadores novedosos y objetivos terapéuticos innovadores para la PM del CRC.

La evidencia emergente destaca que TWIST1 es crucial en la progresión del CRC, particularmente a través de la activación de genes posteriores que contribuyen a la metástasis y la resistencia a la terapia [^[16], ^[36]–^[38]]. La correlación entre la alta expresión de TWIST1 y la etapa tumoral avanzada, la metástasis en los ganglios linfáticos y las malas tasas de supervivencia subraya su potencial como biomarcador pronóstico [^[15], ^[39], ^[40]]. Además, se ha implicado a TWIST1 en la regulación de las propiedades de las células madre cancerosas, que contribuyen a la iniciación del tumor, la recurrencia y la resistencia a los agentes quimioterapéuticos como el 5-fluorouracilo y el oxaliplatino [^[41]]. Esta contribución multifacética a la progresión del CRC y la regulación al alza específica dentro de la PM del CRC se demuestra en la disminución de TWIST1, lo que resulta en la depleción de las propiedades de invasión y la capacidad de autorrenovación [^[17]].

A pesar de la importancia de TWIST1 en la PM del CRC, se definió SPON2 como un objetivo directo posterior responsable del fenotipo tumoral. Validamos de manera definitiva esta regulación directa mediante la identificación de un motivo E-box conservado en el promotor de SPON2 y la confirmación de ChIP-qPCR de la unión de TWIST1. En el CRC, la alta expresión de SPON2 se correlacionó significativamente con una peor supervivencia libre de enfermedad y con etapas avanzadas del cáncer (HR > 10 en la etapa 4). Aunque se ha informado previamente que SPON2 media la migración y la invasión en el CRC y sirve como un marcador pronóstico para la metástasis hepática [^[42]], nuestros datos revelan una distinción crítica. Nuestro análisis transcriptómico de muestras emparejadas demostró que TWIST1 y SPON2 se regulan al alza específicamente en la PM, pero NO en la metástasis en el hígado (Figs. 1C, D, 2D). Dado que Lenos et al. [^[13]] demostraron que el enriquecimiento de CMS4 en la PM del CRC y predominantemente el fenotipo CMS2 (> 60%) con la fracción restante siendo casi exclusivamente CMS4 en la metástasis en el hígado, la observación de Schmid et al. [^[42]] probablemente proporciona un mecanismo para este subgrupo CMS4 específico dentro de las metástasis hepáticas. Además, esto sugiere un papel contextual específico para este eje en el nicho peritoneal, distinto del proceso dominante en la metástasis en el hígado. SPON2 codifica una proteína secretada con funciones intrínsecas y extrínsecas limitadas. Las células SPON2KO imitaron a las células TWIST1KO en la evaluación del potencial metastásico in vitro intrínseco, mientras que la adición de SPON2 recombinante o la sobreexpresión de SPON2 resultó en un rescate de estos fenotipos deficientes. Es importante destacar que la neutralización mediada por anticuerpos de SPON2 en las células cancerosas resultó en la depleción del fenotipo metastásico, análogo a SPON2KO. En una enfermedad en la que no existen opciones terapéuticas eficaces, SPON2 puede servir potencialmente como un biomarcador y un objetivo terapéutico novedosos.

La composición celular y molecular del microambiente tumoral sirve para fomentar el potencial maligno de células específicas para adquirir potencial metastásico y exacerbar la resistencia terapéutica [^[43]–^[45]]. El peritoneo es un tejido que consta de varias células del estroma, incluidas las células mesoteliales, los fibroblastos, las células endoteliales y las células inmunes. Nuestro estudio reciente ha demostrado que las células mesoteliales pueden diferenciarse en una población específica de CAF, conocida como fibroblastos cancerosos presentadores de antígenos (apCAF), que contribuyen a la progresión del cáncer [^[31]]. Los CAF pueden interactuar con el epitelio tumoral a través de la señalización parácrina, como el TGF-β, para respaldar los fenotipos agresivos del cáncer [^[17]]. Además, se identificó recientemente que SPP1 derivado de CAF es un factor crítico para mantener un microambiente pro-tumoral y la similitud de las células cancerosas a través de CD44 [^[29]]. Además, se ha informado que la expresión de SPP1 en los macrófagos asociados al tumor promueve la progresión tumoral y la supresión inmune en el CRC [^[46]]. Sin embargo, nuestra investigación identificó a las células mesoteliales como una fuente importante de SPP1 del estroma en la PM del CRC. A su vez, la estimulación de las células tumorales por SPP1 a través de CD44 activó la cascada de señalización PI3K/AKT para inducir el eje transcripcional TWIST1-SPON2 en las células tumorales para mejorar el potencial metastásico. Esta observación novedosa destaca la importante contribución del MET para la tumorigénesis de la PM del CRC.

Por último, SPON2, al ser un factor secretado, probablemente ejerce su función biológica a través de la regulación mediada por señales paracrinas, no solo en las células tumorales, sino también dentro del microambiente tumoral (TME). La estimulación con SPON2 recombinante o medios acondicionados que contienen SPON2 demostró un aumento de la expresión y secreción de SPP1. Cabe destacar que SPON2 regula diferencialmente SPP1 en las células cancerosas y en las células del estroma: en las células cancerosas, SPON2 solo aumenta la secreción, probablemente a través de mecanismos dependientes de TWIST1, mientras que en las células del estroma, como las células mesoteliales, SPON2 aumenta tanto la SPP1 intracelular como la secretada, a través de la activación transcripcional directa, como lo demuestran los ensayos de reportero del promotor. Estas distintas respuestas pueden surgir de vías de señalización específicas del tipo celular o de la interacción diferencial con los receptores, aunque los mecanismos precisos, incluidos los receptores específicos que median los efectos de SPON2, siguen siendo objeto de investigación. Lo que es más importante, la estimulación con SPON2 inició la diferenciación mesotelial, lo que demuestra un nuevo circuito de señalización paracrina entre las células tumorales y el estroma que impulsa la tumorigénesis del CRC PM. Descubrimos que SPON2 activa EGFR en las células tumorales, pero desencadena la señalización FAK/SRC en las células mesoteliales. De manera crucial, nuestros estudios con inhibidores revelaron que la secreción y la señalización de Spp1 mediadas por Spon2 dependen de la actividad de Src y Fak, pero, sorprendentemente, son independientes de la integrina β1 o β3, lo que sugiere la existencia de un receptor de SPON2 alternativo, aún por identificar, en las células mesoteliales.

A pesar de la limitación de los modelos de inyección intraperitoneal in vivo y de la inexistencia de modelos transgénicos de CRC PM, nuestro experimento in vivo estableció aún más este importante y novedoso circuito en la tumorigénesis del CRC PM y en la posterior producción de ascitis. La producción de ascitis se observa con frecuencia en el PM y es un factor importante que contribuye al mal pronóstico del paciente debido al dolor abdominal, la anorexia, las náuseas y la caquexia [^[47]]. La hipótesis comúnmente aceptada es que las células tumorales son las principales responsables de la producción de ascitis. A través de nuestro experimento transgénico, la secreción de SPP1 en el estroma y la posterior expresión de SPON2 probablemente sean responsables de la producción de ascitis. Tras la abolición completa de la ascitis en los ratones con deleción de SPP1 en el estroma, hipotetizamos que las células mesoteliales y/o el estroma son los principales activadores de la producción de ascitis, en lugar del epitelio tumoral. Además, nuestro perfilado inmunitario reveló un papel fundamental del eje SPP1-TWIST1-SPON2 en la evasión inmunitaria. Recientemente, se informó que SPON2 promueve la polarización de los macrófagos hacia un fenotipo M2 inmunosupresor en el osteosarcoma [^[48]]. Interesantemente, aunque observamos un fenotipo de exclusión inmune significativo, la depleción de cualquier componente de este eje (SPP1, TWIST1 o SPON2) resultó en una infiltración significativa de células T citotóxicas CD8+ en el tumor, mientras que las poblaciones de CD4+ y CD11b+ permanecieron en gran medida inalteradas. Este robusto aumento de la infiltración de células T CD8+ tras la ablación genética de SPP1 en el estroma o de TWIST1 en el tumor es un hallazgo particularmente intrigante con importantes implicaciones biológicas y clínicas. Se reconoce cada vez más que SPP1 es una potente citocina inmunosupresora que ayuda a construir una barrera física y bioquímica contra el tráfico de células T, a menudo promoviendo una densa matriz fibrótica y suprimiendo directamente la activación de las células T [^[19], ^[46], ^[49]]. Al interrumpir el bucle paracrino SPP1-TWIST1-SPON2, esta barrera fibrótica e inmunosupresora probablemente se ve comprometida, transformando eficazmente un microambiente peritoneal "frío" y con exclusión inmune en un lecho tumoral "caliente" e inflamado por células T dentro del microambiente peritoneal. Esto indica que, en el contexto del CRC PM, el eje TWIST1-SPON2 impulsa principalmente la exclusión de las células T citotóxicas en lugar de la modulación de los macrófagos, fomentando así un nicho fibrótico e inmunosuprimido que permite la metástasis.

En conclusión, nuestros hallazgos identifican un nuevo eje SPP1-TWIST1-SPON2 que desempeña un papel fundamental en la progresión del CRC PM. Este eje funciona como un mecanismo regulador clave y como un impulsor de la invasión y metástasis tumoral, la fibrosis y la exclusión inmune dentro del microambiente tumoral peritoneal. Dada su función fundamental, el eje SPP1-TWIST1-SPON2 tiene un potencial significativo como biomarcador para la progresión de la enfermedad, como efector de la señalización metastásica y como un prometedor objetivo terapéutico para la intervención en el CRC PM.