Inmunidad antitumoral inducida por la ablación con etanol en gel para el tratamiento de metástasis hepáticas irresecables de cáncer colorrectal.

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Centro Oncológico Marlene y Stewart Greenebaum, Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland, Baltimore, Maryland, Estados Unidos de América

El cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. Una cuarta parte de los pacientes con CCR desarrollan metástasis hepáticas. Las opciones de tratamiento para las metástasis hepáticas incluyen la extirpación quirúrgica de los tumores o la realización de un trasplante de hígado; sin embargo, muchos pacientes no son elegibles para estos tratamientos debido a una enfermedad extrahepática grave o a la falta de donantes adecuados. La ablación por radiofrecuencia ofrece una alternativa de tratamiento local para resolver las metástasis hepáticas del CCR y se sabe que genera efectos antitumorales para frenar el crecimiento tumoral contralateral. Sin embargo, la ablación por radiofrecuencia no es adecuada para tumores situados cerca de estructuras críticas o grandes vasos sanguíneos. La ablación con etanol es una opción de tratamiento alternativa en la que se inyecta etanol puro directamente en los tumores para inducir la necrosis y no se ve obstaculizada por las desventajas de la ablación por radiofrecuencia. La adición de celulosa etílica con etanol (EC-etanol) mejora su retención en el tejido y, posteriormente, mejora la eficacia ablativa del tumor. Sin embargo, la respuesta antitumoral tras la ablación con EC-etanol en tumores de CCR es poco conocida. Por lo tanto, utilizamos un modelo murino de CCR para investigar los efectos inmunitarios tras el tratamiento con EC-etanol. Los estudios en el modelo de flanco único demostraron un aumento de hasta 27 veces en las citocinas proinflamatorias IL-6 y KC/GRO dentro de las 6 horas posteriores al tratamiento en comparación con los tratamientos simulados, junto con un aumento de 4 veces en la necrosis del tejido diana y un aumento de las células T citotóxicas en la vecindad de la zona de ablación durante 7 días. Los estudios en el modelo de tumor de flanco bilateral demostraron que la ablación con EC-etanol en el tumor primario resultó en un aumento de 1,6 veces en las células T citotóxicas dentro del tumor contralateral después de 7 días en comparación con el grupo de control simulado. La combinación del tratamiento con EC-etanol con la ablación por radiofrecuencia resultó en un aumento más pronunciado, de 2 veces, en las células T citotóxicas dentro del tumor contralateral. En general, estos resultados sugieren que el EC-etanol potencia los efectos antitumorales en los tumores de CCR y es un fuerte candidato terapéutico para el tratamiento de pacientes con CCR en todo el mundo.

Citación: Yang J, Morhard R, Huth H, Karim B, Karanian JW, Wood BJ, et al. (2026) Inmunidad antitumoral inducida por la ablación con etanol en gel para tratar las metástasis de cáncer colorrectal irresecables en el hígado. PLoS One 21(4): e0347625.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0347625

Editor: Ashraf Elbahrawy, Universidad de Al-Azhar, EGIPTO

Recibido: 22 de septiembre de 2025; Aceptado: 3 de abril de 2026; Publicado: 22 de abril de 2026

Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido, distribuido, transmitido, modificado, utilizado o utilizado de cualquier otra manera por cualquier persona para cualquier propósito legal. La obra se pone a disposición bajo la dedicación de dominio público Creative Commons CC0.

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes se encuentran en el artículo y en los archivos de información complementaria.

Financiación: Este trabajo cuenta con el apoyo de los subsidios intramurales Z01 1ZID BC011242 y CL040015 de los Institutos Nacionales de la Salud (B.J.W.); fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer, Instituto Nacional de la Salud, bajo el contrato número HHSN26120150003I (B.K.); los fondos iniciales de la Universidad de Maryland (J.L.M.); y la Asociación NCI/UMD para la Investigación Integrada del Cáncer (J.Y., B.J.W., A.S.M., J.L.M.). Los financiadores no participaron en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Conflictos de intereses: Los autores han declarado que no existen conflictos de intereses.

El cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo, y se espera que esta carga se duplique para 2040 ^[1]. Casi 1 de cada 4 pacientes con CCR son diagnosticados con enfermedad metastásica en el hígado [2–5] y, en consecuencia, tienen una tasa de supervivencia general a 5 años inferior al 20% ^[6,7]. Los tratamientos de las metástasis hepáticas del CCR incluyen la resección quirúrgica, en la que se extirpan físicamente los tumores del tejido hepático afectado ^[8] y, en casos muy seleccionados, el trasplante de hígado, que consiste en reemplazar el hígado enfermo por un hígado sano de un donante. Estas intervenciones mejoran las tasas de supervivencia general a 5 años hasta el 80% ^[9,10]. Sin embargo, entre el 15 y el 30% de los pacientes no son elegibles para estos tratamientos debido a una enfermedad extrahepática extensa, una escasez de donantes de órganos adecuados o un volumen hepático insuficiente después de la cirugía y, por lo tanto, una funcionalidad hepática deficiente [11–13].

Las terapias ablativas locales son una opción de tratamiento alternativa bien establecida para los pacientes con metástasis hepáticas de CCR irresecables. La ablación por radiofrecuencia (ARF) es una de las terapias ablativas hepáticas más utilizadas; genera calor a través de una corriente alterna de alta frecuencia que se administra a través de electrodos de aguja insertados en los tumores, lo que produce un daño térmico. Un ensayo clínico aleatorizado, controlado y de fase III de no inferioridad no encontró diferencias en la supervivencia general y el control tumoral local, así como menos eventos adversos para la ARF en comparación con la resección quirúrgica para las metástasis de CCR de hasta 3 cm ^[14]. También se demostró que la ARF induce la creación de un microambiente altamente inmunogénico ^[15,16], lo que mejora aún más su eficacia ablativa en las metástasis de CCR. Sin embargo, la ARF puede no ser adecuada cuando existe el riesgo de daño térmico a los tejidos críticos cercanos o un efecto de sumidero de calor sustancial que disminuya la eficacia ablativa cerca de los grandes vasos sanguíneos ^[17]. Una terapia ablativa alternativa que no se vea obstaculizada por estas desventajas es la ablación con etanol, un método de ablación química en el que se administra etanol puro directamente a los tumores para inducir la necrosis ^[18]. Se ha demostrado que la combinación de la ablación con etanol y la ARF mejora la eficacia ablativa en los tumores hepáticos, ya que la realización de la ablación con etanol antes de la ARF ocluye la vasculatura, lo que disminuye el efecto de sumidero de calor y mejora la eficacia ablativa de la ARF ^[19,20].

Sin embargo, la ablación con etanol sufre de fugas en los tejidos circundantes, lo que puede reducir la eficacia o causar daños adversos en los tejidos no diana ^[21]. Para resolver este problema, agregamos el polímero celulosa etílica (CE) al etanol, que, al inyectarse en el tejido, forma un depósito de gel que mejora la retención de etanol en el lugar de la inyección ^[22]. Un estudio inicial en el que se inyectó un 3% de CE-etanol (CE:etanol, p:p) en un modelo preclínico de carcinoma oral demostró una regresión tumoral completa después de 7 días, en comparación con las inyecciones de etanol puro, que fueron ineficaces para erradicar los tumores ^[22]. La formulación de CE-etanol se optimizó aún más en el hígado de cerdo, donde el 6% de CE-etanol demostró una mejor administración del inyectado y la formación del depósito en comparación con el 3% de CE-etanol y el etanol puro ^[23].

La evidencia reciente sugiere que el CE-etanol, similar a otras terapias ablativas como la ARF, puede estimular las respuestas inmunitarias antitumorales y fortalecer los efectos de la inmunoterapia ^[15,16]. El tratamiento de un modelo murino de cáncer de mama metastásico triple negativo con CE-etanol resultó en un aumento significativo de 3 veces en el reclutamiento de células T CD3+ en los tumores después de 30 días posteriores a la ablación ^[24]. Además, el CE-etanol aumentó la respuesta a las inmunoterapias de inhibidores de puntos de control anti-PD1 y anti-CTLA4 y mejoró la supervivencia general de los ratones que presentaban tumores metastásicos 4T1 después de 60 días en comparación con el CE-etanol o la inhibición de puntos de control solos ^[24], lo que demuestra el potencial de utilizar el CE-etanol como una terapia inmunomoduladora adyuvante.

El objetivo de este estudio fue establecer los efectos inmunitarios tras la ablación con CE-etanol en los tumores de CCR. Se seleccionó un modelo murino de CCR altamente inmunogénico, ya que nuestro grupo lo había utilizado previamente para caracterizar la respuesta inmunitaria generada por varias tecnologías de ablación ^[25]. Se utilizaron modelos de tumor de flanco único y bilateral para examinar los efectos locales y sistémicos inducidos por la ablación con CE-etanol. Se realizaron ablaciones tumorales y se llevó a cabo una investigación inmunitaria durante 7 días para evaluar los efectos inmunitarios locales y sistémicos. Se incluyó un grupo de ARF como comparador positivo para los experimentos de ablación tumoral, dado su conocido efecto para inducir efectos antitumorales sistémicos ^[26]. Además, se incluyó un grupo de combinación para establecer el potencial sinérgico del CE-etanol cuando se utiliza en combinación con otras terapias ablativas establecidas.

El CE (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) se disolvió en etanol de 200 pruebas (The Warner Graham Company, Cockeysville, MD, EE. UU.) con una placa agitadora a temperatura ambiente, como se describió anteriormente ^[27]. La relación de CE a etanol fue del 6% (CE:etanol, p:p) para todos los experimentos.

Este estudio se llevó a cabo bajo un protocolo de uso de animales aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Centro Clínico del NIH (DRD 23–04). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes sobre el bienestar animal. La Figura 1 describe el flujo de trabajo y los métodos del estudio. Las células de CRC murino CT26 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE. UU.) se mantuvieron mediante cultivo en medio RPMI-1640 sin rojo fenol (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) que contenía 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (Gibco), 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y tampón HEPES (Quality Biological, Gaithersburg, MD, EE. UU.). Para el modelo de flanco único (Figura 1A), se inocularon ratones BALB/c salvajes (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA, EE. UU.) de entre 6 y 8 semanas de edad en el flanco de forma subcutánea con 1,0 x 106 células suspendidas en 100 µL de solución salina tamponada con Hank’s (Gibco), como se describió previamente ^[28]. El volumen tumoral (VT) y el peso corporal del ratón se midieron y controlaron cada 2-3 días. Se utilizó la siguiente fórmula para calcular el VT:

(A) Se inocularon ratones en el flanco derecho con células CT26 y se les permitió crecer durante 14 días. Luego, los tumores se ablacionaron localmente. Después de 3 y 7 días posteriores al tratamiento, se sacrificaron los ratones y se recolectaron los tumores para el análisis de inmunohistoquímica. También se recolectó suero en cada punto temporal para realizar análisis de citocinas. (B) Se inocularon ratones en ambos flancos con células CT26. Después de 14 días, se ablacionó el tumor primario. Se recolectaron los tumores primarios y contralaterales después de 7 días posteriores al tratamiento para el análisis de inmunohistoquímica. Creado con Biorender.com.

Para el modelo de tumor bilateral (Figura 1B), se inocularon simultáneamente ratones con 1,0 x 106 y 2,0 x 105 células CT26 en flancos opuestos para generar tumores primarios para el tratamiento o procedimientos simulados posteriores y tumores contralaterales no tratados, respectivamente.

Todos los procedimientos se realizaron bajo anestesia general con isoflurano (1-3% v/v). La Tabla 1 proporciona una descripción general de los grupos de tratamiento asociados con cada experimento. Para el grupo de estudio de flanco único, cuando el VT alcanzó aproximadamente 250 mm3, los ratones se dividieron en: 1) ablación con EC-etanol y 2) grupos de control simulados (20 ratones en total, n = 10 para cada grupo) para establecer los efectos antitumorales locales inducidos por EC-etanol. Para los grupos de EC-etanol, se infundieron 60 µL de 6% de EC-etanol intratumoralmente en el centro del tumor con una aguja hipodérmica de 27G a una velocidad de infusión de 30 mL/h utilizando una bomba de jeringa programable, como se describió previamente [29, 30]. Esta configuración de administración generó una dosis subterapéutica en los tumores para evaluar cualquier efecto inmunitario inducido tanto en las regiones tumorales tratadas como no tratadas ^[31-33]. Los procedimientos simulados se realizaron mediante la inserción de la aguja en el centro del tumor sin infusión de etanol, durante el mismo tiempo que los grupos de tratamiento.

Para el modelo de tumor bilateral, cuando el tumor primario alcanzó aproximadamente 250 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en: 1) ablación con EC-etanol, 2) AIT, 3) combinación de EC-etanol + AIT y 4) grupos de control simulados (40 ratones en total, n = 10 para cada grupo) para evaluar los efectos antitumorales inducidos por EC-etanol en el tumor contralateral. La administración de EC-etanol se realizó utilizando el mismo procedimiento descrito para el grupo de estudio de flanco único. Para el grupo de AIT, se insertó una cánula de 22G con una punta no aislada de 2 mm (Boston Scientific, Marlborough, MA, EE. UU.) conectada a un generador de lesiones de radiofrecuencia (Baylis Medical Company, Inc., Mississauga, ON, Canadá) en el centro del tumor primario bajo guía ecográfica, y se aplicó calor a 90 °C durante 90 segundos, como se describió previamente ^[25]. Para el grupo de combinación, primero se aplicó el protocolo de tratamiento con EC-etanol, seguido inmediatamente por el tratamiento con AIT. Se ha demostrado previamente que la realización de los tratamientos concomitantes en este orden produce áreas más grandes de necrosis y una mejor inhibición del crecimiento tumoral ^[34-36]. Se administró buprenorfina a una dosis de 0,05 mg/kg por vía subcutánea a todos los ratones de ambos grupos de estudio inmediatamente después del tratamiento. Se controló diariamente a todos los ratones después de los tratamientos y se les aplicó la eutanasia humanitaria si los tumores alcanzaban un VT acumulado de 2000 mm3 antes de alcanzar los puntos temporales objetivo de 3 días o 7 días para la eutanasia. Ninguno de los tumores superó los 2000 mm3, y se aplicó la eutanasia a todos los ratones por asfixia con CO2 seguida de dislocación cervical una vez que se alcanzaron los 3 o 7 días posteriores al tratamiento.

Se recolectó sangre total de cada ratón en el modelo de flanco único mediante sangrado submandibular en los siguientes puntos temporales, como se realizó previamente ^[25]: 1) el día de la inoculación del tumor para establecer los valores de referencia ^[25], 2) seis horas después de la ablación ^[25], 3) 3 días después de la ablación ^[25] y 4) 7 días después de la ablación para explorar la respuesta inmunitaria proinflamatoria. Luego, se extrajo y crioconservó el suero. Todos los especímenes de suero se analizaron para detectar citocinas proinflamatorias mediante un ensayo de quimioluminiscencia (V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Mouse Kit, Meso Scale Diagnostics, LLC, Gaithersburg, MD, EE. UU.). Los valores de concentración de cada citocina se normalizaron a los valores obtenidos del suero recolectado el día de la inoculación del tumor.

Inmediatamente después de la eutanasia, se extirparon los tumores y se fijaron en formaldehído neutro tamponado al 10% (Azer Scientific, Morgantown, PA, EE. UU.), se incluyeron en parafina y se seccionaron. Se obtuvieron secciones secuenciales de 5 µm del centro de cada tumor y se montaron en portaobjetos de vidrio. Luego, se tiñeron las secciones secuenciales con hematoxilina y eosina (H&E) y tinción de inmunohistoquímica (IHC) para marcadores inmunitarios. Específicamente, la tinción de IHC incluyó la recuperación de epítopos inducida por calor (citrato) durante 20 minutos para CD8a (eBioscience Catalog #14-0195-82 rat IgG2a, 1:50). Se utilizó el kit Bond Polymer Refine (menos reactivo postprimario) para ambos marcadores, junto con un anticuerpo secundario anti-ratón para CD8a. Se utilizó bazo de ratón normal como tejido de control positivo para CD8a. Para los controles negativos, los anticuerpos de control isotípico reemplazaron a los anticuerpos primarios.

Todos los análisis de imágenes se realizaron en el software HALO (Indica Labs, Albuquerque, NM, EE. UU.) de forma ciega por un patólogo veterinario (BK). Las zonas de ablación se definieron por el tejido necrótico resultante de los tratamientos. Los márgenes de la zona de ablación se definieron como regiones concéntricas de 400 µm, que contenían las áreas que contenían tinciones positivas que rodeaban el perímetro de la zona de ablación. Los márgenes tumorales se analizaron mediante análisis de partición concéntrica utilizando la plataforma de análisis de imágenes Cytonuclear HALO. Para los tratamientos simulados, se delimitaron los márgenes que rodeaban los bolsillos de necrosis. Para la cuantificación de la necrosis, el porcentaje de necrosis tisular inducida por los tratamientos se calculó dividiendo el área de necrosis por el área tumoral total en las láminas teñidas con H&E y luego multiplicando por 100. Para la cuantificación de los linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8a+, se calculó la densidad de población (es decir, células positivas por mm2) para una región específica (es decir, tumor completo, zona de ablación, márgenes de la zona de ablación) dividiendo el número total de células teñidas positivamente dentro de la región específica por el área de la región específica en las láminas teñidas con IHC.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Graphpad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). Para el análisis de citocinas séricas y el análisis de H&E de necrosis para el estudio de tumor de flanco único, se utilizó una prueba t no pareada para comparar las diferencias entre los niveles de citocinas inducidos por EC-etanol y los tratamientos simulados en el mismo punto temporal. Además, se realizó un ANOVA de medidas repetidas sobre las concentraciones de citocinas normalizadas a lo largo de la línea de tiempo del tratamiento para comparar las diferencias en los niveles de citocinas desde el punto temporal inicial dentro de cada grupo de tratamiento. Para todos los gráficos de IHC, se utilizó la prueba de Mann-Whitney U para evaluar cualquier diferencia significativa en las células positivas por mm2 entre los puntos temporales de 3 días y 7 días para cada grupo de tratamiento. Además, para el estudio de tumor bilateral, se utilizó el análisis de varianza no paramétrico de Kruskal-Wallis para comparar las diferencias significativas en las células positivas por mm2 entre todos los grupos de tratamiento dentro del punto temporal de 7 días. Se aplicó un nivel de significancia de p = 0,10 para rechazar la hipótesis nula en todos los análisis.

La Figura 2 muestra las fluctuaciones en la concentración de dos citocinas, la interleucina-6 (IL-6) y el quimioatractante de queratinocitos/quimioquina regulada por el crecimiento humano (KC/GRO), durante un período de 7 días. Los valores de concentración se normalizaron a las lecturas de referencia (es decir, suero recolectado el día de la inoculación del tumor) y se mostraron como un valor de 1 en T = 0 horas. A las 6 horas posteriores a la ablación, IL-6 y KC/GRO experimentaron un aumento significativo de 27 y 7 veces (p = 0,013 y 0,026, respectivamente) en la expresión, respectivamente, en comparación con las inyecciones simuladas (Figura 2A, 2B). Después de 3 días posteriores a la ablación, las inyecciones de EC-etanol mostraron una disminución posterior en la expresión de IL-6 y KC/GRO similar a la de las inyecciones simuladas (14 veces y 3 veces desde la línea de base, respectivamente, p > 0,10). Después de 7 días posteriores a la ablación, la expresión de IL-6 disminuyó aún más hacia los niveles de referencia (4 veces desde la línea de base), junto con la expresión de KC/GRO (2 veces) disminuyendo por debajo de la de la inyección simulada (3 veces, p > 0,10). Las inyecciones simuladas mostraron un ligero aumento en la expresión de IL-6 después de 3 días antes de disminuir a los niveles de referencia después de 7 días, mientras que las concentraciones de KC/GRO permanecieron estables durante el procedimiento (p > 0,10). Las citocinas restantes probadas no mostraron diferencias significativas entre los grupos de tratamiento (IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12p70) (Figura S1).

El cambio de pliegue de (A) IL-6 y (B) KC/GRO durante un período de 7 días (n = 8-10). Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). *P < 0,10, P < 0,05, *P < 0,01, ****P < 0,001.

La Figura 3 ilustra la zona de ablación tumoral inducida por EC-etanol, que se define por las regiones que son predominantemente visibles solo por la tinción con eosina (es decir, rosa claro), en comparación con la región tumoral no tratada donde la tinción con hematoxilina (es decir, púrpura oscuro) es predominante (Figura 3A-G). La zona de ablación para los tratamientos con EC-etanol en los 3 y 7 días posteriores a la ablación mostró patrones de necrosis coagulativa (sin núcleos intactos, pero la arquitectura del tejido aún se conserva) y necrosis licuefactiva (la arquitectura del tejido se degrada en una masa licuada) (Figura 3B, F) mientras que los tratamientos simulados solo tenían pequeños bolsillos de necrosis licuefactiva dispersos por todo el tumor (Figura 3D, H). En particular, la cantidad de necrosis del tratamiento con EC-etanol (es decir, el tamaño de la zona de ablación) fue significativamente mayor que la de los controles para ambos puntos temporales (41% ± 4% frente a 9% ± 1% en el día 3, p < 0,001, y 34% ± 5% frente a 14% ± 2% en el día 7, p = 0,0050, para EC-etanol y simulado, respectivamente) (Figura 3I).

Tumores teñidos con H&E representativos tratados con (A, E) EC-etanol a los 3 y 7 días posteriores a la ablación o (C, G) tratamientos simulados a los 3 y 7 días posteriores a la ablación. Las barras de escala = 2 mm. Inserciones ampliadas de las regiones necróticas a 20x para tumores tratados con (B, F) EC-etanol a los 3 y 7 días posteriores a la ablación o (D, H) tratamientos simulados a los 3 y 7 días posteriores a la ablación se muestran para ilustrar los patrones de necrosis coagulativa (estrella roja) y necrosis licuefactiva (flecha verde). Las barras de escala = 200 µm. (I) Cuantificación y comparación de la cantidad de necrosis dentro del tumor entre los grupos de tratamiento con EC-etanol y simulado (n = 5-8). Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). *P < 0,10, P < 0,05, *P < 0,01, ****P < 0,001.

La figura 4 ilustra los resultados de la tinción IHC del tumor para CD8a, que detecta los CTLs que se infiltraron en el tumor 3 y 7 días después de la ablación (figura 4A-D). Los tumores tratados con EC-etanol mostraron un ligero aumento en el reclutamiento de CTLs CD8a+ en ambos puntos temporales (702 ± 197 y 232 ± 50 células positivas/mm2 para los días 3 y 7, respectivamente), en comparación con los del grupo de control (625 ± 48 y 122 ± 28 células positivas/mm2 para los días 3 y 7, respectivamente), aunque se observó una disminución significativa de los CTLs después del día 7 (p = 0,016) (figura 4E). La densidad de CTLs CD8a+ dentro de la zona de ablación disminuyó ligeramente (496 ± 151 células positivas/mm2) en comparación con la del tumor completo en el día 3 (figura 4F), aunque había significativamente menos CTLs presentes después del día 7 (28 ± 10 células positivas/mm2, p = 0,0079). El grupo de control mostró una disminución similar de los CTLs, de 224 ± 82 células positivas/mm2 a 39 ± 10 células positivas/mm2. Al examinar los márgenes que rodean la zona de ablación inducida por EC-etanol (figura 5A-B), se observó un aumento de 1,4 veces (1858 ± 727 células positivas/mm2) en la densidad de la población de CTLs CD8a+ en el día 3, en comparación con el grupo de control (1353 ± 105 células positivas/mm2, figura 5C, p > 0,10). Se observó un aumento aún mayor, de 4,3 veces (471 ± 176 células positivas/mm2), en la densidad de la población de CTLs CD8a+ en el día 7 en comparación con el grupo de control (109 ± 52 células positivas/mm2, p = 0,071, figura 5D).

Tumores representativos teñidos con IHC para CD8a tratados con (A, B) EC-etanol a los 3 y 7 días después de la ablación o (C, D) tratamientos de control a los 3 y 7 días después de la ablación. UT = tumor no tratado. Las barras de escala = 2 mm. (E) Cuantificación y comparación de la cantidad de CTLs CD8a+ dentro del tumor y (F) dentro de la zona de ablación únicamente (denotada como la región delimitada por líneas punteadas amarillas) entre los grupos de tratamiento con EC-etanol y el grupo de control (n = 3-5). *P < 0,10, P < 0,05, *P < 0,01, ****P < 0,001.

Primeros planos de los márgenes de la zona de ablación con EC-etanol después de (A) 3 días (recuadro negro) y (B) 7 días (recuadro rojo), con los márgenes (región denotada con una flecha negra y el límite delimitado con líneas punteadas amarillas y verdes) definidos como 400 µm desde el perímetro de la zona de ablación. Cuantificación y comparación de la cantidad de CTLs CD8a+ dentro de los márgenes en (C) 3 y (D) 7 días después de la ablación (n = 3-5). Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). Las barras de escala = 300 µm. *P < 0,10, P < 0,05, *P < 0,01, ****P < 0,001.

La figura 6 ilustra los resultados de la tinción IHC del tumor contralateral para CD8a después de 7 días de la ablación (figura 6A-D). Los tumores primarios tratados con EC-etanol o RFA dieron como resultado un aumento en el número de CTLs CD8a+ dentro del tumor contralateral (241 ± 80 y 175 ± 23 células positivas/mm2 para EC-etanol y RFA, respectivamente) en comparación con el del grupo de control (154 ± 50 células positivas/mm2, p > 0,10) (figura 6E). El tratamiento combinado también mostró un aumento en el número de CTLs reclutados en el tumor contralateral, con 287 ± 45 células positivas/mm2 (p > 0,10). Todos los grupos de tratamiento mostraron que la mayoría de los CTLs se acumularon a lo largo de los márgenes de la periferia del tumor, lo que mostró una mayor densidad de CTLs dentro de esta región en comparación con el grupo de control (figura 6F). Hubo un aumento de 2 veces (607 ± 142 células positivas/mm2) y 1,5 veces (435 ± 61 células positivas/mm2) en la densidad de la población de CTLs después del tratamiento con EC-etanol y RFA, respectivamente, en comparación con el tratamiento de control (300 ± 129 células positivas/mm2) (p > 0,10). Cabe destacar que el tratamiento combinado mostró un aumento significativo de 2,2 veces en la densidad de la población de CTLs (649 ± 84 células positivas/mm2), en comparación con el del tratamiento de control (p = 0,094).

Tumores contralaterales representativos teñidos con IHC para CD8a tratados con (A) control, (B) EC-etanol, (C) RFA o (D) combinación (EC-etanol + RFA) a los 7 días después de la ablación. Las barras de escala = 400 µm. Cuantificación y comparación de la cantidad de CTLs CD8a+ dentro de (E) la totalidad del tumor contralateral y (F) dentro de los márgenes de la periferia del tumor (n = 5-6). Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). *P < 0,10, P < 0,05, *P < 0,01, ****P < 0,001.

La ablación con etanol posee algunas ventajas sobre otras terapias ablativas locorregionales y puede potenciar los efectos inmunitarios antitumorales. Sin embargo, sufre de fugas de etanol, lo que afecta negativamente la distribución del etanol dentro del tumor y disminuye la eficacia del tratamiento. La adición de EC al inyectado de etanol da como resultado la formación de un depósito de gel de EC-etanol dentro del tumor, lo que evita las fugas de etanol y mejora la eficacia ablativa del tumor ^[22]. Este estudio implementó modelos murinos de CRC unilateral y bilateral para explorar la capacidad del EC-etanol para inducir efectos inmunitarios antitumorales tanto locales como sistémicos, respectivamente. Estos efectos se evaluaron midiendo los niveles de citocinas en el suero en múltiples puntos temporales después de la inyección intratumoral de EC-etanol y mediante el análisis de la inmunohistoquímica del tumor de CD8a.

Las terapias ablativas a menudo inducen la secreción de citocinas, lo que promueve la infiltración de células inmunitarias y el reconocimiento de antígenos ^[37]. El aumento significativo en la expresión de las citocinas IL-6 y KC/GRO dentro de los primeros 3 días posteriores a la ablación sugiere que el EC-etanol induce una respuesta inflamatoria (figura 2), lo que es consistente con los perfiles de citocinas inducidos por otras terapias ablativas dentro de la primera semana [38, 39]. La IL-6 recluta células inmunitarias innatas como neutrófilos y macrófagos [40, 41]; también desempeña un papel clave en la respuesta inmunitaria adaptativa, incluida la inducción de la diferenciación de células T ingenuas en células auxiliares o citotóxicas ^[42]. KC/GRO (una quimiocina análoga a CXCL1) es un quimioatrayente de neutrófilos y también un mediador de la angiogénesis [43, 44]. La disminución posterior en los niveles de IL-6 y KC/GRO después de los 3 y 7 días sugiere un cambio de la fase inflamatoria a la fase de proliferación [45, 46], lo que puede corresponder al inicio de una respuesta inmunitaria adaptativa y el reclutamiento de CTLs en la zona de ablación y sus márgenes (figura 5). Esta elevación temprana de las citocinas por la ablación con EC-etanol es consistente con un informe anterior que demostró una elevación en los niveles de IL-6 y KC/GRO en el suero 6 horas después de la criocirugía de tumores CT26 de ratón, seguida de una disminución en los niveles de IL-6 y KC/GRO en el suero después de 3 días ^[25]. Un estudio clínico también demostró elevaciones en la IL-6 dentro de las 48 horas posteriores a la ablación térmica ^[47]; sin embargo, los niveles elevados de IL-6 se correlacionaron con una disminución de la supervivencia general en 99 pacientes con cáncer de CRC [48, 49]. Un estudio en ratones con tumores CT26 mostró que los niveles elevados de CXCL1 después de 2 semanas se correlacionaron con un crecimiento tumoral exacerbado ^[50]. Por lo tanto, si bien la ablación con EC-etanol puede ser suficiente para generar fuertes señales antitumorales comparables a las de las modalidades establecidas para tratar el CRC, se justifican más estudios para garantizar que los tratamientos con EC-etanol den como resultado una mejora en la supervivencia de los pacientes con cáncer. La modulación de las concentraciones de citocinas proinflamatorias como la IL-6 y la KC/GRO puede mejorar los beneficios terapéuticos de la ablación con EC-etanol en el tratamiento del CRC.

Se cree que el mecanismo principal de la ablación con etanol es la inducción de necrosis coagulativa debido a la isquemia [51, 52]. Específicamente, se ha demostrado que induce la oclusión vascular y, posteriormente, interrumpe el suministro de sangre del tumor. Aquí, las regiones tumorales tratadas con EC-etanol contenían tanto necrosis coagulativa como licuefactiva, mientras que los tratamientos de control solo tenían pequeños focos de necrosis licuefactiva dispersos por todo el tumor (figura 3). Las regiones de necrosis coagulativa contenían células que carecían de núcleos pero que mantenían la arquitectura estructural del tejido. Por el contrario, las regiones de necrosis licuefactiva carecían de una arquitectura consistente con células lisadas, detritos y espacio claro. La necrosis licuefactiva fue más prominente dentro del centro de la zona de ablación con EC-etanol, mientras que la necrosis coagulativa tendía a ser prevalente cerca del borde de la zona de ablación. Estas observaciones corroboran los resultados de un estudio en el que una terapia combinada de EC-etanol y terapia fotodinámica resultó en necrosis licuefactiva dentro del centro del depósito y necrosis coagulativa a lo largo del perímetro del depósito después de 7 días posteriores a la ablación ^[30].

La muerte celular necrótica inducida por el EC-etanol también suele dar como resultado la liberación de patrones moleculares asociados al daño, que incluyen antígenos específicos del tumor que pueden ser captados por las células presentadoras de antígenos y presentados para iniciar la inmunidad adaptativa a largo plazo ^[53], específicamente la iniciación de las células T. La presencia de CTLs CD8a+ dentro del tumor es un indicador importante de los posibles efectos antitumorales después de la ablación. Después de la inyección intratumoral de EC-etanol, hubo un ligero aumento en los CTLs CD8a+ en comparación con el del grupo de control durante el período de 7 días posteriores a la ablación (figura 4E). La mayoría de estas células se ubicaron dentro de la zona de ablación o alrededor de sus márgenes inmediatos (figura 4F, 5D). Los márgenes de ablación, definidos como la interfaz entre el tumor intacto y la zona de ablación, se compusieron de una banda gruesa de CTLs densamente empaquetados en el día 3 (figura 5C) antes de adelgazarse a un perímetro más bien definido a lo largo del borde de la zona de ablación en el día 7 (figura 5D). Esto significa una fuerte acumulación de CTLs dentro de la interfaz del depósito de EC-etanol y sugiere efectos de tratamiento prolongados en las regiones tumorales circundantes no tratadas. El aumento de la presencia de CTLs en el tumor corrobora los resultados anteriores en los que el tratamiento con EC-etanol en un modelo murino de cáncer de mama triple negativo inducido químicamente reclutó células T generales CD3+ en el tumor después de 30 días posteriores a la ablación ^[24]. Este estudio amplía aún más esta observación al caracterizar específicamente los CTLs CD8a+ dentro del margen del tumor y cuantificar su población celular, lo cual es fundamental para caracterizar la citotoxicidad y la eficacia antitumoral de la ablación con EC-etanol. El trabajo futuro caracterizará la colocalización de los CTLs con otros infiltrados inmunitarios (por ejemplo, células T auxiliares, células B, macrófagos) para dilucidar la interacción detrás de las propiedades inmunomoduladoras de la ablación con EC-etanol, junto con la expresión de receptores y ligandos inhibidores (por ejemplo, PD-1, PD-L1) para identificar posibles objetivos para estrategias terapéuticas combinadas con EC-etanol para ablacionar tumores de CRC.

El efecto abscopal se basa en la presencia de efectos antitumorales en el tumor contralateral después de la ablación local del tumor primario. En el presente estudio, el tratamiento con EC-etanol produjo un número comparable de CTLs en los tumores contralaterales al observado con RFA en el día 7 (figura 6F), lo que sugiere que el EC-etanol es igualmente eficaz que el RFA para promover el reclutamiento de CTLs en los sitios tumorales contralaterales. Estudios anteriores han demostrado que la combinación de la ablación percutánea con etanol y la RFA confiere un mejor control tumoral local y una mejor supervivencia a largo plazo en pacientes con tumores hepáticos en comparación con la RFA sola [34, 35]. Por lo tanto, para evaluar inicialmente los efectos antitumorales inducidos por las terapias ablativas combinadas, combinamos la ablación con EC-etanol y la RFA en un solo régimen de tratamiento en el tumor primario y evaluamos cualquier mejora en la calidad de la respuesta inmunitaria en el tumor contralateral. Hubo un aumento de 2 veces en los CTLs CD8a+ en el tumor contralateral para el grupo de tratamiento combinado en comparación con el del grupo de control, junto con un aumento de 1,6 a 1,2 veces en comparación con las monoterapias con EC-etanol y RFA, respectivamente (figura 6E). Además, hubo un aumento significativo de 2,2 veces en los CTLs dentro de los márgenes del tumor contralateral después del tratamiento combinado en comparación con el del grupo de control (figura 6F), mientras que no se observaron diferencias significativas entre los otros grupos de tratamiento (figura 6F), lo que sugiere efectos sinérgicos entre los tratamientos con EC-etanol y RFA. El trabajo futuro investigará el aumento de la dosis de los tratamientos (por ejemplo, mayor volumen de EC-etanol, múltiples inyecciones en un solo tumor) para lograr una dosis terapéutica y luego evaluará su eficacia antitumoral, e implementará un estudio longitudinal para evaluar la capacidad de los tratamientos basados en EC-etanol durante un período de tiempo más largo para mejorar las tasas de supervivencia.

Este estudio tuvo limitaciones. En primer lugar, se inocularon tumores de CRC subcutáneos en el flanco de ratones. Los estudios futuros incluirán la evaluación de los efectos antitumorales del etanol-EC en un modelo ortotópico de CRC [54, 55] para recapitular mejor el microambiente tumoral nativo del CRC y su posible impacto en los efectos inmunitarios. En segundo lugar, evaluamos los efectos inmunitarios solo en dos puntos temporales después del tratamiento, y la evaluación en etapas posteriores se vio impedida por el crecimiento inherentemente agresivo de los tumores y la implementación de dosis subterapéuticas para examinar las poblaciones de células inmunitarias tanto en las regiones tratadas como en las no tratadas dentro del tumor. Dado que la inmunidad antitumoral es un proceso dinámico, los estudios futuros incorporarán puntos temporales adicionales, dosis terapéuticas aumentadas y pueden emplear modelos tumorales de crecimiento más lento para permitir una evaluación más completa de las respuestas inmunitarias provocadas por el tratamiento con etanol-EC. También se realizarán estudios de supervivencia para comparar y contrastar la eficacia de los tratamientos con etanol-EC con la ablación por radiofrecuencia (RFA) y otras modalidades de tratamiento estándar. Por último, debido a la naturaleza altamente inmunogénica del modelo tumoral CT26, las diferencias en los efectos antitumorales y el reclutamiento de células inmunitarias entre el etanol-EC y los tratamientos simulados pueden estar parcialmente enmascaradas. Los estudios futuros obtendrán datos sobre las poblaciones de células inmunitarias en el tumor antes de la inyección.

La ablación con etanol-EC generó efectos antitumorales locales y sistémicos en los tumores de CRC durante un período de 7 días. El aumento de la expresión de las citocinas IL-6 y KC/GRO dentro de las primeras 6 horas posteriores a la ablación indicó que el tratamiento con etanol-EC provocó una fuerte respuesta inmunitaria proinflamatoria. Durante un período de 7 días, una disminución gradual de la expresión de citocinas se complementó con el gran reclutamiento de CTLs CD8a+ en la vecindad de la zona de ablación dentro del tumor primario. Estos cambios en la expresión de citocinas y las poblaciones celulares indicaron un cambio hacia una respuesta inmunitaria adaptativa para frenar el crecimiento del tumor de CRC. Los tumores contralaterales también mostraron un aumento de la infiltración de CTLs después de la ablación con etanol-EC, lo que indica la capacidad del etanol-EC para potenciar los efectos abscopales. En general, estos resultados sugieren que el etanol-EC potencia los efectos antitumorales en los tumores de CRC y es un fuerte candidato terapéutico para el tratamiento de pacientes con CRC en todo el mundo.

Valores de concentración normalizados de los perfiles de citocinas inducidos por el etanol-EC y los tratamientos simulados durante un período de 7 días (n = 8-10). IL-4 e IL-12p70 no generaron ninguna lectura cuantificable en ningún punto temporal. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM). *P < 0,10, P < 0,05, *P < 0,01, ****P < 0,001.

Esta investigación contó con el apoyo del Programa de Investigación Intramural de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH). Las contribuciones del/de los autor(es) del NIH se realizaron como parte de sus funciones oficiales como empleados federales del NIH, cumplen con los requisitos de la política de la agencia y se consideran Obras del Gobierno de los Estados Unidos. Sin embargo, los hallazgos y las conclusiones presentadas en este artículo son los del/de los autor(es) y no reflejan necesariamente las opiniones del NIH o del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE. UU. Agradecemos al equipo de ACUC del Centro Clínico del NIH por el trabajo de cuidado y el uso de las instalaciones para ratones en este estudio. También agradecemos al Laboratorio de Apoyo Clínico en NCI Frederick por la adquisición y la ejecución del análisis del kit de panel de citocinas, y al Laboratorio de Histopatología Molecular (MHL) del Laboratorio Nacional Frederick para la Investigación del Cáncer (FNLCR) por el procesamiento, la tinción y la obtención de imágenes de todos los especímenes tumorales.