Análisis integrado a nivel de célula única y mediante técnicas de localización espacial de la expresión génica de MMP en el cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer tipo de cáncer más diagnosticado en el mundo y una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer, con una estimación de 1,9 millones de nuevos casos y más de 900.000 muertes anualmente [^[1]]. Si bien la incidencia general de CCR está disminuyendo, está aumentando en poblaciones más jóvenes, particularmente en países de ingresos altos, lo que subraya la necesidad de una mejor comprensión de la etiología y la fisiopatología del CCR [^[1], ^[2]]. Los CCR están compuestos tanto por células epiteliales genéticamente transformadas como por un diverso compartimento estromal que comprende fibroblastos, células endoteliales e infiltrados de células inflamatorias. Las células cancerosas exhiben proliferación incontrolada y capacidad invasiva, mientras que las células estromales sirven como moduladores clave de la progresión tumoral, en parte a través de su función en la angiogénesis y las respuestas inmunitarias e inflamatorias [^[3]]. Las interacciones recíprocas entre las células cancerosas y los componentes estromales dan forma activa al microambiente tumoral (MET), lo que puede afectar significativamente el crecimiento y la progresión del cáncer.

Las metaloproteinasas de la matriz (MMP) son una familia de endopeptidasas dependientes del zinc que median la degradación de la matriz extracelular y, por lo tanto, desempeñan un papel fundamental en la remodelación de los tejidos en condiciones tanto fisiológicas como patológicas. Las MMP escinden los componentes de la MEC, lo que a su vez puede afectar la adhesión celular, la señalización y el movimiento dentro, fuera y a través de un tejido. Por lo tanto, las MMP pueden afectar numerosos eventos en el cáncer, que van desde la metástasis hasta la vigilancia inmunitaria. Estas enzimas se clasifican según su especificidad de sustrato y sus características estructurales en colagenasas (MMP1, MMP8, MMP13, MMP18), gelatinasas (MMP2, MMP9), estromelisinas (MMP3, MMP10, MMP11, MMP12), matrilisinas (MMP7, MMP26) y MMP de tipo membrana (MT-MMP, por ejemplo, MMP14, MMP15, MMP16, MMP25) [^[4], ^[5]]. Cada grupo escinde una selección de componentes de la MEC, con cierta superposición entre los grupos. Además, las MMP pueden escindir proteínas no MEC para modular su actividad, incluidos los citocinas y los receptores de membrana que desempeñan un papel central en la promoción del CCR. La expresión de MMP aumenta en los tejidos inflamados y neoplásicos, y gran parte de esta regulación se produce a nivel transcripcional. Las MMP se expresan inicialmente como zimógenos (pro-MMP) que requieren escisión para su activación, a menudo por otras MMP, y están inhibidas por los inhibidores de metaloproteinasas tisulares (TIMP), lo que proporciona dos capas adicionales de regulación. La escisión de MMP por otras MMP establece cascadas de activación, en las que una MMP activa a otra. Por ejemplo, la MMP3 puede activar tanto la MMP7 como la MMP9, mientras que la MMP2 es activada por la MMP14 [^[6]–^[8]]. Las matrilisinas, en particular la MMP7, desempeñan un papel clave en el CCR al degradar los componentes de la membrana basal y activar la MMP2 y la MMP9, reforzando una red proteolítica autorreguladora que sustenta la progresión tumoral [^[6]]. Esta interacción enzimática cooperativa entre las MMP mejora la degradación de la MEC para afectar el tráfico celular y la metástasis. Por lo tanto, comprender la interacción entre los diversos subtipos de MMP dentro del tejido del CCR es importante para comprender numerosos eventos de la progresión del CCR.

Si bien las MMP se han estudiado ampliamente, su expresión espacial dentro del CCR (y otros cánceres) sigue estando menos definida. Los avances en la secuenciación de ARN de una sola célula y la transcriptómica espacial ahora permiten el mapeo de alta resolución de las MMP en el CCR, lo que proporciona información sobre su localización y posibles interacciones funcionales. Este conocimiento podría conducir a una mejor comprensión de cómo estas enzimas influyen colectivamente en la composición de la MEC y la progresión del cáncer. Esta información también podría aprovecharse para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas que exploten los cambios asociados con el cáncer en la expresión de MMP, ya sea a través de inhibidores que detengan el crecimiento de las lesiones o como objetivos para terapias y profármacos dirigidos al cáncer.

Resultados

Expresión de MMP en el CCR

Se analizaron los datos de TCGA para identificar las MMP altamente expresadas en el CCR. Este análisis reveló una alta expresión de las MMP 1, 2, 3, 7, 9, 11, 12, 14 y 15 (Fig. 1A). La mayoría de estas MMP se expresan a niveles más altos en el tejido canceroso que en el tejido normal, aunque las MMP 2, 4 y 15 se expresan a niveles relativamente altos en el tejido normal. Dado que los CCR están poblados por numerosos tipos de células que pueden afectar la progresión de la lesión, determinamos los perfiles de expresión de MMP en los diferentes tipos de células dentro del tejido sano y canceroso utilizando datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq). En el tejido normal, los datos de scRNA-seq mostraron que los fibroblastos (FB) y las células del músculo liso (SMC) son los principales expresores de MMP, siendo la MMP2 la isoforma más expresada (Fig. 1B). En el CCR, muchos más tipos de células expresan MMP; existen aumentos notables en las células epiteliales y las células mieloides, además del aumento de la expresión en los FB y las SMC (Fig. 1C). Se muestra una tabla que resume la expresión de MMP por tipo de célula en el tejido normal y el CCR (Fig. 1D).

Expresión de MMP en los CAF y las SMC

Dado que los CAF y las SMC en los datos de células únicas del CCR expresan un conjunto similar de MMP, estos dos tipos de células se combinaron y se resolvieron en 8 grupos (Fig. 2A). Las SMC y los CAF poblaron por igual muchos de los grupos, lo que es consistente con el hecho de que estos dos tipos de células expresan MMP similares. Sin embargo, los grupos 3, 4 y 5 estaban compuestos principalmente por CAF. Estos grupos se distinguieron por una alta MMP1/3, una alta MMP11 y una alta expresión de MMP1, respectivamente. Para determinar si los patrones de expresión de MMP estaban asociados con diferentes tipos de CAF, se identificaron los genes enriquecidos en los grupos definidos por MMP (Fig. 2B) y se analizaron para determinar el tipo de célula utilizando la base de datos ToppCell Atlas (Fig. 2C). Este análisis devolvió diferentes categorías de células para los diferentes grupos definidos por MMP, incluidos "fibroblasto-pericitos", "fibroblasto mesenquimal" y "miofibroblasto" (Fig. 2C). Este análisis es consistente con la idea de que los diferentes tipos de fibroblastos dentro del CCR tienen perfiles de expresión de MMP únicos, lo que probablemente afecta su función en la regulación de la dinámica de la MEC en el tumor [^[9]].

Expresión de MMP en las células mieloides

Se realizó un análisis de grupos de las MMP asociadas a las células mieloides 9, 12 y 14 en los datos de scRNA-seq, centrándose en tres tipos principales de células mieloides: monocitos, macrófagos y células dendríticas. El grupo más grande (grupo 0) mostró la expresión de las tres MMP preferidas por las células mieloides en los tres tipos de células mieloides (Fig. 3A). Los grupos 1, 2, 3, 5 y 6 mostraron una expresión relativamente baja de MMP y estaban compuestos predominantemente por monocitos (Fig. 3A). Otros dos grupos de interés son el grupo 4, en el que los monocitos y los macrófagos expresan casi exclusivamente la MMP14, y el grupo 7, en el que los macrófagos y las células dendríticas expresan altos niveles de MMP12. Para comprender mejor la base de la expresión de MMP en las células mieloides, se resolvieron las células de alta expresión de las células de baja expresión (Fig. 3B). Se observó una superposición significativa en la expresión de las tres MMP mieloides, lo que es consistente con una regulación subyacente (Fig. 3C). Los genes asociados con la alta expresión de MMP 9, 12 o 14 se analizaron para detectar su enriquecimiento utilizando la base de datos Gene Ontology (GO). Las tres MMP se asociaron con la expresión de genes implicados en la formación de vesículas secretoras y la actividad lisosomal (Fig. 3D). Con base en este análisis, la expresión de MMP en las células mieloides no parece ser altamente específica del tipo de célula, sino que está asociada con una expresión más robusta de los componentes del sistema endomembranoso, incluidas las vesículas secretoras y los lisosomas. En general, esto sugiere que la expresión de MMP en las células mieloides está asociada con un fenotipo más secretor.

Expresión de MMP en las células cancerosas

Los datos de scRNA-seq mostraron que la expresión de MMP es baja en las células epiteliales del colon normal, pero aumenta en el cáncer colorrectal, y la MMP7 muestra una alta expresión en un subconjunto de células cancerosas (Fig. 1C) [^[10], ^[11]]. Como se muestra en la Fig. 4A, la expresión de MMP7 en las células cancerosas varía en varios órdenes de magnitud. Para comprender mejor la naturaleza de las células cancerosas que expresan MMP7, se agruparon las células cancerosas en función de su expresión de MMP. Las células cancerosas que expresan la MMP7 más alta se encontraron en el grupo 0 (Fig. 4B). Para determinar cómo la expresión de MMP7 se correlaciona con otras características de las células cancerosas, se identificaron los genes enriquecidos en el grupo 0 (Fig. 4C). Los genes más enriquecidos en este grupo fueron MMP1, MMP7 y MMP14. Este hallazgo indica que estas células cancerosas probablemente poseen un alto potencial de degradación de la MEC, lo que posiblemente afecta su malignidad [^[10], ^[11]]. Además, este grupo muestra una expresión enriquecida de los potenciadores de la señalización de Wnt, RSPO2, SPON1 y PTGS2 [^[12]–^[14]], y los genes diana de Wnt MMP17, PTGS2/COX2 y ETV1 [^[15]–^[17]]. Esta observación es consistente con los informes de que la MMP7 es en sí misma un gen diana de Wnt y sugiere que esta subpoblación de células cancerosas tiene una señalización de Wnt elevada [^[10], ^[18], ^[19]].

Expresión espacial de MMP en el CCR

Para determinar cómo las diferentes MMP podrían interactuar dentro de un CCR, analizamos los datos de transcriptómica espacial. Se utilizaron datos de resolución moderada con aproximadamente 20 células por píxel para revelar la superposición de la expresión de MMP. El análisis de los datos de transcriptómica espacial mostró patrones de expresión regional distintos para las MMP individuales (Fig. 5A). Para comprender cómo se superpone la expresión de MMP dentro de la lesión, se agruparon los píxeles en función de la expresión de MMP (Fig. 5B) y estos grupos se "pintaron" en la sección de tejido (Fig. 5C). Los grupos de expresión de MMP se vieron influenciados en parte por los tipos de células presentes en el píxel (Fig. 5C). Los grupos de MMP también generaron un patrón similar al creado por los genes más expresados diferencialmente (Fig. 5C), un hallazgo consistente con la idea de que la expresión de MMP ayuda a establecer subdominios discretos. El análisis de los genes marcadores mostró que la mayoría de las células cancerosas se encontraban en los grupos de MMP 0 y 4 (células que expresan EPCAM), mientras que la mayoría de los fibroblastos se encontraban en el grupo 1 (células que expresan ACTA2) y la mayoría de las células inflamatorias se encontraban en el grupo 3 (células que expresan CXCL8) (Fig. 5D). El grupo 1 también parece ser más angiogénico, según la expresión de PECAM1 (Fig. 5D). El enriquecimiento de genes dentro de los grupos de MMP indicó que la mayoría de la división celular se produce en los grupos de células cancerosas 0 y 4, mientras que el grupo de fibroblastos 1 es activo en la remodelación de la MEC y el desarrollo vascular. Finalmente, el grupo 3 muestra un enriquecimiento en la actividad de las células inmunitarias e inflamatorias (Tabla 1), que formó centros inmunitarios/inflamatorios discretos en la lesión (Fig. 5C).

Como se discutió anteriormente, las células cancerosas que expresan MMP7 y otras MMP son potencialmente más propensas a moverse a través de la MEC [^[20]–^[23]]. La MMP7 específica de las células cancerosas se dividió en varios grupos (principalmente los grupos 3 y 4), y el grupo 3 incluyó altos niveles de las MMP mieloides. Estos datos muestran que una subpoblación de células cancerosas con alta expresión de MMP7 reside dentro de una región que también está poblada por células mieloides que expresan MMP. Esta superposición de la expresión de MMP puede predecir un mayor potencial de degradación de la MEC y una mayor movilidad de las células cancerosas a través y, posiblemente, fuera de la lesión primaria.

Se analizó un segundo CRC para evaluar la expresión espacial de las MMP (tumor 2). La sección de tejido del tumor 2, teñida con hematoxilina y eosina (H&E), mostró regiones de músculo liso y criptas de aspecto normal, que también se revelaron en el análisis del transcriptoma (Fig. 6A). Para mantener la coherencia con el tumor 1, estas regiones de tejido no canceroso se excluyeron del análisis. El mapeo de la expresión de las MMP en el tumor 2 mostró un patrón similar al encontrado en el tumor 1, con la expresión de las MMP influenciada, en parte, por la ubicación de los diferentes tipos de células (Fig. 6B). El agrupamiento de las MMP para el tumor 2 se muestra como un mapa de calor en la Fig. 6C y se "representa" en el tejido en la Fig. 6D. Se encontró que las células cancerosas predominaban en los grupos 0 y 1, y el grupo 1 mostró una mayor expresión de MMP7 y una mayor actividad proliferativa (Tabla 2), lo que sugiere que la MMP7 marca células cancerosas más agresivas [^[24]–^[26]]. Al igual que en el tumor 1, el estroma denso formó un grupo distinto con alta expresión de MMP2 (grupo 2), y las MMP9 y MMP12, expresadas por células mieloides, se agruparon en un grupo inmunitario/inflamatorio (grupo 3) (Tabla 2). A pesar de las similitudes con el tumor 1, se observaron dos diferencias en el tumor 2: 1) mientras que la región del estroma del tumor 1 mostró altos niveles de expresión de MMP1, se encontró relativamente poca expresión de MMP1 en la región del estroma del tumor 2, y 2) el tumor 2 mostró un grupo con una extensa superposición de MMP, donde las enzimas de fibroblastos (MMP1, MMP3), células mieloides (MMP9, MMP12) y células cancerosas (MMP7) se localizaron en el mismo lugar (grupo 3). La superposición de la expresión de las MMP en el grupo 3 sugiere un área con un alto potencial de remodelación de la MEC, lo que puede facilitar la dinámica de la MEC y el movimiento celular. Esto puede ser particularmente relevante, ya que las células cancerosas que expresan MMP7 también se encuentran en este grupo y pueden ser más propensas a moverse a través de la MEC.

Expresión variable de MMP1 en los CAF

Una diferencia entre los tumores 1 y 2 fue el nivel de expresión de MMP1 en la región del estroma/fibroblastos. Esto se muestra más claramente en las dos secciones de tumor en la Fig. 7A, donde se observan menos píxeles de fibroblastos positivos para MMP1 en el tumor 2. Para comprender mejor la regulación de MMP1 en los fibroblastos, cuantificamos la expresión de ARN de MMP en ocho líneas de CAF derivadas de ocho pacientes con CRC. Los CAF cultivados expresaron la mayoría de las MMP observadas en el análisis de ARN de una sola célula: MMP1, MMP2, MMP3 y MMP14 (Fig. 7B; Fig. 1C–D). Curiosamente, se detectó la expresión de MMP11 en los datos de scRNA-seq, pero no en los CAF cultivados, lo que sugiere que este subtipo de fibroblastos está subrepresentado en los cultivos (Fig. 1C; Fig. 7B). Entre las MMP expresadas por los CAF, la MMP1 mostró la mayor variabilidad. Los niveles de ARNm de MMP1 en las líneas de CAF se correspondieron estrechamente con los niveles de proteína de MMP1, lo que indica que la regulación de MMP1 es principalmente transcripcional (Fig. 7C). La tinción de inmunofluorescencia para la proteína MMP1 reveló que solo una subpoblación de CAF expresaba MMP1 (Fig. 7D–E). Para las células aisladas de un paciente, la proporción de CAF positivos para MMP1 fue mayor que en los fibroblastos cultivados a partir de tejido normal adyacente, lo que es consistente con los datos de RNA-seq (Fig. 1).

Para determinar si la expresión de MMP1 constituía un fenotipo CAF estable, se sembraron varias líneas de CAF a baja densidad para formar colonias discretas. El análisis de inmunofluorescencia mostró que estas colonias eran positivas o negativas para MMP1. La Fig. 8A muestra dos ejemplos en los que las colonias positivas y negativas para MMP1 estaban en estrecha proximidad. Dado el tamaño de las colonias, estimamos que el fenotipo MMP1 es estable durante al menos 5 divisiones celulares. El número de células que expresaban MMP1 varió entre las líneas de CAF aisladas, oscilando entre el 5 y el 20 % (Fig. 8B). Para determinar si el número de células que expresan MMP1 cambia después de la estimulación, se trataron los cultivos con TNF, LPS o niveles crecientes de suero, seguido de un análisis de la expresión de MMP1. Se encontró que el TNF y las altas concentraciones de suero pudieron aumentar la fracción de células que expresan MMP1 hasta cierto punto, mientras que el LPS no lo hizo (Fig. 8C y 8D). Estos datos muestran que los estímulos pueden aumentar el número de CAF que expresan MMP1, pero que el número de células que se pueden convertir es limitado. En general, estos datos indican que la expresión de MMP1 es un fenotipo de fibroblastos relativamente estable que persiste durante la división celular. Estos fibroblastos pueden constituir el tipo de fibroblastos "mesenquimal" identificado en el análisis de scRNA-seq (Fig. 2C). Estos fibroblastos pueden proliferar dentro del cáncer para generar los grupos de células que expresan MMP1 observados en los datos transcriptómicos espaciales del tumor 1 (Fig. 5A y 7A).

Expresión de MMP en el CRC

Se analizaron los datos de TCGA para identificar las MMP altamente expresadas en el CRC. Este análisis reveló una alta expresión de las MMP 1, 2, 3, 7, 9, 11, 12, 14 y 15 (Fig. 1A). La mayoría de estas MMP se expresan a niveles más altos en las células cancerosas que en los tejidos normales, aunque las MMP 2, 4 y 15 se expresan a niveles relativamente altos en los tejidos normales. Dado que los CRC están poblados por numerosos tipos de células que pueden afectar la progresión de la lesión, determinamos los perfiles de expresión de MMP en los diferentes tipos de células dentro de los tejidos sanos y cancerosos utilizando los datos de scRNA-seq. En los tejidos normales, los datos de scRNA-seq mostraron que los fibroblastos (FB) y las células del músculo liso (SMC) eran los mayores expresores de MMP, siendo la MMP2 la isoforma más expresada (Fig. 1B). En el CRC, muchos más tipos de células expresan MMP; se observan aumentos notables en las células epiteliales y las células mieloides, además de un aumento de la expresión en los FB y las SMC (Fig. 1C). Se muestra una tabla que resume la expresión de MMP por tipo de célula en los tejidos normales y del CRC (Fig. 1D).

Expresión de MMP en los CAF y las SMC

Dado que los CAF y las SMC en los datos de una sola célula del CRC expresan un conjunto similar de MMP, estos dos tipos de células se combinaron y se resolvieron en 8 grupos (Fig. 2A). Las SMC y los CAF poblaron por igual muchos de los grupos, lo que es consistente con el hecho de que estos dos tipos de células expresan MMP similares. Sin embargo, los grupos 3, 4 y 5 estaban compuestos principalmente por CAF. Estos grupos se distinguieron por una alta expresión de MMP1/3, una alta expresión de MMP11 y una alta expresión de MMP1, respectivamente. Para determinar si los patrones de expresión de MMP estaban asociados con diferentes tipos de CAF, se identificaron los genes enriquecidos en los grupos definidos por MMP (Fig. 2B) y se analizaron para determinar el tipo de célula utilizando la base de datos ToppCell Atlas (Fig. 2C). Este análisis devolvió diferentes categorías de células para los diferentes grupos definidos por MMP, incluidos "fibroblasto-pericito", "fibroblasto mesenquimal" y "miofibroblasto" (Fig. 2C). Este análisis es consistente con la idea de que los diferentes tipos de fibroblastos dentro del CRC tienen perfiles de expresión de MMP únicos, lo que probablemente afecta su papel en la regulación de la dinámica de la MEC en el tumor [^[9]].

Expresión de MMP en las células mieloides

Se realizó un análisis de agrupamiento de las MMP asociadas a las células mieloides 9, 12 y 14 en los datos de scRNA-seq, centrándose en tres tipos principales de células mieloides: monocitos, macrófagos y células dendríticas. El grupo más grande (grupo 0) mostró la expresión de las tres MMP preferidas por las células mieloides en los tres tipos de células mieloides (Fig. 3A). Los grupos 1, 2, 3, 5 y 6 mostraron una expresión de MMP relativamente baja y estaban compuestos predominantemente por monocitos (Fig. 3A). Otros dos grupos de interés son el grupo 4, en el que los monocitos y los macrófagos expresan MMP14 casi exclusivamente, y el grupo 7, en el que los macrófagos y las células dendríticas expresan altos niveles de MMP12. Para comprender mejor la base de la expresión de MMP en las células mieloides, se resolvieron las células de alta expresión de las células de baja expresión (Fig. 3B). Se observó una superposición significativa en la expresión de las tres MMP mieloides, lo que es consistente con una regulación subyacente (Fig. 3C). Los genes asociados con la alta expresión de MMP 9, 12 o 14 se analizaron para detectar su enriquecimiento utilizando la base de datos Gene Ontology (GO). Las tres MMP se asociaron con la expresión de genes implicados en la formación de vesículas secretoras y la actividad lisosomal (Fig. 3D). Basado en este análisis, la expresión de MMP en las células mieloides no parece ser altamente específica del tipo de célula, sino que está asociada con una expresión más robusta de los componentes del sistema de endomembranas, incluidas las vesículas secretoras y los lisosomas. En general, esto sugiere que la expresión de MMP en las células mieloides está asociada con un fenotipo más secretor.

Expresión de MMP en las células cancerosas

Los datos de scRNA-seq mostraron que la expresión de MMP es baja en las células epiteliales normales del colon, pero aumenta en el cáncer colorrectal, y la MMP7 muestra una alta expresión en un subconjunto de células cancerosas (Fig. 1C) [^[10], ^[11]]. Como se muestra en la Fig. 4A, la expresión de MMP7 en las células cancerosas varía en varios órdenes de magnitud. Para comprender mejor la naturaleza de las células cancerosas que expresan MMP7, se agruparon las células cancerosas en función de su expresión de MMP. Las células cancerosas que expresan los niveles más altos de MMP7 se encontraron en el grupo 0 (Fig. 4B). Para determinar cómo la expresión de MMP7 se correlaciona con otras características de las células cancerosas, se identificaron los genes enriquecidos en el grupo 0 (Fig. 4C). Los genes más enriquecidos en este grupo fueron MMP1, MMP7 y MMP14. Este hallazgo indica que estas células cancerosas probablemente poseen un alto potencial de degradación de la MEC, lo que posiblemente afecta su malignidad [^[10], ^[11]]. Además, este grupo muestra una expresión enriquecida de los potenciadores de la señalización de Wnt, RSPO2, SPON1 y PTGS2 [^[12]–^[14]], y los genes diana de Wnt MMP17, PTGS2/COX2 y ETV1 [^[15]–^[17]]. Esta observación es consistente con los informes de que la MMP7 es en sí misma un gen diana de Wnt y sugiere que esta subpoblación de células cancerosas tiene una señalización de Wnt elevada [^[10], ^[18], ^[19]].

Expresión espacial de MMP en el CRC

Para determinar cómo las diferentes MMP podrían interactuar dentro de un CRC, analizamos los datos de transcriptómica espacial. Se utilizaron datos de resolución moderada con aproximadamente 20 células por píxel para revelar la superposición de la expresión de MMP. El análisis de los datos de transcriptómica espacial mostró patrones de expresión regional distintos para las MMP individuales (Fig. 5A). Para comprender cómo se superpone la expresión de las MMP dentro de la lesión, se agruparon los píxeles en función de la expresión de MMP (Fig. 5B), y estos grupos se "representaron" en la sección de tejido (Fig. 5C). Los grupos de expresión de MMP se vieron influenciados en parte por los tipos de células presentes en el píxel (Fig. 5C). Los grupos de MMP también generaron un patrón similar al creado por los genes más expresados diferencialmente (Fig. 5C), un hallazgo consistente con la idea de que la expresión de MMP ayuda a establecer subdominios discretos. El análisis de los genes marcadores mostró que la mayoría de las células cancerosas se encontraban en los grupos de MMP 0 y 4 (células que expresan EPCAM), mientras que la mayoría de los fibroblastos se encontraban en el grupo 1 (células que expresan ACTA2) y la mayoría de las células inflamatorias se encontraban en el grupo 3 (células que expresan CXCL8) (Fig. 5D). El grupo 1 también parece ser más angiogénico, según la expresión de PECAM1 (Fig. 5D). El enriquecimiento de genes dentro de los grupos de MMP indicó que la mayoría de la división celular se produce en los grupos de células cancerosas 0 y 4, mientras que el grupo de fibroblastos 1 es activo en la remodelación de la MEC y el desarrollo vascular. Finalmente, el grupo 3 muestra un enriquecimiento en la actividad de las células inmunitarias e inflamatorias (Tabla 1), que formaron centros inmunitarios/inflamatorios discretos en la lesión (Fig. 5C).

Como se discutió anteriormente, las células cancerosas que expresan MMP7 y otras MMP son potencialmente más propensas a moverse a través de la MEC [^[20]–^[23]]. La MMP7 específica de las células cancerosas se dividió en múltiples grupos (principalmente los grupos 3 y 4), y el grupo 3 incluyó altos niveles de las MMP mieloides. Estos datos muestran que una subpoblación de células cancerosas con alta expresión de MMP7 reside dentro de una región que también está poblada por células mieloides que expresan MMP. Esta superposición de la expresión de MMP puede indicar un mayor potencial de degradación de la MEC y una mayor movilidad de las células cancerosas a través de, y posiblemente fuera de, la lesión primaria.

Se analizó un segundo CRC para evaluar la expresión espacial de MMP (tumor 2). La sección de tejido del tumor 2, teñida con hematoxilina y eosina (H&E), mostró regiones de músculo liso y criptas de aspecto normal, que también se revelaron en el análisis del transcriptoma (Fig. 6A). Para mantener la coherencia con el tumor 1, estas regiones de tejido no canceroso se excluyeron del análisis. El mapeo de la expresión de MMP en el tumor 2 mostró un patrón similar al encontrado en el tumor 1, con la expresión de MMP influenciada, en parte, por la ubicación de diferentes tipos de células (Fig. 6B). El agrupamiento de MMP para el tumor 2 se muestra como un mapa de calor en la Fig. 6C y se "representa" en el tejido en la Fig. 6D. Se encontró que las células cancerosas predominaban en los grupos 0 y 1, y el grupo 1 mostró una mayor expresión de MMP7 y una mayor actividad proliferativa (Tabla 2), lo que concuerda con la idea de que MMP7 marca células cancerosas más agresivas [^[24]–^[26]]. Al igual que en el tumor 1, el estroma denso formó un grupo distinto con alta expresión de MMP2 (grupo 2), y las MMP9 y MMP12 expresadas por células mieloides se agruparon en un grupo inmunitario/inflamatorio (grupo 3) (Tabla 2). A pesar de las similitudes con el tumor 1, se observaron dos diferencias en el tumor 2: 1) mientras que la región estromal del tumor 1 mostró altos niveles de expresión de MMP1, se encontró relativamente poca expresión de MMP1 en la región estromal del tumor 2, y 2) el tumor 2 mostró un grupo con una extensa superposición de MMP, donde las enzimas de fibroblastos (MMP1, MMP3), mieloides (MMP9, MMP12) y células cancerosas (MMP7) se localizaron en el mismo lugar (grupo 3). La superposición de la expresión de MMP en el grupo 3 sugiere un área con un alto potencial de remodelación de la MEC, lo que puede facilitar la dinámica de la MEC y el movimiento celular. Esto puede ser particularmente relevante, ya que las células cancerosas que expresan MMP7 también se encuentran en este grupo y pueden ser más propensas a moverse a través de la MEC.

Expresión variable de MMP1 en los CAF

Una diferencia entre los tumores 1 y 2 fue el nivel de expresión de MMP1 en la región estromal/fibroblástica. Esto se muestra más claramente en las dos secciones de tumor en la Fig. 7A, donde se observan menos píxeles de fibroblastos positivos para MMP1 en el tumor 2. Para comprender mejor la regulación de MMP1 en los fibroblastos, cuantificamos la expresión de ARN de MMP en ocho líneas de CAF derivadas de ocho pacientes con CRC. Los CAF cultivados expresaron la mayoría de las MMP observadas en el análisis de ARN de una sola célula: MMP1, MMP2, MMP3 y MMP14 (Fig. 7B; Fig. 1C–D). Curiosamente, se detectó la expresión de MMP11 en los datos de secuenciación de ARN de una sola célula, pero no en los CAF cultivados, lo que sugiere que este subtipo de fibroblastos está poco representado en los cultivos (Fig. 1C; Fig. 7B). Entre las MMP expresadas por los CAF, MMP1 mostró la mayor variabilidad. Los niveles de ARNm de MMP1 en las líneas de CAF se correspondieron estrechamente con los niveles de proteína MMP1, lo que indica que la regulación de MMP1 es principalmente transcripcional (Fig. 7C). La tinción de inmunofluorescencia para la proteína MMP1 reveló que solo una subpoblación de CAF expresaba MMP1 (Fig. 7D–E). Para las células aisladas de un paciente, la proporción de CAF positivos para MMP1 fue mayor que en los fibroblastos cultivados a partir de tejido normal adyacente, lo que concuerda con los datos de secuenciación de ARN (Fig. 1).

Para determinar si la expresión de MMP1 constituía un fenotipo CAF estable, se sembraron varias líneas de CAF a baja densidad para formar colonias discretas. El análisis de inmunofluorescencia mostró que estas colonias eran positivas o negativas para MMP1. La Fig. 8A muestra dos ejemplos en los que las colonias positivas y negativas para MMP1 estaban en estrecha proximidad. Dado el tamaño de las colonias, estimamos que el fenotipo MMP1 es estable durante al menos 5 divisiones celulares. El número de células que expresaban MMP1 varió entre las líneas de CAF aisladas, oscilando entre el 5 y el 20% (Fig. 8B). Para determinar si el número de células que expresan MMP1 cambia después de la estimulación, se trataron los cultivos con TNF, LPS o niveles crecientes de suero, seguido de un análisis de la expresión de MMP1. El TNF y las altas concentraciones de suero pudieron aumentar la fracción de células que expresan MMP1 hasta cierto punto, mientras que el LPS no lo hizo (Fig. 8C y 8D). Estos datos muestran que los estímulos pueden aumentar el número de CAF que expresan MMP1, pero que el número de células que se pueden convertir es limitado. En general, estos datos indican que la expresión de MMP1 es un fenotipo fibroblástico relativamente estable que persiste durante la división celular. Estos fibroblastos pueden constituir el tipo de fibroblasto "mesenquimal" identificado en el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (Fig. 2C). Estos fibroblastos pueden proliferar dentro del cáncer para generar los grupos de células que expresan MMP1 observados en los datos transcriptómicos espaciales del tumor 1 (Fig. 5A y 7A).

Discusión

Aquí, proporcionamos un análisis exhaustivo de la expresión específica de cada tipo de célula de las MMP en el CRC. Se observaron distintos patrones de expresión de MMP en diferentes tipos de células, y aunque las células individuales pueden expresar MMP fuera de sus perfiles primarios, se observaron preferencias evidentes. Dentro de cada categoría celular principal, se descubrieron capas adicionales de especificidad, relacionadas con el subtipo celular, el estado de activación o una combinación de ambos. Aunque muchas de nuestras observaciones se han informado previamente para tipos de células individuales, nuestro análisis sirve para integrar esta información y, al mismo tiempo, proporciona un análisis de los patrones de expresión espacial en el CRC.

Los CAF son altos expresores de MMP en el CRC y se pueden resolver en múltiples grupos basados en MMP. El análisis de estos grupos sugiere que diferentes subtipos de fibroblastos expresan distintas combinaciones de MMP. Esta observación se alinea con los hallazgos previos de que los CRC contienen múltiples tipos de CAF, incluidos los fibroblastos residentes, los fibroblastos derivados de células madre mesenquimales infiltrantes y las células cancerosas que han sufrido una transición epitelio-mesenquimal [^[9], ^[27], ^[28]]. La forma precisa en que los grupos basados en MMP identificados aquí se relacionan con los subtipos de CAF descritos por otros requerirá un análisis más detallado. En contraste con los fibroblastos, todos los tipos de células mieloides expresan el mismo conjunto de MMP: MMP9, MMP12 y MMP14, aunque los monocitos tienden a expresar niveles más bajos que los macrófagos y las células dendríticas. Los niveles de expresión de MMP en las células mieloides se correlacionan con la expresión de genes relacionados con la producción de vesículas secretoras, que es la vía a través de la cual se secretan las MMP. En este sentido, el perfil de expresión de MMP de las células mieloides parece estar relacionado con la actividad secretora de una célula en lugar de su tipo o subtipo (aparte de la expresión menos frecuente en los monocitos). El análisis de los datos espaciales muestra que las células mieloides que expresan MMP forman centros inmunitarios/inflamatorios dentro del CRC, lo que probablemente facilita su señalización cruzada [^[29], ^[30]].

La MMP que se expresa de manera más característica en las células cancerosas es la MMP7, una matrilisina con un amplio espectro de sustratos. El nivel de expresión de MMP7 en las células cancerosas varía en varios órdenes de magnitud, y la expresión se detecta en aproximadamente un tercio de todas las células cancerosas. Curiosamente, un subconjunto de células cancerosas que expresan altos niveles de MMP7 también expresa altos niveles de MMP1 y MMP14. Estas células cancerosas "triplemente positivas para MMP" podrían ser más propensas a atravesar la MEC. Aunque no está del todo claro cómo se está regulando la expresión de estas MMP, se ha informado previamente que la MMP7 es un objetivo de la vía de señalización de Wnt [^[31]–^[33]]. En concordancia con esta posibilidad, tres potenciadores de la señalización de Wnt, RSPO2, SPON1 y PTGS2/COX2, también se expresan en el grupo de alta expresión de MMP7, junto con los genes regulados por Wnt MMP17, PTPRU, PTGS2/COX2 y ETV1 [^[12], ^[34]–^[39]]. Las señales que regulan este conjunto de genes pueden ser un determinante central del potencial metastásico.

El análisis de los datos transcriptómicos espaciales del CRC mostró grupos de MMP consistentes con la expresión específica de cada tipo de célula derivada del análisis de secuenciación de ARN de una sola célula. Las MMP expresadas principalmente por las células cancerosas se localizaron en regiones de alta densidad de células cancerosas, mientras que las MMP derivadas de los fibroblastos se enriquecieron en áreas del estroma. Las MMP expresadas por las células mieloides se agruparon en regiones caracterizadas por la expresión de genes inmunitarios e inflamatorios. El agrupamiento computacional basado en la expresión de MMP produjo subregiones dentro de los tumores que se superpusieron con regiones definidas por la expresión diferencial de genes y el tipo de célula. Este hallazgo apoya la idea de que la actividad de la MMP contribuye al establecimiento y mantenimiento de los subdominios tumorales. Nuestros hallazgos muestran que las MMP expresadas por los fibroblastos/estroma se elevan en regiones de angiogénesis activa, lo que sugiere que esta combinación o "cóctel" de MMP puede facilitar la formación de nuevos vasos [^[40]]. De manera similar, el enriquecimiento espacial de las MMP mieloides puede desempeñar un papel en el establecimiento de centros inmunitarios e inflamatorios dentro del tumor [^[30]].

La comparación de los patrones de expresión espacial de MMP de dos tumores reveló patrones de agrupamiento similares, con algunas diferencias clave. Una diferencia notable fue el grado de superposición de MMP dentro del tumor. Dado que las MMP son activas sobre diferentes sustratos de la MEC, la superposición de la expresión de MMP dentro de un tumor es probablemente relevante para la progresión de la lesión. Aunque solo se analizaron dos tumores espacialmente, se observaron diferentes grados de superposición de MMP. El análisis de tumores adicionales sería necesario para comprender la relación entre la superposición espacial de la expresión de MMP y las características clínicas de un CRC, pero nuestros datos indican que este análisis podría ser esclarecedor. Otra diferencia notable observada fue el nivel de expresión de MMP1 dentro de las regiones ricas en fibroblastos del estroma. Nuestro análisis espacial señaló grandes diferencias en el número de CAF que expresan MMP1 en los dos tumores analizados. El análisis de los CAF cultivados a partir de pacientes también mostró una amplia gama de expresión de MMP1. Considerando tanto los datos de secuenciación de ARN de una sola célula como la expresión clonal de MMP1 en los fibroblastos cancerosos cultivados, los CAF que expresan MMP1 parecen ser un tipo de célula que se integra y prolifera dentro del tumor. No está claro cómo las diferencias en la expresión de MMP fibroblástica/estromal afectan la progresión tumoral y requerirá el análisis de cánceres adicionales con resultados clínicos conocidos.

Existen varias limitaciones en nuestros estudios, siendo la más evidente que se limitan al análisis de la expresión de ARN. Esta limitación es particularmente importante para las MMP, ya que pueden estar reguladas a múltiples niveles, incluyendo la secreción, la activación de la zimógeno y la inhibición por las TIMP. No obstante, nuestros hallazgos tienen implicaciones para la comprensión de la progresión tumoral y para posibles estrategias terapéuticas. Aunque los inhibidores de las MMP mostraron ser prometedores en estudios preclínicos, la mayoría han fracasado en ensayos clínicos debido a una toxicidad excesiva y una eficacia limitada [^[41]]. Los inhibidores de amplio espectro, como el batimastat y el marimastat, causaron una toxicidad musculoesquelética significativa, mientras que agentes más selectivos como el DX-2400 (dirigido a la MMP-14) generaron preocupaciones porque la MMP14 se expresa tanto en tejidos tumorales como normales [^[42]]. Identificar qué MMP están selectivamente enriquecidas en los tumores puede ayudar a refinar el enfoque terapéutico. Nuestro análisis indica que las MMP 1, 3, 7 y 11 están enriquecidas en el cáncer, mientras que las MMP2, MMP14 y MMP15 no lo están. Comprender la distribución espacial de las MMP también puede ayudar en el desarrollo de inhibidores selectivos que minimicen los efectos fuera del objetivo. Por ejemplo, dirigir las MMP expresadas en las regiones angiogénicas puede sinergizar con los inhibidores del VEGF, como el bevacizumab, para suprimir más eficazmente la neovascularización. Más allá de la inhibición, también se ha propuesto la expresión de MMP como un medio de orientación terapéutica, ya sea a través de la liberación localizada de fármacos o de estrategias basadas en anticuerpos. Se ha demostrado que las nanopartículas que pueden ser degradadas por la MMP2 entregan con éxito fármacos como el SN38 y la doxorrubicina en modelos de CRC [^[43]–^[46]]. Nuestros hallazgos sugieren que la MMP7 podría utilizarse para la administración dirigida directamente adyacente a las células cancerosas agresivas. Nuestro análisis también destaca qué MMP podrían no ser útiles para dirigir. Por ejemplo, la MMP12, que se expresa principalmente en las células mieloides asociadas al cáncer, se ha relacionado con la supresión tumoral [^[47]]. Esta MMP puede ser importante para la función de las células dendríticas. En general, nuestros hallazgos demuestran que todavía hay mucho por aprender sobre el papel y la distribución de las enzimas MMP en el CRC. Esta información podría facilitar una mejora en el pronóstico y, potencialmente, nuevos enfoques de orientación terapéutica.

Métodos

Adquisición y procesamiento de datos

Los datos de RNA-seq a granel para la identificación de MMP se obtuvieron del cohorte TCGACOAD STAR. Los datos de RNA-seq de una sola célula se recuperaron de GEO (GSE132465), y los conjuntos de datos de transcriptómica espacial se obtuvieron de 10X Genomics (CytAssist11mmFFPEHumanColorectalCancer, Tumor 1; VisiumHDHumanColon_Cancer, Tumor 2). Todos los análisis se realizaron en R. Los recuentos de RNA-seq a granel del cohorte TCGACOAD se normalizaron utilizando DESeq2, y la expresión diferencial de MMP entre los tejidos cancerosos y normales se visualizó con ggplot2. Las MMP altamente expresadas se examinaron más a fondo en los conjuntos de datos de una sola célula y espacial. Los datos de una sola célula se procesaron como objetos Seurat utilizando SCTransform, con la anotación de tipo celular mediante SingleR utilizando el conjunto de datos HumanPrimaryCellAtlas (restringido a tipos relevantes para el CRC) como referencia. Los datos se dividieron en compartimentos epiteliales, mieloides y de fibroblastos/músculo liso. El agrupamiento siguió las pautas establecidas por el Tutorial de Agrupamiento Guiado del Laboratorio Satija, utilizando las funciones RunPCA, FindNeighbors y FindClusters de Seurat. El agrupamiento se llevó a cabo basándose tanto en los genes variables como en los genes MMP seleccionados. Los enfoques de vecino más cercano y de vecino más cercano compartido en múltiples resoluciones proporcionaron perspectivas de agrupamiento complementarias.

Procesamiento de datos espaciales

Los datos de transcriptómica espacial de los dos cánceres de colon se capturaron a diferentes resoluciones. Para que los conjuntos de datos sean comparables en número de píxeles y lecturas por píxel, los bins de 8 μm × 8 μm del tumor 2 se agregaron en bins de 56 μm × 56 μm. Ambos tumores se procesaron como objetos Seurat y se agruparon utilizando enfoques basados en genes variables y MMP. Para la asignación de tipo celular a nivel de píxel, se utilizó SingleR con la misma referencia que los datos de una sola célula. Los píxeles asociados a fibroblastos y músculo liso se dividieron aún más para análisis más específicos.

Visualización y análisis posteriores

Los gráficos de puntos, los mapas de calor, los gráficos de violín y los gráficos de barras se generaron con ggplot2. Las células se clasificaron como positivas o negativas para un gen en función de la expresión mediana de todas las células que expresan el gen. SpatialFeaturePlot y SpatialDimPlot se utilizaron para visualizar la expresión espacial de MMP y el agrupamiento. Se creó un mapa de calor de expresión génica adicional con ComplexHeatmap. Los genes definitorios del grupo se identificaron utilizando la función FindAllMarkers de Seurat. Los 500 principales marcadores positivos de cada grupo se analizaron con PANTHER Gene Ontology para el Proceso Biológico. El enriquecimiento, la probabilidad y los procesos representativos se resumieron en tablas generadas con gt.

Aislamiento y cultivo de fibroblastos

Los especímenes de tejido colorrectal se obtuvieron del UConn Health/Waterbury Hospital. Todas las muestras y los datos clínicos asociados se recopilaron de pacientes que dieron su consentimiento y se sometieron a una resección de colon, y se anonimizaron de acuerdo con los protocolos institucionales y las pautas éticas establecidas. Los tejidos se lavaron con solución salina tamponada con Hanks 1x e incubaron con 25 mM de etilendiaminotetraacético (EDTA) durante 1 hora a 4 °C. La capa de células epiteliales se eliminó mediante múltiples rondas de vortex. Los tejidos restantes se incubaron con solución de colagenasa (1 mg/ml de colagenasa, 1 mg/ml de dispasa y 10 μg/ml de DNasa I) durante 90 minutos a 37 °C. Los tejidos digeridos se filtraron (70 mm), se centrifugaron a 300 g durante 5 minutos y se lavaron con medio Dulbecco modificado Eagle (DMEM) suplementado con 10 % de suero fetal bovino (SFB), 2 mM de L-glutamina y 1x de solución Penn/Strep (Gibco). Las células resuspendidas se cultivaron en DMEM completo y se congelaron en alícuotas con medio completo más 10 % de dimetilsulfóxido (DMSO). Para el crecimiento y el análisis, las alícuotas de células congeladas se descongelaron y se mantuvieron en medio de crecimiento de fibroblastos Lonza (FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit) a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2. Las células se subcultivaron hasta siete pasajes y se controlaron los cambios en la morfología.

Tratamientos y análisis de fibroblastos

Para evaluar la expresión de MMP1 en respuesta a los estímulos, las células se cultivaron en portaobjetos, se privaron de suero durante la noche y luego se trataron con 10 ng/mL de TNFα (Thermo Fisher Scientific), 1 μg/mL de LPS-EB (InvivoGen) o niveles graduados de suero durante 20 horas. Para evaluar las diferencias en la expresión de MMP1 entre las colonias de fibroblastos, las células se sembraron en portaobjetos en placas de 24 pocillos a una densidad de 120 células por pocillo, con la adición de medio acondicionado recogido de la placa de células anterior (25 % v/v). Las células se incubaron durante 9 días, reponiendo el medio según sea necesario. Para el análisis de RNA-seq, el ARN se aisló utilizando el kit de extracción RNeasy (Qiagen), según las instrucciones del fabricante. La evaluación de la calidad del ARN se realizó en el centro de innovación genómica (CGI) de la Universidad de Connecticut. La preparación de la biblioteca y la secuenciación de RNA a granel se realizaron en Azenta Life Sciences en una plataforma Illumina NovaSeq 6000, generando lecturas apareadas de 150 pb con una profundidad objetivo de ~30x. Los datos se normalizaron y analizaron utilizando DESeq2 (R/Bioconductor) para cuantificar los cambios en la expresión génica. Para los experimentos de tinción por inmunofluorescencia, las células se fijaron en 3 % de paraformaldehído, se permeabilizaron con 0,3 % de Triton X-100 en tampón fosfato salino de Dulbecco (DPBS) y se bloquearon en 5 % de suero de cabra (Jackson ImmunoResearch) en DPBS. Luego, las células se tiñeron para la expresión de MMP1 utilizando el anticuerpo GeneTex MMP1 GTX100534 y los anticuerpos secundarios apropiados (Thermo Fisher Scientific, Jackson ImmunoResearch). Los núcleos se visualizaron utilizando el tinte de ADN DAPI (Thermo Fisher Scientific). Las imágenes fluorescentes se adquirieron con un microscopio confocal de escaneo láser Nikon A1R (Nikon Instruments, Japón) y se analizaron utilizando el software Fiji /ImageJ. Se utilizó una prueba exacta de Fisher de dos colas (GraphPad Prism) para comparar las células MMP1-positivas entre los fibroblastos normales y los CAF; se consideró significativo un valor de p < 0,05. Los datos se presentaron como porcentajes. Los niveles de proteína MMP1 secretada se cuantificaron mediante Western blot utilizando geles prefabricados Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad), el anticuerpo primario GeneTex MMP1 y el anticuerpo secundario IRDye® 680RD. Las bandas se visualizaron en un sistema de imágenes LiCor Odyssey® CLx.

Se obtuvieron muestras de tejido colorrectal del UConn Health/Waterbury Hospital. Todas las muestras y los datos clínicos asociados se recopilaron de pacientes que dieron su consentimiento y se sometieron a una resección de colon, y se anonimizaron de acuerdo con los protocolos institucionales y las directrices éticas establecidas. Los tejidos se lavaron con solución salina tamponada de Hanks 1x e se incubaron con 25 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) durante 1 hora a 4 °C. La capa de células epiteliales se eliminó mediante varias rondas de vortex. Los tejidos restantes se incubaron con solución de colagenasa (1 mg/ml de colagenasa, 1 mg/ml de dispasa y 10 μg/ml de DNasa I) durante 90 minutos a 37 °C. Los tejidos digeridos se filtraron (70 mm), se centrifugaron a 300 g durante 5 minutos y se lavaron con medio Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina y solución 1x Penn/Strep (Gibco). Las células resuspendidas se cultivaron en DMEM completo y se congelaron en alícuotas con medio completo más 10 % de dimetilsulfóxido (DMSO). Para el crecimiento y el análisis, las alícuotas de células congeladas se descongelaron y se mantuvieron en medio de crecimiento de fibroblastos Lonza (FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit) a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2. Las células se subcultivaron hasta un máximo de siete pasajes y se controlaron los cambios en la morfología.

Tratamientos y análisis de fibroblastos

Para evaluar la expresión de MMP1 en respuesta a los estímulos, las células se cultivaron en portaobjetos, se privaron de suero durante la noche y luego se trataron con 10 ng/ml de TNFα (Thermo Fisher Scientific), 1 μg/ml de LPS-EB (InvivoGen) o niveles graduados de suero durante 20 horas. Para evaluar las diferencias en la expresión de MMP1 entre las colonias de fibroblastos, las células se sembraron en portaobjetos en placas de 24 pocillos a una densidad de 120 células por pocillo, con la adición de medio acondicionado recogido de la placa anterior de las células (25 % v/v). Las células se incubaron durante 9 días, reponiendo el medio según sea necesario. Para el análisis de RNA-seq, el ARN se aisló utilizando el kit de extracción RNeasy (Qiagen), según las instrucciones del fabricante. La evaluación de la calidad del ARN se realizó en el centro de investigación genómica (CGI) de la Universidad de Connecticut. La preparación de la biblioteca y la secuenciación masiva de ARN se realizaron por Azenta Life Sciences en una plataforma Illumina NovaSeq 6000, generando lecturas de 150 pares de bases con una profundidad objetivo de ~30x. Los datos se normalizaron y analizaron utilizando DESeq2 (R/Bioconductor) para cuantificar los cambios en la expresión génica. Para los experimentos de tinción de inmunofluorescencia, las células se fijaron en 3 % de paraformaldehído, se permeabilizaron con 0,3 % de Triton X-100 en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) y se bloquearon en 5 % de suero de cabra (Jackson ImmunoResearch) en DPBS. Luego, las células se tiñeron para la expresión de MMP1 utilizando el anticuerpo GeneTex MMP1 GTX100534 y los anticuerpos secundarios apropiados (Thermo Fisher Scientific, Jackson ImmunoResearch). Los núcleos se visualizaron utilizando el colorante de ADN DAPI (Thermo Fisher Scientific). Las imágenes fluorescentes se adquirieron con un microscopio confocal de escaneo láser Nikon A1R (Nikon Instruments, Japón) y se analizaron utilizando el software Fiji/ImageJ. Se utilizó una prueba exacta de Fisher de dos colas (GraphPad Prism) para comparar las células MMP1-positivas entre los fibroblastos normales y los CAF; se consideró significativo un valor de p < 0,05. Los datos se presentaron como porcentajes. Los niveles de proteína MMP1 secretada se cuantificaron mediante Western blot utilizando geles prefabricados Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad), el anticuerpo primario GeneTex MMP1 y el anticuerpo secundario IRDye® 680RD. Las bandas se visualizaron en un sistema de imágenes LiCor Odyssey® CLx.