La caquexia asociada al cáncer colorrectal (CCR) induce disfunción del músculo esquelético, lo que afecta la calidad de vida y empeora el pronóstico del cáncer. Se han desarrollado múltiples modelos preclínicos, incluido el modelo de ratón ampliamente utilizado con inoculación subcutánea de la línea celular de carcinoma colorrectal C26, para estudiar los mecanismos biológicos de la caquexia del CCR y dilucidar posibles nuevos tratamientos. Se ha propuesto que una línea celular distinta del mismo origen, es decir, CT26, es relativamente no caquectizante.
Sin embargo, los estudios que evalúan el potencial relativo de las células C26 y CT26 para inducir la caquexia del cáncer en paralelo han sido limitados. Tampoco se han dilucidado por completo las diferencias en los mecanismos biológicos por los que C26 y CT26 afectan la masa y la función del músculo esquelético. En el presente estudio, investigamos la capacidad diferencial de C26 y CT26 para inducir la caquexia del cáncer utilizando tanto un cocultivo in vitro de células cancerosas y musculares como un modelo de ratón sinérgico in vivo.
Nuestros resultados muestran que tanto las células C26 como las CT26 indujeron una atrofia significativa de los miotubos C2C12 del músculo esquelético murino. En el modelo de ratón, si bien tanto C26 como CT26 redujeron la masa del músculo esquelético y la masa grasa, solo los tumores C26 provocaron pérdida de peso corporal y alteración de la fuerza del músculo esquelético.
Además, demostramos que los ratones con tumores C26 presentan una mayor inflamación muscular que los ratones con tumores CT26.
Además, los ratones con tumores C26 y CT26 mostraron una regulación diferencial de las respuestas inmunitarias innatas y el recambio de proteínas musculares. En general, nuestros datos sugieren que, aunque tanto las células C26 como las CT26 exhiben efectos caquectizantes, las células C26 inducen una mayor pérdida de peso corporal, masa grasa, masa muscular esquelética y función física al promover la inflamación crónica y desregular el equilibrio de proteínas del músculo esquelético.
La caquexia cancerosa es un síndrome multifactorial caracterizado por una pérdida progresiva de peso corporal, masa muscular esquelética, tejido adiposo y función física ([1]). Como la segunda causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer, se prevé que el cáncer colorrectal (CCR) afecte a más de 150.000 personas en los Estados Unidos en 2026, con una creciente incidencia en adultos menores de 50 años ([2]). Más del 30% de los pacientes con CCR desarrollan caquexia cancerosa, que está estrechamente asociada con la morbilidad y la mortalidad del cáncer ([3]–[5]). Durante la progresión del CCR, la pérdida de masa muscular esquelética es un predictor independiente de una respuesta menos favorable a los tratamientos contra el cáncer y un peor pronóstico del CCR ([6], [7]). Sin embargo, a pesar de la investigación activa sobre las intervenciones anticacquéxicas, las estrategias médicas para aliviar la caquexia cancerosa en pacientes con CCR son actualmente limitadas ([8]).
Se han desarrollado múltiples modelos preclínicos para investigar los mecanismos biológicos de la caquexia del CCR y descubrir posibles nuevas intervenciones anticacquéxicas. Uno de los modelos preclínicos de caquexia más prevalentes es el inducido por las células de carcinoma colorrectal C-26 ([9], [10]). Establecida inicialmente por Corbett y colaboradores en 1975, la línea celular C26 se derivó originalmente de ratones BALB/c hembra a los que se administró el carcinógeno del colon N-nitroso-N-metilureano (NMU) ([11]). Se identificó que los tumores C26 eran un carcinoma colorrectal indiferenciado que presentaba una alta tumorigenicidad ([11], [12]). La investigación posterior exhaustiva ha demostrado que los factores derivados del tumor secretados por las células C26 provocan una profunda pérdida muscular en los cultivos terminalmente diferenciados de la línea celular de músculo esquelético murino C2C12 ([13], [14]). Las células C26 también se han utilizado ampliamente en modelos animales, y varios estudios han demostrado que la inyección subcutánea, intravenosa o intramuscular induce el crecimiento tumoral y la caquexia cancerosa tanto en ratones BALB/c como en CD2F1 ([10], [15]–[20]). La investigación inicial sobre la tumorigenicidad mostró que la inyección de una dosis de 1 × 105 de células C26 condujo a una inducción tumoral del 100% en dos semanas después de la inoculación ([12]). Los ratones que portan tumores C26 presentan una disminución del peso corporal, la masa muscular esquelética y la masa de tejido adiposo, así como hipoglucemia y disfunción hepática ([10], [21]). Mecánicamente, la caquexia en ratones con tumores C26 se ha asociado con un aumento de la inflamación muscular, una alteración del anabolismo/un aumento del catabolismo, una alteración de la integridad de la membrana y una alteración de la función mitocondrial ([18], [22]–[25]).
Otra línea celular de CCR del mismo origen, denominada CT26, se ha estudiado relativamente menos. La línea celular CT26 también se derivó originalmente de un tumor de colon inducido por NMU en ratones BALB/c, pero no hay registros que indiquen cuándo y cómo la línea celular CT26 divergió de las células C26, y algunos estudios incluso utilizan los términos C26 y CT26 indistintamente ([26]). La investigación reciente sobre la inmunogenicidad tumoral de ratones que portan carcinomas C26 frente a CT26 demuestra diferencias distintas en las mutaciones genéticas y la infiltración inmune tumoral de las dos líneas celulares. Si bien ambas líneas celulares tienen la mutación KrasG12D, el perfil genómico demuestra que las células CT26 poseen mutaciones únicas en oncogenes (por ejemplo, Birc5 y Mki67) y supresores tumorales (por ejemplo, Cdkn2a) que no se observan en las células C26 ([27], [28]). Por otro lado, las células C26 tienen un nivel más alto de actividad de señalización de Wnt que las células CT26 ([29]). Además, los estudios in vivo han demostrado que, si bien los tejidos tumorales CT26 están infiltrados por más células T citotóxicas, células dendríticas y células asesinas naturales (NK), los tumores C26 presentan una menor infiltración de células T y una mayor resistencia a la terapia anti-PD1 ([29]).
Varios estudios han informado sobre la pérdida de peso corporal y el desgaste muscular en ratones con tumores CT26 ([30]–[33]). Sin embargo, otros grupos han propuesto que las células CT26 podrían ser relativamente incapaces de inducir la caquexia cancerosa ([34]–[36]). Las observaciones inconsistentes de los investigadores que emplean el modelo CT26 podrían atribuirse quizás a las diferencias en las fuentes de CT26 y las características fisiológicas de los huéspedes. Además, la progresión tumoral y la eficacia para inducir la caquexia podrían verse afectadas potencialmente por el sitio de inoculación del tumor ([37], [38]). Sin embargo, la investigación que compare directamente las células C26 y CT26 en paralelo para su potencial de inducir la caquexia cancerosa y las posibles diferencias en los mecanismos biológicos ha sido limitada hasta la fecha ([34], [36]).
Cabe mencionar que la mayoría de los estudios de inoculación previos con C26 o CT26 se realizaron en ratones jóvenes de 6 a 8 semanas ([39], [40]). A esta edad, los ratones aún pueden experimentar un aumento del tamaño de las fibras musculares esqueléticas y un aumento del peso corporal ([41], [42]). Si bien la investigación previa ha demostrado que C26 induce con éxito la caquexia cancerosa tanto en ratones jóvenes en desarrollo (8 semanas) como en ratones adultos de mediana edad (12 meses), se observaron diferentes impactos en el tamaño de las fibras y las vías de proteólisis entre los grupos de edad ([43]). En particular, la edad promedio de inicio del CCR en las poblaciones humanas es superior a los 50 años, con un aumento del CCR de inicio temprano (35 a 49 años) ([44]). Por lo tanto, los modelos de caquexia que utilizan ratones jóvenes de 6 a 8 semanas podrían no representar completamente las características fisiológicas de los adultos que desarrollan caquexia cancerosa del CCR. Por lo tanto, podría ser significativo investigar cómo la caquexia del CCR influye en los músculos esqueléticos en ratones adultos mayores que representan mejor la edad promedio de inicio del cáncer colorrectal en la población humana ([45], [46]).
En el estudio actual, nuestro objetivo fue investigar los diferentes impactos de las células de carcinoma colorrectal C26 y CT26 en la fisiología del músculo esquelético, así como los mecanismos biológicos subyacentes. Para examinar las posibles diferencias entre los modelos in vitro e in vivo de caquexia cancerosa, utilizamos tanto un modelo de cocultivo de células cancerosas y musculares como un modelo de ratón de inoculación subcutánea de tumores. Si bien tanto las células C26 como las CT26 indujeron una atrofia comparable en los miotubos C2C12 in vitro, la inoculación de células C26 resultó en una disminución relativamente mayor de la masa muscular esquelética y la fuerza en los ratones BALB/c. La inmunohistoquímica y el análisis molecular revelaron que los ratones con tumores C26 exhibieron una mayor inflamación del músculo esquelético asociada con una sobreexpresión de la enzima proinflamatoria 5-lipooxigenasa (5-LOX) y una marcada disminución de la enzima antiinflamatoria/proresolutiva 12/15-lipooxigenasa (12/15-LOX). Los tumores C26 y CT26 también mostraron una regulación diferencial de las vías de síntesis y degradación de proteínas musculares.
METODOLOGÍA
Cultivo celular:
La línea celular de músculo esquelético murino C2C12 (ATCC, CRL-1772) y dos líneas celulares de carcinoma colorrectal, incluidas C26 (un regalo del Dr. Keehong Kim de la Universidad de Purdue) y CT26 (ATCC, CRL-2638), se cultivaron por separado en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco, 11995–065) que contenía 10% de suero fetal bovino (SFB, Corning, 35-010-CV) y antibióticos (penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 μg/mL, Gibco, 15140–122) a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2.
Modelo de cocultivo:
Cuando se alcanzó una confluencia del 70%, las células C2C12 se pasaron y sembraron en una placa de cocultivo de 24 pocillos (Corning, 353504) en medio de crecimiento a una densidad celular de 2,5 × 104/cm2 y se les permitió proliferar. Cuatro días después de la siembra, se indujo a los mioblastos C2C12 para que formaran miotubos en medio de diferenciación (DM), DMEM que contiene 2% de suero de caballo (SF, Gibco 26050088) y antibióticos según lo descrito anteriormente. Las células C26 y CT26 se sembraron en DM en los compartimentos superiores de los insertos de la placa de cocultivo (Corning, 353095) a una baja densidad (4,17 × 104/cm2), una densidad moderada (8,3 × 104/cm2) o una alta densidad (1,67 × 105/cm2). Además, se sembraron 8,3 × 104/cm2 de células C2C12 en los insertos como control para el experimento de cocultivo. 72 horas después de que se indujera a las células C2C12 para que se diferenciaran, los insertos de cocultivo superiores se movieron a los compartimentos inferiores de las placas base. Se agregó DM fresco a los miotubos C2C12 en las placas base y a todas las células en los insertos cuando se establecieron los cocultivos. Los miotubos C2C12 se cocultivaron con C2C12 de control, C26 o CT26 durante 72 horas antes de la fijación y la inmunocitoquímica según lo descrito a continuación.
Ratones e inoculación de tumores:
Se obtuvieron ratones BALB/c hembra de 10 meses de Charles River Laboratories y se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos con acceso ad libitum a alimentos y agua. Después de una semana de aclimatación, los ratones se asignaron aleatoriamente a tres grupos con pesos corporales iniciales equilibrados. Antes de la inoculación del tumor, se cosecharon por separado las células C26 y CT26 y se resuspendieron en solución salina estéril. Dos grupos de ratones fueron inoculados con células C26 (5 × 105 células/100 μL de solución salina por ratón, n=6) o células CT26 (5 × 105 células/100 μL de solución salina por ratón, n=7) por vía subcutánea en el flanco superior derecho. Los ratones de control sanos (n=6) de la misma edad y sexo fueron inyectados con solución salina estéril (100 μL/ratón). La condición del ratón y el peso corporal se controlaron al menos tres veces por semana, y las dimensiones del tumor (longitud y anchura) se midieron con un calibrador cada dos días a partir del día 5 después de la inoculación. El estudio con animales fue aprobado por el protocolo IACU de la Universidad de Purdue #2205002271.
Medición de la composición corporal:
Un día antes de la eutanasia, se escaneó la composición corporal de todos los ratones mediante análisis basado en resonancia magnética (EchoMRI 3-en-1). Los ratones no anestesiados se colocaron individualmente en un cilindro de plástico, que luego se insertó en el escáner para medir la grasa corporal, la masa magra, la masa de agua libre y la masa total de agua.
Prueba de fuerza muscular:
Un día antes de la eutanasia, los ratones se anestesiaron con 2% de isoflurano y se colocaron en una plataforma calentada a 37 °C. La función del grupo muscular flexor plantar del tobillo, que incluye los músculos gastrocnemio (GAST), plantaris (PLA) y sóleo (SOL), se evaluó mediante el ensayo in vivo no invasivo (Sistema integral para ratones 1300A 3-en-1, Aurora Scientific). La articulación de la rodilla de la pata derecha se inmovilizó con la pinza de rodilla y la pata se fijó a la peana. Los electrodos se colocaron superficialmente debajo de la piel que recubre el GAST, y el músculo se estimuló después de ajustar la corriente óptima para medir el par isométrico máximo. Para obtener la relación fuerza-frecuencia, el músculo se estimuló luego a frecuencias crecientes (10, 25, 50, 80, 100, 150, 250 y 300 Hz) con un descanso de 1 minuto entre dos estimulaciones. Se permitió que los ratones se recuperaran durante la noche después de la prueba in vivo. El día de la eutanasia, se anestesiaron los ratones con isoflurano y se aisló la parte distal del músculo tibial anterior (TA) mediante disección. Durante la prueba de fuerza in situ, la articulación de la rodilla se fijó a la placa del miembro y el tendón distal del TA se ató al brazo de la palanca del aparato de prueba de fuerza con una sutura de seda 4/0 (FST, 18020–40). El músculo TA se estimuló con los electrodos de platino insertados dentro de la piel y la fascia subyacentes. La corriente y la longitud del músculo se ajustaron para obtener la fuerza máxima isométrica de contracción (Pt) en la longitud óptima del músculo (Lo). Se aplicó continuamente PBS al músculo TA expuesto. Luego, el músculo TA se estimuló a frecuencias crecientes y se mantuvo en Lo hasta alcanzar la fuerza isométrica tetánica máxima (Po). Luego, el músculo TA se estimuló a frecuencias crecientes (10, 25, 50, 80, 100, 150, 250 y 300 Hz) y se permitió un descanso de 1 minuto antes de cada contracción. La longitud óptima de la fibra TA (Lf) se determinó multiplicando Lo por la relación Lf/Lo del músculo TA de 0,6 ([47]). El CSA del músculo TA se calculó como masa muscular dividida por el producto de Lf y 1,06 mg/mm3 ([48]). La fuerza tetánica específica de TA sPo se calculó como Po/CSA del músculo.
Recolección de tejido muscular:
Después de realizar pruebas de fuerza in situ en el músculo tibial anterior (TA), todos los animales fueron sacrificados mediante dislocación cervical y neumotórax bilateral bajo anestesia con isoflurano, y se disecaron y pesaron los músculos de las extremidades posteriores, incluidos el GAST, el PLA, el SOL, el TA y el extensor digitorum longus (EDL) de ambas patas. Los músculos completos de la pata izquierda y la mitad proximal de los músculos de la pata derecha se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido para la extracción de ARN y proteínas, y la mitad distal de los músculos se incluyó en un compuesto de temperatura de corte óptima (O.C.T.) y se congeló en isopentano enfriado en nitrógeno líquido. Todas las muestras se almacenaron a −80 °C hasta el análisis posterior.
Inmunocitoquímica:
Para evaluar la morfología celular en el modelo de cocultivo, los miotubos C2C12 se fijaron en un 4% de paraformaldehído (PFA, Electron Microscopy Sciences, 15710) durante 30 minutos a 4 °C. Las células se permeabilizaron luego con un 0,1% de Triton X-100 durante 30 minutos y se bloquearon en un 1% de albúmina sérica bovina (BSA, Sigma-Aldrich A3294–50G) durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de una incubación nocturna con anticuerpos primarios contra la miosina sarcomérica (MF20c, DSHB, 1:100) y la miogenina (F5Dc, DSHB, 1:100) a 4 °C. Al día siguiente, las células C2C12 se lavaron en PBS y luego se incubaron con anticuerpos secundarios, incluidos el Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 (Invitrogen A-21124, Thermo Fisher Scientific, 1:500) y el Goat Anti-Mouse IgG2b Alexa Fluor 647 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A-21242, 1:500). Se utilizó DAPI (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific D21490, 2 μg/mL) para la contratinción de los núcleos celulares. Los miotubos C2C12 se visualizaron mediante un microscopio fluorescente (Echo Revolution) que funciona en configuración invertida, y se capturaron imágenes fluorescentes con un aumento de 10×. Nueve imágenes se capturaron automáticamente desde las mismas posiciones predeterminadas en cada pocillo de cultivo para evitar el sesgo del investigador.
Inmunohistoquímica:
Se cortaron secciones criotómicas de 10 μm de SOL y EDL, parte media del músculo, en un criostato a −20 °C. Las secciones se adhirieron a portaobjetos SuperFrost Plus y se dejaron secar al aire. Se utilizaron portaobjetos no fijados para la tinción con hematoxilina y eosina (H y E) y la tinción de tipo de fibra. Para la tinción de células inmunitarias, los portaobjetos se fijaron en acetona a −20 °C durante 10 minutos. Todos los portaobjetos utilizados para la inmunotinción se bloquearon en el reactivo de bloqueo de inmunoglobulinas M.O.M (Vector Laboratories, BMK-2202) durante 1 hora a temperatura ambiente antes de la incubación nocturna a 4 °C con anticuerpos primarios. Al día siguiente, los portaobjetos se lavaron en solución PBS y se incubaron con anticuerpos secundarios durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado en PBS, los portaobjetos se montaron utilizando un medio de montaje fluorescente (Agilent Dako, S3023) y se capturaron imágenes fluorescentes utilizando un microscopio Echo Revolution que funciona en configuración vertical. Se utilizaron anticuerpos primarios para la tinción de MyHC I (DSHB, BA-D5c, 1:100), MyHC IIa (DSHB, SC-71c, 1:100), MyHC IIb (DSHB, BF-F3c, 1:100), laminina (Abcam, ab7463, 1:100 o Novus Biologicals N-600–883, 1:100), Gr-1 (Bio-Rad, MCA2387, 1:50), CD68 (Bio-Rad, MCA1957, 1:100 o Abcam, ab283654) y CD206 (Bio-Rad, MCA2235, 1:100). Los anticuerpos secundarios utilizados para los anticuerpos primarios correspondientes incluyeron el Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) conjugado con Alexa Fluor 350 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, A-21068), el Goat Anti-Rat IgG (H+L) conjugado con Alexa Fluor 555 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, A-21434), el Goat Anti-Mouse IgG1 conjugado con Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, A-21221) y el Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) conjugado con Alexa Fluor 647 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, A-21244). Se utilizó DAPI (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, D21490, 2 μg/mL) para la contratinción de los núcleos celulares en los portaobjetos del marcador inmunitario.
Análisis de imágenes:
En el modelo de cocultivo, se analizaron la densidad celular general, el área del miotubo, el porcentaje de células myogenin+ y el diámetro del miotubo utilizando ImageJ/FIJI como índices cuantitativos para la diferenciación y el crecimiento del miotubo. Para determinar el diámetro medio del miotubo, las diez células positivas para miosina más grandes de cada imagen se evaluaron manualmente en su punto más ancho y uniforme perpendicular a la longitud de la célula utilizando la herramienta de selección de línea recta en el software. Para los miotubos ramificados, cada rama se midió como un miotubo individual, y la región donde se unen las ramas se excluyó del análisis. Se analizaron al menos tres imágenes para cada réplica biológica. El número total de células (células DAPI+/mm2), el porcentaje de células myogenin+ (células myogenin+/células DAPI+) (%) y el porcentaje de área positiva para miosina (área del miotubo) (%) por campo de visión se cuantificaron utilizando un complemento interno automatizado personalizado para ImageJ/FIJI. Las imágenes de tipificación de fibras musculares se analizaron y cuantificaron utilizando MuscleJ 1.0.2 con modificaciones menores ([49]). Las muestras de EDL y SOL se analizaron con umbrales de sensibilidad de detección de tipo de fibra personalizados de SD=1 y SD=0.5, respectivamente. Las células inmunitarias, incluidas las células CD68+, CD206+ y Gr-1+, se contaron manualmente en toda la sección transversal del EDL o SOL, que luego se normalizó al área total del tejido determinada por el modo completo de MuscleJ 2.0 ([50]).
Extracción de ARN y RT-qPCR:
El ARN tisular de la mitad proximal congelada del músculo GAST (~25 mg) se extrajo utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, ThermoFisher Scientific, 15596018). Las muestras de tejido GAST se homogeneizaron utilizando el homogeneizador de cuentas Mixer Mill MM 400 (Retsch) durante 10 minutos en tubos microcentrífugos de bloqueo seguro que contenían cuentas de circonio. Luego, se utilizó bromocloropropano para la separación de la fase del sobrenadante antes del aislamiento del ARN con la ayuda del kit Direct-zol™ RNA MiniPrep Plus (Zymo Research, R2072) y el tratamiento con DNasa en la columna. Se evaluó la concentración y pureza del ARN utilizando el espectrofotómetro UV-Vis Nanodrop 2000c (Thermo Scientific). Después de la síntesis de ADNc utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, 4368813), el nivel de ARNm se midió mediante la reacción de polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) utilizando la mezcla maestra SYBR™ Green PCR (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, 4312704). Las placas de RT-qPCR se ejecutaron utilizando el sistema de PCR en tiempo real CFX Opus 96 (Bio-Rad Laboratories). Se probaron varios genes de referencia para la estabilidad de la expresión. Se identificó que la expresión de la proteína que contiene valosina (VCP, Vcp), la subunidad 7 de la proteína del complejo de membrana ER (EMC7, Emc7) y la GAPDH (Gapdh) eran las menos variables y se utilizaron como genes de referencia. Se utilizó la media geométrica de estos tres genes de referencia para la normalización. Las secuencias de todos los cebadores utilizados se muestran en la Tabla 1. Los datos de RT-PCR se analizaron utilizando el método 2−ΔΔCT.
Extracción de proteínas y Western blot:
El tejido GAST congelado de la pata izquierda (~40 mg) se homogeneizó en tampón RIPA 1 × frío (MilliporeSigma, 20188, 15 μL/mg de tejido) con 1 × cóctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas Halt (Thermo Fisher Scientific, 78442) utilizando un homogeneizador mini Fisherbrand Bead Mill 4 (Thermo Fisher Scientific, 15-340-164) a 5 m/s durante 60 segundos. Los homogenados de tejido se incubaron con agitación suave a 4 °C durante 1 hora. Después de la centrifugación a 13000 × g durante 10 minutos a 4 °C, se recogió el sobrenadante que contenía la proteína. Se utilizó el kit de ensayo de proteínas de ácido bicinquinónico (BCA) (Thermo Fisher Scientific, PI23225) para determinar la concentración de proteína en cada muestra, y las muestras de proteína se diluyeron a 2 μg/μL en tampón Laemmli 1 × (Bio-rad, 1610737). Las muestras de proteína se hirvieron durante 5 minutos, y se cargó un volumen igual de proteína (20 μg) en un electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) al 12%. Después de la separación por electroforesis en gel, las muestras de proteína se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando el sistema de transferencia Trans-Blot Turbo (Bio-Rad, 1704150). Las membranas se bloquearon en un 5% de leche descremada en tampón salino tamponado con Tris con un 0,1% de Tween 20 (TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en un 5% de albúmina sérica bovina (BSA) en TBST durante la noche a 4 °C con agitación suave. Los anticuerpos primarios probados incluyeron el Rabbit Anti-15-LOX-1 (Abcam, ab244205, 1:1,000), el Rabbit Anti-S6 Ribosomal Protein (Cell Signaling Technology, 5G10, 1:1,000), el Rabbit Anti-Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (Cell Signaling Technology, 4858S, 1:1,000), el Rabbit Anti-Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser240/244) (Cell Signaling Technology, 5364S, 1:1,000), el Rabbit Anti-p70 S6 Kinase (Cell Signaling Technology, 2708, 1:1,000), el Rabbit Anti-Phospho-p70 S6 Kinase (Thr421/Ser424) (Cell Signaling Technology, 9204S, 1:1,000), el Rabbit Anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Cell Signaling Technology, 9102, 1:1,000) y el Rabbit Anti-Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (Cell Signaling Technology, 4370, 1:1,000). Se utilizó el Mouse Anti-GAPDH para la tinción del control de carga (Santa Cruz Technology, sc-32233, 1:1,000). Al día siguiente, las membranas se lavaron en TBST durante 5 minutos × 3 veces y se sondearon con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) (Jackson Labs, 111-035-144, 1:10,000) o un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Jackson Labs, 115-035-003, 1:10,000) diluido en un 5% de leche descremada en TBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas de proteína se visualizaron utilizando el sustrato de quimioluminiscencia mejorada Clarity Western (ECL) (Bio-Rad, 1705060), y las señales de quimioluminiscencia se capturaron mediante un sistema de imágenes ChemiDoc (Bio-Rad, 12003153). Se realizó un análisis densitométrico utilizando el software Image Lab 6.1 (Bio-Rad).
Análisis estadístico:
Los datos se presentan como la media ± SEM, con los datos brutos de cada réplica biológica mostrados como diagramas de dispersión en gráficos de columnas. El análisis estadístico se realizó en GraphPad Prism 10. En los experimentos con solo una variable independiente y tres niveles (es decir, Ctrl vs. CT26 vs. C26), las diferencias entre los grupos se probaron mediante una ANOVA de una vía seguida de pruebas post hoc de diferencia mínima significativa (LSD) por pares de Fisher. Para los experimentos con dos variables independientes (por ejemplo, tiempo y tipo de célula), las diferencias entre grupos se probaron mediante una ANOVA de dos vías (efecto principal del tipo de célula) seguida de pruebas post hoc de diferencia mínima significativa (LSD) por pares de Fisher. Se utilizó P ≤ 0,05 para determinar la significación estadística. Los valores atípicos estadísticos se identificaron mediante la prueba de Grubbs con α=0,05, y se eliminó como máximo un valor atípico de cada grupo.
Cultivo celular:
La línea celular de músculo esquelético murino C2C12 (ATCC, CRL-1772) y dos líneas celulares de carcinoma colorrectal, incluidas C26 (un regalo del Dr. Keehong Kim de la Universidad de Purdue) y CT26 (ATCC, CRL-2638), se cultivaron por separado en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco, 11995-065) que contiene un 10% de suero fetal bovino (FBS, Corning, 35-010-CV) y antibióticos (penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 μg/mL, Gibco, 15140-122) a 37 °C en una incubadora de células con un 5% de CO2.
Modelo de cocultivo:
Cuando se alcanza una confluencia del 70%, las células C2C12 se pasaron y se sembraron en una placa de cocultivo de 24 pocillos (Corning, 353504) en un medio de crecimiento a una densidad celular de 2,5 × 104/cm2 y se les permitió proliferar y crecer. Cuatro días después de la siembra, se indujo a los mioblastos C2C12 para que formaran miotubos en un medio de diferenciación (DM), DMEM que contiene un 2% de suero de caballo (HS, Gibco 26050088) y antibióticos, según se describe anteriormente. Las células C26 y CT26 se sembraron en DM en los compartimentos superiores de los insertos de placas de cocultivo (Corning, 353095) a una densidad baja (4,17 × 104/cm2), una densidad moderada (8,3 × 104/cm2) o una densidad alta (1,67 × 105/cm2). Además, se sembraron 8,3 × 104/cm2 de células C2C12 en los insertos como control para el experimento de cocultivo. 72 horas después de que se indujera la diferenciación de las células C2C12, los insertos de cocultivo superiores se trasladaron a los compartimentos inferiores de las placas base. Se añadió DM fresco tanto a los miotubos C2C12 en las placas base como a todas las células en los insertos cuando se establecieron los cocultivos. Los miotubos C2C12 se cocultivaron con células C2C12 de control, C26 o CT26 durante 72 horas antes de la fijación y la inmunocitoquímica, según se describe a continuación.
Ratones e inoculación tumoral:
Se obtuvieron ratones BALB/c hembra de 10 meses de edad de Charles River Laboratories y se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos con acceso ilimitado a alimentos y agua. Después de una semana de aclimatación, los ratones se asignaron aleatoriamente a tres grupos con pesos corporales iniciales equilibrados. Antes de la inoculación tumoral, las células C26 y las células CT26 se recolectaron por separado y se resuspendieron en solución salina estéril. Dos grupos de ratones fueron inoculados con células C26 (5 × 105 células/100 μL de solución salina por ratón, n=6) o células CT26 (5 × 105 células/100 μL de solución salina por ratón, n=7) por vía subcutánea en el flanco superior derecho. Se inyectó solución salina estéril (100 μL/ratón) a ratones de control sanos de la misma edad y sexo (n=6). Se controló la condición del ratón y el peso corporal al menos tres veces por semana, y las dimensiones del tumor (longitud y anchura) se midieron con un calibrador cada dos días a partir del día 5 después de la inoculación. El estudio con animales fue aprobado por el protocolo IACU de la Universidad de Purdue #2205002271.
Medición de la composición corporal:
Un día antes de la eutanasia, se escaneó la composición corporal de todos los ratones mediante análisis basado en resonancia magnética (EchoMRI 3-en-1). Los ratones no anestesiados se colocaron individualmente en un cilindro de plástico, que luego se insertó en el escáner para medir la grasa corporal, la masa magra, la masa de agua libre y la masa total de agua.
Pruebas de fuerza muscular:
Un día antes de la eutanasia, se anestesiaron los ratones con un 2% de isoflurano y se colocaron sobre una plataforma calentada a 37 °C. Se evaluó la función del grupo muscular flexor plantar del tobillo, incluido el gastrocnemio (GAST), el plantar (PLA) y los músculos sóleo (SOL), mediante el ensayo in vivo no invasivo (Sistema de animales enteros 3-en-1 1300A para ratones, Aurora Scientific). La articulación de la rodilla de la pierna derecha se inmovilizó con la pinza de rodilla y el pie se fijó a la pestaña del pie. Se colocaron electrodos superficialmente debajo de la piel que recubre el GAST, y el músculo se estimuló después de ajustar la corriente óptima para medir el par isométrico máximo. Para obtener la relación fuerza-frecuencia, el músculo se estimuló luego a frecuencias crecientes (10, 25, 50, 80, 100, 150, 250 y 300 Hz) con un descanso de 1 minuto entre dos estimulaciones. Se permitió que los ratones se recuperaran durante la noche después de la prueba in vivo. El día de la eutanasia, se colocaron los ratones bajo anestesia con isoflurano y se aisló la parte distal del músculo tibial anterior (TA) mediante disección. Durante la prueba de fuerza in situ, la articulación de la rodilla se fijó a la placa de la extremidad y el tendón distal del TA se ató al brazo de la palanca del aparato de prueba de fuerza con una sutura de seda 4/0 (FST, 18020–40). El músculo TA se estimuló con los electrodos de platino insertados dentro de la piel y la fascia circundantes. Se ajustó la corriente y la longitud del músculo para obtener la fuerza de contracción isométrica máxima (Pt) en la longitud óptima del músculo (Lo). Se aplicó continuamente PBS al músculo TA expuesto. Luego, se estimuló el músculo TA a frecuencias crecientes mientras se mantenía en Lo hasta alcanzar la fuerza tetánica isométrica máxima (Po). Luego, se estimuló el músculo TA a frecuencias crecientes (10, 25, 50, 80, 100, 150, 250 y 300 Hz) y se permitió un descanso de 1 minuto antes de cada contracción. La longitud óptima de la fibra TA (Lf) se determinó multiplicando Lo por la relación Lf/Lo del músculo TA de 0,6 ([47]). El CSA del músculo TA se calculó como masa muscular dividida por el producto de Lf y 1,06 mg/mm3 ([48]). La fuerza tetánica específica del TA (sPo) se calculó como Po/CSA del músculo.
Recolección de tejido muscular:
Después de la prueba de fuerza in situ del músculo TA, se sacrificaron todos los animales mediante dislocación cervical y neumotórax bilateral bajo anestesia con isoflurano, y se disecaron y pesaron los músculos de las extremidades posteriores, incluidos el GAST, el PLA, el SOL, el TA y el extensor digitorum longus (EDL) de ambas piernas. Los músculos enteros de la pierna izquierda y la mitad proximal de los músculos de la pierna derecha se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido para la extracción de ARN y proteínas, y la mitad distal de los músculos se incluyó en un compuesto de temperatura de corte óptima (O.C.T.) y se congeló en isopentano enfriado en nitrógeno líquido. Todas las muestras se almacenaron a −80 °C hasta el análisis posterior.
Inmunocitoquímica:
Para evaluar la morfología celular en el modelo de cocultivo, los miotubos C2C12 se fijaron en un 4% de paraformaldehído (PFA, Electron Microscopy Sciences, 15710) durante 30 minutos a 4 °C. Luego, las células se permeabilizaron con un 0,1% de Triton X-100 durante 30 minutos y se bloquearon en un 1% de albúmina sérica bovina (BSA, Sigma-Aldrich A3294–50G) durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de una incubación nocturna con anticuerpos primarios contra la miosina sarcomérica (MF20c, DSHB, 1:100) y la miogenina (F5Dc, DSHB, 1:100) a 4 °C. Al día siguiente, las células C2C12 se lavaron en PBS y luego se incubaron con anticuerpos secundarios, incluidos el anti-IgG1 anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 568 (Invitrogen A-21124, Thermo Fisher Scientific, 1:500) y el anti-IgG2b anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 647 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A-21242, 1:500). Se utilizó DAPI (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific D21490, 2 μg/mL) para contrateñir los núcleos celulares. Los miotubos C2C12 se visualizaron utilizando un microscopio fluorescente (Echo Revolution) que funciona en configuración invertida, y se capturaron imágenes fluorescentes con un aumento de 10×. Nueve imágenes se capturaron automáticamente desde las mismas posiciones predeterminadas en cada pocillo de cultivo para evitar el sesgo del investigador.
Inmunohistoquímica:
Se cortaron secciones criostáticas de 10 μm de SOL y EDL incrustados en OCT en un criostato a −20 °C. Las secciones se adhirieron a portaobjetos SuperFrost Plus y se dejaron secar al aire. Se utilizaron portaobjetos no fijados para la tinción con hematoxilina y eosina (H y E) y la tinción de tipo de fibra. Para la tinción de células inmunitarias, los portaobjetos se fijaron en acetona a −20 °C durante 10 minutos. Todos los portaobjetos utilizados para la inmunotinción se bloquearon en el reactivo de bloqueo de inmunoglobulinas M.O.M (Vector Laboratories, BMK-2202) durante 1 hora a temperatura ambiente antes de la incubación nocturna a 4 °C con anticuerpos primarios. Al día siguiente, los portaobjetos se lavaron en solución PBS y se incubaron con anticuerpos secundarios durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar en PBS, los portaobjetos se montaron utilizando medio de montaje fluorescente (Agilent Dako, S3023) y se capturaron imágenes fluorescentes utilizando un microscopio Echo Revolution que funciona en configuración vertical. Se utilizaron anticuerpos primarios para teñir la MyHC I (DSHB, BA-D5c, 1:100), la MyHC IIa (DSHB, SC-71c, 1:100), la MyHC IIb (DSHB, BF-F3c, 1:100), la laminina (Abcam, ab7463, 1:100 o Novus Biologicals N-600–883, 1:100), Gr-1 (Bio-Rad, MCA2387, 1:50), CD68 (Bio-Rad, MCA1957, 1:100 o Abcam, ab283654) y CD206 (Bio-Rad, MCA2235, 1:100). Los anticuerpos secundarios utilizados para los anticuerpos primarios correspondientes incluyeron el anti-IgG anti-conejo (H+L) conjugado con Alexa Fluor 350 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, A-21068), el anti-IgG anti-rata (H+L) conjugado con Alexa Fluor 555 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, A-21434), el anti-IgG1 anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, A-21221) y el anti-IgG anti-conejo (H+L) conjugado con Alexa Fluor 647 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, A-21244). Se utilizó DAPI (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, D21490, 2 μg/mL) para contrateñir los núcleos celulares en los portaobjetos de marcadores inmunitarios.
Análisis de imágenes:
En el modelo de cocultivo, se analizaron la densidad celular general, el área del miotubo, el porcentaje de células miogenina+ y el diámetro del miotubo utilizando ImageJ/FIJI como índices cuantitativos para la diferenciación y el crecimiento del miotubo. Para determinar el diámetro medio del miotubo, las diez células positivas para miosina más grandes de cada imagen se evaluaron manualmente en su punto más ancho y uniforme perpendicular a la longitud de la célula utilizando la herramienta de selección de línea recta en el software. Para los miotubos ramificados, cada rama se midió como un miotubo único, y la región donde se unen las ramas se excluyó del análisis. Se analizaron al menos tres imágenes para cada réplica biológica. El número total de células (células DAPI+/mm2), el porcentaje de células miogenina+ (células miogenina+/DAPI+) (%) y el porcentaje de área positiva para miosina (área del miotubo) (%) por campo de visión se cuantificaron utilizando un complemento interno automatizado personalizado para ImageJ/FIJI. Las imágenes de tipificación de fibras musculares se analizaron y cuantificaron utilizando MuscleJ 1.0.2 con modificaciones menores ([49]). Las muestras de EDL y SOL se analizaron con umbrales de sensibilidad de detección de tipo de fibra personalizados de SD=1 y SD=0,5, respectivamente. Las células inmunitarias, incluidas las células CD68+, CD206+ y Gr-1+, se contaron manualmente en toda la sección transversal del EDL o SOL, que luego se normalizó al área total del tejido determinada por el modo completo de MuscleJ 2.0 ([50]).
Extracción de ARN y RT-qPCR:
El ARN tisular del GAST congelado (~25 mg) se extrajo utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, ThermoFisher Scientific, 15596018). Las muestras de tejido GAST se homogeneizaron utilizando el homogeneizador de cuentas Mixer Mill MM 400 (Retsch) durante 10 minutos en tubos de microcentrífuga seguros que contenían cuentas de circonio. Luego, se utilizó bromocloropropano para la separación de la fase del sobrenadante antes del aislamiento del ARN con la ayuda del kit Direct-zol™ RNA MiniPrep Plus (Zymo Research, R2072) y el tratamiento con DNasa en la columna. Se evaluó la concentración y la pureza del ARN utilizando el espectrofotómetro UV-Vis Nanodrop 2000c (Thermo Scientific). Después de la síntesis de ADNc utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, 4368813), se midió el nivel de ARNm mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) utilizando el SYBR™ Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, 4312704). Las placas de RT-qPCR se ejecutaron utilizando el sistema de PCR en tiempo real CFX Opus 96 (Bio-Rad Laboratories). Se probaron varios genes de referencia para la estabilidad de la expresión. Se identificaron la expresión de la proteína que contiene valosina (VCP, Vcp), la subunidad 7 del complejo de proteínas de membrana ER (EMC7, Emc7) y la GAPDH (Gapdh) como los genes menos variables y se utilizaron como genes de referencia. Se utilizó la media geométrica de estos tres genes de referencia para la normalización. Las secuencias de todos los cebadores utilizados se muestran en la Tabla 1. Los datos de RT-PCR se analizaron utilizando el método 2−ΔΔCT.
Extracción de proteínas y Western blot:
Se homogeneizó tejido GAST congelado procedente de la pierna izquierda (~40 mg) en tampón RIPA 1 × frío (MilliporeSigma, 20188, 15 μL/mg de tejido) con 1 × cóctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas Halt (Thermo Fisher Scientific, 78442) utilizando un homogeneizador Fisherbrand Bead Mill 4 mini (Thermo Fisher Scientific, 15–340-164) a 5 m/s durante 60 segundos. Los homogenados de tejido se incubaron con agitación suave a 4 °C durante 1 hora. Tras la centrifugación a 13000 × g durante 10 minutos a 4 °C, se recogió el sobrenadante que contenía la proteína. Se utilizó el kit de ensayo de proteínas Pierce bicinquinónico (BCA) (Thermo Fisher Scientific, PI23225) para determinar la concentración de proteínas en cada muestra, y las muestras de proteínas se diluyeron a 2 μg/μL en tampón Laemmli 1 × (Bio-rad, 1610737). Las muestras de proteínas se hirvieron durante 5 minutos, y se cargó un volumen igual de proteína (20 μg) en un gel de electroforesis en gel de poliacrilamida con sulfato de sodio (SDS-PAGE) al 12 %. Tras la separación por electroforesis en gel, las muestras de proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando un sistema de transferencia Trans-Blot Turbo (Bio-Rad, 1704150). Las membranas se bloquearon en un 5 % de leche descremada en solución salina tamponada con Tris con 0,1 % de Tween 20 (TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en un 5 % de albúmina sérica bovina (BSA) en TBST durante la noche a 4 °C con agitación suave. Los anticuerpos primarios que se analizaron incluyeron: Anti-15-LOX-1 (Abcam, ab244205, 1:1000), Anti-Proteína Ribosomal S6 (Cell Signaling Technology, 5G10, 1:1000), Anti-Proteína Ribosomal S6 Fosforilada (Ser235/236) (Cell Signaling Technology, 4858S, 1:1000), Anti-Proteína Ribosomal S6 Fosforilada (Ser240/244) (Cell Signaling Technology, 5364S, 1:1000), Anti-p70 S6 Kinasa (Cell Signaling Technology, 2708, 1:1000), Anti-p70 S6 Kinasa Fosforilada (Thr421/Ser424) (Cell Signaling Technology, 9204S, 1:1000), Anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Cell Signaling Technology, 9102, 1:1000) y Anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) Fosforilada (Thr202/Tyr204) (Cell Signaling Technology, 4370, 1:1000). Se utilizó Anti-GAPDH (Santa Cruz Technology, sc-32233, 1:1000) para detectar el control de carga. Al día siguiente, las membranas se lavaron en TBST durante 5 minutos × 3 veces y se sondearon con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) anti-IgG (H + L) de cabra (Jackson Labs, 111–035-144, 1:10000) o un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) anti-IgG (H + L) de cabra (Jackson Labs, 115–035-003, 1:10000) diluido en un 5 % de leche descremada en TBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando el sustrato de quimioluminiscencia mejorada Clarity Western (ECL) (Bio-Rad, 1705060), y las señales de quimioluminiscencia se capturaron mediante un sistema de imagen ChemiDoc (Bio-Rad, 12003153). Se realizó un análisis densitométrico utilizando el software Image Lab 6.1 (Bio-Rad).
Análisis estadístico:
Los datos se presentan como la media ± SEM, con los datos brutos de cada réplica biológica mostrados como diagramas de dispersión en gráficos de columnas. El análisis estadístico se realizó en GraphPad Prism 10. En los experimentos con solo una variable independiente y tres niveles (es decir, Ctrl vs. CT26 vs. C26), las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante una ANOVA de una vía seguida de pruebas post hoc de comparación por pares de Fisher’s Least Significant Difference (LSD). Para los experimentos con dos variables independientes (por ejemplo, tiempo y tipo de célula), las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante una ANOVA de dos vías (efecto principal del tipo de célula) seguida de pruebas post hoc de comparación por pares de Fisher’s Least Significant Difference (LSD). Se utilizó P ≤ 0,05 para determinar la significación estadística. Los valores atípicos estadísticos se identificaron mediante la prueba de Grubbs con α = 0,05, y se eliminó como máximo un valor atípico de cada grupo.
RESULTADOS
C26 y CT26 mostraron una potencia similar para inducir atrofia muscular in vitro
Para investigar los efectos de los factores solubles secretados por las células de carcinoma C26 y CT26 en la inducción del desgaste de las células del músculo esquelético in vitro, co-cultivamos miotubos C2C12 maduros con densidades crecientes de células C26 o CT26 (Baja: 4,17 × 104/cm2, Media: 8,3 × 104/cm2 y Alta: 1,67 × 105/cm2) para permitir un intercambio continuo de factores secretados por el músculo y el cáncer (Figura 1A). El análisis de inmunocitoquímica mostró que el co-cultivo de 72 horas con células C26 o CT26 indujo una atrofia significativa de los miotubos C2C12 (Figura 1B). Tanto las células C26 como las CT26 provocaron una marcada disminución del diámetro de los miotubos C2C12 (Figura 1C). Además, las células C26 y CT26 redujeron el porcentaje de área de miotubos en densidades medias y altas (Figura 1D). Si bien las células CT26 no influyeron en la expresión de miogenina, los miotubos C2C12 co-cultivados con células C26 tuvieron una proporción reducida de células miogenina+ en densidades bajas y medias de co-cultivo de células cancerosas (Figura 1E). No hubo diferencia en la viabilidad celular en comparación con el control, como lo indica el número total de células DAPI+/mm2 a cualquier densidad celular (Figura 1F). En general, estos datos muestran que tanto las células de carcinoma CT26 como las C26 inducen un desgaste robusto de las células del músculo esquelético in vitro.
C26 indujo una mayor pérdida de peso corporal, masa magra y masa grasa
Para estudiar el potencial de los tumores C26 y CT26 para inducir la caquexia por cáncer in vivo, se inyectaron por vía subcutánea tres grupos de ratones hembra BALB/c con el mismo peso corporal inicial con solución salina (Ctrl), células C26 (5 × 105 células/ratón) o células CT26 (5 × 105 células/ratón) en el flanco derecho (Figura 2A). Los tumores formados por las células C26 y CT26 se hicieron palpables y medibles 5 días después de la inoculación. Curiosamente, los ratones inoculados con células CT26 desarrollaron tumores subcutáneos más grandes en comparación con los inoculados con células C26, a pesar de una probabilidad de supervivencia similar (Figura 2B y C). El análisis de EchoMRI de la composición corporal reveló que tanto los tumores C26 como los CT26 indujeron el desgaste de la grasa, y los ratones con tumores C26 experimentaron una mayor pérdida de masa grasa que los ratones con tumores CT26 (Figura 2D). Por otro lado, solo los tumores C26 resultaron en una masa magra significativamente menor al final del estudio (Figura 2E). Además, si bien los ratones con tumores C26 experimentaron una pérdida significativa de peso corporal total a partir del día 13 después de la inoculación, los ratones con tumores CT26 no mostraron ninguna pérdida de peso corporal total (Figura 2F). Sin embargo, tanto los tumores C26 como los CT26 condujeron a una marcada reducción de la masa corporal total estimada sin tumor, aunque los tumores C26 exhibieron un inicio más temprano y una mayor magnitud de pérdida de peso que los ratones con tumores CT26 (Figura 2G). Tanto los tumores C26 como los CT26 causaron una pérdida significativa de la masa muscular absoluta en GAST y TA (Figura 2H e I). Sin embargo, en los músculos más pequeños de las extremidades inferiores, incluidos PLA, EDL y SOL, solo los tumores C26 indujeron una pérdida significativa de la masa muscular en comparación con los controles sanos (Figura 2J–L).
Los tumores C26 inducen una mayor pérdida de la función y masa muscular esquelética en comparación con CT26
A continuación, investigamos la influencia de los tumores C26 y CT26 en la función y la masa muscular esquelética. Para probar si la progresión del tumor afecta la función de GAST, se evaluó a todos los ratones para el par máximo de flexión plantar un día antes de la eutanasia. Los tumores CT26 disminuyeron el par de contracción única del músculo GAST y mostraron una tendencia a reducir el par máximo absoluto durante el tétanos (Figura 3A y B). Por otro lado, si bien el tumor C26 no redujo significativamente el par de contracción, indujo una mayor reducción del par tetánico máximo en comparación con los ratones con tumores CT26 (Figura 3A y B). Además, los tumores C26 condujeron a una disminución del par isométrico máximo cuando se estimularon con frecuencias medias a altas (80 Hz ~ 300 Hz), mientras que no se detectó ninguna diferencia en los ratones con tumores CT26 cuando se aplicaron frecuencias crecientes a GAST (Figura 3C).
Para evaluar el posible cambio en la función muscular de TA, el músculo de la extremidad inferior responsable principalmente de la dorsiflexión del tobillo, realizamos la prueba de fuerza in situ en el músculo TA después de un período de recuperación de una noche después de la prueba de fuerza de GAST. Los ratones con tumores C26 tendieron a tener una fuerza de contracción isométrica reducida (Figura 3D). Al igual que en GAST, CT26 tendió a reducir la fuerza tetánica máxima, pero los tumores C26 resultaron en una reducción considerablemente mayor de la fuerza de tétanos en TA (Figura 3E). Sin embargo, no se observó ninguna diferencia en la fuerza de tétanos específica de TA producida por los controles sanos y los ratones con tumores (Figura 3F). Cuando se estimuló TA a frecuencias crecientes, solo los ratones con tumores C26 mostraron una disminución de la producción de fuerza isométrica en comparación con los controles sanos a una estimulación entre 80 Hz y 300 Hz (Figura 3G).
Los tumores C26 y CT26 resultaron en cambios en la morfología de las fibras musculares esqueléticas
Para caracterizar mejor cómo los tumores C26 y CT26 influyen en los diferentes tipos de músculos, investigamos los cambios en la morfología muscular utilizando EDL y SOL como tipos representativos de músculos de contracción rápida y lenta, respectivamente (Figura 4A–C). La tinción de inmunohistoquímica mostró que los tumores C26 redujeron el área de sección transversal media (CSA) de las fibras de SOL y tendieron a disminuir el área de las fibras de EDL (Figura 4D y H). Si bien no fue estadísticamente diferente, CT26 también mostró una tendencia a disminuir el CSA de EDL y SOL (Figura 4D y H). La distribución de la frecuencia de las fibras de SOL y EDL mostró además que los ratones con tumores C26 exhibieron un cambio hacia fibras más pequeñas (Figura 4E e I), pero no observamos ningún cambio en el porcentaje de composición del tipo de fibra en los músculos de los ratones con tumores C26 o CT26 (Figura 4F y J). El efecto atrófico de los tumores C26 en EDL fue causado predominantemente por fibras de tipo IIb más pequeñas, mientras que las fibras de tipo I son más grandes en los músculos de EDL de los ratones con tumores C26 (Figura 4G). Curiosamente, la disminución del tamaño de las fibras musculares en SOL de los ratones con tumores C26 fue impulsada principalmente por la atrofia de las fibras musculares de tipo I de contracción lenta (Figura 4K). Sin embargo, no se detectó ninguna diferencia en el CSA específico de las fibras en EDL (Figura 4G) o SOL (Figura 4K) de los ratones con tumores CT26. En general, el desarrollo del tumor C26 resultó en un mayor nivel de atrofia muscular en SOL y EDL.
Diferentes respuestas inmunitarias intramusculares de los ratones con tumores C26 y CT26
Para determinar la infiltración de células inmunitarias en los músculos esqueléticos durante la caquexia por cáncer, se tiñeron los macrófagos totales (MΦ) (células CD68+), los MΦ de tipo M2 (células CD68+CD206+) y los neutrófilos polimorfonucleares (PMN, células Gr-1+) en EDL y SOL (Figura 5A–B y F–G). En EDL, si bien los ratones con tumores C26 tenían un mayor número de MΦ, los tumores CT26 no indujeron ningún aumento significativo en la infiltración de MΦ (Figura 5C). Además, se encontraron más MΦ de tipo M2 en EDL de los ratones con tumores C26 en comparación con los ratones con tumores CT26 (Figura 5D). C26 también indujo un número significativamente mayor de PMN intramusculares, y hubo una tendencia a que CT26 aumentara la infiltración de PMN en comparación con los controles sanos (Figura 5E). Por otro lado, en SOL, tanto los tumores C26 como los CT26 resultaron en una mayor infiltración intramuscular de MΦ totales y MΦ de tipo M2 en comparación con los controles sanos, y los ratones con tumores C26 mostraron un mayor nivel de infiltración de MΦ (Figura 5F, H e I). Además, los ratones con tumores C26 indujeron la infiltración intramuscular de PMN y CT26 tendió a aumentar la infiltración de PMN en SOL (Figura 5G y J).
Para estudiar la regulación transcripcional de las respuestas inflamatorias en los músculos esqueléticos, evaluamos los niveles de expresión de ARNm de los marcadores de la inmunidad innata en el músculo GAST, incluyendo el complejo de diferenciación 68 (CD68, Cd68), CD206 (Mrc-1) y CD11b (Itgam). Si bien la expresión de Cd68 no fue diferente entre los ratones con tumores CT26 y los controles sanos, los tumores C26 indujeron un aumento significativo en la expresión de Cd68 (Figura 5K). Mientras tanto, observamos un aumento significativo en la expresión de Mrc-1 e Itgam en los ratones con tumores C26, pero no en los ratones con tumores CT26 (Figura 5L y M). También medimos la expresión de la proteína 2A del cuerpo multivesicular cargado (CHMP2A, Chmp2a), que regula la autofagia y media la citotoxicidad de las células asesinas naturales (NK) en la inmunidad tumoral ([45], [46]). Descubrimos que los tumores CT26 indujeron un aumento en la expresión de Chmp2a, y los tumores C26 mostraron una tendencia a aumentar el nivel de Chmp2a (Figura 5N).
También medimos la expresión de las principales citoquinas proinflamatorias, incluyendo la proteína quimioatractiva de monocitos-1 (MCP-1, Ccl2), el factor de necrosis tumoral-alfa (TNFα, Tnf), la interleucina-6 (IL-6, Il6) y la interleucina-1 beta (IL-1β, Il1b). Sorprendentemente, C26 no cambió la expresión de Ccl2 y Tnf, mientras que los tumores CT26 reprimieron la expresión de Ccl2 y Tnf en el músculo GAST (Figura S1A y B). Además, no hubo diferencia en la expresión de Il6 e Il1b en ninguno de los ratones con tumores C26 o CT26 (Figura S1C y D). Además, no hubo cambios en la expresión de los factores de transcripción del espaciador transcrito externo (ETS, ETS) o la región del ADN ribosómico del espaciador transcrito interno-5.8S (ITS-5.8S, ITS-5.8S), que está involucrada en la biogénesis de los ribosomas del músculo esquelético (Figura S1E y F) ([47]).
Luego, evaluamos la expresión de las enzimas clave involucradas en la biosíntesis de los mediadores lipídicos y la regulación inmunitaria, incluyendo la 5-lipooxigenasa (5-LOX, Alox15), la leucocito 12/15-LOX (12/15-LOX, Alox15), la plaqueta 12-LOX (12-LOX, Alox12) y la ciclooxigenasa 2 (COX-2, Ptgs2). Descubrimos que los tumores C26 aumentaron significativamente la expresión de Alox5, lo cual no se observó en los tumores CT26 (Figura 5O). Interesantemente, tanto los tumores C26 como los CT26 disminuyeron considerablemente la expresión de Alox15, lo cual desempeña un papel importante en la producción de mediadores proresolutivos especializados (SPM) y la resolución de la inflamación muscular ([48], [49]) (Figura 5P). Un análisis adicional de la expresión de 15-LOX mediante Western blot confirmó la robusta disminución a nivel de proteína en los ratones con tumores C26, pero la proteína 15-LOX no se redujo en los ratones CT26 (Figura 5S). Se ha demostrado que la COX-2 y la 12-LOX promueven la caquexia del CRC al activar la inflamación y reprimir las vías de síntesis de proteínas ([32], [50]). Sin embargo, la expresión de Alox12 o Ptgs2 en los músculos GAST no se vio afectada por ninguno de los tumores C26 o CT26 (Figura 5Q y R).
C26 y CT26 modulan las vías de renovación de proteínas del músculo esquelético
Para estudiar la influencia de los tumores C26 y CT26 en la regulación de las vías de renovación de proteínas musculares, determinamos los niveles de fosforilación de las enzimas clave involucradas en la señalización de la síntesis de proteínas en los músculos GAST (Figura 6A). Ni la inoculación de tumores C26 ni CT26 cambió el nivel de fosforilación de la proteína quinasa B (Akt) en Ser473 (Figura 6B). Si bien los tumores CT26 no influyeron en el nivel de fosforilación de la proteína quinasa S6 ribosómica p70 (p70S6K) (Thr421/Ser424), los tumores C26 mostraron una tendencia a disminuir el nivel de fosforilación de p70S6K (Figura 6C). También observamos una ligera, pero significativa, disminución en el nivel de fosforilación de la quinasa extracelular regulada por señales 1/2 (ERK1/2, Thr202/Tyr204) (Figura 6D). Sorprendentemente, hubo un aumento significativo en el nivel de fosforilación de la proteína ribosómica S6 (S6) en los sitios Ser235/236 y Ser240/244 en los ratones con tumores C26 (Figura 6E y F). También observamos un aumento en el nivel de fosforilación de la proteína quinasa activada por estrés (SAPK) c-Jun N-terminal quinasa (JNK) (Thr193/Tyr185) en los ratones con tumores CT26, pero no en los ratones con tumores C26.
Además, se midió el nivel de expresión de ARNm de los biomarcadores de la degradación de proteínas y la atrofia muscular en el GAST mediante RT-qPCR, incluyendo las ubiquitina ligasas específicas del músculo Atrogin-1 (Fbxo32) y MuRF1 (Trim63). Hubo una regulación al alza significativa de Fbxo32 en el GAST de C26, pero no en los tumores CT26 (Figura 6F). De manera similar, C26 tendió a inducir un aumento en Trim63, mientras que los tumores CT26 no cambiaron la expresión de Trim63 (Figura 6G).
C26 y CT26 exhibieron una potencia similar en la inducción de la atrofia muscular in vitro
Para investigar los efectos de los factores solubles secretados por las células de carcinoma C26 y CT26 en la inducción del desgaste de las células del músculo esquelético in vitro, co-cultivamos miotubos C2C12 maduros con densidades crecientes de células C26 o CT26 (Baja: 4,17 × 104/cm2, Media: 8,3 × 104/cm2 y Alta: 1,67 × 105/cm2) para permitir un intercambio continuo de factores secretados por el músculo y el cáncer (Figura 1A). El análisis de inmunocitoquímica mostró que el co-cultivo de 72 horas con células C26 o CT26 indujo una atrofia significativa de los miotubos C2C12 (Figura 1B). Tanto las células C26 como las CT26 condujeron a una marcada disminución en el diámetro de los miotubos C2C12 (Figura 1C). Además, las células C26 y CT26 redujeron el porcentaje de área de miotubos en densidades medias y altas (Figura 1D). Si bien las células CT26 no influyeron en la expresión de miogenina, los miotubos C2C12 co-cultivados con células C26 tuvieron una proporción reducida de células miogenina+ en densidades bajas y medias de co-cultivo de células cancerosas (Figura 1E). No hubo diferencia en la viabilidad celular en comparación con el control, como lo indica el número total de células DAPI+/mm2 a cualquier densidad celular (Figura 1F). En general, estos datos muestran que tanto las células de carcinoma CT26 como las C26 inducen un desgaste robusto de las células del músculo esquelético in vitro.
C26 indujo una mayor pérdida de peso corporal, masa magra y masa grasa
Para estudiar el potencial de los tumores C26 y CT26 para inducir la caquexia por cáncer in vivo, tres grupos de ratones hembra BALB/c con el mismo peso corporal inicial fueron inyectados subcutáneamente con solución salina (Ctrl), células C26 (5 × 105 células/ratón) o células CT26 (5 × 105 células/ratón) en el flanco derecho (Figura 2A). Los tumores formados por las células C26 y CT26 se volvieron palpables y medibles 5 días después de la inoculación. Interesantemente, los ratones inoculados con células CT26 desarrollaron tumores subcutáneos más grandes en comparación con los inoculados con células C26, a pesar de una probabilidad de supervivencia similar (Figura 2B y C). El análisis de EchoMRI de la composición corporal reveló que tanto los tumores C26 como los CT26 indujeron el desgaste de la grasa, y los ratones con tumores C26 experimentaron una mayor pérdida de masa grasa que los ratones CT26 (Figura 2D). Por otro lado, solo los tumores C26 resultaron en una masa magra significativamente menor al final del estudio (Figura 2E). Además, si bien los ratones con tumores C26 experimentaron una pérdida significativa de peso corporal total a partir del día 13 después de la inoculación, los ratones con tumores CT26 no mostraron ninguna pérdida de peso corporal total (Figura 2F). Sin embargo, tanto los tumores C26 como los CT26 condujeron a una marcada reducción en la masa corporal total estimada sin tumor, aunque los tumores C26 exhibieron un inicio más temprano y una mayor magnitud de pérdida de peso que los ratones CT26 (Figura 2G). Tanto los tumores C26 como los CT26 causaron una pérdida significativa de la masa muscular absoluta en el GAST y el TA, con C26 resultando en un mayor desgaste muscular (Figura 2H e I). Sin embargo, en los músculos más pequeños de las extremidades, incluyendo PLA, EDL y SOL, solo los tumores C26 indujeron una pérdida significativa de la masa muscular en comparación con los controles sanos (Figura 2J-L).
Los tumores C26 inducen un mayor desgaste del músculo esquelético en comparación con CT26
A continuación, investigamos la influencia de los tumores C26 y CT26 en la función y la masa del músculo esquelético. Para probar si la progresión del tumor afecta la función del GAST, se realizó una prueba de todos los ratones para medir el par de flexión plantar máximo un día antes de la eutanasia. Los tumores CT26 disminuyeron el par de contracción única del músculo GAST y mostraron una tendencia a reducir el par máximo absoluto durante el tétanos (Figura 3A y B). Por otro lado, si bien los tumores CT26 no influyeron en el nivel de fosforilación de p70S6K, los tumores C26 mostraron una tendencia a disminuir el nivel de fosforilación de p70S6K (Figura 3C). También observamos una ligera, pero significativa, disminución en el nivel de fosforilación de la quinasa extracelular regulada por señales 1/2 (ERK1/2, Thr202/Tyr204) (Figura 3D). Sorprendentemente, hubo un aumento significativo en el nivel de fosforilación de la proteína ribosómica S6 (S6) en los sitios Ser235/236 y Ser240/244 en los ratones con tumores C26 (Figura 3E y F). También observamos un aumento en el nivel de fosforilación de la proteína quinasa activada por estrés (SAPK) c-Jun N-terminal quinasa (JNK) (Thr193/Tyr185) en los ratones con tumores CT26, pero no en los ratones con tumores C26.
Además, se midió el nivel de expresión de ARNm de los biomarcadores de la degradación de proteínas y la atrofia muscular en el GAST mediante RT-qPCR, incluyendo las ubiquitina ligasas específicas del músculo Atrogin-1 (Fbxo32) y MuRF1 (Trim63). Hubo una regulación al alza significativa de Fbxo32 en el GAST de C26, pero no en los tumores CT26 (Figura 3F). De manera similar, C26 tendió a inducir un aumento en Trim63, mientras que los tumores CT26 no cambiaron la expresión de Trim63 (Figura 3G).
C26 y CT26 exhibieron una potencia similar en la inducción de la atrofia muscular in vitro
Para investigar los efectos de los factores solubles secretados por las células de carcinoma C26 y CT26 en la inducción del desgaste de las células del músculo esquelético in vitro, co-cultivamos miotubos C2C12 maduros con densidades crecientes de células C26 o CT26 (Baja: 4,17 × 104/cm2, Media: 8,3 × 104/cm2 y Alta: 1,67 × 105/cm2) para permitir un intercambio continuo de factores secretados por el músculo y el cáncer (Figura 1A). El análisis de inmunocitoquímica mostró que el co-cultivo de 72 horas con células C26 o CT26 indujo una atrofia significativa de los miotubos C2C12 (Figura 1B). Tanto las células C26 como las CT26 condujeron a una marcada disminución en el diámetro de los miotubos C2C12 (Figura 1C). Además, las células C26 y CT26 redujeron el porcentaje de área de miotubos en densidades medias y altas (Figura 1D). Si bien las células CT26 no influyeron en la expresión de miogenina, los miotubos C2C12 co-cultivados con células C26 tuvieron una proporción reducida de células miogenina+ en densidades bajas y medias de co-cultivo de células cancerosas (Figura 1E). No hubo diferencia en la viabilidad celular en comparación con el control, como lo indica el número total de células DAPI+/mm2 a cualquier densidad celular (Figura 1F). En general, estos datos muestran que tanto las células de carcinoma CT26 como las C26 inducen un desgaste robusto de las células del músculo esquelético in vitro.
C26 indujo una mayor pérdida de peso corporal, masa magra y masa grasa
Para estudiar el potencial de los tumores C26 y CT26 para inducir la caquexia por cáncer in vivo, tres grupos de ratones hembra BALB/c con el mismo peso corporal inicial fueron inyectados subcutáneamente con solución salina (Ctrl), células C26 (5 × 105 células/ratón) o células CT26 (5 × 105 células/ratón) en el flanco derecho (Figura 2A). Los tumores formados por las células C26 y CT26 se volvieron palpables y medibles 5 días después de la inoculación. Interesantemente, los ratones inoculados con células CT26 desarrollaron tumores subcutáneos más grandes en comparación con los inoculados con células C26, a pesar de una probabilidad de supervivencia similar (Figura 2B y C). El análisis de EchoMRI de la composición corporal reveló que tanto los tumores C26 como los CT26 indujeron el desgaste de la grasa, y los ratones con tumores C26 experimentaron una mayor pérdida de masa grasa que los ratones CT26 (Figura 2D). Por otro lado, solo los tumores C26 resultaron en una masa magra significativamente menor al final del estudio (Figura 2E). Además, si bien los ratones con tumores C26 experimentaron una pérdida significativa de peso corporal total a partir del día 13 después de la inoculación, los ratones con tumores CT26 no mostraron ninguna pérdida de peso corporal total (Figura 2F). Sin embargo, tanto los tumores C26 como los CT26 condujeron a una marcada reducción en la masa corporal total estimada sin tumor, aunque los tumores C26 exhibieron un inicio más temprano y una mayor magnitud de pérdida de peso que los ratones CT26 (Figura 2G). Tanto los tumores C26 como los CT26 causaron una pérdida significativa de la masa muscular absoluta en el GAST y el TA, con C26 resultando en un mayor desgaste muscular (Figura 2H e I). Sin embargo, en los músculos más pequeños de las extremidades, incluyendo PLA, EDL y SOL, solo los tumores C26 indujeron una pérdida significativa de la masa muscular en comparación con los controles sanos (Figura 2J-L).
Los tumores C26 inducen un mayor desgaste del músculo esquelético en comparación con CT26
A continuación, investigamos la influencia de los tumores C26 y CT26 en la función y la masa del músculo esquelético. Para probar si la progresión del tumor afecta la función del GAST, se realizó una prueba de todos los ratones para medir el par de flexión plantar máximo un día antes de la eutanasia. Los tumores CT26 disminuyeron el par de contracción única del músculo GAST y mostraron una tendencia a reducir el par máximo absoluto durante el tétanos (Figura 3A y B). Por otro lado, si bien los tumores CT26 no influyeron en el nivel de fosforilación de p70S6K, los tumores C26 mostraron una tendencia a disminuir el nivel de fosforilación de p70S6K (Figura 3C). También observamos una ligera, pero significativa, disminución en el nivel de fosforilación de la quinasa extracelular regulada por señales 1/2 (ERK1/2, Thr202/Tyr204) (Figura 3D). Sorprendentemente, hubo un aumento significativo en el nivel de fosforilación de la proteína ribosómica S6 (S6) en los sitios Ser235/236 y Ser240/244 en los ratones con tumores C26 (Figura 3E y F). También observamos un aumento en el nivel de fosforilación de la proteína quinasa activada por estrés (SAPK) c-Jun N-terminal quinasa (JNK) (Thr193/Tyr185) en los ratones con tumores CT26, pero no en los ratones con tumores C26.
Además, se midió el nivel de expresión de ARNm de los biomarcadores de la degradación de proteínas y la atrofia muscular en el GAST mediante RT-qPCR, incluyendo las ubiquitina ligasas específicas del músculo Atrogin-1 (Fbxo32) y MuRF1 (Trim63). Hubo una regulación al alza significativa de Fbxo32 en el GAST de C26, pero no en los tumores CT26 (Figura 3F). De manera similar, C26 tendió a inducir un aumento en Trim63, mientras que los tumores CT26 no cambiaron la expresión de Trim63 (Figura 3G).
C26 y CT26 exhibieron una potencia similar en la inducción de la atrofia muscular in vitro
Para investigar los efectos de los factores solubles secretados por las células de carcinoma C26 y CT26 en la inducción del desgaste de las células del músculo esquelético in vitro, co-cultivamos miotubos C2C12 maduros con densidades crecientes de células C26 o CT26 (Baja: 4,17 × 104/cm2, Media: 8,3 × 104/cm2 y Alta: 1,67 × 105/cm2) para permitir un intercambio continuo de factores secretados por el músculo y el cáncer (Figura 1A). El análisis de inmunocitoquímica mostró que el co-cultivo de 72 horas con células C26 o CT26 indujo una atrofia significativa de los miotubos C2C12 (Figura 1B). Tanto las células C26 como las CT26 condujeron a una marcada disminución en el diámetro de los miotubos C2C12 (Figura 1C). Además, las células C26 y CT26 redujeron el porcentaje de área de miotubos en densidades medias y altas (Figura 1D). Si bien las células CT26 no influyeron en la expresión de miogenina, los miotubos C2C12 co-cultivados con células C26 tuvieron una proporción reducida de células miogenina+ en densidades bajas y medias de co-cultivo de células cancerosas (Figura 1E). No hubo diferencia en la viabilidad celular en comparación con el control
Para estudiar la regulación transcripcional de las respuestas inflamatorias en los músculos esqueléticos, evaluamos los niveles de expresión de ARNm de los marcadores de la inmunidad innata en el músculo GAST, incluyendo el complejo de diferenciación 68 (CD68, Cd68), CD206 (Mrc-1) y CD11b (Itgam). Si bien la expresión de Cd68 no fue diferente entre los ratones con tumores CT26 y los controles sanos, los tumores C26 indujeron un aumento significativo en la expresión de Cd68 (Figura 5K). Mientras tanto, observamos un aumento significativo en la expresión de Mrc-1 e Itgam en los ratones con tumores C26, pero no en los ratones con tumores CT26 (Figura 5L y M). También medimos la expresión de la proteína 2A del cuerpo multivesicular cargado (CHMP2A, Chmp2a), que regula la autofagia y media la citotoxicidad de las células asesinas naturales (NK) en la inmunidad tumoral ([45], [46]). Encontramos que los tumores CT26 indujeron un aumento en la expresión de Chmp2a, y los tumores C26 mostraron una tendencia a aumentar el nivel de Chmp2a (Figura 5N).
También medimos la expresión de las principales citoquinas proinflamatorias, incluyendo la proteína quimioatractiva de monocitos-1 (MCP-1, Ccl2), el factor de necrosis tumoral-alfa (TNFα, Tnf), la interleucina-6 (IL-6, Il6) y la interleucina-1 beta (IL-1β, Il1b). Sorprendentemente, C26 no cambió la expresión de Ccl2 y Tnf, mientras que los tumores CT26 reprimieron la expresión de Ccl2 y Tnf en el músculo GAST (Figura S1A y B). Además, no hubo diferencia en la expresión de Il6 e Il1b en ninguno de los ratones con tumores C26 o CT26 (Figura S1C y D). Además, no hubo cambios en la expresión de los factores de transcripción del espaciador transcrito externo (ETS, ETS) o la región del ADN ribosómico del espaciador transcrito interno-5.8S (ITS-5.8S, ITS-5.8S), que está involucrada en la biogénesis de los ribosomas del músculo esquelético (Figura S1E y F) ([47]).
Luego, evaluamos la expresión de las enzimas clave involucradas en la biosíntesis de los mediadores lipídicos y la regulación inmunitaria, incluyendo la 5-lipooxigenasa (5-LOX, Alox15), la leucocito 12/15-LOX (12/15-LOX, Alox15), la plaqueta 12-LOX (12-LOX, Alox12) y la ciclooxigenasa 2 (COX-2, Ptgs2). Encontramos que los tumores C26 aumentaron significativamente la expresión de Alox5, lo cual no se observó en los tumores CT26 (Figura 5O). Interesantemente, tanto los tumores C26 como los CT26 disminuyeron en gran medida la expresión de Alox15, lo cual desempeña un papel importante en la producción de mediadores proresolutivos especializados (SPM) y la resolución de la inflamación muscular ([48], [49]) (Figura 5P). Un análisis adicional de la expresión de 15-LOX mediante Western blot confirmó la robusta disminución a nivel de proteína en los ratones con tumores C26, pero la proteína 15-LOX no se redujo en los ratones CT26 (Figura 5S). Se ha demostrado que la COX-2 y la 12-LOX promueven la caquexia del CRC a través de la activación de la inflamación y la represión de las vías de síntesis de proteínas ([32], [50]). Sin embargo, la expresión de Alox12 o Ptgs2 en los músculos GAST no se vio afectada por ninguno de los tumores C26 o CT26 (Figura 5Q y R).
C26 y CT26 modulan las vías de renovación de proteínas del músculo esquelético
Para estudiar la influencia de los tumores C26 y CT26 en la regulación de las vías de renovación de proteínas musculares, determinamos los niveles de fosforilación de las enzimas clave involucradas en la señalización de la síntesis de proteínas en los músculos GAST (Figura 6A). Ni la inoculación de tumores C26 ni CT26 cambió el nivel de fosforilación de la proteína quinasa B (Akt) en Ser473 (Figura 6B). Si bien los tumores CT26 no influyeron en el nivel de fosforilación de la proteína quinasa S6 ribosómica p70 (p70S6K) (Thr421/Ser424), los tumores C26 mostraron una tendencia a disminuir el nivel de fosforilación de p70S6K (Figura 6C). También observamos una ligera, pero significativa, disminución en el nivel de fosforilación de la quinasa extracelular regulada por señales 1/2 (ERK1/2, Thr202/Tyr204) (Figura 6D). Sorprendentemente, hubo un aumento significativo en el nivel de fosforilación de la proteína ribosómica S6 (S6) en los sitios Ser235/236 y Ser240/244 en los ratones con tumores C26 (Figura 6E y F). También observamos un aumento en el nivel de fosforilación de la proteína quinasa activada por estrés (SAPK) c-Jun N-terminal quinasa (JNK) (Thr193/Tyr185) en los ratones con tumores CT26, pero no en los ratones con tumores C26.
Además, se midió el nivel de expresión de ARNm de los biomarcadores de la degradación de proteínas y la atrofia muscular en el GAST mediante RT-qPCR, incluyendo las ubiquitina ligasas específicas del músculo Atrogin-1 (Fbxo32) y MuRF1 (Trim63). Hubo una regulación al alza significativa de Fbxo32 en el GAST de C26, pero no en los tumores CT26 (Figura 6F). De manera similar, C26 tendió a inducir un aumento en Trim63, mientras que los tumores CT26 no cambiaron la expresión de Trim63 (Figura 6G).
DISCUSIÓN
La caquexia del cáncer colorrectal (CRC) implica la pérdida involuntaria de masa y función del músculo esquelético, lo cual podría disminuir la calidad de vida de los pacientes con cáncer y reducir el pronóstico general ([1], [51]). Aunque tanto la línea celular de carcinoma de colon murino C26 como la CT26 se han utilizado para modelar la caquexia del CRC, se han realizado pocas investigaciones que hayan comparado directamente su potencial relativo para inducir la caquexia del cáncer. En el presente estudio, investigamos la capacidad de C26 y CT26 para inducir la caquexia asociada al CRC en modelos in vitro e in vivo. Si bien ambas líneas celulares resultaron en atrofia muscular in vitro, los tumores C26 exhibieron una mayor capacidad para inducir la caquexia en un modelo de ratón. También demostramos que C26 y CT26 pueden influir en la dinámica del músculo esquelético a través de diferentes mecanismos biológicos.
Investigaciones previas demuestran que el medio acondicionado (CM) de las células de carcinoma C26 y CT26 induce una atrofia significativa de los miotubos esqueléticos murinos C2C12 ([52]–[55]). Un estudio reciente utilizó un modelo de cocultivo para investigar la interacción entre las células C26 y las células C2C12, mostrando que el cocultivo con las células C26 condujo a una grave atrofia muscular ([14]). Utilizando el modelo de cocultivo de células musculares y cancerosas, probamos la potencia relativa de las células C26 y CT26 para inducir la atrofia de C2C12 a diferentes densidades de siembra. Encontramos que las células CT26 y C26 indujeron de manera equivalente la atrofia muscular en los miotubos C2C12, lo que se indica por una disminución significativa en el diámetro del miotubo. Si bien las células CT26 condujeron a una mayor reducción en el área total del miotubo, solo C26 disminuyó la relación myogenin/DAPI. Como un factor regulador miogénico crucial, la myogenin impulsa la diferenciación terminal de los mioblastos y es fundamental para la expresión de los genes musculares tardíos, incluyendo la creatina quinasa muscular (MCK) ([56]). Se ha demostrado que la disfunción de la myogenin interfiere con la fusión de los miocitos y conduce a un tamaño de fibra más pequeño in vivo ([57]). Además de regular la diferenciación muscular, la myogenin también desempeña un papel importante en el mantenimiento de las fibras musculares adultas y la regulación de las células madre musculares ([58]). Nuestros resultados indican que, si bien tanto las células C26 como las CT26 indujeron la atrofia muscular, las células C26 perjudicaron aún más la expresión de la myogenin en los miotubos C2C12 maduros, lo cual podría contribuir a defectos adicionales en la fusión y el mantenimiento del miotubo.
Por otro lado, las células C26 y CT26 exhibieron una capacidad diferencial para inducir la caquexia en el modelo de ratón. Aunque tanto los ratones con tumores CT26 como los C26 tuvieron una reducción en el peso corporal libre de tumores, los tumores C26 condujeron a una mayor pérdida de masa magra libre de tumores y masa muscular esquelética. Sorprendentemente, en contra de investigaciones previas, demostramos que tanto los tumores C26 como los CT26 condujeron a una reducción del peso en GAST y TA, mientras que una disminución en la masa de PLA, EDL y SOL solo se observó en los ratones con tumores C26 ([34]). Se observan cambios diferenciales en la masa muscular esquelética en diferentes modelos de tumores, y una mayor reducción en la masa muscular a menudo indica una caquexia más grave o en etapa tardía ([59], [60]). Además, encontramos que los tumores C26 resultaron en una caquexia muscular más grave. Coherente con investigaciones previas que utilizan modelos animales de caquexia del cáncer, los ratones con tumores C26 en nuestro estudio mostraron un déficit en la producción de fuerza junto con una disminución significativa en la masa muscular ([59], [61], [62]). A pesar de la disminución observada en la masa muscular de TA y GAST, los ratones con tumores CT26 no mostraron pérdida de la fuerza de TA o GAST durante las pruebas de frecuencia de fuerza. En conjunto, la reducción de la masa muscular, pero la preservación de la contractilidad en los ratones con tumores CT26, podría indicar una caquexia del cáncer más leve o en etapa temprana en comparación con los tumores C26.
En el presente estudio, también observamos cambios específicos del músculo en la morfología y composición de las fibras de los ratones con tumores C26. Investigaciones previas sugieren que la progresión del cáncer afecta diferencialmente a las fibras de contracción rápida y lenta ([63]). Se ha propuesto que los músculos ricos en fibras musculares oxidativas de tipo I son más resistentes a la atrofia relacionada con el cáncer que los músculos compuestos predominantemente por fibras de contracción rápida de tipo IIb y IIx, lo cual podría estar asociado con la disfunción metabólica específica del tipo de fibra ([64], [65]). Por ejemplo, investigaciones previas muestran que la progresión del tumor C26 redujo en gran medida el área de la fibra de TA, pero no causó cambios significativos en el CSA de la fibra SOL ([66]). Ha habido otras investigaciones que informan que los tumores C26 condujeron a la atrofia muscular y redujeron la producción de fuerza en SOL, pero la disminución en el CSA medio de la fibra se debió principalmente a la atrofia de las fibras relativamente glucolíticas de tipo IIa y tipo IIb/IIx ([67]). Sin embargo, nuestro modelo muestra que los tumores C26 indujeron una disminución en el CSA medio de la fibra SOL, y dicha disminución se debió principalmente a la reducción del CSA medio de las fibras de tipo I. A diferencia de investigaciones previas en ratones con tumores C26, no observamos un cambio en el tipo de fibra de tipo I a tipo IIa o tipo IIx/b en SOL ([67]). En el músculo de contracción rápida EDL, observamos que los tumores C26 tuvieron una fuerte tendencia a reducir el CSA medio, aunque esto no fue estadísticamente significativo. Investigaciones previas muestran que los tumores C26 redujeron el CSA medio en las fibras de tipo IIa y tipo IIb/IIx dentro del EDL de ratones CD2F1 machos ([67]). Por el contrario, no vimos ninguna disminución en el CSA medio de las fibras de tipo IIa o tipo IIx en el EDL de los ratones con tumores C26. En cambio, el efecto atrófico se debió principalmente a la reducción del CSA de las fibras de tipo IIb. Cabe destacar que también observamos un aumento en el CSA de las fibras de tipo I en el EDL de los ratones C26. Investigaciones previas han informado una disminución en el porcentaje de fibras de tipo IIa y un aumento en el porcentaje de fibras de tipo IIb/IIx en EDL ([67]). Sin embargo, no se observó ninguna diferencia en el porcentaje de tipos de fibra en el EDL en nuestro modelo C26. Estas inconsistencias en la composición de las fibras de SOL y EDL podrían estar relacionadas con las diferencias de sexo, la cepa del ratón, la edad del ratón y los protocolos para el análisis del tipo de fibra.
Además de la masa muscular, los ratones con tumores C26 mostraron una mayor reducción en la masa grasa en comparación con los ratones con tumores CT26. La disminución del tejido adiposo en la caquexia del cáncer podría atribuirse al aumento de la lipólisis, el pardeamiento del tejido adiposo blanco y el metabolismo alterado caracterizado por un mayor gasto energético ([68]–[70]). Investigaciones previas demuestran una reprogramación del metabolismo de los adipocitos en la caquexia inducida por C26, que aumenta la producción de metabolitos, incluyendo la sarcosina y la timidina ([71]). También se ha demostrado que el agotamiento de los adipocitos puede preceder a la atrofia muscular en la caquexia del cáncer a través de mecanismos dependientes de la lipasa de triglicéridos del tejido adiposo (ATGL) ([72]). Los ratones con tumores C26 exhibieron una mayor capacidad para inducir el agotamiento de los adipocitos, lo cual podría contribuir a la progresión de la atrofia muscular esquelética. El trabajo futuro podría investigar el metabolismo diferencial de los adipocitos en los ratones con tumores C26 y CT26 y cómo influye en el crecimiento muscular esquelético en los dos modelos.
Para ilustrar los posibles mecanismos por los cuales C26 y CT26 impactan de manera diferente en la masa y función del músculo esquelético, examinamos las respuestas inmunitarias innatas intramusculares en diferentes tipos de músculo. Observamos un mayor nivel de inflamación muscular en ratones con tumor C26 en comparación con CT26, tanto en el músculo SOL como en el EDL. La inmunohistoquímica del SOL mostró que la inoculación de C26 indujo la infiltración de MΦ CD68+ y CD206+. De manera similar, la RT-qPCR también mostró que los ratones con tumor C26 presentaban una expresión significativamente mayor de ARNm del marcador de células inmunitarias innatas CD11b (Itgam) y del marcador de macrófagos M2 CD206 (Mrc1) en el GAST. Estudios previos han identificado una mayor actividad de los macrófagos asociados al tumor (MAT) en el microambiente tumoral, lo que promueve la proliferación tumoral y estimula la producción de citocinas como IL-6 y CCL2 ([73]). También se ha demostrado que el músculo cuádriceps de ratones con tumor C26 exhibe una mayor infiltración tanto de MΦ con receptor de quimiocina CXC 1+ (CX3CR1+) como de MΦ M2 de tipo antiinflamatorio ([74]). Aunque a menudo se considera que los MΦ M2 son antiinflamatorios/pro-regenerativos y desempeñan un papel esencial en la resolución de la inflamación del músculo esquelético, los factores secretados por los MΦ M2 también pueden ejercer funciones pro-tumorales y promover el desgaste muscular en el contexto del cáncer ([75], [76]). De manera similar, se ha demostrado que los MΦ M2 aumentan la expresión del factor asociado al receptor de TNF 6/NF-κB (TRAF6/p65) en el cáncer de páncreas, lo que promueve la activación de Atrogin-1 y MuRF1 en las células del músculo esquelético ([77]).
Los ratones con tumor C26 también exhibieron un mayor número de PMN intramusculares (células Gr-1+) tanto en SOL como en EDL en comparación con CT26. Asimismo, se ha informado de un aumento tanto de los PMN circulantes como intramusculares en ratones con tumor C26, y este aumento no se observó en ratones CD2F1 con tumor CT26 ([34]). En el mismo estudio, los autores también informaron de un aumento en la expresión génica del factor de crecimiento transformante-β (TGF-β), la subunidad alfa del factor inducible por hipoxia 1 (HIF1α) y la IL-6 en el SOL, lo que se limita a los ratones con tumor C26 ([34]). Los PMN activados patológicamente podrían contribuir potencialmente al desgaste del músculo esquelético en la caquexia relacionada con el cáncer ([78]). Anteriormente, la investigación demostró que las células supresoras derivadas de la médula ósea polimorfonucleares (PMN-MDSC) promueven el desgaste del músculo esquelético al aumentar la expresión de la vía de señalización de activina A en un modelo de ratón de carcinoma pulmonar de Lewis (LLC) ([79]). Además, observamos un aumento en la expresión de CHMP2A (Chmp2a) solo en ratones con tumor CT26. CHMP2A es necesaria para la autofagia y desempeña un papel importante en la mediación de la biogénesis de los autofagosomas ([80], [81]). Aunque el papel de CHMP2A en la mediación de la caquexia relacionada con el cáncer aún no está claro, se ha demostrado que la autofagia excesiva promueve el desgaste muscular ([82]). Además, la autofagia podría estar implicada en la infiltración y supervivencia de los PMN en múltiples tipos de cáncer ([83]). En conjunto, el reclutamiento diferencial de las células inmunitarias innatas en el músculo esquelético podría contribuir a los diferentes efectos caquécticos de los tumores C26 y CT26.
A pesar de la evidencia clara de la inflamación celular del SOL y el EDL de los ratones con tumor C26, no observamos un cambio transcripcional de las citocinas o quimiocinas proinflamatorias clásicas, como IL-6 (Il6), MCP-1 (Ccl2), TNFα (Tnf) e IL1β (Il1b) en el músculo GAST. Curiosamente, investigaciones previas han demostrado una expresión diferencial de citocinas y quimiocinas en el TA y el GAST en ratones con tumor C26. Si bien el músculo TA presentaba un aumento significativo en el nivel de expresión de MCP-1 (Ccl2), ligando 1 del motivo C-X-C (CXCL1, Cxcl1) y CXCL2 (Cxcl2), el GAST solo mostró un aumento masivo en la expresión de CXCL1, lo que revela una respuesta inflamatoria diferencial a la progresión del cáncer en diferentes tipos de músculo ([84]). Aunque la regulación al alza de las citocinas y quimiocinas proinflamatorias está implicada en la patología de la caquexia relacionada con el cáncer, investigaciones previas han sugerido que la progresión de la caquexia podría no depender de la expresión elevada de las citocinas ([61], [78], [85]). Además, el cambio en el nivel de las citocinas proinflamatorias en el tejido muscular podría depender del tiempo.
Curiosamente, encontramos que los tumores C26 y CT26 también mediaron de manera diferente la expresión de las enzimas de la biosíntesis de lípidos en el músculo esquelético caquéctico. Los tumores C26 aumentaron significativamente la expresión génica de 5-LOX (Alox5), mientras que no se encontró tal cambio en los ratones con tumor CT26. 5-LOX es la enzima esencial implicada en la producción de eicosanoides derivados del ácido araquidónico omega-6 (ARA, 20:4n-6), incluidos los leucotrienos ([86]). La sobreexpresión de 5-LOX se observa en los tejidos de CRC y contribuye a la progresión del cáncer ([87]–[89]). En un modelo agudo de lesión del músculo esquelético inducida por miotoxina, se ha sugerido que una actividad excesiva de 5-LOX puede provocar un aumento de la inflamación y una alteración de la regeneración de las miofibras ([90]). También se ha informado que una mayor actividad de 5-LOX impulsa la atrofia de los miotubos inducida por glucocorticoides al promover la producción local del eicosanoide proinflamatorio leucotrieno B4 (LTB4) y activar la vía del factor nuclear kappa B (NF‐κB) ([91]). Además, se ha demostrado que un tratamiento de 4 semanas con el inhibidor farmacológico de 5-LOX, el malotilato, puede aliviar el desgaste del músculo esquelético en ratones que envejecen ([91]). Por otro lado, recientemente descubrimos que tanto el malotilato como el inhibidor de la proteína activadora de 5-LOX (FLAP), el MK886, interfirieron notablemente con la diferenciación mionogénica de los mionblastos C2C12 ([92]). Por lo tanto, la vía de 5-LOX puede desempeñar un papel dual en la plasticidad del músculo esquelético en diferentes circunstancias. No obstante, nuestros datos sugieren que una actividad de 5-LOX crónicamente aumentada puede contribuir al desgaste del músculo esquelético en ratones con tumor C26.
A diferencia de 5-LOX, también observamos una supresión tumoral específica de la expresión de ARNm de la leucocina-tipo 12/15-LOX (Alox15) en ratones con tumor CT26 y C26, que es una enzima clave que media en la producción de SPM y la resolución de la inflamación ([93]). Se ha informado de una expresión reducida de 15-LOX-1, el ortólogo humano de la 12/15-LOX murina, en líneas celulares de adenocarcinoma de colon y páncreas humano, lo que contribuye a la supervivencia del tumor y al crecimiento tumoral desregulado ([94]–[96]). Sin embargo, los estudios sobre la influencia de la caquexia relacionada con el cáncer en la expresión de la 12/15-LOX del músculo esquelético han sido limitados. Aquí, mostramos que los tumores C26 disminuyeron notablemente tanto el nivel génico como el proteico de la 12/15-LOX en el GAST. Por otro lado, si bien los tumores CT26 también redujeron la expresión de ARNm de la 12/15-LOX, no se encontró deficiencia de proteínas en los músculos CT26, lo que indica posibles mecanismos postranscripcionales para compensar la función de la 12/15-LOX en los ratones con tumor CT26. Recientemente se informó que la deficiencia genética de la 12/15-LOX bloqueó el cambio de clase de los mediadores lipídicos bioactivos después de una lesión muscular aguda, lo que resultó en una regeneración alterada del músculo esquelético después de una lesión aguda ([92], [97]). Los ratones transgénicos que carecen de la enzima 12/15-LOX (Alox15−/−) también exhibieron una inflamación crónica basal del músculo esquelético caracterizada por un aumento de la infiltración de PMN y MΦ ([92]). La disminución de la expresión de la 12/15-LOX en los ratones con tumor C26 podría contribuir a la progresión del desgaste muscular al mediar en las respuestas inflamatorias. En conjunto, la regulación distinta de la expresión de 5-LOX y 12/15-LOX en los músculos esqueléticos podría contribuir potencialmente a las diferentes respuestas inmunitarias intramusculares y los efectos caquécticos en los ratones con tumor CT26 y C26. Curiosamente, en la caquexia relacionada con el cáncer inducida por LLC, a pesar de una menor expresión de la proteína 12/15-LOX en el músculo GSAT, la producción de oxilipinas derivadas de la 12/15-LOX fue aparentemente elevada, lo que ha sugerido que contribuye a la progresión de un fenotipo caquéctico al promover el estrés oxidativo ([98]). Esto podría sugerir una fisiopatología distinta de la caquexia relacionada con el cáncer inducida por C26 y LLC. Se debe realizar más investigación para evaluar las concentraciones intramusculares y los papeles biológicos de varios mediadores lipídicos bioactivos derivados de las vías de 5-LOX y 12/15-LOX en los ratones C26 y CT26.
También mostramos que los tumores C26 y CT26 regularon de manera diferente las vías de señalización implicadas en la síntesis de proteínas. Si bien no se observó un cambio significativo en el nivel de fosforilación de Akt en Ser473, los ratones con tumor C26 tendieron a tener un nivel de fosforilación disminuido de p70S6K en Thr421/Ser424, mientras que los ratones con tumor CT26 no. La vía Akt/mTOR/p70S6K desempeña un papel crucial en la regulación de la síntesis de proteínas musculares, y la actividad reprimida de Akt reduce la masa muscular y la función contráctil ([99], [100]). Mientras tanto, también encontramos que el nivel de fosforilación de ERK1/2 se redujo en los ratones con tumor C26. ERK1/2 pertenece a la familia de las quinasas activadas por mitógenos (MAPK) y puede regular positivamente la actividad de p70S6K en varios tejidos, incluidos los músculos cardíacos y las células del epitelio de la retina ([101]–[103]). Si bien mTOR se dirige principalmente al sitio de fosforilación Thr389 de p70S6K, MAPK fosforila los sitios Thr421/Ser424 ([104]). También se ha demostrado que la inhibición farmacológica de ERK1/2 reprime la actividad de p70S6K en los miotubos C2C12, lo que resulta en una disminución del diámetro de los miotubos ([105]). De manera consistente, informamos previamente que la fosforilación de p70S6K inducida por el eicosanoide prostaglandina F2α (PGF2α) fue mediada por un mecanismo dependiente de ERK, pero independiente de Akt ([106]). La inhibición de la fosforilación de p70S6K en los sitios Thr421/Ser424 en los músculos GAST de C26 podría, por lo tanto, estar asociada con la disminución de la actividad de ERK1/2. Sorprendentemente, observamos una fosforilación elevada de la proteína ribosómica S6, un efector descendente bien establecido de las vías ERK y mTOR/p70S6K, en los ratones con tumor C26 en los sitios Ser235/236 y Ser240/244. Estudios previos han demostrado que la señalización de Akt/mTOR puede verse afectada en gran medida en el cáncer de colon, lo que indica la disminución del nivel de fosforilación de p70S6K, S6 o 4E-BP1, lo que conduce a una disminución de la síntesis de proteínas ([23], [107], [108]). Sin embargo, un estudio reciente mostró que la inoculación del tumor C26 no necesariamente disminuyó el nivel de fosforilación de p70S6K o S6 a pesar de la pérdida significativa de la masa muscular esquelética ([109]). Además, el aumento de la fosforilación de S6 no refleja directamente el aumento de la síntesis de proteínas ([110], [111]). Nuestra observación del aumento de la actividad de S6 podría estar asociada con la fosforilación relacionada con mTOR de p70S6K en el sitio Thr389 en respuesta a la liberación de aminoácidos después de una mayor degradación de proteínas ([112]–[114]). Además, la mayor actividad de S6 podría implicar vías no canónicas, como la proteína quinasa A (PKA), que no influye en la eficiencia de la traducción ([115]). Si bien se ha demostrado que la señalización de PKA se ve afectada en los ratones machos después de la inoculación de C26, podría producirse una regulación diferencial de PKA debido al sexo del ratón, la edad (2 meses frente a 10 meses) y la etapa de la caquexia relacionada con el cáncer (día 13 frente a > día 20) ([116]). Además, la actividad de la fosfatasa S6, principalmente la proteína fosfatasa de tipo 1 (PP1), podría suprimirse en el cáncer de colon, lo que también podría atenuar la supresión de la fosforilación de S6 ([117], [118]). La posible red reguladora de ERK1/2, p70S6K y S6 en el contexto de la caquexia avanzada del CRC indica una regulación compleja de las vías de renovación de proteínas.
Cabe destacar que, en los ratones portadores de tumores CT26, pero no en los portadores de tumores C26, se observó un aumento significativo de la fosforilación de JNK en Thr183/Tyr185, que es otra subfamilia de MAPK ([119]). La vía JNK/c-Jun podría estar asociada con un mayor potencial de metástasis y características de células madre cancerosas ([120], [121]). En el contexto de la caquexia asociada al cáncer de páncreas, se ha sugerido que la activación de la señalización de JNK contribuye a la pérdida de masa muscular al activar las E3 ubiquitina ligasas específicas del músculo Atrogin-1 (Fbxo32) y MuRF1 (Trim63) ([122]). Sin embargo, nuestro modelo muestra que, a pesar del aumento de la fosforilación de JNK tanto en los ratones CT26 como en los C26, la expresión de ARNm de estas E3 ubiquitina ligasas específicas del músculo solo aumentó en los ratones portadores de tumores C26. Este resultado sugiere otros mecanismos reguladores de la vía de degradación de proteínas en los ratones portadores de tumores CT26 que contrarrestan la activación de la señalización de JNK. Además, la mayor expresión de ARNm de las E3 ubiquitina ligasas específicas del músculo en los ratones C26 en comparación con los CT26 indica una posible mayor degradación de proteínas inducida por los tumores C26 a través de un mecanismo independiente de JNK.
Una limitación de este estudio es que no se midieron los niveles circulantes de citocinas proinflamatorias. Aunque no se detectó ningún cambio en la expresión de citocinas en los músculos GAST, las citocinas secretadas por el tumor podrían aumentar potencialmente en el plasma, contribuyendo a la inflamación sistémica. Tampoco examinamos el perfil sistémico o intramuscular de los mediadores lipídicos proinflamatorios y antiinflamatorios/pro-resolutivos derivados de varias vías dependientes de LOX. Los estudios futuros deberían evaluar si la disminución de la expresión de 15-LOX y el aumento de la expresión de 5-LOX en el tejido muscular esquelético de los ratones portadores de tumores C26 afectan a las concentraciones posteriores de los respectivos mediadores lipídicos bioactivos. Además, aunque estudios recientes indican que los ratones machos pueden ser más propensos a la caquexia inducida por C26, utilizamos ratones hembra BALB/c para comparar la diferencia intrínseca entre los carcinomas C26 y CT26 ([123], [124]). Por lo tanto, los estudios futuros deberían investigar si los diferentes efectos de las células C26 y CT26 se ven afectados por el sexo. También se podría investigar más a fondo los posibles cambios dependientes del tiempo en la producción de citocinas en los músculos esqueléticos. Además, aunque evaluamos la actividad de fosforilación de las principales enzimas implicadas en la síntesis de proteínas y medimos la expresión de las E3 ubiquitina ligasas específicas del músculo, no se midió directamente la tasa de síntesis o proteólisis de proteínas. Si bien nuestro principal objetivo en el estudio actual fue la dinámica de la pérdida de masa muscular esquelética, podría ser interesante examinar las diferencias celulares y moleculares locales entre los tumores C26 y CT26, así como la forma en que regulan de forma diferente la pérdida de tejido adiposo. Por último, la investigación futura podría examinar cómo se modula el metabolismo muscular en los ratones portadores de tumores C26 y CT26.
CONCLUSIÓN
En el estudio actual, encontramos que tanto las células de carcinoma de colon C26 como las CT26 inducen atrofia de las células del músculo esquelético en un modelo de cocultivo de músculo y cáncer. Sin embargo, en un modelo de ratón de inoculación de tumores, si bien los tumores CT26 provocaron una disminución del peso corporal libre de tumores y de la masa muscular en GAST y TA, la inoculación de C26 causó una pérdida más significativa de masa magra y un deterioro más grave de la función del músculo esquelético. Mostramos que los tumores C26 provocaron un mayor nivel de inflamación intramuscular que los CT26, y los músculos C26 presentaron una mayor expresión de 5-LOX y una expresión reducida de 15-LOX. Además, las dos líneas celulares regulan de forma diferente las vías de renovación de proteínas. A pesar de la actividad aumentada de la señalización de JNK, CT26 exhibió un fenotipo de caquexia más leve.
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